Summary
C'è una carenza significativa donatore di fegato, e i criteri per i donatori di fegato sono stati ampliati. Perfusione normotermica ex vivo del fegato (NEVLP) è stato sviluppato per valutare e modificare la funzione dell'organo. Questo studio dimostra un modello del ratto di NEVLP e verifica la capacità di pegylated-catalasi, per attenuare la lesione di conservazione del fegato.
Abstract
C'è una scarsità significativa dei documenti non autografo del fegato per i trapianti, e in risposta ai criteri del donatore sono stati ampliati. Di conseguenza, perfusione normotermica ex vivo del fegato (NEVLP) è stato introdotto come un metodo per valutare e modificare la funzione dell'organo. NEVLP ha molti vantaggi rispetto ai ipotermico e subnormothermic perfusione tra cui ha ridotto la lesione di conservazione, il ripristino della funzione normale dell'organo in condizioni fisiologiche, valutazione delle prestazioni di organo e come piattaforma per la riparazione dell'organo , ritocco e la modifica. Modelli NEVLP sia murini che suini sono stati descritti. Dimostriamo un modello del ratto di NEVLP e utilizzare questo modello per mostrare una delle sue importanti applicazioni — l'uso di una molecola terapeutica aggiunta al perfusato del fegato. Catalasi è un organismo saprofago di ossigeno reattive endogene specie (ROS) e ha dimostrata di diminuire ischemia-reperfusion dentro l'occhio, il cervello e il polmone. PEGilazione ha dimostrato di catalasi all'endotelio di destinazione. Qui, abbiamo aggiunto pegilato-catalasi (PEG-CAT) al perfusato base e dimostrato la sua capacità di mitigare la ferita di conservazione del fegato. Un vantaggio del nostro modello NEVLP roditore è che è poco costoso rispetto ai modelli animali più grandi. Una limitazione di questo studio è che non include attualmente post-aspersione trapianto del fegato. Di conseguenza, stima della funzione del post-trapianto dell'organo non può essere fatta con certezza. Tuttavia, il modello di trapianto di fegato del ratto è ben consolidato e certamente potrebbe essere utilizzato in combinazione con questo modello. In conclusione, abbiamo dimostrato un modello NEVLP poco costoso, semplice e facilmente replicabile utilizzando ratti. Applicazioni di questo modello possono includere test perfusati romanzo e additivi di perfusato, software progettato per la valutazione dell'organo test ed esperimenti progettati per riparare organi.
Introduction
Ci sono 14.578 pazienti in lista d'attesa per trapianto di fegato e circa 7.000 trapianti vengono eseguiti per anno1,2. In risposta a questa carenza significativa dei donatori, hanno ampliato i criteri per i donatori di fegato; Questi sono spesso indicati come organi marginali o donatori di criteri estesi e sono tenuti a svolgere meno bene dopo trapianto di allotrapianti di criteri standard, con più alti tassi di disfunzione dell'innesto primario e funzione di ritardo dell'innesto3, 4,5,6. Di conseguenza, NEVLP è stato introdotto come un metodo per valutare e modificare organo funzione6,7. Abbiamo progettato un modello del ratto di NEVLP e utilizzato questo modello per illustrare una delle sue potenziali applicazioni importanti – la sperimentazione di additivi di nuove molecole di perfusato del fegato.
NEVLP è stata valutata in murino (ratto) sia modelli porcine, così come in organi umani scartati6,8,9. I risultati delle prime prove umane di NEVLP sono stati anche recentemente pubblicati10. Sebbene l'aspersione ipotermica macchina chiaramente è diventato lo standard per la conservazione del rene, la temperatura alla quale macchina del fegato dovrebbe verificarsi perfusione è ancora discutibile. NEVLP ha proposti molti vantaggi rispetto ai ipotermico e perfusione subnormothermic. Questi includono lesioni ridotta conservazione, il ripristino della funzione normale dell'organo in condizioni fisiologiche, la capacità di valutare le prestazioni dell'organo e come una piattaforma per la riparazione dell'organo, ritocco e modifica7,11, 12,13,14,15,16,17.
Un numero significativo di studi siano stato completato utilizzando modelli NEVLP suine. Anche se questi modelli sono comparativamente poco costosi quando considerando modelli utilizzando scartato organi umani o test clinici umani, essi sono molto costosi rispetto al nostro piccolo animale NEVLP modello. Una componente significativa della per esperimento costo è il perfusato. Siamo in grado di completare un'aspersione di 4h con 300 mL di perfusato ad un costo relativamente basso. Inoltre, il costo di piccoli animali tra cui ratti è molto basso rispetto al costo dei suini.
In confronto ad altri modelli di NEVLP nel ratto, il modello presentato qui è relativamente semplice da implementare e ha una vasta gamma di applicazioni. Il circuito di perfusione può essere visto nella Figura 1. Il perfusato inizia nel perfusato serbatoio (1), che è un contenitore rivestito di acqua. Perfusato è tirato dal serbatoio di una pompa a rulli (2) e spinto in un windkessel (3) e poi l'ossigenatore (4). L'ossigenatore è impostata per gas controcorrente e flusso di perfusato per fornire uno scambio gas di massima. Il perfusato quindi procede a un riscaldamento della bobina (5) all'interno della camera di perfusione per assicurarsi che è a temperatura fisiologica, e un gorgogliatore (6) per prevenire l'aspersione di bolle d'aria ci sono pre-organo (7) e post-organo (8) porte di campione, che consentono il perfusato essere Campionati. Il perfusato poi entra il fegato attraverso la cannula della vena portale. La cannula della vena portale è collegata a un monitor di pressione che mappa i valori sul software di raccolta dati. Il perfusato poi esce il fegato attraverso la cannula IVC e sfocia il blocco equalizzatore di pressione (9). Infine, il perfusato è tirato dal blocco pressione indietro attraverso la pompa roller e svuotato nel serbatoio. Questo modello include aspersione continua alla vena portale e lascia fuori il flusso pulsatile per l'arteria epatica e la dialisi usati in alcuni altri modelli, ognuno dei quali richiede un circuito separato e aggiuntivo, ma in precedenza è stato dimostrato per non essere richiesto9,13.
Per esplorare l'aggiunta di una nuova molecola terapeutica al perfusato, abbiamo scelto l'enzima catalasi. Catalasi è un organismo saprofago endogeno di ROS che fa parte del meccanismo di difesa interno cellule per mitigare gli effetti di ROS18. Espressione di catalasi è aumentata di ischemia epatica riperfusione pregiudizio19. Sperimentale aggiunta della catalasi è stata dimostrata per diminuire ischemia-reperfusion dentro l'occhio, il cervello e il polmone20,21,22,23,24. PEGilazione ha dimostrato di destinazione catalasi per l'endotelio e aiuto nell'assorbimento della catalasi in cellule endoteliali25. PEG-CAT è stato somministrato per via sistemica con limitata efficacia nel ridurre la lesione di ischemia-riperfusione epatica; Tuttavia, abbiamo supposto che l'aggiunta di CHE PEG-CAT ad un circuito di perfusione d'organo isolato porterebbe a una migliore risultati26,27,28. Qui, si aggiunge il PEG-CAT alla nostra base perfusato e dimostrare la propria capacità ridurre lesioni conservazione del fegato.
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Protocol
Tutte le procedure sono state effettuate secondo le linee guida di istituzionale Animal Care e Consiglio nazionale delle ricerche di guida per la cura umana e l'uso di animali di laboratorio (IACUC) e ha subito l'approvazione del Comitato di Ohio State University IACUC.
1. il primo set-up
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Preparare la soluzione di perfusione combinando le seguenti: 86 mL di 25% di albumina, 184 mL di media Williams', 30 mL di penicillina/streptomicina (10 U/mL penicillina e 0,01 mg/mL di streptomicina), insulina (50 U/L), eparina (0.01 U/mL), L-Glutammina (0,292 g/L), e idrocortisone (0,010 g/L) per un volume totale di 300 mL. Per il perfusato base e gruppo PEG-CAT, aggiungere 625 U/mL di PEG-CAT.
- Il tampone di perfusato utilizzando tris (idrossimetil) amminometano (THAM) a pH 7,4. Utilizzare una macchina di gas del sangue arterioso per confermare il pH di perfusato.
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Impostare il circuito (Figura 1).
- Accendere il bagno d'acqua più calda e impostarlo a 37 ° C. Consentire la camera di organo per riscaldarsi.
- Versare il perfusato misto e tamponato nel serbatoio e avviare la circolazione.
Nota: Il perfusato menzionato in questo passaggio è stato preparato al punto 1.1.1. - Accendere il gas ossigenante (95% di ossigeno e 5% anidride carbonica) per il contatore di flusso attraverso l'ossigenatore in linea.
- Attivare il software di raccolta dati e fare clic su "start" per registrare per tutta la durata dell'esperimento.
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Impostare il microscopio operatorio e la sala operatoria (Figura 2).
- Accendere tutte le apparecchiature compreso la scheda scaldavivande, elettrocauterizzazione e l'anestesia e segni vitali (cuore tasso e saturazione dell'ossigeno) apparecchiature di monitoraggio.
Nota: Le impostazioni di microscopio variano a seconda il microscopio utilizzato e possono essere regolate per la comodità dell'utente. - Riempire la siringa di anestesia da 10 mL con 10 mL di liquido isoflurano per inalazione (peso molecolare 184,5 g/mol) e inserire nell'unità di anestesia.
- Posizionare una siringa da 0,5 mL di eparina (50 U), strumenti chirurgici, 4-0 e 7-0 di seta sutura, tamponi di cotone sterile e spugne garza 4 x 4 cm non tessuta in modo appropriato (Figura 2).
- Accendere tutte le apparecchiature compreso la scheda scaldavivande, elettrocauterizzazione e l'anestesia e segni vitali (cuore tasso e saturazione dell'ossigeno) apparecchiature di monitoraggio.
- Preparare la camera di isoflurane.
2. induzione dell'anestesia
- Indossare i seguenti dispositivi di protezione individuale (PPE): maschera chirurgica, guanti chirurgici, abito USA e getta.
- Pesare il ratto.
Nota: Usiamo ratti Sprague-Dawley tra 250 – 350 g. - Accendere il compressore ossigeno e isoflurano. Mettere il topo, dopo deve essere pesato, nella camera di isoflurano e fissare il coperchio. Inducono anestesia utilizzando 6% isoflurane consegnata con 2 L/min di ossigeno.
Nota: La dose esatta isoflurano utilizzata dipenderà il sistema di anestesia specifico utilizzato. - Utilizzare clippers elettronico per clip capelli addominale dell'animale.
- Sostituire l'animale nella camera di isoflurane.
- Accendere l'unità di anestesia in sala operatoria.
- Rimuovere il ratto dalla camera di isoflurane quando l'anestesia è completamente indotta. Confermare la profondità dell'anestesia utilizzando un pizzico di punta.
3. gara d'appalto
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Preparare il bracciale portale 16 G (Figura 3).
- Iniziare con un angiocatheter 16 G. Tagliare una sezione di 7 mm di tubo. Determinare il punto medio della sezione 7 mm dalla misura 3,5 mm. Incise a metà e togliere la metà anteriore del tubo.
- Utilizzare una pinza emostatica per schiacciare questa parte ora piatta. Utilizzare un accendino per sciogliere l'altra estremità del angiocatheter per creare un labbro. Non collocare la punta direttamente in fiamma o bruceranno.
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Preparare la cannula del dotto biliare.
- Prendete un angiocath di 27 G e tagliare fuori la porta di iniezione lasciando solo il catetere. Collegare questo ad una sezione di 10 cm del tubo cannular 27 G.
- Posizione il topo con il naso nel cono di naso di anestesia e le quattro estremità, immobilizzate. Monitorare i segni vitali collegando il monitor alla estremità posteriori di sinistra. Eseguire un pizzico di punta per confermare appropriata profondità dell'anestesia. Continuare l'anestesia al 4% isoflurane (per gli animali che pesano > 250 g).
- Spruzzare dell'addome dell'animale con alcool isopropilico al 70%. Lasciare per asciugare. Posizionare un telino sterile sopra l'animale.
- Fare un'incisione del midline al xifoideo al pube utilizzando sharp forbici e si estende attraverso la pelle (Figura 4). Delicatamente immettere il peritoneo e incidere il muscolo. Fare attenzione a non danneggiare la vescica in funzione inferiore di questa incisione e fegato in funzione superiore di questa incisione.
- Estendere l'incisione lateralmente a sinistra e a destra a forma di croce a livello del bordo inferiore del fegato.
- Girare l'anestesia fino al 2% (per animali di peso > 250 g).
- Ritrarre il processo xifoideo mediante una fascetta di zanzara curvo e le costole utilizzando le coste divaricatori (Figura 5).
- Tagliare il falciformi, frenico e legamenti gastroepatico con forbici affilate.
- Individuare e cravatta-off la vena frenica con una sutura di 7-0 come vicino alla sua origine possibile prevenire le infiltrazioni.
- Eviscerate il ratto usando un applicatore sterile di cotone inumidito e avvolgere l'intestino in garza inumidita con soluzione salina 0.9%. Fare attenzione a non per allungare il sistema vascolare del piccolo intestino.
- Sezionare sopra la vena cava inferiore (IVC) per rimuovere il tessuto in eccesso. Sezionare dietro il IVC appena superiore alla biforcazione e passare un ciclo di una sutura seta 4-0 per un uso successivo (Figura 6).
- Ritrarre il rene di destra per fornire l'esposizione alla vena surrenalica destra. Ritrarre il lobo di destra del fegato superiormente con una garza. Legare la vena adrenale di destra con una sutura in seta 7-0 più vicino il IVC come possibile e cauterizzare attraverso esso distale alla cravatta (Figura 7).
- Accuratamente sezionare la vena splenica, legarlo fuori con due punti di sutura seta 7-0 e tagliare attraverso di esso tra i due punti di sutura.
- Legare e legare ulteriori vene con sutura seta 7-0 per la lunghezza supplementare sulla vena portale, se necessario.
Nota: Ci sono a volte piccoli rami di infrahepatic IVC tra il fegato inferiore e la vena surrenalica destra. - Sezionare intorno all'arteria gastroduodenale, legare l'arteria gastroduodenale con una sutura in seta 7-0 e legare l'arteria gastroduodenale.
- Sezionare intorno all'arteria epatica e quindi posizionare una 7-0 sutura seta cravatta intorno ad esso (Figura 8).
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Sezionare il dotto biliare.
- Controllare la lunghezza del dotto biliare. Legare il dotto biliare all'estremità distale utilizzando una sutura in seta 7-0. Inserire un ciclo di una sutura seta 7-0 intorno il dotto biliare prossimalmente possibile.
- Tagliare un buco che è la metà del diametro del condotto con piccole forbici e posizionare un catetere di 27 G nel dotto biliare prossimale. Legare il catetere in posizione mediante una sutura di cravatta sandalo romano (Figura 9).
- Iniettare 0,5 mL di eparina (50 U) la vena del pene o IVC dell'animale usando un ago 27G.
Nota: Una siringa da insulina 27 G può anche essere utilizzata invece. - Morsetto e fissare il IVC utilizzando precedentemente posizionata la sutura seta 4-0.
- Fissare l'arteria epatica utilizzando precedentemente posizionata la sutura seta 7-0.
- Morsetto fuori vena portale utilizzando una clip microsurgical. Incannulare la vena portale utilizzando un angiocatheter 22 G. A livello della vena portale con 60 mL di freddo fisiologica 0,9% con eparina 1 mL (100 U) fino al fegato blanches (Figura 10).
Nota: Se il fegato non scottate immediatamente può essere massaggiata con applicatori con punta di cotone sterile. - Esporre il suprahepatic IVC e tagliare attraverso di esso come alta al petto come possibile.
- Eseguire un'epatectomia come segue. Tagliare intorno al diaframma, tagliare l'arteria epatica, tagliare il IVC, tagliare la vena portale, tagliare qualsiasi ulteriori legamenti ed estrarre il fegato. Posizionare il fegato in ghiaccio freddo normale soluzione salina 0,9% (Figura 11).
- Posto un polsino vascolare 16g nella vena portale (Figura 12). Posizionare il fegato sul circuito di perfusione epatica normotermica ex vivo .
4. Ex Vivo normotermica aspersione del fegato
Nota: Il perfusato usato qui era preparato al protocollo punto 1.1.1.
- Inserire la cannula della vena portale nella vena portale con risvolto (Figura 13).
- Durante il posizionamento di cannula della vena portale, mantenere il flusso del perfusato attraverso il circuito a 2 mL/min per iniziare. Guardare il monitor per eventuali picchi di pressione della vena portale; Ciò potrebbe indicare la nave ha sono occluse e riposizionamento della cannula è necessaria.
- Sutura nella cannula IVC per il flusso di ritorno del perfusato utilizzando una sutura in seta 7-0.
- Una volta che entrambi cannule sono a posto, iniziare a girare il flusso a 1 mL/min fino a raggiunta una pressione fisiologica nella gamma di 10 – 16 cmH2O.
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Prendere un campione di 1 mL da pre- e post-porte a 0, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210 e 240 min di aspersione. Dividere il campione 1 mL in due campioni di 0,5 mL.
Nota: 0,5 mL di questo verrà utilizzato nel passaggio di protocollo 4.5.1 e 0,5 mL verrà essere utilizzato nel passaggio di protocollo 4.5.2.- Snap congelare 0,5 mL di questo campione in provette criogeniche in azoto liquido.
- Eseguire un'analisi di gas del sangue arterioso utilizzando il restante 0,5 mL di perfusato.
- Dopo aver eseguito l'analisi di gas del sangue in ogni momento (0, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210 e 240 min) esaminare i livelli di pH e buffer il perfusato come bisogno di tornare a pH 7,4.
- A conclusione di 4 h di aspersione, scollegare il fegato dal circuito di perfusione. Dividere il fegato in segmenti di 0,5 g. Snap congelare il tessuto epatico in tubi criogenici in azoto liquido.
5. post-esperimento analisi
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Determinare alanina aminotransferasi (ALT) livello nel perfusato a 0, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210 e 240 min utilizzando un kit commerciale saggio colorimetrico.
- In breve, incubare il perfusato con i reagenti di mix di reazione a 37 ° C per 60 min. misurare la densità ottica i valori a 570 nm utilizzando un lettore di micropiastre.
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0,5 g di tessuto epatico con 100 µ l di tampone di lisi di omogeneizzare e analizzare il tessuto lisato per l'adenosina trifosfato (ATP), glutatione (GSH) e malondialdeide (MDA).
- In breve, misura i livelli di ATP dei campioni di tessuto del fegato utilizzando un kit di analisi commerciale. Mescolare il campione con il tampone di reazione e incubare a temperatura ambiente per 30 min. misura la densità ottica a 570 nm utilizzando un lettore di micropiastre.
- Misurare i livelli GSH dei campioni di tessuto del fegato utilizzando un kit di analisi commerciale. Mescolare i campioni di tessuto con il cocktail di dosaggio. Misurare i valori di densità ottica a 405-414 nm.
- Misurare i livelli di MDA dei campioni di tessuto del fegato utilizzando un kit di analisi commerciale. Mescolare i campioni con TBA e calore a 95 ° C per 60 min. centrifuga reattivo e trasferire il surnatante in una piastra a 96 pozzetti. Misurare la densità ottica a 532 nm.
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0,5 g di tessuto epatico con 100 µ l di tampone di lisi di omogeneizzare e analizzare il tessuto lisato per attività di caspase-3/7 relativa utilizzando un kit di analisi commerciale.
- Mescolare il tessuto lisato con il tampone di dosaggio del reagente di caspase-3-7 e incubare a temperatura ambiente per 30 min.
- Misurare il livello di fluorescenza in ogni pozzetto usando un lettore di micropiastre.
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Determinare il livello delle cellule apoptotiche nei campioni di tessuto del fegato utilizzando un kit di rilevazione del morte commerciale in situ .
- Pre-trattare la 0,5 g tessuto sezioni con 10 U/mL proteinasi K per 10 min e poi incubare con la miscela di reazione a 37 ° C per 60 min. eseguire l'analisi utilizzando un microscopio a fluorescenza.
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Representative Results
È stato utilizzato un campione di dimensioni di tre ratti per gruppo. ALT è stata misurata a 0, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210 e 240 min di aspersione. Abbiamo usato di Student t-test per confrontare i risultati tra il perfusato base e base perfusato più gruppi di PEG-CAT in ogni tempo. Comparando il perfusato base e base perfusato plus gruppi PEG-CAT, c'è significativamente inferiore (p < 0,05) ALT nel perfusato base plus gruppo PEG-CAT a 150, 180, 210 e 240 min (Figura 14A).
Tessuto del fegato è stato acquistato al fine di analizzare il danno tissutale da entrambi il perfusato base e base perfusato più gruppi PEG-CAT. Abbiamo usato di Student t-test per confrontare i risultati tra il perfusato base e base perfusato plus gruppi PEG-CAT. Tessuto ATP è stata mantenuta nel perfusato base plus gruppo di PEG-CAT rispetto al gruppo solo di perfusato base (Figura 14B, p < 0,05). Produzione di MDA del tessuto era significativamente più alta nel gruppo base perfusato che nel perfusato base plus PEG-CAT gruppo (Figura 14, p < 0,05). GSH totale è stata mantenuta nel perfusato base plus gruppo di PEG-CAT rispetto al gruppo solo di perfusato base (Figura 14, p < 0,05).
Per analizzare l'apoptosi, attività di caspase 3/7 del tessuto del fegato è stato confrontato fra i gruppi. La fluorescenza è stata misurata in ciascun pozzetto. Abbiamo usato di Student t-test per confrontare i risultati tra il perfusato base e base perfusato plus gruppi PEG-CAT. L'attività della caspasi 3/7 è stato diminuito significativamente nel perfusato base plus gruppo di PEG-CAT rispetto al gruppo solo di perfusato base (Figura 15A, p < 0,05). Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) dUTP Nick-End Labeling (TUNEL) la macchiatura è stata utilizzata per confrontare gli apoptosi fra i gruppi. La percentuale di cellule apoptotiche era significativamente di meno nel perfusato base plus gruppo PEG-CAT rispetto al solo gruppo di perfusato base (Figura 15B, p < 0,05).
Figura 1: circuito di perfusione. Componenti del circuito sono etichettati. Il perfusato inizia nel perfusato serbatoio (1), che è un contenitore rivestito di acqua. Perfusato è tirato dal serbatoio di una pompa a rulli (2) e spinto in un windkessel (3) e poi l'ossigenatore (4). L'ossigenatore è impostata per gas controcorrente e flusso di perfusato per fornire uno scambio gas di massima. Il perfusato procede quindi ad una bobina di riscaldamento (5) all'interno della camera di perfusione per assicurarsi che sia a temperatura fisiologica e un gorgogliatore (6) per prevenire l'aspersione di bolle d'aria. Non ci sono pre-organo (7) e post-organo (8) porte di campione, che consentono il perfusato da campionare. Il perfusato poi entra il fegato attraverso la cannula della vena portale. La cannula della vena portale è collegata a un monitor di pressione, che regola l'equalizzatore di pressione (9). Infine, il perfusato è tirato dal blocco pressione indietro attraverso la pompa roller e svuotato nel serbatoio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: sala operatoria e set-up strumento chirurgico. Il microscopio operatorio (1) deve essere regolato all'altezza appropriata e ingrandimento per l'utente. Isoflurano può essere pre-caricato nella macchina di anestesia (2). Naso dell'animale si trova nel cono di naso (3). Gli strumenti chirurgici devono essere disposti dove possono essere facilmente accessibile (4). Avendo l'elettrocauterio (5) nelle vicinanze è disponibile. Suture (6) dovrebbero essere pre-tagliate in modo pezzi possono essere ottenuti rapidamente quando necessario ed extra dovrebbero essere disponibile (7). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: preparare il bracciale della vena portale 16 G. Iniziare con un angiocatheter 16 G. Tagliare una sezione di 7 mm di tubo. Determinare il punto medio della sezione 7 mm dalla misura 3,5 mm. Incise qui e togliere la metà anteriore del tubo. Utilizzare una pinza emostatica per schiacciare questa parte ora piatta. Usare un accendino per bruciare l'altra estremità del angiocatheter per creare un labbro. Non collocare la punta direttamente in fiamma o bruceranno. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: incisione del Midline. Fare un'incisione del midline al xifoideo (1) al pube (2) utilizzando sharp forbici e si estende attraverso la pelle e il muscolo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: ottenere adeguata ritrazione. Ritrarre il processo xifoideo (1) utilizzando una pinza di zanzara curvo (2) e la nervatura inserendo le coste divaricatori (3, 4). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: la dissezione della vena cava inferiore (IVC). Capovolgi il fegato fino a esporre il rene di destra (1) e della vena portale (2). Sezionare intorno il IVC (3) e inserire un ciclo di 7-0 suturare per uso futuro. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: la legatura della vena surrenalica destra. Ritrarre il rene di destra (1) per fornire l'esposizione alla vena surrenalica destra. Legare la vena surrenalica destra e tagliare attraverso di esso. Una garza inumidita (2) può essere utilizzata per proteggere il fegato durante questa manovra. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 8: la dissezione dell'arteria epatica. Sezionare intorno e posizionare una cravatta intorno all'arteria epatica (1) vicino a dove passa sotto la vena portale (2). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 9: inserimento di una canula dei dotti biliari. Cannulate dotto biliare (1) utilizzando il angiocatheter 27 G (2) collegata alla tubazione di 27 G (3). Questo vi aiuterà a raccogliere la bile durante l'aspersione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 10: colore fegato. Lavare il fegato (1) con 60 cc di freddo fisiologica 0,9% con 100 U (1 mL) di eparina utilizzando un angiocatheter 16 G (2). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 11: dopo l'epatectomia. Eseguire un'epatectomia e posizionare il fegato in soluzione salina fredda. Fare attenzione a non per rimuovere la cannula del dotto biliare. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 12: vena portale cuffing. Individuare la vena portale. Utilizzare un morsetto grande (1) a reggere la vena lasciando un millimetro-labbro diversi della vena sopra il morsetto. Uso microsurgical forcipe (2, 3) per posizionare un polsino vascolare 16 G (4) nella vena portale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 13: polsino della vena portale e inserimento di una canula superior IVC. Incannulare la vena portale polsino (1) e superior IVC (2). Dovrà prestare molta attenzione a non rimuovere la cannula del dotto biliare (3). Inoltre, fare attenzione a non per torcere il IVC superior. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 14: analisi del danno tissutale in base perfusato sola perfusato e base e plus gruppi PEG-CAT (N = 3/group). Barre di errore rappresentano la deviazione standard. Livelli dell'alanina aminotransferasi (ALT) (A). Nel confronto tra livelli di ALT tra il perfusato base e base perfusato plus gruppo pegilato-catalasi (PEG-CAT), c'è significativamente meno ALT nel perfusato base plus gruppo PEG-CAT a 150, 180, 210 e 240 min (p < 0,05). Livelli di adenosina trifosfato (B). Tessuto dell'adenosina trifosfato (ATP) è stata mantenuta nel perfusato base plus gruppo di PEG-CAT rispetto al gruppo solo di perfusato base (p <0.05). Livelli di malondialdeide (C). Produzione di malondialdeide (MDA) del tessuto era significativamente più alta nel gruppo base perfusato che nel perfusato base plus PEG-CAT gruppo (p < 0,05). Livelli di glutatione (D). Totali del glutatione (GSH) è stato mantenuto nel perfusato base plus gruppo PEG-CAT rispetto al gruppo di perfusato base da solo (p < 0,05). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 15: analisi dei meccanismi di apoptosi in base perfusato sola perfusato e base e plus gruppi PEG-CAT (N = 3/group). Barre di errore rappresentano la deviazione standard. (A) attività di Caspase-3/7 Activity.Caspase 3/7 è stato diminuito significativamente nel perfusato base plus gruppo PEG-CAT rispetto al gruppo di perfusato base da solo (p < 0,05). (B) Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) dUTP Nick-End Labeling (TUNEL) la macchiatura. Immagini sono state scattate con un 4 X microscopio a fluorescenza. La percentuale di cellule apoptotiche era significativamente di meno nel perfusato base plus gruppo PEG-CAT rispetto al perfusato base (p < 0,05). Verde: le cellule apoptotiche. Blu: nucleare. Scala bar = 1.000 µm. TUNEL positivo cellule sono state quantificate contando le cellule da 4 campi microscopici casuale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
C'è una scarsità significativa dei documenti non autografo del fegato per i trapianti e in risposta i criteri dei donatori sono stati espansi1,2,3,4,5. A causa della scarsità di donatori, NEVLP è stato introdotto come un metodo per valutare e modificare organo funzione6,7. Abbiamo progettato un modello del ratto di NEVLP. Inoltre, abbiamo utilizzato questo modello per dimostrare una delle sue importanti applicazioni potenziali — la sperimentazione di additivi di nuove molecole di perfusato del fegato. Qui, abbiamo aggiunto PEG-CAT al perfusato base e dimostrato la sua capacità di mitigare la ferita di conservazione del fegato.
Fasi critiche
Il circuito di perfusione del fegato è stato acquistato e utilizzato senza modifiche. Il circuito può essere visualizzato nella Figura 1. Il serbatoio di perfusato utilizzato è un contenitore principaleè che viene utilizzato per mantenere il perfusato alla temperatura fisiologica. Dal bacino perfusato è tirata fuori da un rullo pompato e spinto in un alloggiamento di windkessel. Quest'Aula aiuta a smorzare il flusso pulsatile del perfusato e renderlo più laminare per l'ingresso nell'organo. Dopo il windkessel dell'alloggiamento dei flussi di perfusato verso l'ossigenatore. L'ossigenatore è impostato per il flusso di gas e di perfusato controcorrente fornendo lo scambio di gas massima al perfusato con 95% di ossigeno. Il perfusato procede quindi ad una bobina di riscaldamento per garantire che è ancora alla temperatura fisiologica. Un gorgogliatore giusto prima che l'organo previene l'aspersione di bolle d'aria. Il perfusato viene poi pompato fuori dalla trappola di bolla e attraverso la cannula della vena portale nel fegato. La cannula della vena portale presenta un piccolo ramo fuori di esso per il monitoraggio della pressione. Il tubo del sensore deve essere innescato con fluido non aria quindi non c'è nessuna perdita di pressione al sensore. Dopo ossigenante l'organo, il perfusato fuoriesce dal fegato attraverso la cannula vena inferiore di un equalizzatore di pressione. Il blocco equalizzatore di pressione aiuta a impedire l'eccessiva pressurizzazione del circuito o dell'organo. Infine, il perfusato è tirato dal blocco pressione indietro attraverso la pompa roller e svuotato nel serbatoio.
Prima di iniziare ogni aspersione ispezione visiva del circuito deve essere eseguita per identificare eventuali danni o accumulo di componenti del circuito o della tubazione. Se c'è un accumulo di batteri o altre sostanze sul circuito, parti dovrebbero essere sostituiti o puliti, se possibile. Successivamente, la soluzione detergente mantenendo i componenti interni dovrebbe essere risciacquata. Come i componenti sono essere risciacquati fuori il sensore di pressione e linea di pressione dovrebbe essere eliminato l'inceppo di eventuali bolle d'aria con acqua deionizzata. Inoltre, il flusso deve essere regolata a intervalli regolari per assicurarsi che la lettura della pressione è rispondere in modo appropriato ai cambiamenti. Se il sensore di pressione non risponde in modo appropriato, tutti gli elementi in linea per il sensore dovrebbero essere controllati e ricalibrati se necessario. All'inizio di una perfusione è fondamentale per assicurarsi che i vasi sanguigni del fegato non diventare torti o piegati quando si collega il fegato al circuito. Se si è verificato questo ci sarà un picco di pressione immediata visto sul monitor in un andamento logaritmico. L'errore più comune è una strozzatura nella vena portale con una cannula mal posizionata. Questo problema può essere risolto spostando il vaso in una posizione più naturale tirandolo leggermente fuori e raddrizzamento della vena portale. Il monitor di pressione indica la risoluzione di questo problema con un calo della pressione e maggiore coerenza. Successivamente, quando si collega il bracciale della vena portale alla vena portale cannula della nave può diventare contorta che ostacolano l'aspersione dell'organo. Regolazione del bracciale e la correzione di questo errore si tradurrà in un picco improvviso nella pressione della vena portale che dovrebbe quindi tornare immediatamente a un livello di pressione più bassa e fuori un flusso coerente. Un IVC piegato o attorcigliato può essere identificato rapidamente da nessun flusso della cannula e un gonfiamento della nave. Entrambi questi errori nella vena cava comporterà anche un aumento della pressione, tuttavia a differenza della vena portale problemi questa pressione viene esercitata sull'organo e deve essere risolti rapidamente. Questo problema dovrebbe essere risolto entro 10 min o l'esperimento deve essere annullato. Un'indicazione immediata per l'annullamento dell'esperimento sta vedendo l'edema chiaro nell'organo entro i primi 20 min.
Se c'è una perdita dal fegato o da uno dei collegamenti di cannula sarà importante monitorare il livello del serbatoio del perfusato. A corto di perfusato e aria di pompaggio può essere catastrofici per l'esperimento. Una volta che l'aria è pompata nelle linee non è possibile mettere in pausa l'esperimento e ri-adescare le linee di tubazione. La correzione solo possibile è per il gorgogliatore catturare l'aria iniettata.
Le modifiche e la risoluzione dei problemi
Una volta che il circuito viene svuotato l'ossigenatore può essere messo in linea e poi il circuito può essere innescato con perfusato. Correttamente evitando l'accumulo di aria l'ossigenatore può richiedere qualche minuto, ma è un passo cruciale in assicurandosi che un'embolia non viene generata nel mezzo di una perfusione. Dopo l'ossigenatore è innescato completamente con il ferma-bolle deve essere riempito accanto al perfusato acquisire eventuali bolle d'aria che si formano. A questo punto il flusso del circuito deve essere impostato su un flusso di 1 o 2 mL/min per evitare il perfusato spostare fino a quando il fegato è pronto per l'inserimento di una canula.
Dopo incannulamento della vena portale e IVC del fegato, la pressione dovrebbe aumentare e poi stabilizzarsi. Come il flusso è aumentato ad una pressione fisiologica normale la pressione registrata dovrebbe iniziare ad aumentare in modo graduale simile. Una volta raggiunta la portata desiderata (8 – 16 mmHg) la pressione deve rimanere abbastanza costante. Puntiamo ad una pressione di 10 mmHg e regolare di conseguenza il flusso. Il flusso necessario per raggiungere una pressione di 10 mmHg può variare da organo. Ci può essere una lieve perdita di perfusato dall'organo ma questo perfusato è possibile raccogliere e restituito al serbatoio.
Il circuito deve essere pulito dopo ogni aspersione per mantenere la camera ed il serbatoio e per preservare i tubi monouso e le porte. Tutti perfusato deve essere rimosso dal circuito. Il circuito deve essere immediatamente lavato con un minimo di 300 mL di acqua deionizzata. Mentre l'acqua deionizzata svuota il tubo del circuito le parti esterne devono essere pulite in modo appropriato. Componenti esterni dovrebbero essere risciacquati o delicatamente spazzato via giù e permesso di aria secchi. Componenti del circuito sono fragili e facilmente danneggiabili. È pertanto della massima importanza per pulirlo delicatamente. Il circuito interno dovrebbe essere conservato in una soluzione di 5% di detergente alcalino in acqua deionizzata quando non in uso. Il detersivo nel circuito aiuta a prolungare la vita del tubo e prevenire l'accumulo di altri componenti, quali il gorgogliatore ed equalizzatore di pressione.
La maggior parte delle difficoltà con il circuito può essere prevenuta con accurata pulizia e manutenzione del circuito dopo ogni utilizzo. Questo aiuta a garantire che non c'è nessun accumulo di perfusato residuo che può portare a tubi intasati o cannule. Tubi e componenti del circuito dovrebbe essere controllati regolarmente e sostituiti come necessario prima di ogni utilizzo per assicurarsi che non c'è nessuna contaminazione o restrizione del flusso.
Limitazioni
Una limitazione di questo piccolo animale modello NEVLP è che non include attualmente post-aspersione trapianto. Pertanto è Impossibile valutare la funzione dell'innesto del fegato dopo trapianto. Si tratta di un'importante area per la ricerca futura. Inoltre, utilizzando il piccolo circuito animale richiede sia conoscenze e abilità.
Rilevanza rispetto ai modelli esistenti
Suina e murino modelli (ratto) di aspersione ipotermica, normotermica e SUBNORMOTERMICA ex vivo del fegato sono stati descritti nella letteratura. Anche se la polemica ancora esiste per quanto riguarda temperatura di perfusione, è stato dimostrato che tale perfusione macchina può migliorare la funzione degli innesti del fegato indipendentemente dalla temperatura9. Il modello NEVLP presentato qui è semplice, facilmente replicabili, basso costo e ha una vasta gamma di applicazioni. Questo modello non include dialisi o flusso pulsatile all'arteria epatica, che sono inclusi in alcuni altri modelli, come sono stati indicati per essere inutili9,13. Inoltre, i risultati delle prime prove umane utilizzando NEVLP hanno dimostrato di essere un efficace metodo di conservazione del fegato — pertanto, questo modello è ideale per testare le applicazioni future di ex vivo aspersione del fegato10.
Applicazioni future
Una varietà di applicazioni future per NEVLP sono state proposte in letteratura. Ognuno di questi dovrà essere testato metodicamente nei modelli animali prima del test in organi umani scartati e poi in fegati umani. Il modello qui presentato è ideale per testare queste nuove applicazioni future, come è facilmente replicabile, Elimina passaggi estranei ed è a basso costo. Una delle più importanti applicazioni potenziali di questo modello è quello dimostrato qui - il test di romanzo perfusato farmacologici additivi. Altre applicazioni proposte comprendono la riparazione di organi danneggiati, sgrassaggio dei fegati per consentire il trapianto di organi steatotic, introduzione di resistenza virale dell'epatite C, terapia con cellule staminali mesenchimali, modificazione genetica e aspersione con immunosoppressore agenti11,31,32,33,34,35,36,37,38.
Conclusioni
In conclusione, abbiamo dimostrato un modello NEVLP poco costoso, facilmente replicabile utilizzando ratti. Utilizzo di questo modello richiede un'attenta preparazione, pratica e conoscenza, ma può essere implementato a basso costo. Applicazioni di questo modello possono includere test romanzo perfusato additivi, come è stato dimostrato nei risultati rappresentativi. Ulteriori applicazioni di questo modello possono includere test software progettato per organo valutazione, diversi perfusati e trasportatori di ossigeno artificiale o basati su emoglobina e agenti progettati per riparare organi.
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Disclosures
Tutti gli autori segnalano che non hanno pertinenti informazioni integrative.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dal NIH T32AI 106704-01A1 e dal fondo di Flesch T. per trapianto dell'organo, aspersione, ingegneria e rigenerazione presso la Ohio State University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Perfusate | |||
| 8% Albumin | CLS Behring, King of Prussia, PA | 0053-7680-32 | |
| Williams Media | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | W1878 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | P4333 | |
| Insulin | Eli Lilly, Indianapolis, IL | 0002-8215-91 | |
| Heparin | Fresnius Lab, Lake Zurich, IL | C504701 | |
| L-glutamine | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | G3126 | |
| Hydrocortisone | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | H0888 | |
| THAM | Hospira, Inc, | 0409-1593-04 | |
| Polyethylene Glycol - Catalase | Sigma Aldrich | S9549 SIGMA | |
| Personal Protective Equipment | |||
| Surgical Mask | Generic | N/A | |
| Protective Gown | Generic | N/A | |
| Surgical Gloves | Generic | N/A | |
| Liver Procurement | |||
| Sprague-Dawley Rat | Harlan Sprague Dawley Inc. | 250 -350 grams | |
| Surgical Microscope | Leica | M500-N w/ OHS | |
| Charcoal Canisters | Kent Scientific | SOMNO-2001-8 | |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | N/A | |
| Pressure-Lok Precision Analytical Syringe | Valco Instruments Co, Inc. | SOMNO-10ML | |
| Electrosurgical Unit | Macan | MV-7A | |
| Warming Pad | Braintree Scientific | HHP2 | |
| SomnoSuite Small Animal Anesthesia System | Kent Scientific | SS-MVG-Module | |
| PhysioSuite | Kent Scientific | PS-MSTAT-RT | |
| Isoflurane chamber | Kent Scientific | SOMNO-0530LG | |
| SurgiVet | Isotec | CDS 9000 Tabletop | |
| Oxygen | Praxair | 98015 | |
| Rib retractors | Kent Scientific | INS600240 | |
| GenieTouch | Kent Scientific | GenieTouch | |
| Normal Saline | Baxter | NDC 0338-0048-04 | |
| 4x4 Non-Woven Sponges | Criterion | 104-2411 | |
| Sterile Q-Tips | Henry Schein Animal Health | 1009175 | |
| U-100 27 Gauge Insulin Syringe | Terumo | 22-272328 | |
| 5mL Syringe | BD | REF 309603 | |
| 4-0 Braided Silk Suture | Deknatel, Inc. | 198737LP | |
| 7-0 Braided Silk Suture | Teleflex Medical | REF 103-S | |
| 16 gauge Catheters | BBraun Introcan Safety | 4252586-02 | |
| 14 gauge Catheters | BBraun Introcan Safety | 4251717-02 | |
| Bile Duct Cannular Tubing | Altec | 01-96-1727 | |
| Liver Perfusion Circuit Components | |||
| Water Bath Warmer | Lauda Ecoline Staredition | E103 | |
| Data Collection Software | ADInstruments | Labchart 7 | |
| Liver Perfusion Circuit | Harvard Apparatus | 73-2901 | |
| Membrane Oxygenator | Mediac SPA | M03069 | |
| Roller Pump | Ismatec | ISM827B | |
| Gas (95% oxygen and 5% carbon dioxide) | Praxair | 98015 | |
| Organ Chamber | Harvard Apparatus | ILP-2 | |
| 1.8 mL Arcticle Cryogenic Tube | USA Scientific | 1418-7410 | |
| Mucasol | Sigma-Aldrich | Z637181 | |
| Microsurgical Instruments | |||
| Small Scissors | Roboz | RS-5610 | |
| Large Scissors | S&T | SAA-15 | |
| Forceps - Large Angled | S&T | JFCL-7 | |
| Forceps - Small Angled | S&T | FRAS-15 RM-8 | |
| Clip Applier | ROBOZ | RS-5440 | |
| Scissors - non micro | FST 14958-11 | 14958-11 | |
| Forceps - Straight Tip | S&T | FRS-15 RM8TC | |
| Large Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-01 | |
| Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-01 | |
| Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-02 | |
| Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-03 | |
| Small Mosquito Clamps | Generic | N/A | |
| Post-Experiment Analysis | |||
| Alanine Aminotransferase (ALT) Activity Colorimetric/Fluorometric Assay Kit | BioVision | K752 | |
| Adenosine Triphosphate (ATP) Colorimetric/Fluorometric Assay Kit | BioVision | K354 | |
| Glutathione Assay Kit | Cayman Chemical | 703002 | |
| Lipid Peroxidation (MDA) Assay Kit | Abcam | ab118970 | |
| Caspase-Glo 3/7 Assay Systems | Promega | G8090 | |
| POLARstar OMEGA Microplate Reader | BMG LABTECH | N/A |
References
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