Summary
Det er betydelige leveren donor mangel, og kriterier for leveren givere har blitt utvidet. Normothermic ex vivo leveren perfusjon (NEVLP) har blitt utviklet for å evaluere og endre organfunksjon. Denne studien viser en rotte modell av NEVLP og tester pegylert-catalase, evnen til å redusere leveren bevaring skade.
Abstract
Det er en betydelig mangel på leveren allografts tilgjengelig for transplantasjon, og svar donor kriteriene har blitt utvidet. Resultatet har normothermic ex vivo leveren perfusjon (NEVLP) blitt introdusert som en metode for å vurdere og endre organfunksjon. NEVLP har mange fordeler i forhold til hypothermic og subnormothermic perfusjon inkludert redusert bevaring skade, restaurering av normale organfunksjon under fysiologiske forhold, vurdering av organ ytelse, og som en plattform for orgel reparasjon , ombygging og modifisering. Både murine og svin NEVLP modeller har blitt beskrevet. Vi demonstrere en rotte modell av NEVLP og bruke denne modellen til å vise en av sine viktige programmer, bruk av et terapeutisk molekyl lagt til leveren perfusate. Catalase er en endogen reaktive oksygen arter (ROS) åtseldyr og har vist seg for å redusere ischemia-reperfusion i øyet, hjernen og lungene. Pegylation har vist mot catalase til endotelet. Her vi lagt pegylert-catalase (PEG-CAT) til base perfusate og vist sin evne til å redusere leveren bevaring skade. En fordel med vår gnager NEVLP modell er at det er billig i forhold til større dyremodeller. En begrensning av denne studien er at det ikke inkluderer for øyeblikket etter perfusjon levertransplantasjon. Derfor kan ikke prediksjon av den etter organtransplantasjon gjøres med sikkerhet. Men rotte levertransplantasjon modellen er godt etablert og sikkert kan brukes sammen med denne modellen. I konklusjonen, har vi vist en billig, enkel, lett repliserbar NEVLP modellen med rotter. Anvendelser av denne modellen kan inkludere testing romanen perfusates og perfusate tilsetningsstoffer, testing programvare designet for orgel evaluering og eksperimenter designet for å reparere organer.
Introduction
Det er 14,578 pasienter på venteliste for levertransplantasjon ca 7000 transplantasjon er utført per år1,2. Svar på dette betydelig donor mangel, har kriteriene for leveren givere utvidet; disse er ofte referert til som marginale organer eller utvidet kriterier givere og forventes å utføre mindre godt etter transplantasjon enn standardkriteriene allografts, med høyere priser på primære pode dysfunksjon og forsinket pode funksjonen3, 4,5,6. Resultatet har NEVLP blitt introdusert som en metode for å vurdere og endre organ funksjon6,7. Vi har designet en rotte modell av NEVLP og brukt denne modellen til å demonstrere en viktig bruksmuligheter-testing av romanen molekyl tilsetningsstoffer til leveren perfusate.
NEVLP har blitt evaluert både i Trouble (rat) og svin modeller og forkastet organer6,8,9. Resultatene av de første menneskelige studier av NEVLP har også nylig blitt publisert10. Selv om hypothermic maskin perfusjon blitt tydelig standard for nyre bevaring, er temperaturen på hvilken lever maskin perfusjonsmåling skal skje fortsatt kontroversielt. NEVLP har mange foreslåtte fordeler i forhold til hypothermic og subnormothermic perfusjon. Disse inkluderer redusert bevaring skade, restaurering av normale organfunksjon under fysiologiske forhold, evnen å taksere orgelspill, og som en plattform for orgel reparasjon, ombygging og modifisering7,11, 12,,13,,14,,15,,16,,17.
Et betydelig antall studier er fylt med svin NEVLP modeller. Selv om disse modellene er relativt billig når vurderer modeller med forkastet organer eller kliniske studier, er de svært dyre i forhold til våre små dyr NEVLP modell. En betydelig komponent av den per forsøk er perfusate. Vi kan fullføre en 4 h perfusjon med 300 mL av perfusate til en relativt lav kostnad. I tillegg er kostnaden av liten dyrene inkludert rotter svært lav i forhold til kostnaden av griser.
I forhold til andre modeller av NEVLP i rotte, modellen presentert her er relativt enkelt å implementere og har et bredt utvalg av programmer. Perfusjon kretsen kan ses i figur 1. Perfusate starter i perfusate reservoaret (1), som er en jacketed vannbeholderen. Perfusate er trukket fra reservoaret av en berg-pumpe (2) og presset inn en windkessel (3) og oxygenator (4). Oxygenator er angitt for countercurrent gass og perfusate flyt å gi maksimal gassutveksling. Det perfusate så inntektene til en oppvarming coil (5) innsiden perfusjon kammeret å sikre at det er fysiologiske temperatur, og en boble felle (6) å hindre perfusjon luftbobler det er pre organ (7) og etter organ (8) prøve porter, slik at perfusate skal samplet. Perfusate så inn leveren gjennom portalen blodåre kanyle. Portalen blodåre kanyle er knyttet til en press skjerm som diagrammer verdiene på den samling programvaren. Perfusate deretter avslutter leveren gjennom IVC kanyle og munner press equalizer blokken (9). Endelig er perfusate trukket fra press blokken tilbake gjennom Berg-pumpe og tømmes i reservoaret. Denne modellen inkluderer kontinuerlig perfusjon til portalen blodåre og utelater pulsatile flyten hepatic arterien og dialyse brukes i noen andre modeller, hver krever en separat og ytterligere krets, men har tidligere vist seg å ikke være nødvendig9,13.
For å utforske tillegg av en romanen terapeutiske molekyl til perfusate, valgte vi enzym catalase. Catalase er en endogen ROS åtseldyr som en del av celler interne forsvarsmekanisme å dempe virkningene av ROS18. Catalase uttrykk er økt i hepatic iskemi reperfusion skade19. Eksperimentell tillegg av catalase har vist seg for å redusere ischemia-reperfusion i øyet, hjernen og lungene,20,,21,,22,,23,,24. Pegylation har vist mot catalase endotelet og hjelp i catalase opptak til endotelceller25. PEG-CAT har blitt administrert systemisk med begrenset effekt i å redusere hepatic ischemia-reperfusion skader. men hypotese vi at legge PEG-katten å en isolert organ perfusjon krets vil føre til bedre resultater26,27,28. Her legger vi PEG-CAT til våre grunnleggende perfusate og demonstrere evnen redusere leveren bevaring skade.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer ble utført i henhold til retningslinjene i den institusjonelle Animal Care og National Research Council's Guide for Human vare og bruk av laboratoriet dyr (IACUC) og har gjennomgått godkjenning av Ohio State University IACUC.
1. første oppsett
-
Forberede perfusjon løsningen ved å kombinere følgende: 86 mL av 25% albumin, 184 mL av Williams' media, 30 mL av penicillin/streptomycin (10 U/mL penicillin og 0,01 mg/mL streptomycin), insulin (50 U/L), heparin (0,01 U/mL), L-glutamin (0.292 g/L), og Hydrocortisone (0,010 g/L) til et totalt volum på 300 mL. For grunnleggende perfusate og PEG-katten gruppe, legger du til 625 U/mL av PEG-CAT.
- Bufferen perfusate løsningen bruker tris (hydroxymethyl) aminomethane (THAM) til pH 7.4. Bruke en arterial blod gass maskin for å bekrefte perfusate pH.
-
Definere kretsen (figur 1).
- Slå på vannbad varmere og sett den til 37 ° C. Tillate orgel kammeret å varme opp.
- Hell den blandet og bufret perfusate i reservoaret og begynne sirkulasjon.
Merk: Perfusate nevnt i dette trinnet ble utarbeidet i trinn 1.1.1. - Slå på oksygennivået gassen (95% oksygen og 5% karbondioksid) mot flyt gjennom den innebygde oxygenator.
- Slå på den samling programvaren og klikk "start" for å registrere for varigheten av eksperimentet.
-
Definere kirurgisk mikroskopet og operasjonsstuen (figur 2).
- Slå på alle utstyr inkludert oppvarming styret, electrocautery, og bedøvelse og vitale (hjertet og oksygen metning) overvåking.
Merk: Innstillingen mikroskop vil variere avhengig av mikroskopet brukes og kan justeres til brukerens komfort. - Fylle 10 mL anestesi sprøyten med 10 mL av flytende isoflurane til inhalasjon (molekylvekt 184.5 g/mol), og plasser i anestesi enheten.
- Plassere en 0,5 mL sprøyte av heparin (50 U), av kirurgiske instrumenter, 4-0 og 7-0 silke Sutur steril bomull vattpinner og 4 cm x 4 cm ikke-vevd gasbind svamper riktig (figur 2).
- Slå på alle utstyr inkludert oppvarming styret, electrocautery, og bedøvelse og vitale (hjertet og oksygen metning) overvåking.
- Forberede isoflurane kammeret.
2. induksjon av anestesi
- Ha følgende personlig beskyttende utstyr (PPE): kirurgiske maske, kirurgiske hansker, disponibel kappe.
- Veie rotta.
Merk: Vi bruker Sprague-Dawley rotter mellom 250-350 g. - Slå på oksygen kompressoren og isoflurane. Plasser rotte, etter som veide, i isoflurane kammeret og sikre lokket. Indusere anestesi med 6% isoflurane leveres med 2 L/min oksygen.
Merk: Den nøyaktige isoflurane dosen brukes avhenger på bestemte anestesi systemet brukes. - Bruk elektroniske avklipt for å klippe dyrets abdominal hår.
- Erstatte dyr i det isoflurane kammeret.
- Slå på anestesi enheten i operasjonssalen.
- Fjern rotta fra isoflurane kammeret når anestesi er fullt indusert. Bekreft dybden av anestesi bruker tå knipe.
3. innkjøp prosedyre
-
Forberede 16 G portalen cuff (Figur 3).
- Begynne med en 16 G angiocatheter. Skjær en 7 mm delen av slangen. Bestemme midtpunktet i delen 7 mm ved å måle 3,5 mm. Incise midt og fjerne den fremre delen av slangen.
- Bruk en hemostat til å knuse denne nå flate delen. Bruk en lettere for å smelte den andre enden av angiocatheter opprette en lip. Plasser ikke tuppen direkte i flammen, eller det vil antennes.
-
Forberede galle duct kanyle.
- Ta en 27 G angiocath og kuttet av injeksjon porten forlate bare kateter. Koble denne til en 10 cm del av 27 G cannular slangen.
- Plasser rotte med nesen sin i anestesi nesen kjegle, og dens fire ekstremiteter immobilisert. Overvåke vitale ved å feste skjermen til venstre hind enden. Utføre en tå knipe for å bekrefte riktig dybde av anestesi. Fortsette anestesi på 4% isoflurane (for dyr som veier > 250 g).
- Spray dyrets magen med 70% isopropylalkohol. La tørke. Plass en steril drapere over dyrene.
- Gjøre en midtlinjen snitt fra xiphoid på pubis ved hjelp skarp saks og utvide gjennom huden (Figur 4). Forsiktig angir peritoneum og incise muskelen. Pass på å unngå å skade blæren i det dårligere aspektet ved denne snitt og leveren i overlegen aspekt av denne snitt.
- Utvide innsnitt lateralt til venstre og høyre danner et kors på nivå med dårligere grensen i leveren.
- Slå av anestesi ned til 2% (for dyr veier > 250 g).
- Trekke xiphoid prosessen ved hjelp av en buet mygg klemme og ribbeina med vrbord retractors (figur 5).
- Kutte falciform, phrenic, og gastrohepatic leddbånd med skarp saks.
- Finn og tie-off phrenic åre med en 7-0 Sutur som nær sin opprinnelse som mulig å hindre lekker.
- Eviscerate rotta bruker en steril fuktet bomull tips applikator og pakk tarm i gasbind fuktet 0,9% normal saline. Ta vare ikke for å strekke blodkar i tynntarmen.
- Dissekere over den underlegne vena cava (IVC) for å fjerne overflødig vev. Dissekere bak IVC bare overlegen bifurkasjonen og passerer en løkke av en 4-0 silke Sutur for senere bruk (figur 6).
- Trekke høyre nyrene å gi eksponering til høyre adrenal venen. Trekke høyre flik av leveren overlegent med gasbind. Tie av rett adrenal venen med en 7-0 silke Sutur så nær IVC som mulig og cauterize over den distale til fortøyning (figur 7).
- Nøye analysere ut splenic åre, binde den av med to 7-0 silke suturer og kutt over den mellom to bildet.
- Tie av og ligate flere vener med 7-0 silke Sutur for ekstra lengde i portalen blodåre, hvis nødvendig.
Merk: Det er noen ganger små greiner av infrahepatic IVC mellom høyre adrenal venen og mindreverdig leveren. - Dissekere rundt arteria gastroduodenale tie av arteria gastroduodenale med en 7-0 silke Sutur og ligate arteria gastroduodenale.
- Dissekere rundt hepatic arterien og Plasser en 7-0 silke Sutur slips rundt det (Figur 8).
-
Dissekere ut galle duct.
- Kontrollere lengden på gallekanalen. Tie av galle duct på den klubbeformede enden med en 7-0 silke Sutur. Plass en løkke av en 7-0 silke Sutur rundt galle duct så proximally som mulig.
- Skjære hull som er halvparten så stor diameter av kanalens med liten saks og Plasser et 27 G kateter i gallekanalen proximally. Binde kateter i stedet bruker en romersk sandal slips Sutur (figur 9).
- Injisere 0,5 mL av heparin (50 U) i penile blodåre eller IVC av dyret bruker en 27 G nål.
Merk: 27 G insulinsprøyte kan også brukes i stedet. - Klemme og knytte av IVC ved hjelp av den tidligere plasseres 4-0 silke Sutur.
- Tie av hepatic arterien ved hjelp av den tidligere plasseres 7-0 silke Sutur.
- Klemme av portalen blodåre bruke en Mikrokirurgiske utklippet. Cannulate portalen blodåre bruker en 22 G angiocatheter. Flush blanches portalen blodåre med 60 mL kaldt 0,9% normal saline med 1 mL heparin (100 U) til leveren (Figur 10).
Merk: Hvis leveren ikke blanch umiddelbart kan det bli massert med steril bomull tips påføring. - Utsett suprahepatic IVC og kutt over den så høy i brystet som mulig.
- Utføre en hepatectomy slik. Klippe rundt membranen, kuttet hepatic arterien, kuttet IVC, kuttet portalen blodåre, kutte noen ekstra leddbånd, og ta leveren. Plass leveren i isen kalde 0,9% normal saline (Figur 11).
- Plass en 16 G vaskulær mansjett i portalen blodåre (Figur 12). Plass leveren på ex vivo normothermic lever perfusjon krets.
4. Ex Vivo Normothermic lever perfusjon
Merk: Perfusate her er utarbeidet i protokollen trinn 1.1.1.
- Plass portalen blodåre kanyle i håndjern portalen blodåre (figur 13).
- I portalen blodåre kanyle plasseringen, opprettholde flyten av perfusate gjennom kretsen på 2 mL/min for å starte. Se skjermen alle toppene i portalen blodåre press; Dette kan indikere fartøyet har blitt okkludert og omplassering av kanyle er nødvendig.
- Sutur i IVC kanyle avkastningen renner perfusate med en 7-0 silke Sutur.
- Når begge cannulas er på plass, kan du begynne å snu flyten på 1 mL/min til fysiologiske presset mellom 10-16 cmH2O er nådd.
-
Ta en 1 mL prøve fra før og etter porter på 0, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210 og 240 minutter av perfusjon. Del 1 mL prøven i to 0,5 mL prøvene.
Merk: 0,5 mL av dette vil bli brukt i protokollen trinn 4.5.1 og 0,5 mL brukes i protokollen trinn 4.5.2.- Fest fryse 0,5 mL av dette eksemplet i Kryogenisk rør i flytende nitrogen.
- Kjøre en arterial blod gass analyse med de resterende 0,5 mL av perfusate.
- Etter å ha kjørt blod gass analyse på hvert tidspunkt (0, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210 og 240 minutter) undersøke pH-verdier og buffer i perfusate for å gå tilbake til pH 7.4.
- Ved avslutningen av 4 h av perfusjon, koble leveren fra perfusjon krets. Del leveren i 0,5 g segmenter. Fest fryse leveren vev i Kryogenisk rør i flytende nitrogen.
5. etter eksperiment analyse
-
Bestemme alanin aminotransferase (ALT) nivå i perfusate på 0, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210 og 240 minutter med en kommersiell kolorimetrisk analyse kit.
- I korte trekk ruge perfusate med reaksjonen blanding reagensene ved 37 ° C i 60 min. mål optisk densitet verdier på 570 nm likner en microplate.
-
Homogenize 0,5 g av leveren vev med 100 µL av lyseringsbuffer og analysere vevet lysate for adenosin trifosfat (ATP), glutathione (GSH) og malondialdehyde (MDA).
- I korthet, måle ATP nivåene av leveren vev eksemplene bruker en kommersiell analyse kit. Bland prøven med reaksjon bufferen og ruge ved romtemperatur for 30 min. mål optisk densitet ved 570 nm likner en microplate.
- Måle GSH nivåene av leveren vev eksemplene bruker en kommersiell analyse kit. Bland vevsprøver med analysen cocktail. Måle de optisk densitet ved 405-414 nm.
- Måle MDA nivåene av leveren vev eksemplene bruker en kommersiell analyse kit. Bland prøvene med TBA og varme til 95 ° C for 60 min. sentrifuge reactant og overføre nedbryting til en 96-brønns plate. Måle optisk densitet ved 532 nm.
-
Homogenize 0,5 g av leveren vev med 100 µL av lyseringsbuffer og analysere vevet lysate relativ caspase-3/7 aktivitet ved hjelp av en kommersiell analyse kit.
- Bland vevet lysate med caspase-3-7 reagens analysebuffer og ruge ved romtemperatur for 30 min.
- Måle fluorescens nivået i hver brønn ved å en microplate leser.
-
Bestemme nivået av apoptotisk celler i leveren vev eksemplene bruker en kommersiell i situ død oppdagelsen-utstyr.
- Pre-spandere 0,5 g vev seksjoner med 10 U/mL proteinasen K i 10 min og deretter ruge med reaksjonsblandingen ved 37 ° C i 60 min. utføre analyse med fluorescerende mikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En utvalgsstørrelsen av tre rotter per gruppe ble brukt. ALT ble målt på 0, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210 og 240 minutter av perfusjon. Vi brukte Student t-tester til å sammenligne resultater mellom base perfusate og base perfusate pluss PEG-CAT grupper på hvert tidspunkt. Sammenligne base perfusate og base perfusate pluss PEG-CAT grupper, det er betydelig mindre (p < 0,05) ALT i base perfusate pluss PEG-CAT gruppe på 150, 180, 210 og 240 minutter (figur 14A).
Leveren vev ble anskaffet for å analysere vevsskade fra både base perfusate og base perfusate pluss PEG-CAT grupper. Vi brukte Student t-tester til å sammenligne resultater mellom base perfusate og base perfusate pluss PEG-CAT grupper. Vev ATP ble opprettholdt i base perfusate pluss PEG-katten gruppe i forhold til gruppen base perfusate alene (figur 14B, p < 0,05). Vev MDA produksjon var signifikant høyere i gruppen base perfusate enn i base perfusate pluss PEG-CAT gruppe (figur 14C, p < 0,05). Totalt GSH ble opprettholdt i base perfusate pluss PEG-katten gruppe i forhold til gruppen base perfusate alene (figur 14D, p < 0,05).
Analysere apoptose, var leveren vev caspase 3/7 aktivitet forhold mellom gruppene. Fluorescens ble målt i hver brønn. Vi brukte Student t-tester til å sammenligne resultater mellom base perfusate og base perfusate pluss PEG-CAT grupper. Caspase 3/7 aktivitet ble betydelig redusert i base perfusate pluss PEG-katten gruppe i forhold til gruppen base perfusate alene (figur 15A, p < 0,05). Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) dUTP Nick-End merking (tunnel) flekker ble brukt til å sammenligne apoptose mellom gruppene. Prosentandelen av apoptotisk celler var mindre i base perfusate pluss PEG-katten gruppe i forhold til base perfusate alene gruppe (figur 15B, p < 0,05).
Figur 1: perfusjon krets. Komponenter av kretsen er merket. Perfusate starter i perfusate reservoaret (1), som er en jacketed vannbeholderen. Perfusate er trukket fra reservoaret av en berg-pumpe (2) og presset inn en windkessel (3) og oxygenator (4). Oxygenator er angitt for countercurrent gass og perfusate flyt å gi maksimal gassutveksling. Perfusate deretter fortsetter å en oppvarming coil (5) inne i perfusjon kammeret slik det er på fysiologiske temperatur og en boble felle (6) å hindre perfusjon luftbobler. Pre organ (7) og etter organ (8) prøve porter, slik at perfusate skal tas prøver. Perfusate så inn leveren gjennom portalen blodåre kanyle. Portalen blodåre kanyle er knyttet til en press monitor, som regulerer trykket equalizer (9). Endelig er perfusate trukket fra press blokken tilbake gjennom Berg-pumpe og tømmes i reservoaret. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: operasjonsstuen og kirurgisk instrument oppsett. Kirurgisk mikroskopet (1) skal justeres til riktig høyde og forstørrelsen for brukeren. Isoflurane kan være pre-lastet inn i anestesi maskinen (2). Dyrets nese plasseres i nesen kjegle (3). Kirurgiske instrumenter bør legges ut der de kan være lett tilgjengelige (4). Har electrocautery (5) i nærheten er nyttig. Suturer (6) skal pre-cut så stykker kan oppnås raskt når det trengs, og ekstra bør være tilgjengelig (7). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: forberede 16 G portalen blodåre mansjetten. Begynne med en 16 G angiocatheter. Skjær en 7 mm delen av slangen. Bestemme midtpunktet i delen 7 mm ved å måle 3,5 mm. Incise her og fjerne den fremre delen av slangen. Bruk en hemostat til å knuse denne nå flate delen. Bruk en lettere for å brannsår den andre enden av angiocatheter opprette en lip. Plasser ikke tuppen direkte i flammen, eller det vil antennes. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: midtlinjen snitt. Gjøre en midtlinjen snitt fra xiphoid (1) å pubis (2) bruk skarp saks og utvide gjennom huden og muskel. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: få tilstrekkelig retraksjon. Trekke xiphoid prosessen (1) bruker en buet mygg klemme (2) og vrborden ved å plassere vrbord retractors (3, 4). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: dårligere vena cava (IVC) disseksjon. Vend lever opp til utsett høyre nyrene (1) og portalen blodåre (2). Dissekere rundt IVC (3), og Plasser en løkke av 7-0 Sutur for fremtidig bruk. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7: Ligation av rett adrenal venen. Trekke tilbake rett nyrene (1) å gi eksponering til høyre adrenal venen. Tie av rett adrenal venen og kutt over den. En fuktet gasbind (2) kan brukes til å beskytte leveren under denne manøveren. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 8: Hepatic arterien disseksjon. Dissekere rundt og Plasser et slips rundt hepatic arterien (1) i nærheten der det går under portalen blodåre (2). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 9: galle duct cannulation. Cannulate gallekanalen (1) bruke den 27 G angiocatheter (2) koblet til 27 G slangen (3). Dette vil bidra til å samle galle i perfusjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 10: leveren flush. Tømme leveren (1) med 60 kopi av kaldt 0,9% normal saline med 100 U (1 mL) av heparin bruker en 16 G angiocatheter (2). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 11: etter hepatectomy. Utføre en hepatectomy og plasser leveren i kalde saltvann. Ta vare ikke for å dislodge galle duct kanyle. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 12: portalen blodåre cuffing. Finn portalen blodåre. Bruk en stor klemme (1) til å holde opp venen forlate en flere millimeter leppe av venen over klemmen. Bruke Mikrokirurgiske tang (2, 3) til å plassere en 16 G vaskulær mansjett (4) i portalen blodåre. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 13: portalen blodåre mansjett og overlegen IVC cannulation. Cannulate portalen blodåre cuff (1) og overlegen IVC (2). Stor forsiktighet må tas ikke å løsne galle duct kanyle (3). I tillegg ta vare ikke for å vri den overlegne IVC. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 14: analyse av vevsskade i base bare perfusate og base perfusate og pluss PEG-CAT grupper (N = 3/gruppe). Feilfelt representerer standardavvik. (A) alanin aminotransferase (ALT) nivåer. Sammenligne ALT nivåer mellom base perfusate og base perfusate pluss pegylert-catalase (PEG-CAT) gruppe, det er betydelig mindre ALT i base perfusate pluss PEG-CAT gruppe på 150, 180, 210 og 240 minutter (p < 0,05). (B) adenosin trifosfat nivåer. Vev Adenosintrifosfat (ATP) ble opprettholdt i base perfusate pluss PEG-katten gruppe i forhold til base perfusate alene gruppen (p <0,05). (C) Malondialdehyde nivåer. Vev malondialdehyde (MDA) produksjon var signifikant høyere i gruppen base perfusate enn i base perfusate pluss PEG-CAT gruppe (p < 0,05). (D) glutation nivåer. Totalt glutathione (GSH) ble opprettholdt i base perfusate pluss PEG-katten gruppe i forhold til gruppen base perfusate alene (p < 0,05). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 15: analyse av apoptose i base bare perfusate og base perfusate og pluss PEG-CAT grupper (N = 3/gruppe). Feilfelt representerer standardavvik. (A) Caspase-3/7 Activity.Caspase 3/7 aktivitet ble betydelig redusert i base perfusate pluss PEG-katten gruppe i forhold til gruppen base perfusate alene (p < 0,05). (B) Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) dUTP Nick-End merking (tunnel) flekker. Bildene ble tatt med en 4 X fluorescerende mikroskop. Prosentandelen av apoptotisk celler var mindre i base perfusate pluss PEG-katten gruppe i forhold til base perfusate (p < 0,05). Grønn: apoptotisk celler. Blå: kjernefysiske. Skalere barer = 1000 µm. tunnel positiv celler kvantifisert ved å telle celler fra 4 tilfeldige mikroskopiske felt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det er en betydelig mangel på leveren allografts tilgjengelig for transplantasjon og svar donor kriterier har vært utvidet1,2,3,4,5. Som følge av donor mangel, har NEVLP blitt introdusert som en metode for å vurdere og endre organ funksjon6,7. Vi har utviklet en rotte modell av NEVLP. Videre har vi brukt denne modellen til å demonstrere en sin viktige bruksmuligheter-testing av romanen molekyl tilsetningsstoffer til leveren perfusate. Her vi lagt PEG-CAT til base perfusate og vist sin evne til å redusere leveren bevaring skade.
Avgjørende skritt
Leveren perfusjon kretsen ble kjøpt og brukt uten endringer. Kretsen kan visualiseres i figur 1. Perfusate reservoaret brukes er en water-jacketed beholder som brukes til å holde perfusate fysiologiske temperatur. Fra reservoaret er perfusate trukket ut av en valse pumpet og presset inn i en windkessel kammer. Denne kammer bidrar til å dempe den pulsatile perfusate og gjøre det mer laminær for oppføring i orgelet. Etter windkessel chamber perfusate strømmer til oxygenator. Oxygenator er angitt for countercurrent gass og perfusate flyt gir maksimal gassutveksling til perfusate med 95% oksygen. Perfusate deretter fortsetter å en oppvarming coil slik at det er fortsatt på fysiologiske temperatur. En boble trap rett før orgelet hindrer perfusjon luftbobler. Perfusate er så pumpet ut av boblen fellen og gjennom portalen blodåre kanyle inn i leveren. Portalen blodåre kanyle har en liten avdeling av det for press skjermen. Slangen til sensoren bør være fylt med væske ikke luft så ikke noe press til sensoren. Etter oksygen orgel, perfusate renner ut av leveren gjennom dårligere blodåre kanyle til en press equalizer. Trykk equalizer blokken hindrer over pressurization av krets eller orgel. Endelig er perfusate trukket fra press blokken tilbake gjennom Berg-pumpe og tømmes i reservoaret.
Før du begynner hver perfusjon skal visuell inspeksjon av kretsen utføres for å identifisere eventuelle skader eller buildup på krets komponenter eller rør. Hvis det er en oppbygging av bakterier eller andre stoffer på krets, bør deler erstattet eller renset, hvis mulig. Deretter skal såpevann opprettholde de interne komponentene være skylles. Komponentene er blir skylt ut trykksensor og press linje skal slettes eventuelle luftbobler med deionisert vann. Også bør flyt justeres med jevne mellomrom å sikre trykket leser reagerer riktig. Hvis den trykk sensoren ikke svarer riktig, bør alle varene på linjen til sensoren sjekket og kalibreres på nytt om nødvendig. Ved starten av en er det avgjørende å kontrollere fartøyene i leveren ikke bli kinked eller vridd ved tilkobling leveren krets. Hvis dette oppstod det vises en umiddelbar press spike på skjermen i en logaritmisk trend. Den vanligste feilen er en kink i portalen blodåre med en dårlig plassert kanyle. Dette problemet kan løses ved å flytte skipet til en mer naturlig posisjon ved å trekke det litt ut og rette portalen blodåre. Press skjermen angir oppløsningen for denne problem med en nedgang i trykk og forbedret konsistens. Deretter, når du kobler portalen blodåre mansjetten til portalen blodåre kanyle fartøyet kan bli vridd gjennomfartsvei perfusjon av orgelet. Justere mansjetten og korrigere denne feilen vil resultere i en plutselig økning i portalen blodåre presset som skal deretter umiddelbart gå tilbake til en lavere trykk og nivå av på en konsekvent flyt. En kinked eller vridd IVC kan raskt bli identifisert av ingen flyt fra kanyle og en svulmende av fartøyet. Begge disse feilene i vena cava vil også resultere i en økt press, men i motsetning til portalen blodåre problemer dette presset virkar på orgel og skal løses raskt. Problemet må være løst innen 10 min eller eksperimentet bør avbrytes. En umiddelbar indikasjon for avbryter forsøket er å se klart ødem i organ innen de første 20 min.
Hvis det er en lekkasje fra leveren eller fra en av kanyle tilkoblingene vil det være viktig å overvåke perfusate nivået. Tom perfusate og pumpe luft kan være katastrofalt for eksperimentet. Når luften er pumpet inn linjene er det ikke mulig å stoppe eksperimentet og re prime rør linjene. Den eneste mulige korreksjonen er boble fellen å fange injisert luften.
Endringer og feilsøking
Når krets tømmes i oxygenator kan bli satt på linje og deretter kretsen kan være primet med perfusate. Riktig renser luften fra oxygenator kan ta et par minutter men er et viktig skritt i å sørge for en air embolism ikke genereres i en. Etter oxygenator er fullt primet med perfusate boble fellen fylles siden fange eventuelle luftbobler som gjør form. På dette punktet bør krets flyten settes til en strøm av 1 eller 2 mL/min å holde perfusate flytte til leveren er klar for cannulation.
Etter cannulating portalen blodåre og IVC i leveren, bør trykket øke og deretter flate ut. Som flyt er økt til normale fysiologiske presset skal innspilte trykket begynne å øke i en lignende gradvis måte. Når ønsket strømmen (8-16 mmHg) er oppnådd trykket bør fortsatt være nokså konstant. Vi tar sikte på et trykk på 10 mmHg og justere tilsvarende. Nødvendig flyten å nå et trykk på 10 mmHg kan variere fra orgel. Det kan være en liten lekkasje av perfusate fra orgelet, men denne perfusate kan samle og returnerte til reservoaret.
Kretsen bør rengjøres etter hver perfusjon å opprettholde kammer og reservoaret og bevare disponibel rør og porter. Alle perfusate bør fjernes fra krets. Kretsen bør tømmes umiddelbart med et minimum av 300 mL deionisert vann. Mens det deionisert vannet flushes krets slangen bør eksterne deler rengjøres riktig. Eksterne komponenter skal skylles av eller forsiktig tørkes og lov til å lufte tørr. Krets komponenter er skjøre og kan bli ødelagt lett. Derfor er av største betydning å rengjøre den forsiktig. Den indre kretsen skal lagres i en 5% løsning av alkalisk rengjøringsmiddel i deionisert vann når den ikke er i bruk. Vaskemiddel i kretsen bidrar til å forlenge levetiden til slangen og hindre buildup på andre komponenter, for eksempel boble fellen og trykk equalizer.
De fleste problemer med krets kan forebygges med grundig rengjøring og vedlikehold av kretsen etter hver bruk. Dette bidrar til å sikre det er ingen opphoping av gjenværende perfusate som kan føre til tette rør eller cannulas. Krets komponenter og rør skal inspiseres jevnlig og erstattet etter behov før bruk sørge for det er ingen forurensning eller begrensning i flyt.
Begrensninger
En begrensning av denne liten dyr NEVLP modellen er at det ikke inkluderer for øyeblikket etter perfusjon transplantasjon. Derfor er det umulig å vurdere leveren pode funksjon etter transplantasjon. Dette er et viktig område for fremtidig forskning. I tillegg krever bruker lite dyr krets både kunnskap og ferdigheter.
Betydning når det gjelder eksisterende modeller
Svin og murine (rat) modeller av hypothermic, subnormothermic og normothermic ex vivo leveren perfusjon har blitt beskrevet i litteraturen. Selv om kontrovers eksisterer fortsatt om perfusjon temperatur, har det vært vist at denne maskinen perfusjon kan forbedre funksjonen av leveren grafts uansett temperatur9. NEVLP modellen presentert her er enkel, lett repliserbar, lave kostnader, og har et bredt utvalg av programmer. Denne modellen inkluderer ikke dialyse eller pulsatile flyt til hepatic arterien, som er inkludert i noen andre modeller, som de har vist seg å være unødvendige9,13. Videre resultatene av de første menneskelige forsøkene med NEVLP har vist dette er en effektiv metode for leveren bevaring, denne modellen er derfor ideelle for tester framtidige applikasjoner ex vivo leveren perfusjon10.
Framtidige applikasjoner
En rekke fremtidige programmer for NEVLP foreslått i litteraturen. Hver av disse må testes metodisk i dyremodeller før testing kasserte organer og deretter menneskelige lever. Modellen presentert her er ideelle for å teste disse romanen framtidige applikasjoner som det er lett repliserbar, eliminerer overflødig trinn, og er lave kostnader. En av de viktigste potensielle anvendelser av denne modellen er den vist her - testing av romanen pharmacologic perfusate tilsetningsstoffer. Andre foreslåtte programmene omfatter reparasjon av skadet organer, defatting av lever å tillate transplantasjon av steatotic organer, innføring av hepatitt C virus motstand, mesenchymal stilk cellen terapi, genet modifikasjon og perfusjon med immunsuppressive agenter11,31,32,33,34,35,36,37,38.
Konklusjoner
I konklusjonen, har vi vist en billig, lett repliserbar NEVLP modellen med rotter. Bruk av denne modellen krever forsiktig forberedelse, øvelse og kunnskap, men kan gjennomføres på lavpris. Anvendelser av denne modellen kan inkludere testing romanen perfusate tilsetningsstoffer, slik det ble demonstrert i representant resultatene. Flere programmer av denne modellen kan inkludere testing programvare designet for orgel evaluering, ulike perfusates, og kunstig eller hemoglobin-baserte oksygen bærere og agenter utformet for å reparere organer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle forfatterne rapporterer at de har ingen relevante opplysninger.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av NIH T32AI 106704-01A1 og T. Flesch Fund for organtransplantasjon, perfusjon, Engineering og regenerasjon ved Ohio State University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Perfusate | |||
| 8% Albumin | CLS Behring, King of Prussia, PA | 0053-7680-32 | |
| Williams Media | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | W1878 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | P4333 | |
| Insulin | Eli Lilly, Indianapolis, IL | 0002-8215-91 | |
| Heparin | Fresnius Lab, Lake Zurich, IL | C504701 | |
| L-glutamine | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | G3126 | |
| Hydrocortisone | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | H0888 | |
| THAM | Hospira, Inc, | 0409-1593-04 | |
| Polyethylene Glycol - Catalase | Sigma Aldrich | S9549 SIGMA | |
| Personal Protective Equipment | |||
| Surgical Mask | Generic | N/A | |
| Protective Gown | Generic | N/A | |
| Surgical Gloves | Generic | N/A | |
| Liver Procurement | |||
| Sprague-Dawley Rat | Harlan Sprague Dawley Inc. | 250 -350 grams | |
| Surgical Microscope | Leica | M500-N w/ OHS | |
| Charcoal Canisters | Kent Scientific | SOMNO-2001-8 | |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | N/A | |
| Pressure-Lok Precision Analytical Syringe | Valco Instruments Co, Inc. | SOMNO-10ML | |
| Electrosurgical Unit | Macan | MV-7A | |
| Warming Pad | Braintree Scientific | HHP2 | |
| SomnoSuite Small Animal Anesthesia System | Kent Scientific | SS-MVG-Module | |
| PhysioSuite | Kent Scientific | PS-MSTAT-RT | |
| Isoflurane chamber | Kent Scientific | SOMNO-0530LG | |
| SurgiVet | Isotec | CDS 9000 Tabletop | |
| Oxygen | Praxair | 98015 | |
| Rib retractors | Kent Scientific | INS600240 | |
| GenieTouch | Kent Scientific | GenieTouch | |
| Normal Saline | Baxter | NDC 0338-0048-04 | |
| 4x4 Non-Woven Sponges | Criterion | 104-2411 | |
| Sterile Q-Tips | Henry Schein Animal Health | 1009175 | |
| U-100 27 Gauge Insulin Syringe | Terumo | 22-272328 | |
| 5mL Syringe | BD | REF 309603 | |
| 4-0 Braided Silk Suture | Deknatel, Inc. | 198737LP | |
| 7-0 Braided Silk Suture | Teleflex Medical | REF 103-S | |
| 16 gauge Catheters | BBraun Introcan Safety | 4252586-02 | |
| 14 gauge Catheters | BBraun Introcan Safety | 4251717-02 | |
| Bile Duct Cannular Tubing | Altec | 01-96-1727 | |
| Liver Perfusion Circuit Components | |||
| Water Bath Warmer | Lauda Ecoline Staredition | E103 | |
| Data Collection Software | ADInstruments | Labchart 7 | |
| Liver Perfusion Circuit | Harvard Apparatus | 73-2901 | |
| Membrane Oxygenator | Mediac SPA | M03069 | |
| Roller Pump | Ismatec | ISM827B | |
| Gas (95% oxygen and 5% carbon dioxide) | Praxair | 98015 | |
| Organ Chamber | Harvard Apparatus | ILP-2 | |
| 1.8 mL Arcticle Cryogenic Tube | USA Scientific | 1418-7410 | |
| Mucasol | Sigma-Aldrich | Z637181 | |
| Microsurgical Instruments | |||
| Small Scissors | Roboz | RS-5610 | |
| Large Scissors | S&T | SAA-15 | |
| Forceps - Large Angled | S&T | JFCL-7 | |
| Forceps - Small Angled | S&T | FRAS-15 RM-8 | |
| Clip Applier | ROBOZ | RS-5440 | |
| Scissors - non micro | FST 14958-11 | 14958-11 | |
| Forceps - Straight Tip | S&T | FRS-15 RM8TC | |
| Large Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-01 | |
| Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-01 | |
| Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-02 | |
| Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-03 | |
| Small Mosquito Clamps | Generic | N/A | |
| Post-Experiment Analysis | |||
| Alanine Aminotransferase (ALT) Activity Colorimetric/Fluorometric Assay Kit | BioVision | K752 | |
| Adenosine Triphosphate (ATP) Colorimetric/Fluorometric Assay Kit | BioVision | K354 | |
| Glutathione Assay Kit | Cayman Chemical | 703002 | |
| Lipid Peroxidation (MDA) Assay Kit | Abcam | ab118970 | |
| Caspase-Glo 3/7 Assay Systems | Promega | G8090 | |
| POLARstar OMEGA Microplate Reader | BMG LABTECH | N/A |
References
- Network, O. P. aT. National Data. Overall by Organ. Current U.S. Waiting List. Based on OPTN data as of October 19, 2017. , Available from: https://optn.transplant.hrsa.gov/data/view-data-reports/national-data/# (2017).
- OPTN, O. P. aT. N. National Data, Transplants by Donor Type, U.S. Transplants Performed January 1, 1988 - December 31, 2016, For Organ = Liver. , Available from: https://optn.transplant.hrsa.gov/data/view-data-reports/national-data/# (2017).
- Nemes, B., et al. Extended criteria donors in liver transplantation Part I: reviewing the impact of determining factors. Expert Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (7), 827-839 (2016).
- Nemes, B., et al. Extended-criteria donors in liver transplantation Part II: reviewing the impact of extended-criteria donors on the complications and outcomes of liver transplantation. Expert Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (7), 841-859 (2016).
- Pezzati, D., Ghinolfi, D., De Simone, P., Balzano, E., Filipponi, F. Strategies to optimize the use of marginal donors in liver transplantation. World J Hepatol. 7 (26), 2636-2647 (2015).
- Marecki, H., et al. Liver ex situ machine perfusion preservation: A review of the methodology and results of large animal studies and clinical trials. Liver Transpl. 23 (5), 679-695 (2017).
- Barbas, A. S., Knechtle, S. J. Expanding the Donor Pool With Normothermic Ex Vivo Liver Perfusion: The Future Is Now. Am J Transplant. 16 (11), 3075-3076 (2016).
- Dries, S., et al. Ex vivo normothermic machine perfusion and viability testing of discarded human donor livers. Am J Transplant. 13 (5), 1327-1335 (2013).
- Westerkamp, A. C., et al. End-ischemic machine perfusion reduces bile duct injury in donation after circulatory death rat donor livers independent of the machine perfusion temperature. Liver Transpl. 21 (10), 1300-1311 (2015).
- Selzner, M., et al. Normothermic ex vivo liver perfusion using steen solution as perfusate for human liver transplantation: First North American results. Liver Transpl. 22 (11), 1501-1508 (2016).
- Whitson, B. A., Black, S. M. Organ assessment and repair centers: The future of transplantation is near. World J Transplant. 4 (2), 40-42 (2014).
- Tolboom, H., et al. Subnormothermic machine perfusion at both 20°C and 30°C recovers ischemic rat livers for successful transplantation. J Surg Res. 175 (1), 149-156 (2012).
- Nagrath, D., et al. Metabolic preconditioning of donor organs: defatting fatty livers by normothermic perfusion ex vivo. Metab Eng. 11 (4-5), 274-283 (2009).
- Boehnert, M. U., et al. Normothermic acellular ex vivo liver perfusion reduces liver and bile duct injury of pig livers retrieved after cardiac death. Am J Transplant. 13 (6), 1441-1449 (2013).
- Schön, M. R., et al. Liver transplantation after organ preservation with normothermic extracorporeal perfusion. Ann Surg. 233 (1), 114-123 (2001).
- Reddy, S., et al. Non-heart-beating donor porcine livers: the adverse effect of cooling. Liver Transpl. 11 (1), 35-38 (2005).
- Banan, B., et al. Novel strategy to decrease reperfusion injuries and improve function of cold-preserved livers using normothermic ex vivo liver perfusion machine. Liver Transpl. 22 (3), 333-343 (2016).
- Held, P. An Introduction to Reactive Oxygen Species: Measurement of ROS in Cells. , BioTek Instruments, Inc. Vinooski, Vermont. 1-14 (2012).
- Chen, C. F., et al. Reperfusion liver injury-induced superoxide dismutase and catalase expressions and the protective effects of N-acetyl cysteine. Transplant Proc. 39 (4), 858-860 (2007).
- Chen, B., Tang, L. Protective effects of catalase on retinal ischemia/reperfusion injury in rats. Exp Eye Res. 93 (5), 599-606 (2011).
- He, Y. Y., Hsu, C. Y., Ezrin, A. M., Miller, M. S. Polyethylene glycol-conjugated superoxide dismutase in focal cerebral ischemia-reperfusion. Am J Physiol. 265 (1 Pt 2), H252-H256 (1993).
- Işlekel, S., Işlekel, H., Güner, G., Ozdamar, N. Alterations in superoxide dismutase, glutathione peroxidase and catalase activities in experimental cerebral ischemia-reperfusion. Res Exp Med (Berl). 199 (3), 167-176 (1999).
- Li, G., Chen, Y., Saari, J. T., Kang, Y. J. Catalase-overexpressing transgenic mouse heart is resistant to ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol. 273 (3 Pt 2), H1090-H1095 (1997).
- Nowak, K., et al. Immunotargeting of catalase to lung endothelium via anti-angiotensin-converting enzyme antibodies attenuates ischemia-reperfusion injury of the lung in vivo. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 293 (1), L162-L169 (2007).
- Beckman, J. S., et al. Superoxide dismutase and catalase conjugated to polyethylene glycol increases endothelial enzyme activity and oxidant resistance. J Biol Chem. 263 (14), 6884-6892 (1988).
- Yabe, Y., Nishikawa, M., Tamada, A., Takakura, Y., Hashida, M. Targeted delivery and improved therapeutic potential of catalase by chemical modification: combination with superoxide dismutase derivatives. J Pharmacol Exp Ther. 289 (2), 1176-1184 (1999).
- Yabe, Y., et al. Prevention of neutrophil-mediated hepatic ischemia/reperfusion injury by superoxide dismutase and catalase derivatives. J Pharmacol Exp Ther. 298 (3), 894-899 (2001).
- Ushitora, M., et al. Prevention of hepatic ischemia-reperfusion injury by pre-administration of catalase-expressing adenovirus vectors. J Control Release. 142 (3), 431-437 (2010).
- Kakizaki, Y., et al. The Effects of Short-Term Subnormothermic Perfusion after Cold Preservation on Liver Grafts from Donors after Cardiac Death: An Ex Vivo Rat Model. Transplantation. , (2018).
- Kumar, R., Chung, W. Y., Dennison, A. R., Garcea, G. Ex Vivo Porcine Organ Perfusion Models as a Suitable Platform for Translational Transplant Research. Artif Organs. , (2017).
- Nativ, N. I., et al. Liver defatting: an alternative approach to enable steatotic liver transplantation. Am J Transplant. 12 (12), 3176-3183 (2012).
- Yeung, J. C., et al. Ex vivo adenoviral vector gene delivery results in decreased vector-associated inflammation pre- and post-lung transplantation in the pig. Mol Ther. 20 (6), 1204-1211 (2012).
- Goldaracena, N., et al. Inducing Hepatitis C Virus Resistance After Pig Liver Transplantation-A Proof of Concept of Liver Graft Modification Using Warm Ex Vivo Perfusion. Am J Transplant. 17 (4), 970-978 (2017).
- Van Raemdonck, D., Neyrinck, A., Rega, F., Devos, T., Pirenne, J. Machine perfusion in organ transplantation: a tool for ex vivo graft conditioning with mesenchymal stem cells? Curr Opin Organ Transplant. 18 (1), 24-33 (2013).
- Pratschke, S., et al. Results of the TOP Study: Prospectively Randomized Multicenter Trial of an Ex Vivo Tacrolimus Rinse Before Transplantation in EDC Livers. Transplant Direct. 2 (6), e76 (2016).
- Pratschke, S., et al. Protocol TOP-Study (tacrolimus organ perfusion): a prospective randomized multicenter trial to reduce ischemia reperfusion injury in transplantation of marginal liver grafts with an ex vivo tacrolimus perfusion. Transplant Res. 2 (1), 3 (2013).
- Nativ, N. I., et al. Elevated sensitivity of macrosteatotic hepatocytes to hypoxia/reoxygenation stress is reversed by a novel defatting protocol. Liver Transpl. 20 (8), 1000-1011 (2014).
- Lonze, B. E., et al. In vitro and ex vivo delivery of short hairpin RNAs for control of hepatitis C viral transcript expression. Arch Surg. 147 (4), 384-387 (2012).
