Summary
Er is een belangrijke donor van lever tekort, en criteria voor lever donoren hebben uitgebreid. Normothermic ex vivo lever perfusie (NEVLP) is ontwikkeld om te evalueren en wijzigen van orgaanfunctie. Deze studie toont een model van de rat van NEVLP en test het vermogen van gepegyleerde-katalase, te verzachten lever behoud letsel.
Abstract
Er is een significant tekort aan lever allografts beschikbaar voor transplantatie, en naar aanleiding van de donor-criteria hebben uitgebreid. Dientengevolge, is normothermic ex vivo lever perfusie (NEVLP) ingevoerd als een methode om te evalueren en wijzigen van orgaanfunctie. NEVLP heeft vele voordelen in vergelijking met hypothermic en behoud schade, herstel van de normale orgaanfunctie onder fysiologische omstandigheden, evaluatie van de prestaties van het orgel, en als een platform voor orgel reparatie subnormothermic perfusie inclusief verlaagd , remodelleren, en wijziging. Zowel varkens als lymfkliertest NEVLP modellen zijn beschreven. We tonen een rat model van NEVLP en dit model gebruiken een van de belangrijke toepassingen — het gebruik van een therapeutische molecuul aan lever perfusaat toegevoegd. Katalase is een endogene reactieve zuurstof soorten (ROS) scavenger en heeft aangetoond dat verlagen van ischemie-reperfusie in de ogen, hersenen en longen. Pegylation heeft aangetoond dat target katalase aan het endotheel. Hier, we gepegyleerde-katalase (PEG-kat) toegevoegd aan de basis perfusaat en zijn capaciteit te verminderen lever behoud schade aangetoond. Een voordeel van ons knaagdier NEVLP model is dat het is goedkoop in vergelijking met grotere diermodellen. Een beperking van deze studie is dat het op dit moment niet na perfusie levertransplantatie omvat. Daarom niet de voorspelling van de functie van de na orgaantransplantatie met zekerheid worden gemaakt. Echter de rat levertransplantatie model is reeds lang gevestigd en zeker kan worden gebruikt in combinatie met dit model. Kortom, laten wij een goedkoop, eenvoudig, gemakkelijk repliceerbaar NEVLP model met behulp van ratten. Toepassingen van dit model kunnen opnemen testen roman perfusates en perfusaat additieven, testen software ontworpen voor orgel evaluatie en experimenten ontworpen om te herstellen van de organen.
Introduction
Er zijn 14,578 patiënten op de wachtlijst voor levertransplantatie en ongeveer 7.000 transplantaties worden uitgevoerd per jaar1,2. In antwoord op dit belangrijke donor tekort, hebben de criteria voor donors van de lever uitgebreid; deze worden vaak aangeduid als marginale organen of uitgebreide criteria donoren en moeten presteren minder goed na de transplantatie dan standaardcriteria allografts, met hogere tarieven van primaire graft dysfunctie en vertraagde graft functie3, 4,5,6. Dientengevolge, is NEVLP ingevoerd als een methode om te evalueren en wijzigen van orgel functie6,7. Wij hebben ontworpen een rat model van NEVLP en dit model gebruikt om aan te tonen een van zijn belangrijke potentiële toepassingen-het testen van nieuwe molecuul toevoegingsmiddelen lever perfusaat.
NEVLP is beoordeeld in zowel RattenUitrustingen (rat) en varkens modellen, alsmede in afgedankte menselijke organen6,8,9. De resultaten van de eerste menselijke proeven van NEVLP zijn ook onlangs gepubliceerd10. Hoewel hypothermic machine perfusie duidelijk dat de standaard voor het behoud van de nier geworden is, is de temperatuur bij welke lever machine perfusie plaatsvindt nog steeds omstreden. NEVLP heeft veel voorgestelde voordelen in vergelijking met hypothermic en subnormothermic perfusie. Hierbij verminderde behoud schade, herstel van de normale orgaanfunctie onder fysiologische omstandigheden, de mogelijkheid om te beoordelen van de prestaties van het orgel, en als een platform voor orgel reparatie, verbouwing en wijziging7,11, 12,13,14,15,16,17.
Een aanzienlijk aantal studies hebben voltooid met behulp van varkens NEVLP modellen. Hoewel deze modellen relatief goedkope zijn wanneer overweegt modellen met behulp van menselijke organen of menselijke klinische proeven verwijderd, zijn ze erg duur in vergelijking met onze kleine diermodel NEVLP. Een belangrijk onderdeel van de per experiment kosten is het perfusaat. Wij zijn in staat om te voltooien een 4 h perfusie met 300 mL van perfusaat tegen een relatief lage prijs. Bovendien, is de kosten van kleine dieren, met inbegrip van ratten erg laag in vergelijking met de kosten van varkens.
In vergelijking met andere modellen van NEVLP bij de rat, de hier gepresenteerde model is relatief eenvoudig te implementeren en heeft een breed scala aan toepassingen. Het perfusie-circuit kan worden gezien in Figuur 1. Het perfusaat begint in het perfusaat reservoir (1), die een dubbelwandige container van het water is. Perfusaat is die door een roller pomp (2) uit het reservoir wordt getrokken en geduwd in een windkessel (3), waarna de oxygenator (4). De oxygenator ligt voor Tegenstroominstallatie gas en stroom perfusaat bieden maximale Gaswisseling. Het perfusaat dan de opbrengst aan verwarming een coil (5) binnen de perfusie-zaal te bewerkstelligen is bij fysiologische temperatuur, en een waterventiel (6) om te voorkomen dat perfusie van luchtbellen er zijn pre-orgel (7) en na orgel (8) monster poorten, waardoor het perfusaat te zijn bemonsterd. Het perfusaat invoert dan de lever via de portal vein canule. De portal vein canule is aangesloten aan de monitor van een druk die grafieken van de waarden op de software van de verzameling van de gegevens. Het perfusaat vervolgens sluit u de lever via de canule IVC en mondt uit in de druk equalizer blok (9). Tot slot, is het perfusaat getrokken uit het blok druk terug door de roller pomp en geleegd in het reservoir. Dit model omvat continue perfusie aan de portal-ader en laat de Pulsatiele stroom aan de hepatische slagader en dialyse gebruikt in sommige andere modellen, die elk een afzonderlijke en aanvullende circuit vereist, maar hebben eerder aangetoond dat geen vereiste9,13.
De toevoeging van een nieuwe therapeutische molecuul aan het perfusaat verkennen, kozen we voor het enzym katalase. Katalase is een endogene ROS straatveger, die deel uitmaakt van de interne afweermechanisme van cellen om de effecten van ROS18te verminderen. Katalase expressie wordt verhoogd van hepatische ischemie-reperfusie letsel19. Experimentele toevoeging van katalase heeft aangetoond dat verlagen van ischemie-reperfusie in de ogen, hersenen en longen20,21,22,23,24. Pegylation heeft aangetoond dat target katalase op het endotheel en de steun bij katalase opname in de endotheliale cellen25. PEG-CAT is systemisch toegediend met beperkte doeltreffendheid bij het verminderen van hepatische ischemie-reperfusie letsel; echter veronderstelde we dat het toevoegen van DAT PEG-CAT aan een geïsoleerde orgel perfusie circuit zou leiden tot betere26,27,28 resultaten. Hier, we PEG-CAT toevoegen aan onze basis perfusaat en laten zien dat haar lever behoud schade beperken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van de institutionele Animal Care en National Research Council's gids voor de Humane zorg en gebruik van laboratorium dieren (IACUC) en goedkeuring door de Commissie van de Ohio State University IACUC heeft ondergaan.
1. initiële Set-up
-
Bereid de perfusie-oplossing door het combineren van het volgende: 86 mL 25% albumine, 184 milliliters Williams' media, 30 mL penicilline/streptomycine (10 U/mL penicilline en 0,01 mg/mL streptomycine), insuline (50 U/L), heparine (0.01 U/mL), L-glutamine (0.292 g/L), en Hydrocortison (0,010 g/L) tot een totaal volume van 300 mL. Voeg voor de basis perfusaat en PEG-CAT groep, 625 U/mL PEG-CAT.
- Buffer het perfusaat oplossing met behulp van tris (hydroxymethyl) aminomethane (THAM) op een pH van 7,4. Gebruik een arteriële bloed gas-machine om te bevestigen het perfusaat pH.
-
Instellen van het circuit (Figuur 1).
- Inschakelen van het waterbad warmer en zet deze op 37 ° C. Laat het orgel kamer om op te warmen.
- Giet de gemengde en gebufferde perfusaat in het reservoir en start verkeer.
Opmerking: Het perfusaat vermeld in deze stap werd voorbereid in stap 1.1.1. - De zuurstofverrijkende gas (95% zuurstof en 5% koolstofdioxide) naar de balie van de stroom door middel van de in-line oxygenator inschakelen.
- Schakel de software van de verzameling van de gegevens en klik op "start" om op te nemen voor de duur van het experiment.
-
Instellen van de chirurgische Microscoop en de operatiekamer (Figuur 2).
- Alle apparatuur, met inbegrip van de opwarming van de aarde bestuur, elektrocauterisatie, en de anesthesie en de vitale functies (hart tarief en zuurstof saturatie) bewakingstoestellen inschakelen.
Opmerking: De instellingen van de Microscoop zal variëren op basis van de Microscoop gebruikt en kunnen worden aangepast aan het comfort van de gebruiker. - Vul de spuit van 10 mL anesthesie met 10 mL vloeibare Isofluraan voor inhalatie (moleculair gewicht 184,5 g/mol) en plaats in de anesthesie-eenheid.
- Positie van een 0,5 mL spuit van heparine (50 U), de chirurgische instrumenten, 4-0 en 7-0 silk hechtdraad, steriel katoenen wissers en 4 x 4 cm niet-geweven gaas sponzen adequaat (Figuur 2).
- Alle apparatuur, met inbegrip van de opwarming van de aarde bestuur, elektrocauterisatie, en de anesthesie en de vitale functies (hart tarief en zuurstof saturatie) bewakingstoestellen inschakelen.
- Bereiden de Isofluraan kamer.
2. de inductie van de anesthesie
- De volgende persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) dragen: chirurgische masker, chirurgische handschoenen, wegwerp toga.
- Weeg de rat.
Opmerking: We gebruiken Sprague-Dawley ratten tussen 250-350 g. - Schakel de compressor van de zuurstof en Isofluraan. Plaats de rat, na wordt gewogen, in de bedwelmingsruimte Isofluraan en beveiligen van de deksel. Induceren anesthesie met 6% Isofluraan geleverd met 2 L/min voor zuurstof.
Opmerking: De exacte Isofluraan dosis gebruikt zal afhangen van de specifieke anesthesie-systeem wordt gebruikt. - Gebruik elektronische clippers clip van het dier buikhaar.
- Vervang het dier in de zaal Isofluraan.
- Schakel de eenheid van de verdoving in de operatiekamer gelegen.
- Verwijder de rat uit de zaal Isofluraan wanneer verdoving wordt volledig geïnduceerd. Bevestig de diepte van de verdoving met een snuifje van de teen.
3. de aanbestedingsprocedure
-
Bereiden de 16 G portal manchet (Figuur 3).
- Beginnen met een 16 G angiocatheter. Snijd een sectie 7 mm buis. Het middelpunt van de 7 mm sectie bepalen door het meten van 3,5 mm. Incise op het middelpunt en verwijder de voorste helft van de buis.
- Gebruik een hemostat om te verpletteren dit nu platte gedeelte. Gebruik een lichter te smelten van het andere uiteinde van de angiocatheter maken een lip. Plaats het uiteinde niet rechtstreeks in de vlam of het zal ontbranden.
-
De gal duct canule voor te bereiden.
- Neem een 27 G angiocath en afgesneden van de poort van de injectie verlaten alleen de katheter. Sluit deze aan op een deel van de 10 cm van de cannular 27 G-buis.
- Positie de rat met zijn neus in de neus van de verdoving, en zijn vier ledematen geïmmobiliseerd. De vitale tekenen door de monitor aansluiten op de linker hind extremiteit volgen. Het uitvoeren van een teen snuifje ter bevestiging van de juiste diepte van anesthesie. Anesthesie bij 4% Isofluraan blijven (voor dieren die wegen > 250 g).
- Spray de buik van het dier met 70% isopropyl alcohol. Laten drogen. Plaats een steriele draperen over het dier.
- Maak een middellijn insnijding van de xiphoid aan het schaambeen, met behulp van scherpe schaar en uit te breiden via de huid (Figuur 4). Zacht Voer het buikvlies en incise van de spier. Zorg om te voorkomen beschadiging van de blaas in de inferieure aspect van deze incisie en de lever in het superieure aspect van deze insnijding.
- Uitbreiden van de incisie zijwaarts naar links en rechts om te vormen van een kruis op het niveau van de inferieure grens van de lever.
- Draai de narcose tot 2% (voor dieren met een gewicht > 250 g).
- Intrekken van de xiphoid proces met behulp van een gebogen mosquito klem en de ribben met behulp van rib OPROLMECHANISMEN (Figuur 5).
- Snijd het ligamentum, phrenic, en de hepatogastrische ligamenten met een scherpe schaar.
- Zoek en tie-off de phrenic ader met een 7-0 hechtdraad als dicht bij haar oorsprong mogelijk te zijn om te voorkomen dat lekkende.
- Verwijderen van de ingewanden de rat met behulp van een steriele bevochtigd katoen-tip applicator en wikkel de darm in gaas bevochtigd met 0,9% normale zout. Wees voorzichtig niet te rekken van de therapieën van de kleine darm.
- Ontleden over de vena cava (IVC) te verwijderen van de overtollige weefsel, inferior. Achter het IVC gewoon superieur aan de bifurcatie ontleden en doorgeven van een lus van een 4-0 zijde hechtdraad voor later gebruik (Figuur 6).
- De rechter nier om blootstelling aan de juiste bijnier ader worden ingetrokken. Intrekken van de juiste kwab van de lever superiorly met gaas. Tie uit de juiste bijnier ader met een 7-0 zijde hechtdraad zo dicht mogelijk bij de IVC mogelijk en uitbranden overheen distale tot het gelijkspel (Figuur 7).
- Zorgvuldig uit de milt ader ontleden, bind het af met behulp van twee 7-0 zijde hechtingen en dwars door het tussen de twee hechtingen.
- Tie uitgeschakeld en afbinden extra aders met 7-0 zijde Sutuur (geologie) voor extra lengte op de portal-ader, indien nodig.
Opmerking: Er zijn soms kleine takken van de infrahepatic IVC tussen de rechts bijnier ader en de inferieure lever. - Ontleden rond de slagader gastroduodenal gelijkspel uit de slagader van de gastroduodenal met een 7-0 zijde hechtdraad en afbinden van de slagader van de gastroduodenal.
- Ontleden rond de hepatische slagader en plaats dan een 7-0 zijde hechtdraad gelijkspel eromheen (Figuur 8).
-
Ontleden uit de koker van de gal.
- Controleer de lengte van de buis van de gal. Gelijkspel uit de koker van de gal aan het distale einde met behulp van een 7-0 zijde hechtdraad. Plaats een lus van een 7-0 zijde hechtdraad rond de gal-buis zo proximally mogelijk.
- Een gat dat is de helft van de diameter van de buis met een kleine schaar en plaats een 27 G katheter in de gal buis proximally. Bind de katheter op zijn plaats met behulp van een Romeinse sandaal stropdas hechtdraad (Figuur 9).
- Injecteren van 0,5 mL van heparine (50 U) in de penile ader of IVC van het dier met een 27 G naald.
Opmerking: Een 27 G insuline spuit kan ook worden gebruikt in plaats daarvan. - Klem en stropdas uit het IVC met behulp van de eerder geplaatste 4-0 zijde hechtdraad.
- Gelijkspel uit de hepatische slagader met behulp van de eerder geplaatste 7-0 zijde hechtdraad.
- Klem uit de ader van de portal met behulp van een microchirurgische clip. Cannulate de portal ader met een angiocatheter van 22 G. De ader portal met 60 mL koude 0,9% normale zout met 1 mL heparine (100 U) tot de lever blanches flush (Figuur 10).
Opmerking: Als de lever doet niet onmiddellijk blanch kan het worden gemasseerd met steriele katoen-tip applicator. - De suprahepatic IVC bloot en dwars door het zo hoog in de borst mogelijk.
- Uitvoeren van een hepatectomy als volgt. Gesneden rond het middenrif, snijden de hepatische slagader, gesneden van het IVC, de portal vein knippen, snijden van alle extra ligamenten en nemen de lever. Plaats de lever in ijs koud 0,9% normale zout (Figuur 11).
- Plaats een 16 G vasculaire manchet in de portal vein (Figuur 12). Plaats de lever op het ex vivo normothermic lever perfusie circuit.
4. Ex Vivo Normothermic lever perfusie
Opmerking: Het perfusaat hier gebruikt in protocol stap 1.1.1 opgesteld.
- Plaats de canule portal vein in de radialis portal vein (Figuur 13).
- Tijdens de stage portal vein canule handhaven stroom van het perfusaat via het circuit op 2 mL/min om te beginnen. Bekijk de monitor voor eventuele pieken in de portal veneuze druk; Dit kan duiden op het vaartuig heeft worden geroteerd en herpositionering van de canule is nodig.
- Sutuur (geologie) in het IVC canule voor de teruggaande stroom van het perfusaat met behulp van een 7-0 zijde hechtdraad.
- Zodra beide cannulas zijn, beginnen met draaien van de stroom op 1 mL/min tot een fysiologische druk in de range van 10 – 16 cmH2O is bereikt.
-
Neem een 1 mL monster uit pre en post havens aan 0, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210 en 240 min van perfusie. Verdeel het 1 mL monster in twee monsters van 0,5 mL.
Opmerking: 0,5 mL van deze zal worden gebruikt in protocol stap 4.5.1, en 0,5 mL zal worden gebruikt in protocol stap 4.5.2.- Module bevriezen 0,5 mL van dit monster in cryogene buizen in vloeibare stikstof.
- Voer een arteriële bloed gas-analyse met behulp van de resterende 0,5 mL perfusaat.
- Na het uitvoeren van het bloed gas-analyse op elk tijdstip (0, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210 en 240 min) de pH-niveaus te onderzoeken en op te slaan het perfusaat zo nodig om terug te keren op een pH van 7,4.
- Aan het einde van 4 h van perfusie, door de lever te verbreken door de perfusie-circuit. Verdeel de lever in 0,5 g segmenten. Module bevriezen de leverweefsel in cryogene buizen in vloeibare stikstof.
5. na experiment analyse
-
Alanine aminotransferase (ALT) niveau in het perfusaat op 0, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210 en 240 min met behulp van een commerciële colorimetrische assay kit bepalen.
- Kortom, Incubeer het perfusaat met de reactie mix reagentia bij 37 ° C gedurende 60 minuten maatregel de extinctie bij 570 waarden nm microplate lezer gebruikt.
-
Meng 0,5 g leverweefsel met 100 µL van lysis buffer en analyseren van het weefsel lysate voor adenosinetrifosfaat (ATP) en glutathion (GSH) malondialdehyde (MDA).
- Kortom, de ATP meten van het leverweefsel monsters met behulp van een commerciële assay kit. Meng het monster met de reactie buffer en Incubeer bij kamertemperatuur voor 30 min. maatregel de optische dichtheid bij 570 nm microplate lezer gebruikt.
- Meet de GSH-niveaus van de lever weefselsteekproeven met behulp van een commerciële assay kit. Meng de weefselsteekproeven met de assay-cocktail. Meet de extinctie waarden op 405 – 414 nm.
- De MDA meten van het leverweefsel monsters met behulp van een commerciële assay kit. Meng de monsters met TBA en warmte tot 95 ° C gedurende 60 min. Centrifuge de reactieve en het supernatant overbrengen in een 96-wells-plaat. Meten van de extinctie op 532 nm.
-
Meng 0,5 g leverweefsel met 100 µL van lysis buffer en analyseren van het weefsel lysate voor relatieve caspase-3/7 activiteit met behulp van een commerciële assay kit.
- Meng het weefsel lysate met de caspase-3-7 reagens assay buffer en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
- Meten van het niveau van de fluorescentie in elk goed met een microplate-lezer.
-
Bepaal het niveau van apoptotic cellen in de lever weefselsteekproeven met behulp van een commerciële in situ dood detectie kit.
- Pre-Treat het 0,5 g weefsel afdelingen met 10 U/mL proteïnase K gedurende 10 minuten en vervolgens met het reactiemengsel bij 37 ° C gedurende 60 minuten uitvoeren de analyse met behulp van een fluorescente microscoop uit te broeden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De grootte van een steekproef van drie ratten per groep werd gebruikt. ALT werd gemeten op 0, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210 en 240 min van perfusie. We gebruikten de Student t-test resultaten tussen de basis perfusaat en base perfusaat plus PEG-CAT groepen op elk tijdstip te vergelijken. Bij het vergelijken van de base perfusaat en base perfusaat plus PEG-CAT groepen, er is beduidend minder (p < 0.05) ALT in de basis perfusaat plus PEG-CAT groep op 150, 180, 210 en 240 min (Figuur 14 bis).
Leverweefsel werd aangekocht om te analyseren van weefselschade van zowel de basis perfusaat en base perfusaat plus PEG-CAT groepen. We gebruikten de Student t-test resultaten tussen de basis perfusaat en base perfusaat plus PEG-CAT groepen te kunnen vergelijken. Weefsel ATP werd gehandhaafd in de basis perfusaat plus PEG-CAT groep in vergelijking met de basis perfusaat alleen groep (figuur 14B, p < 0,05). Weefsel MDA productie was aanzienlijk hoger in de basis perfusaat groep dan in de basis perfusaat plus PEG-CAT groep (figuur 14C, p < 0,05). Totale GSH werd gehandhaafd in de basis perfusaat plus PEG-CAT groep in vergelijking met de basis perfusaat alleen groep (figuur 14D, p < 0,05).
Als u wilt analyseren apoptosis, werd leverweefsel caspase-3/7 activiteit vergeleken tussen de groepen. Fluorescentie werd gemeten in elk putje. We gebruikten de Student t-test resultaten tussen de basis perfusaat en base perfusaat plus PEG-CAT groepen te kunnen vergelijken. Caspase-3/7 activiteit was sterk gedaald in de basis perfusaat plus PEG-CAT groep in vergelijking met de basis perfusaat alleen groep (figuur 15A, p < 0,05). Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) dUTP Nick-End Labeling (TUNEL) kleuring werd gebruikt voor het vergelijken van apoptosis tussen de fracties. Het percentage van apoptotic cellen was aanzienlijk minder in de basis perfusaat plus PEG-CAT groep in vergelijking met basis perfusaat alleen groep (figuur 15B, p < 0,05).
Figuur 1: perfusie Circuit. Onderdelen van het circuit worden aangeduid. Het perfusaat begint in het perfusaat reservoir (1), die een dubbelwandige container van het water is. Perfusaat is die door een roller pomp (2) uit het reservoir wordt getrokken en geduwd in een windkessel (3), waarna de oxygenator (4). De oxygenator ligt voor Tegenstroominstallatie gas en stroom perfusaat bieden maximale Gaswisseling. Het perfusaat vervolgens overgaat tot een verwarming spoel (5) binnen de perfusie kamer om ervoor te zorgen het fysiologische temperatuur, en een waterventiel (6) om te voorkomen dat perfusie van luchtbellen. Er zijn pre-orgel (7) en na orgel (8) monster poorten, waardoor het perfusaat te bemonsteren. Het perfusaat invoert dan de lever via de portal vein canule. De portal vein canule is aangesloten op een monitor van de druk, die de druk equalizer (9 regelt). Tot slot, is het perfusaat getrokken uit het blok druk terug door de roller pomp en geleegd in het reservoir. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: operatiekamer en chirurgische instrument set-up. De chirurgische Microscoop (1) moet worden aangepast aan de juiste hoogte en vergroting van de gebruiker. Isofluraan kan vooraf worden geladen in de anesthesie-machine (2). De neus van het dier wordt geplaatst in de neus (3). Chirurgische instrumenten moeten worden aangelegd waar kunnen zij gemakkelijk toegankelijke (4). Elektrocauterisatie (5) in de buurt hebben is handig. Hechtingen (6) moeten voorgesneden zodat stukken kunnen snel worden verkregen wanneer nodig, en extra moet beschikbaar (7). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: voorbereiden van de 16 G portal vein manchet. Beginnen met een 16 G angiocatheter. Snijd een sectie 7 mm buis. Het middelpunt van de 7 mm sectie bepalen door het meten van 3,5 mm. Incise hier en verwijder de voorste helft van de buis. Gebruik een hemostat om te verpletteren dit nu platte gedeelte. Gebruik een lichter te branden van het andere uiteinde van de angiocatheter maken een lip. Plaats het uiteinde niet rechtstreeks in de vlam of het zal ontbranden. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: Midline insnijding. Maak een middellijn insnijding van de xiphoid (1) naar het schaambeen (2) met behulp van scherpe schaar en uit te breiden door de huid en spieren. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: het verkrijgen van voldoende retractie. Intrekken van de xiphoid process (1) het gebruikmaken van een gebogen mosquito klem (2) en de rib rib OPROLMECHANISMEN (3, 4) is gepipetteerd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6: vena cava Inferior (IVC) dissectie. Flip de lever tot bloot de rechter nier (1) en portal vein (2). Ontleden rond het IVC (3) en plaats een lus van de 7-0 hechtdraad voor toekomstig gebruik. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 7: Afbinding van de juiste bijnier ader. De rechter nier (1) om blootstelling aan de juiste bijnier ader worden ingetrokken. Gelijkspel uit de juiste bijnier ader en snijd overheen. Een bevochtigde gaas (2) kan worden gebruikt om te beschermen de lever tijdens deze manoeuvre. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 8: Hepatic slagader dissectie. Ontleden rond en plaats een band rond de hepatische slagader (1) in de buurt van waar het komt onder de portal vein (2). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 9: Gal duct cannulation. Cannulate de buis van de gal (1) met de 27 G angiocatheter (2) aangesloten op de 27 G-buis (3). Dit zal bijdragen tot het verzamelen van de gal tijdens perfusie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 10: lever-flush. Spoelen van de lever (1) met 60 cc koud 0,9% normale zoutoplossing met 100 U (1 mL) van heparine met behulp van een 16 G angiocatheter (2). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 11: na de hepatectomy. Uitvoeren van een hepatectomy en plaats de lever in een koude zoutoplossing. Wees voorzichtig niet te verjagen van de gal duct canule. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 12: Portal vein cuffing. Zoek de ader van de portal. Gebruik een grote klem (1) te houden van de ader verlaten van een aantal millimeter-lip van ader boven de klem. Het gebruik van microchirurgische pincet (2, 3) om een 16 G vasculaire manchet (4) in de ader van de portal. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 13: Portal vein manchet en superieure IVC cannulation. Cannulate de portal vein manchet (1) en superieure IVC (2). Grote zorg moet worden genomen niet te verjagen van de gal duct canule (3). Bovendien wees voorzichtig niet te Draai de superieure IVC. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 14: analyse van weefselschade in basis perfusaat-only en base perfusaat en plus PEG-CAT groepen (N = 3/groep). Foutbalken vertegenwoordigen standaarddeviatie. (A) Alanine aminotransferase (ALT) niveaus. Bij het vergelijken van ALT niveaus tussen de basis perfusaat en base perfusaat plus gepegyleerde-katalase (PEG-kat) groep, is er aanzienlijk minder ALT in de basis perfusaat plus PEG-CAT groep op 150, 180, 210 en 240 min (p < 0,05). (B) adenosinetrifosfaat niveaus. Weefsel adenosinetrifosfaat (ATP) bleef in de basis perfusaat plus PEG-CAT groep in vergelijking met de basis perfusaat alleen groep (p <0,05). (C) Malondialdehyde niveaus. Weefsel malondialdehyde (MDA) productie was aanzienlijk hoger in de basis perfusaat groep dan in de basis perfusaat plus PEG-CAT groep (p < 0,05). (D) glutathion niveaus. Totale glutathion (GSH) bleef in de basis perfusaat plus PEG-CAT groep in vergelijking met de basis perfusaat alleen groep (p < 0,05). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 15: analyse van apoptosis in basis perfusaat-only en base perfusaat en plus PEG-CAT groepen (N = 3/groep). Foutbalken vertegenwoordigen standaarddeviatie. (A) Activity.Caspase van de Caspase-3/7 3/7 activiteit was sterk gedaald in de basis perfusaat plus PEG-CAT groep in vergelijking met de basis perfusaat alleen groep (p < 0,05). (B) Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) dUTP Nick-End Labeling (TUNEL) kleuring. Beelden werden genomen met behulp van een 4 X fluorescente microscoop. Het percentage van apoptotic cellen was aanzienlijk minder in de basis perfusaat plus PEG-CAT groep in vergelijking met basis perfusaat (p < 0,05). Groen: apoptotic cellen. Blauw: nucleaire. Schaal bars = 1.000 µm. TUNEL positieve cellen werden gekwantificeerd door het tellen van cellen uit 4 willekeurige microscopische velden. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Er is een significant tekort aan lever allografts beschikbaar voor transplantatie en reactie donor criteria zijn uitgebreide1,2,3,4,5. Als gevolg van de tekort van de donor, is NEVLP ingevoerd als een methode om te evalueren en wijzigen van orgel functie6,7. Wij hebben ontworpen een rat model van NEVLP. Bovendien, we dit model hebben gebruikt om aan te tonen een van zijn belangrijke potentiële toepassingen — het testen van nieuwe molecuul toevoegingsmiddelen lever perfusaat. Hier, we PEG-CAT toegevoegd aan de basis perfusaat en zijn capaciteit te verminderen lever behoud schade aangetoond.
Kritische stappen
De lever perfusie-circuit was gekocht en gebruikt zonder wijziging. Het circuit kan worden gevisualiseerd in Figuur 1. Het perfusaat reservoir gebruikt is een water-jacketed container die is gebruikt om het perfusaat op fysiologische temperatuur. Uit het reservoir wordt perfusaat teruggetrokken door een roller gepompt en geduwd in een windkessel kamer. Hier helpt om te temperen de Pulsatiele stroom van het perfusaat en er meer laminaire voor binnenkomst op het orgel. Kamer de perfusaat stroom naar de oxygenator na de windkessel. De oxygenator is ingesteld voor Tegenstroominstallatie gas en perfusaat stroom maximale gasuitwisseling aan het perfusaat voorzien van 95% zuurstof. Het perfusaat vervolgens overgaat tot een verwarming spoel om ervoor te zorgen dat er nog steeds bij de fysiologische temperatuur. Een waterventiel vlak voordat het orgel perfusie van luchtbellen voorkomt. Het perfusaat wordt dan uit het waterventiel en via de portal vein canule gepompt in de lever. De portal vein canule heeft een kleine tak af voor de druk-monitor. De slang naar de sensor moet worden gevuld met vloeistof niet lucht, dus er geen verlies van druk op de sensor is. Na zuurstof het orgaan, het perfusaat stroomt uit de lever via de canule inferieur ader op een druk-equalizer. Het blok van de equalizer druk helpt over drukregeling van de circuit of orgel te voorkomen. Tot slot, is het perfusaat getrokken uit het blok druk terug door de roller pomp en geleegd in het reservoir.
Voordat u begint elke perfusie moet visueel onderzoek van het circuit worden uitgevoerd om welke eventuele schade of opbouw betreffende circuit onderdelen of buizen. Als er een ophoping van bacteriën of andere stoffen op het circuit, moeten onderdelen worden vervangen of schoongemaakt, indien mogelijk. Vervolgens moet de handhaving van de interne componenten schoonmaakmiddel worden gespoeld. Als de onderdelen zijn te worden gespoeld in de druksensor en drukleiding moet worden gezuiverd van alle luchtbellen met gedeïoniseerd water. Stroom moet ook worden aangepast met regelmatige tussenpozen om ervoor te zorgen dat de druk lezen is adequaat te reageren op veranderingen. Als de druksensor niet op de juiste wijze reageert, moeten alle artikelen op de regel aan de sensor worden gecontroleerd en passen indien nodig. Aan het begin van een perfusie is het van cruciaal belang om ervoor te zorgen de schepen van de lever niet worden opgerold of twisted bij het aansluiten van de lever naar het circuit. Als dit is gebeurd, er zal een onmiddellijke druk spike blijken op de monitor in een logaritmische trend. De meest voorkomende fout is een knik in de ader van de portal met een slecht gepositioneerd canule. Dit probleem kan worden opgelost door het bewegen van het vaartuig in een meer natuurlijke positie door iets uit te trekken en straighten van de ader van de portal. De druk-monitor geeft een oplossing voor dit probleem met een daling van de druk en verbeterde consistentie. Vervolgens, wanneer de portal vein manchet verbinden met de portal vein canule het vaartuig kan worden twisted belemmeren perfusie van het orgel. De manchet aan te passen en deze fout te corrigeren zal resulteren in een plotselinge piek in de portal veneuze druk die moet dan onmiddellijk terug naar een lagere druk en niveau af op een consistente stroom. Een geknikte of gedraaide IVC kan snel worden geïdentificeerd door geen stroom uit de canule en een bolling van het vaartuig. Beide van deze fouten in de vena cava zal ook leiden tot een verhoogde druk, maar in tegenstelling tot portal vein problemen deze druk wordt uitgeoefend op het orgel en snel moet worden opgelost. Dit probleem moet worden opgelost binnen 10 min of het experiment moet worden geannuleerd. Meteen een indicatie voor het annuleren van het experiment is duidelijk oedeem in het orgaan binnen de eerste 20 min te zien.
Als er een lek uit de lever of een van de verbindingen van de canule dient perfusaat reservoir niveau volgen. Running out of perfusaat en lucht pompen kunnen worden katastrofisch aan het experiment. Zodra lucht is gepompt in de regels is het niet mogelijk om te pauzeren het experiment en opnieuw prime de lijnen van de buis. De enige mogelijke correctie is voor het waterventiel te vangen van de lucht ingespoten.
Wijzigingen en probleemoplossing
Zodra het circuit wordt geleegd de oxygenator in lijn kan worden gebracht en vervolgens het circuit kan worden gevuld met perfusaat. Goed het zuiveren van lucht uit de oxygenator kan een paar minuten maar is een cruciale stap om ervoor te zorgen dat een longembolie lucht wordt niet gegenereerd in het midden van een perfusie. Nadat de oxygenator is volledig gevuld met perfusaat die het waterventiel naast moet worden gevuld vangen luchtbellen die uitmaken. Op dit punt moet de stroom circuit worden ingesteld op een stroom van 1 of 2 mL/min te houden het perfusaat bewegen totdat de lever klaar voor cannulation is.
Na cannulating de ader van de portal en het IVC van de lever, moet de druk verhogen en vervolgens niveau uit. Als stroom wordt verhoogd tot een normale fysiologische druk beginnen de opgenomen druk te verhogen op een vergelijkbare stapsgewijze manier. Zodra de gewenste stroom (8 – 16 mmHg) heeft bereikt moet de druk vrij constant blijft. Wij streven naar een druk van 10 mmHg, en de stroom dienovereenkomstig aan te passen. De vereiste stroom tot een druk van 10 mmHg kan variëren door orgel. Kan er een lichte lek van perfusaat van het orgel, maar deze perfusaat kunnen verzamelen en keerde terug naar het reservoir.
Het circuit moet worden gereinigd na elke perfusie de kamer en het reservoir te behouden en het behoud van de wegwerp buis en poorten. Alle perfusaat moet worden verwijderd van het circuit. Het circuit moet onmiddellijk worden gespoeld met een minimum van 300 mL gedeïoniseerd water. Terwijl de gedeïoniseerd water de circuit buis spoelt moeten de externe onderdelen op de juiste manier worden gereinigd. Externe componenten moeten worden gespoeld uit of voorzichtig veegde omlaag en toegestaan in de lucht droog. Circuit onderdelen zijn kwetsbaar en kunnen gemakkelijk worden beschadigd. Het is daarom van het grootste belang om het zachtjes schoon te maken. Het interne circuit moet worden bewaard in een 5%-oplossing van alkalisch wasmiddel in gedeïoniseerd water wanneer niet in gebruik. Het wasmiddel in het circuit helpt te verlengen de levensduur van de slang en het voorkomen van de opbouw op andere componenten, zoals de waterventiel en druk equalizer.
De meeste problemen met het circuit kunnen worden voorkomen met grondige reiniging en onderhoud van het circuit na elk gebruik. Dit helpt om ervoor te zorgen dat er geen opbouw van residuele perfusaat die tot verstopte buis of cannulas leiden kan. Circuit onderdelen- en buizen moeten regelmatig gecontroleerd en zo nodig vóór elk gebruik om ervoor te zorgen dat er geen besmetting of beperking in flow is vervangen.
Beperkingen
Een beperking van deze kleine diermodel NEVLP is dat het op dit moment niet na perfusie transplantatie omvat. Daarom is het onmogelijk te beoordelen lever graft functie na de transplantatie. Dit is een belangrijk gebied voor toekomstig onderzoek. Bovendien, vereist met behulp van het kleine dierlijke circuit zowel kennis en vaardigheden.
Betekenis met betrekking tot bestaande modellen
Varkens en lymfkliertest (rat) modellen van hypothermic, subnormothermic en normothermic ex vivo lever perfusie zijn beschreven in de literatuur. Hoewel controverse nog steeds met betrekking tot de temperatuur van de perfusie bestaat, is gebleken dat die machine perfusie functie van lever transplantaten ongeacht de temperatuur9kan verbeteren. Het model van de NEVLP die hier gepresenteerd is eenvoudig, gemakkelijk repliceerbaar, low-cost, en heeft een breed scala aan toepassingen. Dit model omvat geen dialyse of Pulsatiele doorstroming naar de hepatische slagader, die zijn opgenomen in sommige andere modellen, zoals ze hebben aangetoond dat geen onnodige9,,13. Bovendien, de resultaten van de eerste menselijke proeven met behulp van NEVLP hebben aangetoond dat een effectieve methode van lever behoud — daarom, dit model is ideaal voor het testen van toekomstige toepassingen van ex vivo lever perfusie10.
Toekomstige toepassingen
Een scala aan toekomstige toepassingen voor NEVLP voorgesteld in de literatuur. Elk van deze zal moeten methodisch worden getest in diermodellen vóór de test in afgedankte menselijke organen en vervolgens in menselijke levers. De hier gepresenteerde model is ideaal voor het testen van deze nieuwe toekomstige toepassingen zoals het gemakkelijk repliceerbaar is elimineert overbodige stappen en lage kosten is. Een van de belangrijkste potentiële toepassingen van dit model is aangetoond-het testen van nieuwe farmacologische perfusaat additieven. Andere voorgestelde toepassingen omvatten reparatie van beschadigde organen, ontvetting van levers om transplantatie van organen van de steatotic, invoering van hepatitis C virale weerstand, mesenchymale stamcellen therapie, genetische modificatie en perfusie met Immuunsuppressivum agenten11,31,32,33,34,35,,36,,37,38.
Conclusies
Kortom, laten wij een goedkoop, gemakkelijk repliceerbaar NEVLP model met behulp van ratten. Gebruik van dit model vereist zorgvuldige voorbereiding, praktijken en kennis, maar tegen lage kosten ten uitvoer kan worden gelegd. Toepassingen van dit model kunnen opnemen testen roman perfusaat additieven, zoals werd aangetoond in de representatieve resultaten. Extra toepassingen van dit model kunnen testen software ontworpen voor orgel evaluatie, verschillende perfusates, en kunstmatige of op basis van hemoglobine zuurstof vervoerders en agenten ter reparatie organen omvatten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle auteurs melden dat ze geen relevante informatie hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door de NIH T32AI 106704-01A1 en het T. Flesch Fonds voor orgaantransplantatie, perfusie, Engineering en regeneratie aan The Ohio State University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Perfusate | |||
| 8% Albumin | CLS Behring, King of Prussia, PA | 0053-7680-32 | |
| Williams Media | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | W1878 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | P4333 | |
| Insulin | Eli Lilly, Indianapolis, IL | 0002-8215-91 | |
| Heparin | Fresnius Lab, Lake Zurich, IL | C504701 | |
| L-glutamine | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | G3126 | |
| Hydrocortisone | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | H0888 | |
| THAM | Hospira, Inc, | 0409-1593-04 | |
| Polyethylene Glycol - Catalase | Sigma Aldrich | S9549 SIGMA | |
| Personal Protective Equipment | |||
| Surgical Mask | Generic | N/A | |
| Protective Gown | Generic | N/A | |
| Surgical Gloves | Generic | N/A | |
| Liver Procurement | |||
| Sprague-Dawley Rat | Harlan Sprague Dawley Inc. | 250 -350 grams | |
| Surgical Microscope | Leica | M500-N w/ OHS | |
| Charcoal Canisters | Kent Scientific | SOMNO-2001-8 | |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | N/A | |
| Pressure-Lok Precision Analytical Syringe | Valco Instruments Co, Inc. | SOMNO-10ML | |
| Electrosurgical Unit | Macan | MV-7A | |
| Warming Pad | Braintree Scientific | HHP2 | |
| SomnoSuite Small Animal Anesthesia System | Kent Scientific | SS-MVG-Module | |
| PhysioSuite | Kent Scientific | PS-MSTAT-RT | |
| Isoflurane chamber | Kent Scientific | SOMNO-0530LG | |
| SurgiVet | Isotec | CDS 9000 Tabletop | |
| Oxygen | Praxair | 98015 | |
| Rib retractors | Kent Scientific | INS600240 | |
| GenieTouch | Kent Scientific | GenieTouch | |
| Normal Saline | Baxter | NDC 0338-0048-04 | |
| 4x4 Non-Woven Sponges | Criterion | 104-2411 | |
| Sterile Q-Tips | Henry Schein Animal Health | 1009175 | |
| U-100 27 Gauge Insulin Syringe | Terumo | 22-272328 | |
| 5mL Syringe | BD | REF 309603 | |
| 4-0 Braided Silk Suture | Deknatel, Inc. | 198737LP | |
| 7-0 Braided Silk Suture | Teleflex Medical | REF 103-S | |
| 16 gauge Catheters | BBraun Introcan Safety | 4252586-02 | |
| 14 gauge Catheters | BBraun Introcan Safety | 4251717-02 | |
| Bile Duct Cannular Tubing | Altec | 01-96-1727 | |
| Liver Perfusion Circuit Components | |||
| Water Bath Warmer | Lauda Ecoline Staredition | E103 | |
| Data Collection Software | ADInstruments | Labchart 7 | |
| Liver Perfusion Circuit | Harvard Apparatus | 73-2901 | |
| Membrane Oxygenator | Mediac SPA | M03069 | |
| Roller Pump | Ismatec | ISM827B | |
| Gas (95% oxygen and 5% carbon dioxide) | Praxair | 98015 | |
| Organ Chamber | Harvard Apparatus | ILP-2 | |
| 1.8 mL Arcticle Cryogenic Tube | USA Scientific | 1418-7410 | |
| Mucasol | Sigma-Aldrich | Z637181 | |
| Microsurgical Instruments | |||
| Small Scissors | Roboz | RS-5610 | |
| Large Scissors | S&T | SAA-15 | |
| Forceps - Large Angled | S&T | JFCL-7 | |
| Forceps - Small Angled | S&T | FRAS-15 RM-8 | |
| Clip Applier | ROBOZ | RS-5440 | |
| Scissors - non micro | FST 14958-11 | 14958-11 | |
| Forceps - Straight Tip | S&T | FRS-15 RM8TC | |
| Large Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-01 | |
| Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-01 | |
| Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-02 | |
| Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-03 | |
| Small Mosquito Clamps | Generic | N/A | |
| Post-Experiment Analysis | |||
| Alanine Aminotransferase (ALT) Activity Colorimetric/Fluorometric Assay Kit | BioVision | K752 | |
| Adenosine Triphosphate (ATP) Colorimetric/Fluorometric Assay Kit | BioVision | K354 | |
| Glutathione Assay Kit | Cayman Chemical | 703002 | |
| Lipid Peroxidation (MDA) Assay Kit | Abcam | ab118970 | |
| Caspase-Glo 3/7 Assay Systems | Promega | G8090 | |
| POLARstar OMEGA Microplate Reader | BMG LABTECH | N/A |
References
- Network, O. P. aT. National Data. Overall by Organ. Current U.S. Waiting List. Based on OPTN data as of October 19, 2017. , Available from: https://optn.transplant.hrsa.gov/data/view-data-reports/national-data/# (2017).
- OPTN, O. P. aT. N. National Data, Transplants by Donor Type, U.S. Transplants Performed January 1, 1988 - December 31, 2016, For Organ = Liver. , Available from: https://optn.transplant.hrsa.gov/data/view-data-reports/national-data/# (2017).
- Nemes, B., et al. Extended criteria donors in liver transplantation Part I: reviewing the impact of determining factors. Expert Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (7), 827-839 (2016).
- Nemes, B., et al. Extended-criteria donors in liver transplantation Part II: reviewing the impact of extended-criteria donors on the complications and outcomes of liver transplantation. Expert Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (7), 841-859 (2016).
- Pezzati, D., Ghinolfi, D., De Simone, P., Balzano, E., Filipponi, F. Strategies to optimize the use of marginal donors in liver transplantation. World J Hepatol. 7 (26), 2636-2647 (2015).
- Marecki, H., et al. Liver ex situ machine perfusion preservation: A review of the methodology and results of large animal studies and clinical trials. Liver Transpl. 23 (5), 679-695 (2017).
- Barbas, A. S., Knechtle, S. J. Expanding the Donor Pool With Normothermic Ex Vivo Liver Perfusion: The Future Is Now. Am J Transplant. 16 (11), 3075-3076 (2016).
- Dries, S., et al. Ex vivo normothermic machine perfusion and viability testing of discarded human donor livers. Am J Transplant. 13 (5), 1327-1335 (2013).
- Westerkamp, A. C., et al. End-ischemic machine perfusion reduces bile duct injury in donation after circulatory death rat donor livers independent of the machine perfusion temperature. Liver Transpl. 21 (10), 1300-1311 (2015).
- Selzner, M., et al. Normothermic ex vivo liver perfusion using steen solution as perfusate for human liver transplantation: First North American results. Liver Transpl. 22 (11), 1501-1508 (2016).
- Whitson, B. A., Black, S. M. Organ assessment and repair centers: The future of transplantation is near. World J Transplant. 4 (2), 40-42 (2014).
- Tolboom, H., et al. Subnormothermic machine perfusion at both 20°C and 30°C recovers ischemic rat livers for successful transplantation. J Surg Res. 175 (1), 149-156 (2012).
- Nagrath, D., et al. Metabolic preconditioning of donor organs: defatting fatty livers by normothermic perfusion ex vivo. Metab Eng. 11 (4-5), 274-283 (2009).
- Boehnert, M. U., et al. Normothermic acellular ex vivo liver perfusion reduces liver and bile duct injury of pig livers retrieved after cardiac death. Am J Transplant. 13 (6), 1441-1449 (2013).
- Schön, M. R., et al. Liver transplantation after organ preservation with normothermic extracorporeal perfusion. Ann Surg. 233 (1), 114-123 (2001).
- Reddy, S., et al. Non-heart-beating donor porcine livers: the adverse effect of cooling. Liver Transpl. 11 (1), 35-38 (2005).
- Banan, B., et al. Novel strategy to decrease reperfusion injuries and improve function of cold-preserved livers using normothermic ex vivo liver perfusion machine. Liver Transpl. 22 (3), 333-343 (2016).
- Held, P. An Introduction to Reactive Oxygen Species: Measurement of ROS in Cells. , BioTek Instruments, Inc. Vinooski, Vermont. 1-14 (2012).
- Chen, C. F., et al. Reperfusion liver injury-induced superoxide dismutase and catalase expressions and the protective effects of N-acetyl cysteine. Transplant Proc. 39 (4), 858-860 (2007).
- Chen, B., Tang, L. Protective effects of catalase on retinal ischemia/reperfusion injury in rats. Exp Eye Res. 93 (5), 599-606 (2011).
- He, Y. Y., Hsu, C. Y., Ezrin, A. M., Miller, M. S. Polyethylene glycol-conjugated superoxide dismutase in focal cerebral ischemia-reperfusion. Am J Physiol. 265 (1 Pt 2), H252-H256 (1993).
- Işlekel, S., Işlekel, H., Güner, G., Ozdamar, N. Alterations in superoxide dismutase, glutathione peroxidase and catalase activities in experimental cerebral ischemia-reperfusion. Res Exp Med (Berl). 199 (3), 167-176 (1999).
- Li, G., Chen, Y., Saari, J. T., Kang, Y. J. Catalase-overexpressing transgenic mouse heart is resistant to ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol. 273 (3 Pt 2), H1090-H1095 (1997).
- Nowak, K., et al. Immunotargeting of catalase to lung endothelium via anti-angiotensin-converting enzyme antibodies attenuates ischemia-reperfusion injury of the lung in vivo. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 293 (1), L162-L169 (2007).
- Beckman, J. S., et al. Superoxide dismutase and catalase conjugated to polyethylene glycol increases endothelial enzyme activity and oxidant resistance. J Biol Chem. 263 (14), 6884-6892 (1988).
- Yabe, Y., Nishikawa, M., Tamada, A., Takakura, Y., Hashida, M. Targeted delivery and improved therapeutic potential of catalase by chemical modification: combination with superoxide dismutase derivatives. J Pharmacol Exp Ther. 289 (2), 1176-1184 (1999).
- Yabe, Y., et al. Prevention of neutrophil-mediated hepatic ischemia/reperfusion injury by superoxide dismutase and catalase derivatives. J Pharmacol Exp Ther. 298 (3), 894-899 (2001).
- Ushitora, M., et al. Prevention of hepatic ischemia-reperfusion injury by pre-administration of catalase-expressing adenovirus vectors. J Control Release. 142 (3), 431-437 (2010).
- Kakizaki, Y., et al. The Effects of Short-Term Subnormothermic Perfusion after Cold Preservation on Liver Grafts from Donors after Cardiac Death: An Ex Vivo Rat Model. Transplantation. , (2018).
- Kumar, R., Chung, W. Y., Dennison, A. R., Garcea, G. Ex Vivo Porcine Organ Perfusion Models as a Suitable Platform for Translational Transplant Research. Artif Organs. , (2017).
- Nativ, N. I., et al. Liver defatting: an alternative approach to enable steatotic liver transplantation. Am J Transplant. 12 (12), 3176-3183 (2012).
- Yeung, J. C., et al. Ex vivo adenoviral vector gene delivery results in decreased vector-associated inflammation pre- and post-lung transplantation in the pig. Mol Ther. 20 (6), 1204-1211 (2012).
- Goldaracena, N., et al. Inducing Hepatitis C Virus Resistance After Pig Liver Transplantation-A Proof of Concept of Liver Graft Modification Using Warm Ex Vivo Perfusion. Am J Transplant. 17 (4), 970-978 (2017).
- Van Raemdonck, D., Neyrinck, A., Rega, F., Devos, T., Pirenne, J. Machine perfusion in organ transplantation: a tool for ex vivo graft conditioning with mesenchymal stem cells? Curr Opin Organ Transplant. 18 (1), 24-33 (2013).
- Pratschke, S., et al. Results of the TOP Study: Prospectively Randomized Multicenter Trial of an Ex Vivo Tacrolimus Rinse Before Transplantation in EDC Livers. Transplant Direct. 2 (6), e76 (2016).
- Pratschke, S., et al. Protocol TOP-Study (tacrolimus organ perfusion): a prospective randomized multicenter trial to reduce ischemia reperfusion injury in transplantation of marginal liver grafts with an ex vivo tacrolimus perfusion. Transplant Res. 2 (1), 3 (2013).
- Nativ, N. I., et al. Elevated sensitivity of macrosteatotic hepatocytes to hypoxia/reoxygenation stress is reversed by a novel defatting protocol. Liver Transpl. 20 (8), 1000-1011 (2014).
- Lonze, B. E., et al. In vitro and ex vivo delivery of short hairpin RNAs for control of hepatitis C viral transcript expression. Arch Surg. 147 (4), 384-387 (2012).
