Summary
Det saknas betydande lever givare och kriterier för levern har utökats. Normothermic ex vivo lever perfusion (NEVLP) har utvecklats för att utvärdera och ändra organfunktion. Denna studie visar en råtta modell av NEVLP och tester pegylerat-katalas, förmåga att minska levern bevarande skada.
Abstract
Det finns en betydande brist på levern organtransplantationer för transplantation, och som svar givare kriterierna har utökats. Normothermic ex vivo lever perfusion (NEVLP) har därför införts som en metod för att utvärdera och ändra organfunktion. NEVLP har många fördelar i jämförelse med nerkylda och subnormothermic perfusion inklusive minskad bevarande skada, återställande av normal organfunktion under fysiologiska tillstånd, bedömning av orgel prestanda, och som en plattform för orgel reparation , ombyggnad och ändring. Både murina och svin NEVLP modeller har beskrivits. Vi demonstrerar en råtta modell av NEVLP och använda denna modell för att visa en av dess viktiga program — användning av en terapeutisk molekyl till levern perfusatet. Katalas är ett endogent reaktivt syre arter (ROS) gatsopare och har visat sig minska ischemi-reperfusion i ögat, hjärnan och lungorna. Pegylering har visat att rikta katalas till endotelet. Här har vi lagt pegylerat-katalas (PEG-CAT) till den bas perfusatet och visat sin förmåga att minska levern bevarande skada. En fördel med vår gnagare NEVLP modell är att det är billig i jämförelse med större djurmodeller. En begränsning av denna studie är att det inte inkluderar för närvarande efter perfusion levertransplantation. Därför, prediktion av funktionen av efter organtransplantation kan inte göras med säkerhet. Dock råtta levertransplantation modellen är väl etablerat och verkligen kunde användas tillsammans med denna modell. Sammanfattningsvis har vi visat en billig, enkel, lätt replikerbar NEVLP modell med råttor. Tillämpningar av denna modell kan inkludera tester roman perfusates och perfusatet tillsatser, testa programvara utformad för orgel utvärdering och experiment som syftar till att reparera organ.
Introduction
Det finns 14 578 patienter på väntelista för levertransplantation och cirka 7 000 transplantationer utförs per år1,2. Svar på denna betydande givare brist, har kriterierna för levern givare expanderat; dessa benämns ofta som marginella organ eller utökade kriterier givare och förväntas utföra sämre efter transplantation än standardvillkoren organtransplantationer, med högre nivåer av primära transplantatdysfunktion och fördröjd transplantat funktion3, 4,5,6. NEVLP har därför införts som en metod för att utvärdera och ändra orgel funktion6,7. Vi har utformat en råtta modell av NEVLP och använt denna modell för att demonstrera en av dess viktiga potentiella tillämpningar – provning av romanen molekyl tillsatser till levern perfusatet.
NEVLP har utvärderats i både murin (råtta) och svin modeller samt i kasserade mänskliga organ6,8,9. Resultaten av de första mänskliga försök av NEVLP har också nyligen publicerade10. Även om nerkylda maskin perfusion har tydligt blivit standard för njure bevarande, är den temperatur vid vilken levern maskin perfusion skulle inträffa fortfarande kontroversiell. NEVLP har många föreslagna fördelar i jämförelse med nerkylda och subnormothermic perfusion. Dessa inkluderar minskad bevarande skada, återställande av normal organfunktion under fysiologiska tillstånd, förmågan att bedöma orgel prestanda, och som en plattform för orgel reparation, ombyggnad och ändring7,11, 12,13,14,15,16,17.
Ett betydande antal studier har genomförts med hjälp av svin NEVLP modeller. Även dessa modeller är jämförelsevis billig när betraktande modeller använder kasseras mänskliga organ eller kliniska prövningar, är de mycket dyra jämfört med vår modell med små djur i NEVLP. En betydande del av den per experiment kostnaden är perfusatet. Vi har möjlighet att slutföra en 4 h perfusionen med 300 mL i perfusatet till en relativt låg kostnad. Dessutom är kostnaden för små djur inklusive råttor mycket låg i jämförelse med kostnaden för svin.
Jämfört med andra modeller av NEVLP hos råtta, den modell som presenteras här är relativt enkel att genomföra och har ett brett användningsområde. Perfusion kretsen kan ses i figur 1. Perfusatet startar i reservoaren perfusatet (1), som är en mantlade vattenbehållare. Perfusatet är drog från reservoaren av en rulle pump (2) och knuffade in i en windkessel (3) och sedan oxygenator (4). Oxygenator är inställd för motström gas och perfusatet flöde att ge maximal gasutbyte. Den perfusatet då intäkterna till en uppvärmning spole (5) insidan perfusion kammaren att se till att det är vid fysiologiska temperatur, och en bubbelfälla (6) att förhindra genomblödning av luftbubblor det är pre (7) och efter organ (8) provet hamnar, som tillåter den perfusatet vara provtas. Perfusatet anger sedan levern via Portådern kanylen. Portalen ven kanylen är kopplad till en tryckövervakaren som kartlägger värdena på data insamling programvara. Perfusatet sedan avslutar levern genom IVC kanylen och flödar in i blocket tryck equalizer (9). Slutligen är perfusatet drog från blocket trycket tillbaka genom rulle pumpen och töms i reservoaren. Denna modell inkluderar kontinuerlig perfusion till portalen ven och lämnar ut pulserande flödet till levern artär och dialys används i vissa andra modeller, som alla kräver en separat och ytterligare krets, men har tidigare visat sig inte vara krävs9,13.
Om du vill utforska tillägg av en ny terapeutisk molekyl till perfusatet, valde vi enzymet katalas. Katalas är ett endogent ROS asätare som är en del av mekanismen celler inre försvar för att mildra effekterna av ROS18. Katalas uttryck ökas i nedsatt ischemi reperfusion skada19. Experimentella tillägg av katalas har visat sig minska ischemi-reperfusion i ögat, hjärnan och lungorna20,21,22,23,24. Pegylering har visat att rikta katalas till endotelet och stöd i katalas upptag till endotelceller25. PEG-CAT har administrerats systemiskt med begränsad effekt i att minska hepatisk ischemi-reperfusionsskada; dock hypotesen vi att lägga till PEG-katt till en isolerad orgel perfusion krets skulle leda till förbättrade resultat26,27,28. Här, vi lägger till PEG-CAT till vår bas perfusatet och visa sin förmåga minska levern bevarande skada.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla förfaranden utfördes enligt riktlinjerna i den institutionella Animal Care och National Research Council's Guide för Human Care och användning av laboratorium djur (IACUC) och har genomgått godkännande av Ohio State University IACUC kommittén.
1. första installation
-
Förbereda perfusion lösningen genom att kombinera följande: 86 mL 25% albumin, 184 mL Williams media, 30 mL penicillin/streptomycin (10 U/mL penicillin och 0,01 mg/mL streptomycin), insulin (50 U/L), heparin (0.01 U/mL), L-glutamin (0,292 g/L), och hydrokortison (0,010 g/L) till en total volym 300 ml. För bas perfusatet och PEG-CAT grupp, lägga till 625 U/mL av PEG-katt.
- Buffra perfusatet lösningen med tris (hydroxymetyl) aminometan (THAM) till pH 7,4. Använd ett arteriellt blod gas maskin för att bekräfta perfusatet pH.
-
Ställa in kretsen (figur 1).
- Slå på vattenbadet varmare och ange det till 37 ° C. Tillåta orgel kammaren att värma upp.
- Häll den blandade och buffrad perfusatet i behållaren och starta cirkulation.
Obs: Den perfusatet som nämns i detta steg förbereddes i steg 1.1.1. - Slå på syresättande gasen (95% syre och 5% koldioxid) till räknaren flödet genom den kabelmonterade oxygenator.
- Slå på data insamling programvara och klicka på ”start” för att spela in under experimentet.
-
Ställ in det kirurgiska mikroskopet och operationssalen (figur 2).
- Slå på all utrustning, inklusive den värmande styrelsen, diatermi, anestesi och vitala tecken (hjärta och syre mättnad) utrustning för övervakning.
Obs: Mikroskop inställningarna varierar beroende på mikroskopet används och kan justeras till användarens komfort. - Fyll 10 mL anestesi sprutan med 10 mL flytande isofluran för inandning (molekylvikt 184,5 g/mol) och placera i enheten anestesi.
- Placera en 0,5 mL spruta av heparin (50 U), kirurgiska instrument, 4-0 och 7-0 silk sutur, sterila svabbar och 4 x 4 cm non-woven kompress svampar på lämpligt sätt (figur 2).
- Slå på all utrustning, inklusive den värmande styrelsen, diatermi, anestesi och vitala tecken (hjärta och syre mättnad) utrustning för övervakning.
- Förbereda isofluran kammaren.
2. induktion av anestesi
- Den följande personliga skyddsutrustning (PPE): kirurgisk mask, kirurgiska handskar, disponibel klänning.
- Väga råtta.
Obs: Vi använder Sprague-Dawley-råttor mellan 250 – 350 g. - Slå på syre kompressor och isofluran. Placera råtta, efter att tyngas, in i isofluran kammaren och säkra locket. Inducera anestesi med 6% isofluran levereras med 2 L/min av syre.
Observera: Den exakta isofluran dos som används beror på den specifika anestesi-system som används. - Använda elektroniska clippers för att klippa djurets buk hår.
- Byt ut djuret i isofluran kammaren.
- Slå på anestesi enheten ligger i operationssalen.
- Ta bort råttan från isofluran kammaren när anestesi induceras fullt. Bekräfta djup anestesi med en tå nypa.
3. upphandlingsförfarandet
-
Förbereda 16 G portal manschetten (figur 3).
- Börja med en 16 G angiocatheter. Skär ett 7 mm avsnitt av slangar. Bestämma mittpunkten av avsnittet 7 mm genom att mäta 3,5 mm. incisionsfilm vid mittpunkten och ta bort den främre halvan av slangen.
- Använd en hemostat för att krossa detta nu platta delen. Använd en tändare för att smälta andra änden av angiocatheter att skapa en läpp. Placera inte spetsen direkt in i flamman eller det antänds.
-
Förbereda gallgången kanylen.
- Ta en 27 G angiocath och avskurna injektion hamnen lämnar endast katetern. Anslut denna till ett 10 cm avsnitt på 27 G cannular slang.
- Placera råtta med nosen i anestesi näsan konen och dess fyra extremiteter orörlig. Övervaka de vitala tecken genom att ansluta bildskärmen till vänster bakben extremiteten. Utföra en tå nypa för att bekräfta lämplig djup anestesi. Fortsätt anestesi på 4% isofluran (för djur som väger > 250 g).
- Spraya djurets buk med 70% isopropylalkohol. Låt torka. Placera en steril draperi över djuret.
- Gör en mittlinjen snitt från xiphoid till pubis med vassa saxar och sträcker sig genom huden (figur 4). Försiktigt in bukhinnan och incisionsfilm muskeln. Var noga med för att undvika att skada blåsan i sämre aspekt av detta snitt och levern i överlägsen aspekten av detta snitt.
- Förlänga snittet sidled till vänster och höger att bilda ett kors i nivå med sämre gränsen i levern.
- Vända anestesi ner till 2% (för djur som väger > 250 g).
- Återkalla den xiphoid process med hjälp av en böjd mygga klämma och revbenen med rib upprullningsdon (figur 5).
- Skär den falciform, phrenic, och bukhåla ligament med vass sax.
- Leta upp och trådfästning phrenic venen med en 7-0 sutur som nära dess ursprung som möjligt för att förhindra läckage.
- Rensning på råtta med hjälp av en steril fuktad bomull tip applikator och Linda tarmen i gasväv fuktad med 0,9% fysiologisk koksaltlösning. Se till att inte sträcka vaskulatur av tunntarmen.
- Dissekera över den sämre vena cava (IVC) för att avlägsna överflödig vävnad. Dissekera bakom den bara överlägsen bifurkation IVC och passera en slinga av en 4-0 silk suturen för senare användning (figur 6).
- Återkalla den högra njuren för att ge exponering till höger binjure ven. Dra tillbaka höger lob i levern mycket fint med gasbinda. Binda höger binjure venen med en 7-0 silk sutur så nära IVC som möjligt och bränna över det distalt slips (figur 7).
- Noggrant dissekera ut mjälten venen, binda det med två 7-0 silk suturer och skär över det mellan de två suturerna.
- Binda och ligera ytterligare vener med 7-0 silk sutur för extra längd på portalen ven, om det behövs.
Obs: Det finns ibland små grenar av infrahepatic IVC mellan höger binjure venen och sämre levern. - Dissekera runt gastroduodenala artär, binda den gastroduodenala artären med en 7-0 silk sutur och ligera gastroduodenala artär.
- Dissekera runt den hepatiska artären och placera sedan en 7-0 silk suturen slips runt det (figur 8).
-
Dissekera ut gallgången.
- Kontrollera längden på gallgången. Binda gallgången på den distala änden med en 7-0 silk sutur. Placera en slinga av en 7-0 silk suturen runt gallgången så proximalt som möjligt.
- Skär ett hål som är halva diametern kanalen med liten sax och placera en 27 G kateter i gallgången proximalt. Knyta katetern på plats med en romersk sandal slips sutur (figur 9).
- Injicera 0,5 mL heparin (50 U) in i penis ven eller IVC djuret med en 27 G nål.
Obs: En 27 G insulinspruta kan också användas i stället. - Klämma och binda den IVC använder den tidigare placerade 4-0 silk suturen.
- Binda den hepatiska artären med hjälp av den tidigare placerade 7-0 silk suturen.
- Klämma bort portalen ven använder en mikrokirurgisk klipp. Cannulate portalen ven med en 22 G angiocatheter. Spola blanches portalen ven med 60 mL kall 0,9% fysiologisk koksaltlösning med 1 mL heparin (100 U) tills levern (figur 10).
Obs: Om levern inte skålla omedelbart det kan masseras med steril Bomull Tips applikatorer. - Exponera suprahepatic IVC och skär över det som hög i bröstet som möjligt.
- Utföra en hepatectomy enligt följande. Skär runt membranet, skär den hepatiska artären, skär IVC, skära portalen ven, skär några ytterligare ligament och ta levern ut. Lägg levern i is kallt 0,9% fysiologisk koksaltlösning (figur 11).
- Placera en 16 G vaskulär manschett i portalen ven (figur 12). Lägg levern på ex vivo normothermic lever perfusion kretsen.
4. Ex Vivo Normothermic lever Perfusion
Obs: Den perfusatet används här förbereddes i protokollet steg 1.1.1.
- Placera av portalen ven kanylen i bojad portalen ven (figur 13).
- Under portalen ven kanyl placeringen, bibehålla flödet av perfusatet genom kretsen på 2 mL/min till start. Titta på bildskärmen för några spikar i portalen ven tryck; Detta kan tyda på fartyget har blivit ockluderas och ompositionering av kanylen behövs.
- Sutur i IVC kanylen för återflödet av den perfusatet använder en 7-0 silk sutur.
- När båda kanyler är på plats, börja vrida upp flödet vid 1 mL/min tills en fysiologisk i intervallet 10 – 16 cmH2O har uppnåtts.
-
Ta en 1 mL prov från före och efter hamnar på 0, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210 och 240 min av perfusion. Dela 1 mL provet i två 0,5 mL prover.
Obs: 0,5 mL av detta kommer att användas i protokollet steg 4.5.1 och 0,5 mL kommer att användas i protokollet steg 4.5.2.- Snapin frysa 0,5 mL av detta prov i kryogena rör i flytande kväve.
- Kör en arteriellt blod gasar analys med hjälp av de återstående 0,5 mL av perfusatet.
- Efter löpande den blod gasar analysen vid varje tidpunkt (0, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210 och 240 min) undersöka pH-nivåer och buffert i perfusatet som behövs för att återgå till pH 7,4.
- Vid avslutningen 4 h av perfusion, koppla från levern från perfusion kretsen. Dela levern i 0,5 g segment. Snapin frysa levern vävnad i kryogena rör i flytande kväve.
5. efter experimentet analys
-
Fastställa alanin alaninaminotransferas (ALAT) nivå i perfusatet vid 0, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210 och 240 min med en kommersiell kolorimetrisk test kit.
- I korthet, inkubera i perfusatet med reaktion blanda reagenserna vid 37 ° C i 60 min. mått optiska densitet värden på 570 nm med en microplate reader.
-
Homogenisera 0,5 g levervävnad med 100 μl lyseringsbuffert och analysera vävnaden lysate för omvandlingen av adenosintrifosfat (ATP), glutation (GSH) och malondialdehyde (MDA).
- I korthet, mäta ATP nivåerna av levervävnad proverna med en kommersiell assay kit. Blanda provet med reaktion bufferten och inkubera i rumstemperatur i 30 min. mått den optiska densiteten vid 570 nm med en microplate reader.
- Mäta GSH nivåerna av levervävnad proverna med en kommersiell assay kit. Blanda vävnadsproverna med assay cocktail. Mät de optiska densiteten värdena vid 405 – 414 nm.
- Mäta MDA nivåerna av levervävnad proverna med en kommersiell assay kit. Blanda proverna med TBA och värme till 95 ° C i 60 min. Centrifugera reaktant och överför supernatanten till en plattan med 96 brunnar. Mät den optiska densiteten vid 532 nm.
-
Homogenisera 0,5 g levervävnad med 100 μl lyseringsbuffert och analysera vävnaden lysate för relativa kaspas-3/7 aktiviteten använder en kommersiell analyssats.
- Blanda vävnaden lysate med kaspas-3-7 reagens analysbuffert och odla i rumstemperatur i 30 min.
- Mäta fluorescens nivån i varje väl med en microplate reader.
-
Fastställa nivån på apoptotiska celler i levern vävnadsprover med en upptäckt kommersiella i situ död kit.
- Förbehandla den 0,5 g vävnad avsnitt med 10 U/mL proteinas K i 10 min och sedan Inkubera med reaktionsblandningen vid 37 ° C i 60 min. utför analysen med fluorescerande Mikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En stickprovsstorlek på tre råttor per grupp användes. ALT mättes på 0, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210 och 240 min av perfusion. Vi använde Student's t-test för att jämföra resultaten mellan de bas perfusatet och bas perfusatet plus PEG-CAT grupper vid varje tidpunkt. Vid jämförelse mellan de bas perfusatet och bas perfusatet plus PEG-CAT grupper, det finns betydligt mindre (p < 0,05) ALT i bas perfusatet plus PEG-CAT grupp på 150, 180, 210 och 240 min (figur 14A).
Levervävnad införskaffades för att analysera vävnadsskada från både bas perfusatet och bas perfusatet plus PEG-CAT grupper. Vi använde Student's t-test för att jämföra resultaten mellan de bas perfusatet och bas perfusatet plus PEG-CAT grupper. Vävnaden ATP bibehölls i den bas perfusatet plus PEG-katt-gruppen i jämförelse med gruppen som enbart bas perfusatet (figur 14B, p < 0,05). Vävnaden MDA produktion var signifikant högre i gruppen bas perfusatet än i bas perfusatet plus PEG-CAT grupp (figur 14C, p < 0,05). Totala GSH bibehölls i den bas perfusatet plus PEG-katt-gruppen i jämförelse med gruppen som enbart bas perfusatet (figur 14D, p < 0,05).
För att analysera apoptos, jämfördes levervävnad kaspas 3/7 aktivitet mellan grupperna. Fluorescens mättes i varje brunn. Vi använde Student's t-test för att jämföra resultaten mellan de bas perfusatet och bas perfusatet plus PEG-CAT grupper. Kaspas 3/7 aktivitet minskade avsevärt i bas perfusatet plus PEG-katt-gruppen i jämförelse med gruppen som enbart bas perfusatet (figur 15A, p < 0,05). Terminal deoxynucleotidyl transferas (TdT) dUTP Nick-slutet märkning (TUNEL) färgning användes för att jämföra apoptos mellan grupperna. Procentandelen av apoptotiska celler var betydligt mindre i bas perfusatet plus PEG-katt-gruppen jämfört med bas perfusatet ensam grupp (figur 15B, p < 0,05).
Figur 1: Perfusion Circuit. Komponenter av kretsen är märkta. Perfusatet startar i reservoaren perfusatet (1), som är en mantlade vattenbehållare. Perfusatet är drog från reservoaren av en rulle pump (2) och knuffade in i en windkessel (3) och sedan oxygenator (4). Oxygenator är inställd för motström gas och perfusatet flöde att ge maximal gasutbyte. Perfusatet fortsätter till en värmeslinga (5) inne i perfusion kammaren att se till att det är på fysiologiska temperatur och bubbelfällan (6) att förhindra genomblödning av luftbubblor. Det finns före (7) och efter organ (8) provet hamnar, som tillåter den perfusatet som skall provtas. Perfusatet anger sedan levern via Portådern kanylen. Portalen ven kanylen är kopplad till en tryck monitor, som reglerar trycket equalizern (9). Slutligen är perfusatet drog från blocket trycket tillbaka genom rulle pumpen och töms i reservoaren. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: operationssalen och kirurgiska instrument set-up. Kirurgiska Mikroskop (1) bör anpassas till lämplig höjd och förstoring för användaren. Isofluran kan vara förinstallerad i anestesi maskinen (2). Djurets näsa placeras i näsan konen (3). Kirurgiska instrument bör läggas ut där de kan vara lättåtkomlig (4). Med diatermi (5) i närheten är bra. Suturer (6) bör vara färdigskurna så bitar kan erhållas snabbt när det behövs, och extra bör vara tillgänglig (7). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: förbereda 16 G portalen ven manschetten. Börja med en 16 G angiocatheter. Skär ett 7 mm avsnitt av slangar. Bestämma mittpunkten av avsnittet 7 mm genom att mäta 3,5 mm. incisionsfilm här och ta bort den främre halvan av slangen. Använd en hemostat för att krossa detta nu platta delen. Använd en lättare för att bränna den andra änden av angiocatheter att skapa en läpp. Placera inte spetsen direkt in i flamman eller det antänds. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: mittlinjen snitt. Gör en mittlinjen snitt från xiphoid (1) till pubis (2) med vassa saxar och sträcker sig genom hud och muskel. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: erhålla adekvat retraction. Återkalla den xiphoid process (1) med en böjd mygga klämman (2) och revbenet genom att placera rib upprullningsdon (3, 4). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: sämre vena cava (IVC) dissektion. Vänd lever upp till exponera den högra njuren (1) och portalen ven (2). Dissekera runt IVC (3) och placera en slinga av 7-0 sutur för framtida bruk. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: ligering av höger binjure ven. Återkalla den högra njuren (1) för att ge exponering till höger binjure ven. Binda höger binjure venen och skär över den. En fuktad kompress (2) kan användas för att skydda levern under denna manöver. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8: hepatiska artären dissektion. Dissekera runt och placera en slips runt den hepatiska artären (1) nära där det passerar under portalen ven (2). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 9: gallgången kanylering. Cannulate gallgången (1) använder den 27 G angiocatheter (2) ansluten till 27 G slangen (3). Detta hjälper till att samla in gallan under perfusion. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 10: lever flush. Skölj levern (1) med 60 cc av kall 0,9% fysiologisk koksaltlösning med 100 U (1 mL) av heparin med en 16 G angiocatheter (2). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 11: efter hepatectomy. Utföra en hepatectomy och Lägg levern i kallt saline. Se till att inte rubba gallgången kanylen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 12: portalen ven ansamling. Leta upp portalen ven. Använd en stor klämma (1) att hålla upp den ven som lämnar en flera millimeter-läpp på ven ovanför klämman. Använda mikrokirurgisk pincett (2, 3) för att placera en 16 G vaskulär manschett (4) i portalen ven. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 13: portalen ven manschetten och överlägsen IVC kanylering. Hål i portalen ven manschetten (1) och överlägsen IVC (2). Vara måste mycket försiktig för att inte rubba gallgången kanylen (3). Dessutom, se till att inte vrida den överlägsna IVC. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 14: analys av vävnadsskada i bas perfusatet-bara och bas perfusatet och plus PEG-CAT grupper (N = 3/grupp). Felstaplar representera standardavvikelse. (A) alaninaminotransferasnivå (ALAT) i serum. I jämföra ALAT-nivåer mellan de bas perfusatet och bas perfusatet plus pegylerat-katalas (PEG-CAT) gruppen, finns betydligt mindre ALT i bas perfusatet plus PEG-CAT grupp på 150, 180, 210 och 240 min (p < 0,05). (B) adenosintrifosfat nivåer. Vävnaden adenosintrifosfat (ATP) bibehölls i den bas perfusatet plus PEG-katt-gruppen i jämförelse med gruppen som enbart bas perfusatet (p <0,05). (C) Malondialdehyde nivåer. Vävnaden malondialdehyde (MDA) produktion var signifikant högre i gruppen bas perfusatet än i bas perfusatet plus PEG-CAT grupp (p < 0,05). (D) glutation nivåerna. Totala glutation (GSH) bibehölls i den bas perfusatet plus PEG-katt-gruppen i jämförelse med gruppen som enbart bas perfusatet (p < 0,05). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 15: analys av apoptos i bas perfusatet-bara och bas perfusatet och plus PEG-CAT grupper (N = 3/grupp). Felstaplar representera standardavvikelse. (A) kaspas-3/7 Activity.Caspase 3/7 aktivitet minskade avsevärt i bas perfusatet plus PEG-katt-gruppen i jämförelse med gruppen som enbart bas perfusatet (p < 0,05). (B) Terminal deoxynucleotidyl transferas (TdT) dUTP Nick-slutet märkning (TUNEL) färgning. Bilder är tagna med en 4 X fluorescerande Mikroskop. Procentandelen av apoptotiska celler var betydligt mindre i bas perfusatet plus PEG-katt-gruppen jämfört med bas perfusatet (p < 0,05). Grön: apoptotiska celler. Blå: kärnvapen. Skala barer = 1000 µm. TUNEL positiva celler kvantifierades genom att räkna celler från 4 slumpmässiga mikroskopiska fält. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det finns en betydande brist på levern organtransplantationer för transplantation och svar givare kriterier har expanderat1,2,3,4,5. Till följd av bristen på givare, har NEVLP införts som en metod för att utvärdera och ändra orgel funktion6,7. Vi har utformat en råtta modell av NEVLP. Dessutom har vi använt denna modell för att demonstrera en av dess viktiga potentiella tillämpningar — provning av romanen molekyl tillsatser till levern perfusatet. Här, vi lagt till PEG-CAT till den bas perfusatet och visat sin förmåga att minska levern bevarande skada.
Kritiska steg
Lever perfusion kretsen var köpt och använt utan modifiering. Kretsen kan visualiseras i figur 1. Perfusatet reservoaren används är en water-jacketed behållare som används för att hålla perfusatet vid fysiologisk temperatur. Från reservoaren dras perfusatet av en rulle pumpas och skjuts in i en windkessel kammare. Denna kammare hjälper till att dämpa den pulserande flöden av perfusatet och göra det mer laminär för inträde i orgeln. Efter windkessel kammare perfusatet flödena till oxygenator. Oxygenator är inställd för motström gas och perfusatet flöde som ger maximal gasutbyte till perfusatet med 95% syre. Perfusatet fortsätter till en värmeslinga för att det är fortfarande vid fysiologisk temperatur. Bubbelfälla precis innan orgeln förhindrar perfusion av luftbubblor. Perfusatet pumpas sedan ut ur bubblan fällan och genom portalen ven kanylen i levern. Portalen ven kanylen har en liten gren av det för tryckövervakaren. Slangen till sensorn bör vara primas med vätska inte luft så det finns ingen förlust av tryck till sensorn. Efter syresätta orgeln, perfusatet flödar ur levern genom sämre ven kanylen till en tryck equalizer. Tryck equalizer blocket förhindrar över trycksättning av krets eller orgel. Slutligen är perfusatet drog från blocket trycket tillbaka genom rulle pumpen och töms i reservoaren.
Innan du börjar varje perfusion bör okulärbesiktning av kretsen utföras för att identifiera skador eller uppbyggd på krets komponenter eller slangar. Om det finns en ansamling av bakterier eller andra ämnen på krets, bör delar bytas ut eller rengöras, om möjligt. Nästa, den rengöringslösning upprätthålla de inre delarna sköljas. Eftersom komponenterna är sköljs ut tryckgivaren och tryckledningen bör rensas eventuella luftbubblor med avjoniserat vatten. Flödet bör dessutom justeras med jämna mellanrum kontrollera trycket läsning svarar korrekt på förändringar. Om trycksensorn inte svarar korrekt, alla artiklar på raden till sensorn kontrolleras och kalibreras vid behov. I början av en perfusion är det viktigt att se till att kärlen i levern inte blivit böjd eller vriden när du ansluter levern till kretsen. Om detta har inträffat där ses en omedelbar trycket spike på monitorn i en logaritmisk trend. Det vanligaste felet är en kink i portalen ven med en dåligt placerad kanyl. Problemet kan lösas genom att flytta fartyget till en mer naturlig position genom att dra det något ute och uträtning portalen ven. Tryckövervakaren anger upplösning av problemet med en droppe i tryck och bättre konsistens. Nästa, när du ansluter portalen ven manschetten till portalen ven kanylen fartyget kan bli vridna hindra perfusion av orgeln. Justera manschetten och korrigera detta fel kommer att resultera i en plötslig stegring i portalen ven tryck som bör då omedelbart återvända till ett lägre tryck och nivå av på ett konsekvent flöde. En böjd eller vriden IVC kan snabbt identifieras genom inget flöde från kanylen och en utbuktningen av fartyget. Båda dessa fel i vena cava kommer också att resultera i ett ökat tryck, men till skillnad från portalen ven bekymmer detta tryck utövas på orgel och bör lösas snabbt. Problemet ska vara löst inom 10 min eller experimentet ska avbrytas. En omedelbar upplysning för att avbryta experimentet ser tydliga ödem i orgeln inom de första 20 min.
Om det finns en läcka från levern eller från en av kanyl anslutningar kommer det vara viktigt att övervaka perfusatet reservoar nivå. Ont om perfusatet och pumpa luft kan vara katastrofalt för experimentet. När luften pumpas in i fodrar går det inte att pausa experimentet och åter-prime raderna slangar. Den enda möjliga korrigeringen är för bubbelfällan att fånga den injicerade luften.
Modifieringar och felsökning
När kretsen spolas oxygenator kan sättas i linje och sedan kretsen kan vara primas med perfusatet. Korrekt rensa luften från oxygenator kan ta några minuter men är ett avgörande steg för att se till att en luftemboli inte genereras i mitten en perfusion. Efter oxygenator är fullt laddad med perfusatet bubbelfällan ska fyllas bredvid fånga eventuella luftbubblor som utgör. På denna punkt ska krets flödet anges till ett flöde av 1 eller 2 mL/min till hålla den perfusatet flytta tills levern är redo för kanylering.
Efter cannulating portalen ven och IVC i levern, bör trycket öka och sedan plana ut. Som ökas flödet till ett normala fysiologiska tryck bör inspelade trycket börja öka stegvis likartat. När önskad flödet (8 – 16 mmHg) har uppnåtts bör trycket vara ganska konstant. Vi strävar efter ett tryck på 10 mmHg, och justera flödet. Önskat flöde att nå ett tryck på 10 mm Hg kan variera beroende på orgel. Det kan finnas en liten läcka av perfusatet från orgeln men detta perfusatet kan samla och återvände till reservoaren.
Kretsen bör rengöras efter varje perfusion att upprätthålla kammare och reservoar och att bevara disponibel slangar och portar. Alla perfusatet bör tas bort från kretsen. Kretsen bör omedelbart spolas med ett minimum av 300 mL avjoniserat vatten. Medan det avjoniserat vattnet spolar krets slangen bör yttre delar rengöras på lämpligt sätt. Externa komponenter ska sköljas bort eller försiktigt torkas och luften torr. Krets komponenter är sköra och kan skadas lätt. Det är därför av yttersta vikt att rengöra den försiktigt. Den inre kretsen bör bevaras i en 5% lösning av alkaliskt tvättmedel i avjoniserat vatten när inte i använda. Tvättmedel i kretsen hjälper till att förlänga livslängden på slangen och förhindra uppbyggd på andra komponenter, såsom bubbelfällan och tryck equalizer.
De flesta svårigheter med kretsen kan förhindras med grundlig rengöring och underhåll av banan efter varje användning. Detta bidrar till att det finns ingen ackumulering av kvarvarande perfusatet som kan leda till igensatta slangar eller kanyler. Krets komponenter och slangar bör inspekteras regelbundet och ersättas vid behov innan varje användning för att kontrollera att ingen förorening eller begränsning i flödet.
Begränsningar
En begränsning av denna modell med små djur i NEVLP är att det inte inkluderar för närvarande efter perfusion transplantation. Det är därför omöjligt att utvärdera lever transplantatfunktion efter transplantation. Detta är ett viktigt område för framtida forskning. Dessutom kräver utnyttjar små djur kretsen både kunskap och skicklighet.
Betydelse med avseende på befintliga modeller
Svin och murina (råtta) modeller av nerkylda, subnormothermic och normothermic ex vivo lever perfusion har beskrivits i litteraturen. Även om kontroversen kvarstår angående perfusion temperatur, har det visat att denna maskin perfusion kan förbättra funktionen av levern ympkvistar oavsett temperatur9. Den NEVLP modellen presenteras här är enkel, enkelt replikerbar, låg kostnad, och har ett brett spektrum av applikationer. Denna modell inkluderar inte dialys eller pulserande flöde till den hepatiska artären, vilket ingår i vissa andra modeller, eftersom de har visat sig vara onödiga9,13. Dessutom resultaten av de första mänskliga försök med NEVLP har visat detta är en effektiv metod för levern bevarande — därför, denna modell är perfekt för att testa framtida tillämpningar av ex vivo lever perfusion10.
Framtida tillämpningar
En mängd framtida tillämpningar för NEVLP har föreslagits i litteraturen. Varje av dessa kommer att behöva testas metodiskt i djurmodeller före provning i kasserade mänskliga organ och sedan i människors lever. Den modell som presenteras här är idealisk för att testa dessa nya framtida tillämpningar som det är enkelt replikerbar, eliminerar ovidkommande steg och är låg kostnad. En av de viktigaste potentiella tillämpningarna av denna modell är den visade här - testning av nya farmakologiska perfusatet tillsatser. Andra föreslagna program inkluderar reparation av skadade organ, avfettning av lever att tillåta steatotic organtransplantation, införandet av hepatit C virus motstånd, mesenkymala stamcellsterapi, genmodifiering och perfusion med immunsuppressiva medel11,31,32,33,34,35,36,37,38.
Slutsatser
Sammanfattningsvis har vi visat en billig, lätt replikerbar NEVLP modell med råttor. Användning av denna modell kräver noggranna förberedelser, praxis och kunskap, men kan genomföras till en låg kostnad. Tillämpningar av denna modell kan inkludera testning roman perfusatet tillsatser, vilket visades i de representativa resultat. Ytterligare tillämpningar av denna modell kan inkludera testning programvara utformad för orgel utvärdering, olika perfusates, och konstgjorda eller hemoglobin-baserade syre bärare och agenter för att reparera organ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alla författarna uppger att de har inga relevanta upplysningar.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av NIH T32AI 106704-01A1 och T. Flesch fonden för organtransplantation, Perfusion, teknik och regenerering vid The Ohio State University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Perfusate | |||
| 8% Albumin | CLS Behring, King of Prussia, PA | 0053-7680-32 | |
| Williams Media | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | W1878 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | P4333 | |
| Insulin | Eli Lilly, Indianapolis, IL | 0002-8215-91 | |
| Heparin | Fresnius Lab, Lake Zurich, IL | C504701 | |
| L-glutamine | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | G3126 | |
| Hydrocortisone | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | H0888 | |
| THAM | Hospira, Inc, | 0409-1593-04 | |
| Polyethylene Glycol - Catalase | Sigma Aldrich | S9549 SIGMA | |
| Personal Protective Equipment | |||
| Surgical Mask | Generic | N/A | |
| Protective Gown | Generic | N/A | |
| Surgical Gloves | Generic | N/A | |
| Liver Procurement | |||
| Sprague-Dawley Rat | Harlan Sprague Dawley Inc. | 250 -350 grams | |
| Surgical Microscope | Leica | M500-N w/ OHS | |
| Charcoal Canisters | Kent Scientific | SOMNO-2001-8 | |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | N/A | |
| Pressure-Lok Precision Analytical Syringe | Valco Instruments Co, Inc. | SOMNO-10ML | |
| Electrosurgical Unit | Macan | MV-7A | |
| Warming Pad | Braintree Scientific | HHP2 | |
| SomnoSuite Small Animal Anesthesia System | Kent Scientific | SS-MVG-Module | |
| PhysioSuite | Kent Scientific | PS-MSTAT-RT | |
| Isoflurane chamber | Kent Scientific | SOMNO-0530LG | |
| SurgiVet | Isotec | CDS 9000 Tabletop | |
| Oxygen | Praxair | 98015 | |
| Rib retractors | Kent Scientific | INS600240 | |
| GenieTouch | Kent Scientific | GenieTouch | |
| Normal Saline | Baxter | NDC 0338-0048-04 | |
| 4x4 Non-Woven Sponges | Criterion | 104-2411 | |
| Sterile Q-Tips | Henry Schein Animal Health | 1009175 | |
| U-100 27 Gauge Insulin Syringe | Terumo | 22-272328 | |
| 5mL Syringe | BD | REF 309603 | |
| 4-0 Braided Silk Suture | Deknatel, Inc. | 198737LP | |
| 7-0 Braided Silk Suture | Teleflex Medical | REF 103-S | |
| 16 gauge Catheters | BBraun Introcan Safety | 4252586-02 | |
| 14 gauge Catheters | BBraun Introcan Safety | 4251717-02 | |
| Bile Duct Cannular Tubing | Altec | 01-96-1727 | |
| Liver Perfusion Circuit Components | |||
| Water Bath Warmer | Lauda Ecoline Staredition | E103 | |
| Data Collection Software | ADInstruments | Labchart 7 | |
| Liver Perfusion Circuit | Harvard Apparatus | 73-2901 | |
| Membrane Oxygenator | Mediac SPA | M03069 | |
| Roller Pump | Ismatec | ISM827B | |
| Gas (95% oxygen and 5% carbon dioxide) | Praxair | 98015 | |
| Organ Chamber | Harvard Apparatus | ILP-2 | |
| 1.8 mL Arcticle Cryogenic Tube | USA Scientific | 1418-7410 | |
| Mucasol | Sigma-Aldrich | Z637181 | |
| Microsurgical Instruments | |||
| Small Scissors | Roboz | RS-5610 | |
| Large Scissors | S&T | SAA-15 | |
| Forceps - Large Angled | S&T | JFCL-7 | |
| Forceps - Small Angled | S&T | FRAS-15 RM-8 | |
| Clip Applier | ROBOZ | RS-5440 | |
| Scissors - non micro | FST 14958-11 | 14958-11 | |
| Forceps - Straight Tip | S&T | FRS-15 RM8TC | |
| Large Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-01 | |
| Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-01 | |
| Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-02 | |
| Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-03 | |
| Small Mosquito Clamps | Generic | N/A | |
| Post-Experiment Analysis | |||
| Alanine Aminotransferase (ALT) Activity Colorimetric/Fluorometric Assay Kit | BioVision | K752 | |
| Adenosine Triphosphate (ATP) Colorimetric/Fluorometric Assay Kit | BioVision | K354 | |
| Glutathione Assay Kit | Cayman Chemical | 703002 | |
| Lipid Peroxidation (MDA) Assay Kit | Abcam | ab118970 | |
| Caspase-Glo 3/7 Assay Systems | Promega | G8090 | |
| POLARstar OMEGA Microplate Reader | BMG LABTECH | N/A |
References
- Network, O. P. aT. National Data. Overall by Organ. Current U.S. Waiting List. Based on OPTN data as of October 19, 2017. , Available from: https://optn.transplant.hrsa.gov/data/view-data-reports/national-data/# (2017).
- OPTN, O. P. aT. N. National Data, Transplants by Donor Type, U.S. Transplants Performed January 1, 1988 - December 31, 2016, For Organ = Liver. , Available from: https://optn.transplant.hrsa.gov/data/view-data-reports/national-data/# (2017).
- Nemes, B., et al. Extended criteria donors in liver transplantation Part I: reviewing the impact of determining factors. Expert Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (7), 827-839 (2016).
- Nemes, B., et al. Extended-criteria donors in liver transplantation Part II: reviewing the impact of extended-criteria donors on the complications and outcomes of liver transplantation. Expert Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (7), 841-859 (2016).
- Pezzati, D., Ghinolfi, D., De Simone, P., Balzano, E., Filipponi, F. Strategies to optimize the use of marginal donors in liver transplantation. World J Hepatol. 7 (26), 2636-2647 (2015).
- Marecki, H., et al. Liver ex situ machine perfusion preservation: A review of the methodology and results of large animal studies and clinical trials. Liver Transpl. 23 (5), 679-695 (2017).
- Barbas, A. S., Knechtle, S. J. Expanding the Donor Pool With Normothermic Ex Vivo Liver Perfusion: The Future Is Now. Am J Transplant. 16 (11), 3075-3076 (2016).
- Dries, S., et al. Ex vivo normothermic machine perfusion and viability testing of discarded human donor livers. Am J Transplant. 13 (5), 1327-1335 (2013).
- Westerkamp, A. C., et al. End-ischemic machine perfusion reduces bile duct injury in donation after circulatory death rat donor livers independent of the machine perfusion temperature. Liver Transpl. 21 (10), 1300-1311 (2015).
- Selzner, M., et al. Normothermic ex vivo liver perfusion using steen solution as perfusate for human liver transplantation: First North American results. Liver Transpl. 22 (11), 1501-1508 (2016).
- Whitson, B. A., Black, S. M. Organ assessment and repair centers: The future of transplantation is near. World J Transplant. 4 (2), 40-42 (2014).
- Tolboom, H., et al. Subnormothermic machine perfusion at both 20°C and 30°C recovers ischemic rat livers for successful transplantation. J Surg Res. 175 (1), 149-156 (2012).
- Nagrath, D., et al. Metabolic preconditioning of donor organs: defatting fatty livers by normothermic perfusion ex vivo. Metab Eng. 11 (4-5), 274-283 (2009).
- Boehnert, M. U., et al. Normothermic acellular ex vivo liver perfusion reduces liver and bile duct injury of pig livers retrieved after cardiac death. Am J Transplant. 13 (6), 1441-1449 (2013).
- Schön, M. R., et al. Liver transplantation after organ preservation with normothermic extracorporeal perfusion. Ann Surg. 233 (1), 114-123 (2001).
- Reddy, S., et al. Non-heart-beating donor porcine livers: the adverse effect of cooling. Liver Transpl. 11 (1), 35-38 (2005).
- Banan, B., et al. Novel strategy to decrease reperfusion injuries and improve function of cold-preserved livers using normothermic ex vivo liver perfusion machine. Liver Transpl. 22 (3), 333-343 (2016).
- Held, P. An Introduction to Reactive Oxygen Species: Measurement of ROS in Cells. , BioTek Instruments, Inc. Vinooski, Vermont. 1-14 (2012).
- Chen, C. F., et al. Reperfusion liver injury-induced superoxide dismutase and catalase expressions and the protective effects of N-acetyl cysteine. Transplant Proc. 39 (4), 858-860 (2007).
- Chen, B., Tang, L. Protective effects of catalase on retinal ischemia/reperfusion injury in rats. Exp Eye Res. 93 (5), 599-606 (2011).
- He, Y. Y., Hsu, C. Y., Ezrin, A. M., Miller, M. S. Polyethylene glycol-conjugated superoxide dismutase in focal cerebral ischemia-reperfusion. Am J Physiol. 265 (1 Pt 2), H252-H256 (1993).
- Işlekel, S., Işlekel, H., Güner, G., Ozdamar, N. Alterations in superoxide dismutase, glutathione peroxidase and catalase activities in experimental cerebral ischemia-reperfusion. Res Exp Med (Berl). 199 (3), 167-176 (1999).
- Li, G., Chen, Y., Saari, J. T., Kang, Y. J. Catalase-overexpressing transgenic mouse heart is resistant to ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol. 273 (3 Pt 2), H1090-H1095 (1997).
- Nowak, K., et al. Immunotargeting of catalase to lung endothelium via anti-angiotensin-converting enzyme antibodies attenuates ischemia-reperfusion injury of the lung in vivo. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 293 (1), L162-L169 (2007).
- Beckman, J. S., et al. Superoxide dismutase and catalase conjugated to polyethylene glycol increases endothelial enzyme activity and oxidant resistance. J Biol Chem. 263 (14), 6884-6892 (1988).
- Yabe, Y., Nishikawa, M., Tamada, A., Takakura, Y., Hashida, M. Targeted delivery and improved therapeutic potential of catalase by chemical modification: combination with superoxide dismutase derivatives. J Pharmacol Exp Ther. 289 (2), 1176-1184 (1999).
- Yabe, Y., et al. Prevention of neutrophil-mediated hepatic ischemia/reperfusion injury by superoxide dismutase and catalase derivatives. J Pharmacol Exp Ther. 298 (3), 894-899 (2001).
- Ushitora, M., et al. Prevention of hepatic ischemia-reperfusion injury by pre-administration of catalase-expressing adenovirus vectors. J Control Release. 142 (3), 431-437 (2010).
- Kakizaki, Y., et al. The Effects of Short-Term Subnormothermic Perfusion after Cold Preservation on Liver Grafts from Donors after Cardiac Death: An Ex Vivo Rat Model. Transplantation. , (2018).
- Kumar, R., Chung, W. Y., Dennison, A. R., Garcea, G. Ex Vivo Porcine Organ Perfusion Models as a Suitable Platform for Translational Transplant Research. Artif Organs. , (2017).
- Nativ, N. I., et al. Liver defatting: an alternative approach to enable steatotic liver transplantation. Am J Transplant. 12 (12), 3176-3183 (2012).
- Yeung, J. C., et al. Ex vivo adenoviral vector gene delivery results in decreased vector-associated inflammation pre- and post-lung transplantation in the pig. Mol Ther. 20 (6), 1204-1211 (2012).
- Goldaracena, N., et al. Inducing Hepatitis C Virus Resistance After Pig Liver Transplantation-A Proof of Concept of Liver Graft Modification Using Warm Ex Vivo Perfusion. Am J Transplant. 17 (4), 970-978 (2017).
- Van Raemdonck, D., Neyrinck, A., Rega, F., Devos, T., Pirenne, J. Machine perfusion in organ transplantation: a tool for ex vivo graft conditioning with mesenchymal stem cells? Curr Opin Organ Transplant. 18 (1), 24-33 (2013).
- Pratschke, S., et al. Results of the TOP Study: Prospectively Randomized Multicenter Trial of an Ex Vivo Tacrolimus Rinse Before Transplantation in EDC Livers. Transplant Direct. 2 (6), e76 (2016).
- Pratschke, S., et al. Protocol TOP-Study (tacrolimus organ perfusion): a prospective randomized multicenter trial to reduce ischemia reperfusion injury in transplantation of marginal liver grafts with an ex vivo tacrolimus perfusion. Transplant Res. 2 (1), 3 (2013).
- Nativ, N. I., et al. Elevated sensitivity of macrosteatotic hepatocytes to hypoxia/reoxygenation stress is reversed by a novel defatting protocol. Liver Transpl. 20 (8), 1000-1011 (2014).
- Lonze, B. E., et al. In vitro and ex vivo delivery of short hairpin RNAs for control of hepatitis C viral transcript expression. Arch Surg. 147 (4), 384-387 (2012).
