Summary
상당한 간 기증자 부족 이며 간 기증자에 대 한 기준을 확대 했습니다. Normothermic ex vivo 간 관류 (NEVLP)를 평가 하 고 장기의 기능을 수정 개발 되었습니다. 이 연구 NEVLP의 쥐 모델을 보여 줍니다 고 간 보존 부상 완화 pegylated catalase의 능력을 테스트 합니다.
Abstract
간 이식의 중요 한 부족, 이식에 사용할 수 있는 이며 응답에서 기증자 기준을 확대 했습니다. 그 결과, normothermic 비보 전 간 관류 (NEVLP)를 평가 하 고 장기의 기능을 수정 하는 방법으로 도입 되었습니다. NEVLP에는 저체온증에 비해 많은 이점이 있다 고 보존 부상, 정상 장기의 기능 생리 조건 평가 기관 성능, 그리고 오르간 수리에 대 한 플랫폼으로의 복원 감소 subnormothermic 관류 등 리 모델링, 그리고 수정. Murine 및 돼지 NEVLP 모델 설명 되었습니다. 우리는 NEVLP의 쥐 모델을 설명 하 고이 모델을 사용 하 여 중요 한 응용 프로그램 중 하나를 보여-치료 분자 간 perfusate에 추가 사용 하 여. 카 탈 라 제 생 반응성 산소 종 (선생님) 폐품 이며 눈, 뇌, 그리고 폐에 국 소 빈 혈 reperfusion 감소 입증 되었습니다. Pegylation은 endothelium에 catalase를 대상으로 표시 되었습니다. 여기, 우리는 기본 perfusate pegylated catalase (못-고양이) 추가 간 보존 상해를 완화 하는 기능을 시연 했다. 우리의 설치류 NEVLP 모델의 장점은 큰 동물 모델에 비해 비싼 아니에요입니다. 이 연구의 한계는 그것은 현재 간 이식 후 관류는 포함 하지 않습니다. 따라서, 확실 하 게 예측 후 장기 이식의 함수를 만들 수 없습니다. 그러나, 쥐 간 이식 모델은 잘 설립 하 고 확실히이 모델과 함께에서 사용 될 수 있습니다. 결론적으로, 우리는 저렴, 간단 하 고, 쉽게 복제 가능한 NEVLP 모델을 쥐를 사용 하 여 설명 했다. 이 모델의 응용 프로그램 테스트 소설 perfusates 및 perfusate 첨가제, 테스트 기관 평가 위한 소프트웨어 및 장기를 복구 하도록 설계 된 실험을 포함할 수 있습니다.
Introduction
14,578 환자 간 이식 대기자 명단에 있으며 약 7000 이식 당 년1,2수행 됩니다. 이 중요 한 기증자 부족에 대응, 간 기증자에 대 한 기준을 확장 했다; 이 종종 한계 장기 또는 확장된 기준 기증자 하며 기본 이식 부전 및 지연된 이식 함수3의 더 높은 속도와 표준 기준 이식 보다 이식 후 덜 잘 수행할 것으로 예상 된다 4,,56. 그 결과, NEVLP 평가 기관 기능6,7을 수정 하는 방법으로 도입 되었습니다. 우리 NEVLP의 쥐 모델을 설계 하 고이 모델을 사용 하는 그것의 중요 한 잠재적인 응용 프로그램-간 perfusate에 비 발한 분자 첨가제의 테스트 중 하나를 보여 줍니다.
NEVLP (쥐) murine 및 돼지 모델 뿐만 아니라 폐기 인간의 장기6,,89평가 하고있다. NEVLP의 첫 인체 실험의 결과 또한 최근 게시10있다. 저체온증이 기계 관류 명확 하 게 신장 보존을 위한 표준 되고있다, 관류는 간 기계에서 발생 하는 온도 여전히 논란. NEVLP는 저체온증에 비해 많은 제안된 이점 및 subnormothermic 관류. 이들은 감소 보전 부상, 정상 장기의 기능 생리 조건, 장기 성능을 평가 하는 능력 및 기관 수리, 개조, 및 수정7,11를 위한 플랫폼으로의 복원 12,13,14,15,,1617.
연구의 상당수 돼지 NEVLP 모델을 사용 하 여 완료 되었습니다. 때 고려 모델을 사용 하 여 삭제 인간 장기 또는 인간 임상 시험이이 모델은 비교적 비싼 되지 않습니다, 하지만 그들은 우리의 작은 동물 NEVLP 모델에 비해 매우 비쌉니다. 중요 한 구성 요소는 실험 당 비용은 perfusate 이다. 우리는 상대적으로 저렴 한 비용에 perfusate의 300 mL와 4 h 관류를 완료할 수 있습니다. 또한, 쥐를 포함 하 여 작은 동물의 비용 돼지의 비용에 비해 매우 낮습니다.
쥐에서 NEVLP의 다른 모델에 비해 여기 모델 구현에 상대적으로 간단한 이며 광범위 한 응용 프로그램 있다. 관류 회로 그림 1에서 볼 수 있습니다. perfusate perfusate 저수지 (1), 물 외피 컨테이너에서 시작 합니다. Perfusate 롤러 펌프 (2) 저수지에서 가져온 이며 windkessel (3) 그리고 oxygenator (4)에 밀어. oxygenator 최대 가스 교환을 제공 역류 가스 및 perfusate 흐름에 대 한 설정 됩니다. Perfusate 다음 수익금으로 난방 코일 (5) 내부 생리 온도에, 그것을 보장 하기 위해 관류 챔버는 그리고 거기 공기 방울의 관류를 방지 하기 위해 거품 트랩 (6) 사전 (7) 및 후 기관 (8) 수를 perfusate 수 있는 샘플 포트 샘플링. perfusate 다음 문맥 정 맥을 통해 간을 입력합니다. 문맥 정 맥 압력 모니터 데이터 수집 소프트웨어에 있는 값을 차트에 첨부 됩니다. perfusate IVC 정 맥을 통해 간 종료 그리고 압력 이퀄라이저 블록 (9)으로 흐른다. 마지막으로, perfusate는 롤러 펌프를 통해 다시 압력 블록에서 가져온 이며 저수지에 비운. 이 모델 포함 하는 문맥에 지속적인 관류 및 간 동맥 및 투 석 다른 모델에 사용 되는 별도 고 추가 회로 필요, 타악기 흐름 밖으로 나뭇잎 하지만 이전 하지 입증 되었습니다. 필요한9,13.
perfusate에 새로운 치료 분자의 추가 탐험, 우리 효소 카 탈 라 제를 선택 했다. 카 탈 라 제는 생 선생님 폐품 선생님18의 효과 완화 하는 셀 내부 방어 메커니즘의 일부입니다. 카 탈 라 제 식 간 국 소 빈 혈 reperfusion 상해19에서 증가 된다. Catalase의 실험 또한 눈, 뇌, 그리고 폐20,,2122,,2324에 국 소 빈 혈 reperfusion 감소 입증 되었습니다. Pegylation 내 피 세포25에 피 catalase 이해에 원조 하는 catalase를 대상으로 표시 되었습니다. 못-고양이 되어 관리 체계적으로 간 국 소 빈 혈 reperfusion 상해; 감소에 제한 된 효능 그러나, 우리는26,,2728결과 추가 말뚝-고양이 격리 된 장기 관류 회로 개선 이어질 것을 가정 했다. 여기, 우리가 우리의 기본 perfusate 말뚝-고양이 추가 및 그것의 능력을 간 보존 부상 완화.
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Protocol
모든 절차는 기관 동물 관리의 지침에 따라 수행 했다 국가 연구 위원회의 자비 롭 배려 그리고 사용의 실험실 동물 (IACUC)에 대 한 가이드 하 고 오하이오 주립 대학 IACUC 위원회에 의해 승인을 받은.
1. 초기 설정
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다음 결합 하 여 관류 솔루션 준비: 25% 알 부 민 86 mL, 윌리엄스 미디어의 184 mL, 페니실린/스 (10 U/mL 페니실린과 0.01 mg/mL 스), 인슐린 (50 U/L), 헤 파 린 (0.01 U/mL), L-글루타민 (0.292 g/L), 30 mL 및 300 mL의 총 볼륨을 날린 (0.010 g/L). 기본 perfusate를 못 고양이 그룹, 페그-고양이의 625 U/mL를 추가 합니다.
- PH 7.4에 트리 (hydroxymethyl) aminomethane (THAM)를 사용 하 여 perfusate 솔루션을 버퍼링 합니다. 동맥 혈액 가스 기계를 사용 하 여 perfusate pH를 확인.
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회로 (그림 1)을 설정 합니다.
- 따뜻한 물 욕조에 설정 하 고 37 ° c.에 설정 워밍업을 기관 실을 수 있습니다.
- 저수지에 혼합 및 버퍼 된 perfusate를 부 어 하 고 순환을 시작 합니다.
참고:이 단계에서 언급 한 perfusate 단계 1.1.1에서에서 준비 되었다. - 인라인 oxygenator 통해 흐름 카운터에 의하여 가스 (95% 산소와 5% 이산화탄소)를 켭니다.
- 데이터 수집 소프트웨어를 켜고 클릭 "시작" 실험의 기간에 대 한 기록.
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수술 현미경과 수술 실 (그림 2)를 설정 합니다.
- 지구 온난화 보드, electrocautery, 마 취 및 생체 신호 (심장 박동과 산소 포화) 장비를 모니터링을 포함 하 여 모든 장비를 켜십시오.
참고: 현미경 설정을 사용 하는 현미경에 따라 달라 집니다 및 사용자의 편안 하 게 조정 될 수 있다. - 흡입 (분자량 184.5 g/mol)에 대 한 액체 isoflurane의 10 mL와 10 mL 마 취 주사기와 마 취 단위에.
- 헤 파 린 (50 U), 외과 악기의 0.5 mL 주사기를 위치, 4-0와 7-0 비단 봉합, 멸 균 면봉, 및 4 cm x 4 cm 직 거 즈 스폰지 적절 하 게 (그림 2).
- 지구 온난화 보드, electrocautery, 마 취 및 생체 신호 (심장 박동과 산소 포화) 장비를 모니터링을 포함 하 여 모든 장비를 켜십시오.
- Isoflurane 챔버를 준비 합니다.
2입니다. 마 취의 유도
- 다음과 같은 개인 보호 장비 (PPE) 착용: 수술 용 마스크, 수술 용 장갑, 일회용 가운.
- 쥐의 무게.
참고: 우리는 250-350 g 사이 Sprague-Dawley 쥐를 사용합니다. - 산소 압축기 및 isoflurane 켭니다. Isoflurane 챔버에 무게 되 고 후는 쥐를 놓고 뚜껑을 확보 합니다. 6% isoflurane 2 L/min의 산소 전달 사용 하 여 마 취를 유도.
참고: 사용 하는 정확한 isoflurane 복용량 사용 되 고 특정 마 취 시스템에 따라 달라 집니다. - 전자 면도기를 사용 하 여 동물의 복 부 머리. 클립
- 동물 isoflurane 챔버에 장착.
- 수술 실에서 마 취 장치를 켭니다.
- 마 취 유도 완전히 isoflurane 상공에서 쥐를 제거. 발가락 핀치를 사용 하 여 마 취의 깊이 확인 합니다.
3. 조달 절차
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16 G 포털 갑 (그림 3)를 준비 합니다.
- 16 G angiocatheter로 시작 합니다. 튜빙의 7mm 섹션을 잘라. 3.5. 절 개를 중간 지점에서 측정 하 여 7 mm 섹션의 중간점을 확인 하 고 튜브의 앞쪽 절반을 제거.
- 이 지금은 평평한 부분을 분쇄 하는 hemostat를 사용 합니다. 라이터를 사용 하 여 입술을 만드는 angiocatheter의 다른 쪽 끝을 녹기. 불꽃에 직접 팁을 배치 하지 마십시오 또는 그것은 점화 하는 것입니다.
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담 관 정을 준비 합니다.
- 27 G angiocath 고만 카 테 터를 떠나 주입 포트 차단. 27 G cannular 튜브의 10 cm 섹션에이 연결 합니다.
- 그것의 코를 가진 쥐를 마 취 코 콘에 놓고 그것의 4 개의 사지를 움직일 수 있습니다. 왼쪽된 뒷 끝에 모니터를 연결 하 여 생체 신호를 모니터링 합니다. 마 취의 적절 한 깊이 확인 하는 발가락 핀치를 수행 합니다. 4 %isoflurane 마 취를 계속 (무게 동물 > 250 g).
- 70% 이소프로필 알코올로 동물의 복 부를 스프레이. 건조를 허용 합니다. 동물 살 균 드 레이프를 놓습니다.
- 중간 절 개를 고 칼에서 사용 하 여 액을 날카로운가 위 (그림 4) 피부를 통해 확장을 확인 합니다. 부드럽게 복을 입력 하 고 근육을 incise. 이 절 개의 열 등 한 측면에서 방광과 간이 절이 개의 우수한 측면에서 손상 되지 않도록 주의 하십시오.
- 간 열 등 한 국경의 수준에서 크로스를 오른쪽과 왼쪽에 옆으로 절 개를 확장 합니다.
- 2%까지 마 취를 설정 (동물 무게 > 250 g).
- 곡선된 모기 클램프와 갈비뼈 늑 골 견인 기 (그림 5)를 사용 하 여 사용 하 여 칼 과정을 철회.
- falciform 인할지, 컷과 날카로운가 위 gastrohepatic 인 대.
- 찾아서 타이-오프 인할지 정 맥 누출을 방지 하기 위해 가능한 그것의 근원에 가까운로 7-0 봉합을 합니다.
- 쥐 살 균 moistened 목화 제보 주걱을 사용 하 여 내장을 들어낸 고 창 0.9% 정상적인 염 분을 적신 거 즈에 포장. 알아서 하지 작은 창 자의 맥 관 구조를 스트레칭.
- 열 등 한 베 나 정 맥 (IVC) 초과 조직을 제거를 통해 해 부. 그냥 분기점을 우수한 IVC 뒤에 dissect 그리고 나중에 사용 (그림 6)에 대 한 4-0 비단 봉합의 루프를 전달 합니다.
- 바로 부 신 정 맥에 노출을 제공 하는 오른쪽 신장 철회. 거 즈와 머리 간 오른쪽 엽을 철회. 최대한 IVC 가까이로 7-0 비단 봉합 사로 바로 부 신 정 맥에서 고 원심 넥타이 (그림 7)에 걸쳐 부식.
- 신중 하 게 비장 정 맥 밖으로 해 부, 그것은 2 개의 7-0 비단 봉합을 사용 하 여 고 두 봉합 사이 가로질러.
- 고 추가 혈관 포털 정 맥에 추가 길이 대 한 7-0 비단 봉합 사를 사용 하 여 필요한 경우 선.
참고: 있습니다 때로는 바로 부 신 정 맥 및 열 등 한 간 사이 infrahepatic IVC의 작은 분 지. - Gastroduodenal 동맥 주위 dissect, 7-0 비단 봉합으로 gastroduodenal 동맥에서 고 gastroduodenal 동맥 선.
- 간 동맥 주위 dissect 하 고 장소 주위 (그림 8) 7-0 비단 봉합 넥타이.
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담 즙 덕트에 밖으로 해 부.
- 담 즙 덕트의 길이 확인 합니다. 7-0 비단 봉합 사를 사용 하 여 선단부에서 담 즙 덕트에서 타이. 담 관 주위 7-0 비단 봉합의 루프를 가능한 proximally 놓습니다.
- 작은 위로 덕트의 절반 직경 구멍을 뚫고 고 27 G 테 담 즙 덕트 proximally 합니다. 로마 샌들 넥타이 봉합 (그림 9)를 사용 하 여 장소에 테를 묶어.
- 음 경 정 맥 또는 IVC 27g 바늘을 사용 하 여 동물의 헤 파 린 (50 U)의 0.5 mL를 주사.
참고: 27 G 인슐린 주사기가 대신 사용할 수도 있습니다. - 클램프와 IVC 이전 배치를 사용 하 여에서 4-0 비단 봉합 넥타이.
- 이전 배치를 사용 하 여 간 동맥을 묶어 7-0 비단 봉합.
- Microsurgical 클립을 사용 하 여 문맥을 클램프. 22 G angiocatheter를 사용 하 여 문맥 cannulate 플러시 간까지 1 mL 헤 파 린 (100 U)와 차가운 0.9% 정상적인 염 분의 60 mL와 문맥 blanches (그림 10).
참고: 간 즉시 희게 하지 않습니다 그것은 메 마른 면 끝 도포와 마사지 될 수 있습니다. - IVC suprahepatic 하 고 높은 가능한 가슴에 그것을 통해 잘라.
- hepatectomy 다음과 같이 수행 합니다. 막 주위, 간 동맥을 잘라, 잘라는 IVC, 포털 정 맥을 잘라, 어떤 추가 인 대를 잘라 잘라내어 간 꺼내. 간 얼음 차가운 0.9% 정상적인 염 분 (그림 11)에 놓습니다.
- 문맥 (그림 12)에서 16 G 혈관 팔목을 놓습니다. 간 비보 전 normothermic 간 관류 회로에 배치 합니다.
4. 전 비보 Normothermic 간 관류
참고: 여기에 사용 되는 perfusate 프로토콜 단계 1.1.1에서에서 준비 되었다.
- (그림 13) cuffed 문맥에 문맥 정 맥을 놓습니다.
- 문맥 정 맥 배치 하는 동안 하려면 2 mL/min에서 회로 통해 perfusate의 흐름을 유지 합니다. 시계 어떤 스파이크 문맥 압력;에 대 한 모니터 이 선박 차단 되 고 필요 하다는 정 맥의 위치를 나타낼 수 있습니다.
- 7-0 비단 봉합 사를 사용 하 여 perfusate의 반환 교류에 대 한 IVC 정에 봉합.
- 일단 두 뉼 그 자리에 이면, 10-16 cmH2O의 범위에서 생리 적 압력에 도달할 때까지 1 mL/min에서 흐름을 선회 시작 합니다.
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사전에서 1 mL 샘플 및 0, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 및 관류의 240 분에 후 포트를 가져가 라. 1 mL 샘플을 두 0.5 mL 샘플 나눕니다.
참고: 0.5 mL이 프로토콜 단계 4.5.1에서 사용 될 것입니다 그리고 0.5 mL 프로토콜 단계 4.5.2에서에서 사용 될 것입니다.- 스냅 액체 질소에 저온 관에이 샘플의 0.5 mL를 고정 합니다.
- Perfusate의 나머지 0.5 mL를 사용 하 여 동맥 혈 가스 분석을 실행 합니다.
- 각 시간 지점에서 혈액 가스 분석을 실행 한 후 (0, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 및 240 분) pH 수준을 검토 하 고 pH 7.4로 돌아갈 필요는 perfusate 버퍼.
- 4 h 관류의의 결론에 간 관류 회로에서 분리 합니다. 간 0.5 g 세그먼트로 나눕니다. 스냅 액체 질소에 저온 관에 간 조직 고정.
5. 사후 실험 분석
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0, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 및 상업 색도계 분석 실험 키트를 사용 하 여 240 분에서 perfusate에 알라닌 aminotransferase (ALT) 레벨을 결정 합니다.
- 간단히, 60 분 측정 570에서 광학 밀도 값에 대 한 37 ° C에서 반응 혼합 시 약으로 perfusate를 품 어 nm microplate 리더를 사용 하 여.
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0.5 g의 간 조직 세포의 용 해 버퍼의 100 µ L 균질 하 고 조직 lysate 아데노신 3 인산 염 (ATP), 티 (GSH) 및 malondialdehyde (MDA)에 대 한 분석.
- 간단히, 상업 시험 키트를 사용 하 여 간 조직 샘플의 ATP 수준을 측정 합니다. 반응 버퍼와 샘플을 혼합 하 고 30 분 측정 570에서 광학 밀도 대 한 실 온에서 품 어 nm microplate 리더를 사용 하 여.
- 상용 시험 키트를 사용 하 여 간 조직 샘플의 GSH 레벨을 측정 합니다. 조직 샘플 분석 결과 칵테일 믹스. 405-414 nm에 광학 밀도 값을 측정 합니다.
- 상용 시험 키트를 사용 하 여 간 조직 샘플의 MDA 레벨을 측정 합니다. TBA와 60 분 분리기 반응에 대 한 95 ° C에 열 샘플을 혼합 하 고 96 잘 접시에는 상쾌한 전송. 532에서 광학 밀도 측정 nm.
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0.5 g의 간 조직 세포의 용 해 버퍼의 100 µ L 균질 하 고 상업 시험 키트를 사용 하 여 상대 caspase-3/7 활동에 대 한 lysate 조직 분석.
- Caspase-3-7 시 분석 결과 버퍼와 조직 lysate를 혼합 하 고 30 분 동안 실 온에서 품 어.
- 잘 사용 하 여 각 microplate 리더에 형광 레벨을 측정 합니다.
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상업적인 제자리에 죽음 탐지 키트를 사용 하 여 간 조직 샘플에 apoptotic 세포의 수준을 결정 합니다.
- 사전 치료는 0.5 g 조직 섹션 10 U/mL 가수분해 K 10 분으로 하 고 60 분 수행 형광 현미경을 사용 하 여 분석에 대 한 37 ° C에서 반응 혼합물으로 품 어.
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Representative Results
그룹 당 3 개의 쥐의 샘플 크기 사용 되었다. ALT는 0, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 및 관류의 240 분에서 측정 했다. 우리가 사용 하는 학생의 t-기본 perfusate 및 기본 perfusate 플러스 각 시간 지점에서 못 고양이 그룹 사이 결과 비교 하는 테스트. 기본 perfusate 및 기본 perfusate 플러스 말뚝-고양이 그룹을 비교, 거기에서는 훨씬 적은 (p < 0.05) 기본 perfusate 플러스 150, 180, 210, 240 분 (그림 14A)에서 못 고양이 그룹에서 ALT.
간 조직 기본 perfusate 및 기본 perfusate 플러스 말뚝-고양이 그룹에서 조직 손상 분석 하기 위해 조달 했다. 우리가 사용 하는 학생의 t-기본 perfusate 및 기본 perfusate 플러스 말뚝-고양이 그룹 사이 결과 비교 하는 테스트. 조직 ATP 기본 perfusate 플러스 기본 perfusate 혼자 그룹에 비해 못 고양이 그룹에 유지 되었다 (그림 14B, p < 0.05). 조직 MDA 생산 기본 perfusate 그룹 기본 perfusate 플러스 말뚝-고양이 그룹 보다 크게 높았다 (그림 14C, p < 0.05). 총 GSH 기본 perfusate 플러스 기본 perfusate 혼자 그룹에 비해 못 고양이 그룹에 유지 되었다 (그림 14D, p < 0.05).
분석 apoptosis, 간 조직 caspase 3/7 활동 그룹 사이 비교 되었다. 형광에 각 잘 측정 했다. 우리가 사용 하는 학생의 t-기본 perfusate 및 기본 perfusate 플러스 말뚝-고양이 그룹 사이 결과 비교 하는 테스트. Caspase 3/7 활동 기본 perfusate 플러스 말뚝-고양이 그룹 기본 perfusate 혼자 그룹에 비해 크게 감소 했다 (그림 15A, p < 0.05). 터미널 deoxynucleotidyl 전이 효소 (TdT) dUTP 닉-엔드 라벨 (TUNEL) 얼룩 apoptosis는 그룹 간의 비교에 사용 되었다. Apoptotic 세포의 백분율은 기본 perfusate 플러스 말뚝-고양이 그룹 기본 perfusate 혼자 그룹에 비해 훨씬 적은 (그림 15B, p < 0.05).
그림 1: 관류 회로. 회로의 구성 요소에 레이블이 지정 됩니다. perfusate perfusate 저수지 (1), 물 외피 컨테이너에서 시작 합니다. Perfusate 롤러 펌프 (2) 저수지에서 가져온 이며 windkessel (3) 그리고 oxygenator (4)에 밀어. oxygenator 최대 가스 교환을 제공 역류 가스 및 perfusate 흐름에 대 한 설정 됩니다. perfusate 다음에 생리 온도 공기 방울의 관류를 방지 하기 위해 거품 트랩 (6)에 관류 챔버 내부 난방 코일 (5)에 진행 됩니다. 전 기관 (7)와 후 기관 (8) 샘플링 수를 perfusate 수 있는 샘플 포트. perfusate 다음 문맥 정 맥을 통해 간을 입력합니다. 문맥 정 맥 압력 이퀄라이저 (9) 조절 압력 모니터에 첨부 됩니다. 마지막으로, perfusate는 롤러 펌프를 통해 다시 압력 블록에서 가져온 이며 저수지에 비운. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 수술 실 및 수술 악기 설정. 수술 현미경 (1) 적절 한 높이 및 사용자에 대 한 배율 조정 되어야 한다. Isoflurane 마 취 기계 (2)에 미리 로드 될 수 있습니다. 동물의 코는 코 콘 (3)에 배치 됩니다. 그들은 쉽게 접근된 (4) 수 외과 기구 계획 되어야 한다. 근처 electrocautery (5) 데 도움이 됩니다. 봉합 (6) 조각, 필요할 때 신속 하 게 얻을 수 있습니다 그래서 미리 잘라 해야 하 고 추가 사용할 수 (7) 해야 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 16 G 문맥 갑 준비. 16 G angiocatheter로 시작 합니다. 튜빙의 7mm 섹션을 잘라. 3.5. 절 개 여기를 측정 하 여 7 mm 섹션의 중간점을 확인 하 고 튜브의 앞쪽 절반을 제거. 이 지금은 평평한 부분을 분쇄 하는 hemostat를 사용 합니다. 입술을 만드는 angiocatheter의 다른 쪽 끝을 라이터를 사용 합니다. 불꽃에 직접 팁을 배치 하지 마십시오 또는 그것은 점화 하는 것입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 중간 절 개. 중간 절 개를는 칼에서 (1) 액 (2) 사용 하 여 날카로운가 위 및 피부와 근육을 통해 확장을 확인 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 적절 한 철회 얻기. (1) 사용 하 여 곡선된 모기 클램프 (2)와 갈비뼈 늑 골 견인 기 (3, 4)를 배치 하 여 칼 과정을 철회. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6: 열 등 한 베 나 정 맥 (IVC) 해 부. 뒤집기까지 노출 오른쪽 신장 간 (1), 포털 정 맥 (2). IVC (3) 주위 dissect 하 고 차후 사용을 위해 7-0 봉합의 루프를 배치 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7: 바로 부 신 혈관의 결 찰. 바로 부 신 정 맥에 노출을 제공 하는 오른쪽 신장 (1)을 철회. 바로 부 신 정 맥에서 고 그것을 통해 잘라. Moistened 거 즈 (2) 간이이 작전 동안 보호 하기 위해 사용할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 8: 간 동맥 해 부. 주위 해 부 고 (1) (2) 문맥에서 전달 하기 근처 간 동맥 주위 넥타이 배치 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 9: 담 즙 덕트 cannulation. Cannulate (1) 27 G angiocatheter를 사용 하 여 담 관 (2) 27 G 튜브 (3)에 연결. 이 관류 동안 담 즙을 수집 하는 데 도움이 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 10: 간 플러시. (1)와 함께 60 간 플러시 cc 100 U 찬 0.9% 정상적인 염 분의 (1 mL) 헤 파 린 16 G angiocatheter (2)를 사용 하 여. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 11:는 hepatectomy 후. hepatectomy 수행 하 고 차가운 식 염 수에 간 장소. 알아서 하지 담 관 정을 꺼내. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 12: 문맥 정돈. 포털 정 맥을 찾습니다. 대형 클램프 (1)를 사용 하 여 몇 밀리미터-클램프 위에 정 맥의 입술을 떠나 정 맥을 개최. Microsurgical 집게 (2, 3)를 사용 하 여 포털 정 맥에서 16 G 관 갑 (4)를. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 13: 문맥 팔목 및 우수한 IVC cannulation. Cannulate 문맥 갑 (1) 및 우수한 IVC (2). 큰 해야 합니다 주의 담 관 정 (3)를 꺼내 려 하지. 또한, 주의 하지 우수한 IVC 트위스트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 14: 기본 perfusate 전용 및 기본 perfusate에서 조직 손상의 분석 및 말뚝 고양이 그룹 플러스 (N = 3/그룹). 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. (A) 알라닌 aminotransferase (ALT) 수준. 사이 베이스 perfusate 및 기본 perfusate + pegylated catalase (못-고양이) 그룹 ALT 수준 비교에 훨씬 적은 기본 perfusate 플러스 150, 180, 210, 240 분에 못 고양이 그룹에서 ALT (p < 0.05). (B) 아데노신 3 인산 염 수준입니다. 조직의 아데노신 3 인산 염 (ATP) 기본 perfusate 플러스 기본 perfusate 혼자 그룹에 비해 못 고양이 그룹에 유지 되었다 (p <0.05). (C) Malondialdehyde 수준입니다. 조직 malondialdehyde (MDA) 생산 기본 perfusate 플러스 말뚝-고양이 그룹 보다 기본 perfusate 그룹에서 현저 하 게 높았다 (p < 0.05). (D) 티 수준입니다. 총 티 (GSH) 기본 perfusate 플러스 기본 perfusate 혼자 그룹에 비해 못 고양이 그룹에 유지 되었다 (p < 0.05). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 15: 기본 perfusate 전용 및 기본 perfusate에 있는 apoptosis의 분석 및 말뚝 고양이 그룹 플러스 (N = 3/그룹). 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. (A) Caspase-3/7 Activity.Caspase 3/7 활동 기본 perfusate 플러스 말뚝-고양이 그룹 기본 perfusate 혼자 그룹에 비해 크게 감소 했다 (p < 0.05). (B) 터미널 deoxynucleotidyl 전이 효소 (TdT) dUTP 닉-엔드 라벨 (TUNEL) 얼룩. 이미지는 형광 현미경 X 4를 사용 하 여 촬영 했다. Apoptotic 세포의 백분율은 기본 perfusate 플러스 말뚝-고양이 그룹 기본 perfusate에 비해 훨씬 적은 (p < 0.05). 녹색: apoptotic 세포입니다. 블루: 핵. 스케일 바 = 1000 µ m. TUNEL 긍정적인 세포 4 무작위 미세한 필드에서 셀을 계산 하 여 계량 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
이식에 사용할 수 있는 간 이식의 중요 한 부족은 그리고 응답에 기증자 기준 확장된1,2,3,,45되었습니다. 기증자 부족 결과로 NEVLP 평가 기관 기능6,7을 수정 하는 방법으로 도입 되었습니다. 우리는 NEVLP의 쥐 모델을 설계 했습니다. 또한, 우리는이 모델을 사용 하는 중요 한 잠재적인 응용 프로그램 중 하나를 보여-간 perfusate에 비 발한 분자 첨가제의 테스트. 여기, 우리는 기본 perfusate 말뚝-고양이 추가 간 보존 상해를 완화 하는 기능을 시연 했다.
중요 한 단계
간 관류 회로 구입 하 고 수정 없이 사용 되었습니다. 회로 그림 1에 구상 될 수 있다. 사용 하는 perfusate 저수지는 생리 적인 온도에 perfusate를 유지 하는 데 사용 되는 water-jacketed 컨테이너입니다. 저수지에서 perfusate는 밖으로 펌핑 하 고 windkessel 챔버로 밀어 롤러에 의해 당겨진 다. 이 챔버는 perfusate의 타악기 흐름을 저해할 하 고 기관에 항목에 대 한 더 많은 층 류 수 있습니다. windkessel 후 챔버는 oxygenator perfusate 흐름. oxygenator 역류 가스 및 perfusate 흐름을 제공 하는 perfusate에 최대 가스 교환을 95% 산소에 대 한 설정 됩니다. Perfusate 다음 생리 온도에서 아직도 다는 것을 보장 하기 위해가 열 코일에 진행 합니다. 거품 함정 기관 공기 방울의 관류를 방지 하기 전에 오른쪽. perfusate은 다음 펌핑 거품 트랩에서 문맥 정 맥을 통해 간으로. 문맥 정 맥 압력 모니터에 대 한 그것의 작은 분 지는 있다. 압력 센서의 아무 손실 되는 액체로 공기 하지 센서 튜브를 끝났다 한다. 순환기는 오르간, 후는 perfusate 압력 이퀄라이저를 열 등 한 정 맥 정 맥을 통해 간으로 흐른다. 압력 이퀄라이저 블록 회로 또는 기관의 가압을 통해 방지할 수 있습니다. 마지막으로, perfusate는 롤러 펌프를 통해 다시 압력 블록에서 가져온 이며 저수지에 비운.
각 재 관류를 시작 하기 전에 회로의 육안 검사 손상이 나 회로 구성 요소 또는 튜브에 증강을 식별 하기 위해 수행 되어야 한다. 박테리아 또는 회로에 다른 물질의 경우 부품 교체 또는 청소, 가능 하다 면 한다. 다음, 내부 구성 요소를 유지 하는 세제 솔루션 밖으로 씻어 서 해야 합니다. 구성 요소 밖으로 씻어 서 되 고는으로 압력 센서와 압력 라인 이온된 수로 어떤 공기 거품의 제거 해야 합니다. 또한, 흐름 읽고 압력 변화에 적절 하 게 응답 되도록 정기적으로 조정 되어야 한다. 압력 센서를 적절 하 게 응답 하지 않는 라인 센서에 있는 모든 항목을 확인 하 고 recalibrated 필요한 경우 합니다. 관류의 시작에 간 혈관 눌릴 것 또는 회로 간 연결 시 트위스트 될 하지 할 다는 것을 확인에 결정적 이다. 이것이 이미 일어났다 면 것입니다 즉시 압력 스파이크 볼 로그 트렌드 모니터에. 가장 일반적인 오류는 제대로 위치 정으로 문맥에 꼬임. 그것을 약간 밖으로 당기 및 포털 정 맥 교정 더 자연 스러운 위치에 선박을 이동 하 여이 문제를 해결할 수 있습니다. 압력 모니터 압력과 향상 된 일관성에 드롭이 문제의 해결을 나타냅니다. 다음, 포털 정 맥 정 맥에 문맥 팔목을 연결할 때 선박 수 될 트위스트 장기의 방해한 관류. 팔목을 조정 하 고이 오류를 수정 다음 즉시 반환 하는 낮은 압력 및 수준에서 일관 된 흐름에 문맥 압력에 갑자기 스파이크를 발생 합니다. 꼬인 또는 꼬인 IVC는 정 및 선박의 불 룩에서 아무 흐름에 의해 신속 하 게 확인할 수 있습니다. 하지만 베 나 정 맥에 이러한 오류 중 두 문맥 문제 달리이 기관에가 해지는 압력과 신속 하 게 해결 해야 또한 압력이 증가 발생 합니다. 이 문제는 10 분 이내 해결 되어야 하거나 실험을 취소 해야 합니다. 실험을 취소에 대 한 즉각적인 표시는 명확한 부 종 첫 20 분 내의 기관에 보고 하 고 있다.
간 또는 정 맥 연결 중 하나에서 누출 경우에 perfusate 저수지 수준 모니터링 중요할 것 이다. Perfusate 실행 하 고 펌핑 공기 실험에 심각한 될 수 있습니다. 일단 공기 라인으로 펌핑 실험을 일시 중지 하 고 다시 프라임 배관 라인 수 아니다. 유일 하 게 가능한 수정 주입 된 공기를 잡으려고 거품 트랩입니다.
수정 및 문제 해결
일단 회로 플러시는 oxygenator 라인에 넣을 수 있습니다 그리고 회로 perfusate와 함께 준비 하는 수 있습니다 다음. 제대로 oxygenator에서 공기를 제거 몇 분 걸릴 수 있습니다 하지만 공기 색 전 증을 관류 중간 생성 되지 않습니다 확신에 중요 한 단계. oxygenator 완전히 거품 함정 옆에 채워져야 하는 perfusate와 함께 준비가 끝났다 후 양식 할 어떤 공기 방울을 캡처하십시오. 이 시점에서 회로 흐름을 간 cannulation에 대 한 준비가 될 때까지 이동 하는 perfusate를 유지 하는 1 또는 2 mL/min의 흐름에 설정 되어야 합니다.
Cannulating는 문맥 및 간 IVC, 후 압력 증가 하 고 레벨 해야 합니다. 흐름은 정상적인 생리 적 압력을 증가 기록된 압력 비슷한 stepwise 방식으로 증가 하기 시작 한다. 원하는 흐름 (8-16 mmHg) 달성 되 면 압력 일정 유지 됩니다. 우리 10 mmHg의 압력에 대 한 목표와 흐름을 조절. 필요한 흐름 10 mmHg의 압력을 도달 하는 기관에 의해 달라질 수 있습니다. 기관에서 perfusate의 약간의 누설이 있을 수 있습니다 하지만이 perfusate 수집 하 고 저수지에 반환 될 수 있습니다.
회로 모든 관류 챔버와 저수지를 유지 하 고 보존 일회용 튜브와 포트 후 청소 되어야 한다. 모든 perfusate는 회로에서 제거 되어야 합니다. 회로 이온된 물 300 mL의 최소 즉시 플러시됩니다 되어야 한다. 이온된 수 플러시 회로 튜브 동안 외부 부품을 적절 하 게 청소 되어야 한다. 외부 부품 씻어 또는 부드럽게 닦아와 있어야 건조 공기를 허용 합니다. 회로 구성 요소는 약 하며 쉽게 손상 될 수 있습니다. 그것은 그러므로 그것을 부드럽게 청소 매우 중요. 내부 회로 알칼리 성 세제에 때 사용 중인 이온된 수의 5% 솔루션에 유지 한다. 회로에 세제는 튜브의 수명을 연장 및 거품 트랩 등의 다른 구성 요소에 증강을 방지 하 고 이퀄라이저 압력 수 있습니다.
각 사용 후 철저 한 청소 및 유지 보수는 회로의 회로 대부분 어려움을 막을 수 있습니다. 이렇게 막힌된 튜브 또는 뉼으로 이어질 수 있는 잔여 perfusate의 아무 증강 확인 하면 됩니다. 회로 구성와 튜브에 정기적으로 검사와 오염 또는 흐름에 제한 되도록 각 사용 하기 전에 필요에 따라 교체 있어야 합니다.
제한 사항
이 작은 동물 NEVLP 모델의 한계는 포함 되지 않습니다 현재 후 관류 이식 이다. 따라서 이식 후 간 이식 함수를 평가할 수는. 이것은 미래의 연구를 위한 중요 한 지역 이다. 또한, 작은 동물 회로 활용 하 여 필요 지식 및 기술 합니다.
기존 모델에 관하여 의미
돼지와 murine 저체온증, subnormothermic, 및 normothermic 비보 전 간 관류 모델 (쥐) 문학에서 설명 되었습니다. 관류 온도 대 한 논란이 여전히 존재 하지만 그것은 보였다 그 기계 관류 온도9에 간 이식의 기능을 향상 시킬 수 있습니다. 여기에 제시 된 NEVLP 모델 간단 하 고, 쉽게 복제, 저렴 한 비용, 이며 응용 프로그램의 광범위 한 범위를 하고있다. 이 모델은 투 석 또는 타악기 흐름으로 그들은 불필요 한9,13로 표시 되었습니다 몇 가지 다른 모델에 포함 되는 간 동맥을 포함 되지 않습니다. 또한, NEVLP를 사용 하 여 첫 번째 인체 실험의 결과이 간 보존의 효과적인 방법으로 나타났습니다-따라서,이 모델 비보 전 간 관류10의 미래 응용 프로그램 테스트에 이상적입니다.
미래의 응용 프로그램
NEVLP에 대 한 미래의 애플 리 케이 션의 다양 한 문학에서 제안 되었습니다. 이러한 각각의 조직적으로 버려진된 인간의 장기에 그리고 인간의 간은 테스트 전에 동물 모델에서 테스트 해야 합니다. 여기에 제시 된 모델은 그것 쉽게 복제, 불필요 한 단계를 제거 하 고 낮은 비용으로 이러한 새로운 미래 응용 프로그램을 테스트 합니다. 이 모델의 가장 중요 한 잠재적인 응용 프로그램 중 하나는 여기에-소설 pharmacologic perfusate 첨가제의 테스트 시연. 손상 된 장기의 수리를 포함 하는 다른 제안 된 응용 프로그램의 steatotic 장기의 이식, C 형 간염 바이러스 저항, 중간 엽 줄기 세포 치료, 진 수정, 그리고와 관류의 도입을 허용 하도록 간 defatting 기전을 에이전트11,31,32,33,34,35,36,,3738.
결론
결론적으로, 우리는 저렴 하 고 쉽게 복제할 NEVLP 모델을 쥐를 사용 하 여 설명 했다. 이 모델의 사용 주의 준비, 연습, 및 지식, 필요 하지만 낮은 비용으로 구현 될 수 있습니다. 이 모델의 응용 프로그램으로 대표적인 결과에서 설명 되었다 소설 perfusate 첨가제 테스트 포함할 수 있습니다. 이 모델의 응용 프로그램은 기관 평가, 다른 perfusates 및 인공 또는 헤모글로빈 산소 수송 및 장기를 복구 하도록 설계 된 에이전트에 대 한 테스트 소프트웨어를 포함할 수 있습니다.
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Disclosures
모든 저자 들은 아무 관련 공개 보고서.
Acknowledgments
이 작품은 장기 이식, 관류, 엔지니어링 및 오하이오 주립 대학에서 재생에 대 한 NIH T32AI 106704-01A1와 토니 flesch 식 기금에 의해 지원 되었다.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Perfusate | |||
8% Albumin | CLS Behring, King of Prussia, PA | 0053-7680-32 | |
Williams Media | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | W1878 | |
Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | P4333 | |
Insulin | Eli Lilly, Indianapolis, IL | 0002-8215-91 | |
Heparin | Fresnius Lab, Lake Zurich, IL | C504701 | |
L-glutamine | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | G3126 | |
Hydrocortisone | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | H0888 | |
THAM | Hospira, Inc, | 0409-1593-04 | |
Polyethylene Glycol - Catalase | Sigma Aldrich | S9549 SIGMA | |
Personal Protective Equipment | |||
Surgical Mask | Generic | N/A | |
Protective Gown | Generic | N/A | |
Surgical Gloves | Generic | N/A | |
Liver Procurement | |||
Sprague-Dawley Rat | Harlan Sprague Dawley Inc. | 250 -350 grams | |
Surgical Microscope | Leica | M500-N w/ OHS | |
Charcoal Canisters | Kent Scientific | SOMNO-2001-8 | |
Isoflurane | Piramal Healthcare | N/A | |
Pressure-Lok Precision Analytical Syringe | Valco Instruments Co, Inc. | SOMNO-10ML | |
Electrosurgical Unit | Macan | MV-7A | |
Warming Pad | Braintree Scientific | HHP2 | |
SomnoSuite Small Animal Anesthesia System | Kent Scientific | SS-MVG-Module | |
PhysioSuite | Kent Scientific | PS-MSTAT-RT | |
Isoflurane chamber | Kent Scientific | SOMNO-0530LG | |
SurgiVet | Isotec | CDS 9000 Tabletop | |
Oxygen | Praxair | 98015 | |
Rib retractors | Kent Scientific | INS600240 | |
GenieTouch | Kent Scientific | GenieTouch | |
Normal Saline | Baxter | NDC 0338-0048-04 | |
4x4 Non-Woven Sponges | Criterion | 104-2411 | |
Sterile Q-Tips | Henry Schein Animal Health | 1009175 | |
U-100 27 Gauge Insulin Syringe | Terumo | 22-272328 | |
5mL Syringe | BD | REF 309603 | |
4-0 Braided Silk Suture | Deknatel, Inc. | 198737LP | |
7-0 Braided Silk Suture | Teleflex Medical | REF 103-S | |
16 gauge Catheters | BBraun Introcan Safety | 4252586-02 | |
14 gauge Catheters | BBraun Introcan Safety | 4251717-02 | |
Bile Duct Cannular Tubing | Altec | 01-96-1727 | |
Liver Perfusion Circuit Components | |||
Water Bath Warmer | Lauda Ecoline Staredition | E103 | |
Data Collection Software | ADInstruments | Labchart 7 | |
Liver Perfusion Circuit | Harvard Apparatus | 73-2901 | |
Membrane Oxygenator | Mediac SPA | M03069 | |
Roller Pump | Ismatec | ISM827B | |
Gas (95% oxygen and 5% carbon dioxide) | Praxair | 98015 | |
Organ Chamber | Harvard Apparatus | ILP-2 | |
1.8 mL Arcticle Cryogenic Tube | USA Scientific | 1418-7410 | |
Mucasol | Sigma-Aldrich | Z637181 | |
Microsurgical Instruments | |||
Small Scissors | Roboz | RS-5610 | |
Large Scissors | S&T | SAA-15 | |
Forceps - Large Angled | S&T | JFCL-7 | |
Forceps - Small Angled | S&T | FRAS-15 RM-8 | |
Clip Applier | ROBOZ | RS-5440 | |
Scissors - non micro | FST 14958-11 | 14958-11 | |
Forceps - Straight Tip | S&T | FRS-15 RM8TC | |
Large Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-01 | |
Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-01 | |
Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-02 | |
Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-03 | |
Small Mosquito Clamps | Generic | N/A | |
Post-Experiment Analysis | |||
Alanine Aminotransferase (ALT) Activity Colorimetric/Fluorometric Assay Kit | BioVision | K752 | |
Adenosine Triphosphate (ATP) Colorimetric/Fluorometric Assay Kit | BioVision | K354 | |
Glutathione Assay Kit | Cayman Chemical | 703002 | |
Lipid Peroxidation (MDA) Assay Kit | Abcam | ab118970 | |
Caspase-Glo 3/7 Assay Systems | Promega | G8090 | |
POLARstar OMEGA Microplate Reader | BMG LABTECH | N/A |
References
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