Summary
Здесь мы описываем протокол для визуализации мотонейрона проекции и аксон арборизация в трансгенной эмбриона мыши Hb9::GFP . После иммуноокрашивания для двигательных нейронов мы использовали свет лист флуоресцентной микроскопии для изображения эмбрионов для дальнейшего количественного анализа. Этот протокол применяется к другим процессам навигации нейрон в центральной нервной системе.
Abstract
Мотонейронов спинного мозга (MNs) расширить их аксоны общаться с их innervating цели, тем самым контроль движения и сложные задачи в позвоночных. Таким образом важно выявить молекулярные механизмы как Мотор аксоны перейдите к arborize и иннервируют их периферические миорелаксанты цели во время разработки и дегенерации. Хотя трансгенных линий мыши Hb9::GFP долго служил для визуализации траекторий двигателя аксона во время эмбрионального развития, подробные описания полного спектра терминала арборизация аксона остаются неполными ввиду сложности шаблон и ограничения текущей оптической микроскопии. Здесь мы описываем улучшение протокол, который сочетает в себе свет лист флуоресцентной микроскопии (LSFM) и анализ надежной изображений и количественно и качественно визуализировать развивающихся мотор аксоны. Эта система может быть легко принял пересечь генетических мутантов или MN болезни модели с Hb9::GFP линиями, раскрывая новые молекулярные механизмы, которые приводят к дефектам в мотор аксона навигации и арборизация.
Introduction
MNs позвоночника являются частью центральной нервной системы, но иннервируют периферийных мышцы для контроля движения. В развивающихся спинного мозга MN прародителями (ПНЛ) устанавливаются согласно сигналы, исходящие от хорда и смежные сегменты. Все продифференцировано пост митотическая MNs затем создаются из ПНЛ, в конечном счете порождает ряд подтипов MN вдоль оси rostrocaudal спинного1,2. Позвоночника MNs топографически и анатомически хорошо организованы. Расположение их морфологические коррелирует с позиции их соответствующих целевых в периферии3. По достижении их целей мышц, аксоны получать сотовой и экзогенных нейротрофических факторов, которые побудить их расширения и филиал в мышцы. Иннервация и ветвления дефекты могут способствовать несоздания нервно развязок (NMJ). Например, глиальные нейротрофического факторы (GDNF)-индуцированной Pea3 является необходимым условием для арборизация аксона в кожный maximus (см) и мышцы, широчайшая мышца спины (LD)4,5. Кроме того рестораны нокаут мыши эмбрионов показывают дефектных арборизация диафрагмального нервов в диафрагмы, вызывая дыхательной недостаточности и смертности сразу же после рождения6,7. Таким образом этот последний шаг MN созревания (то есть, аксональное проекции и ветвление) имеет решающее значение для обеспечения связи между нейронами и клеток-мишеней.
Чтобы просмотреть шаблоны арборизация, исследователи обычно проводят конфокальная томография или легкие микроскопии флуоресцирования двух Фотон секционного или целое гора образцов8,9,10. Оба эти методы микроскопии генерировать приемлемое разрешение и глубину проникновения. Световой микроскопии флуоресцирования двух Фотон предполагает возбуждения флуорофоров одновременное поглощение двух нижнего энергии фотонов11. Поскольку два Фотон возбуждения использует ближнего инфракрасного излучения, снижение возбуждения частоты способствует уменьшение рассеяния и лучшего проникновения ткани до 1 мм в ткани, таким образом позволяя изображений с большей глубиной. Конфокальная микроскопия удаляет фильтры из фокус сигналов и только собирает свет в пределах фокальной плоскости12. С этим подходом изображения образцов из разных фокальной плоскости могут быть объединены для получения трехмерных (3D) изображения через функцию Z-стека. Тем не менее интенсивность сигнала снижается, как большинство свет блокируется и высокой численного отверстия закрывают глубина резкости. Что еще более важно обе методики способствуют тяжелые фотоповреждения и Фототоксичность поскольку весь образец получает свечение, даже тогда, когда только один самолет отображаемого в данный момент.
Чтобы обойти эти недостатки, LSFM стал благоприятствования альтернативы, с преимуществами, быстро, эффективно свет и меньше фототоксических13,14. Кроме того LSFM позволяет нескольких изображений. Этот подход особенно подходит для визуализации мотор аксонов и их диспергирования терминалы, как они распространились в трехмерном пространстве. LSFM превосходит другие два варианта, поскольку образцы устанавливаются на сцене, которая позволяет вращение вокруг вертикальной оси и движения вдоль x, y и z оси. Эта установка позволяет не только минимально заблокированных вид образца, но и выбор желательной освещение пути, недостаток двух фотонов и конфокальная микроскопия, оба из которых требуют монтажа образцов на слайде плоских. Таким образом LSFM является наиболее подходящим инструментом для 3D визуализации арборизация аксона и количественного определения двигательного нерва терминалов в эмбрионов мыши.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все живые животные хранились в конкретного возбудителя бесплатно (SPF) животных фонда, утвержденных и контролируется IACUC Синика.
1. Фиксация
- Собирать эмбрионов эмбриональных день 12,5 (E12.5) затем обезглавить и потрошение их.
- Исправьте эмбрионы индивидуально в 24-ну пластины с 1 мл/хорошо свежеприготовленные параформальдегида 4% в 1 x фосфатный буфер (PBS) на ночь. Инкубируйте на 4 ° C на шейкер.
- Вымойте фиксированной эмбрионов по крайней мере 3 x, каждый на 5-10 мин, с 1 мл раствора 1 x PBS и инкубировать на ночь при 4 ° C на шейкер для удаления остаточных параформальдегида.
2. всего гора иммуноокрашивания
- Разрушения каждого эмбриона в 1 мл 0,5% PBS-Тритон-X-100 (PBST) на ночь при 4 ° C на шейкер.
- Блокировать каждого образца с 1 мл 10%, ФБС, подготовленном в однократном ПБС на ночь при 4 ° C на шейкер.
- Инкубировать эмбриона с 1 мл раствора первичного антитела анти GFP (1:1, 000 разрежения в 10% FBS) при 4 ° C для 72 ч с постоянной тряски активизировать сигнал GFP двигательных нервов.
- После основное антитело инкубации, мыть с 1 мл 0,5% PBST в течение 1-2 дней при температуре 4 ° C на шейкер, изменив 0,5% PBST по крайней мере три раза.
- Применять 1 мл вторичные антитела (1:1, 000 разрежения в 10% FBS) и инкубировать на ночь в темноте при температуре 4 ° C постоянном встряхивании.
- Вымойте 3 x с 1 мл 0,5% PBST при 4 ° C на шейкер в течение 2-3 дней. Храните пробы в однократном ПБС на 4 ° C до дня изображений.
Примечание: Эмбрионы могут расчленены на меньшие сегменты перед удалением, в зависимости от того, который будет отражаться частью эмбрионов. Передние конечности сохранились в этот экспериментальный подход (рис. 1A). - Инкубируйте эмбриона в коммерческой очистки реагента с показателем преломления 1,49 НД в 1,5 мл трубку, защищенном от света при комнатной температуре на ночь, для визуализации эмбриона прозрачным для изображений.
Примечание: Объем реагента очистки это приблизительно пять раз объема выборки.
3. LSFM (2-3 ч)
-
Пример настройки
- Настройка 5 X / 0.1 оптике освещенности и 5 X / 0,16 обнаружения оптика. Соберите держатель образца и образца капиллярной (1,5 мм внутренний диаметр, зеленый) и поместите их в Микроскоп.
Примечание: Обратитесь к руководство по эксплуатации микроскоп для детальной настройки процедур. - Смонтируйте эмбриона следующим образом:
- Подготовьте наконечник пипетки P200, убирания в верхней части, так что он подходит диаметр капилляра и удалить заостренную часть (~ 3 мм) для образца приложения.
- Расплава притупляются конце кончика пипетки, с помощью малого пламени.
- Погасить пламя и быстро прикрепить эмбриона вертикально на конце расплавленного.
- Установите верхнюю часть кончика пипетки с образцом капилляров.
- Разрешить камеру буфера сбалансировать с эмбриона за 1 мин очистить от мусора или пузырьков.
- Использование изображений программное обеспечение, выберите найти капилляров на вкладке Поиск и настройка x, y, z оси для позиционирования образца капиллярной.
- Выберите Поиск образца и увеличить до 0,6 X сосредоточиться на эмбрион. Вращайте эмбриона, чтобы обеспечить, что длинная ось фотосъемка конечности выравнивает с пути света двух источников света (Рисунок 1B).
- Настройка 5 X / 0.1 оптике освещенности и 5 X / 0,16 обнаружения оптика. Соберите держатель образца и образца капиллярной (1,5 мм внутренний диаметр, зеленый) и поместите их в Микроскоп.
-
Получение изображения
- На вкладке приобретения определить пути света параметры, такие как обнаружение целей, лазерная блокирующего фильтра, splitter луча, камеры и лазеры.
Примечание: GFP канал используется в этом эксперименте (длина волны возбуждения: 488 нм; фильтр выбросов: BP 505 до 545 Нм, splitter луча: SPS LP 560). - Установите флажок для сокращения тени сканирования опоры.
- Определите параметры приобретения: битовая глубина, 16 бит; масштаб, 0,36-0,7 X; односторонняя освещения (слева/справа) или двойной стороне освещения.
- Нажмите непрерывный и установите интенсивности лазера, выдержка, мощность лазера и свет лист позицию приобретать более четкие изображения.
Примечание: Мощность лазера хранится как низкий, как можно свести к минимуму фотоповреждения. - Нажмите кнопку остановить для захвата изображений в конце.
- На вкладке приобретения определить пути света параметры, такие как обнаружение целей, лазерная блокирующего фильтра, splitter луча, камеры и лазеры.
-
Многомерные приобретение
- Определите z стека, перемещая позицию Z для первого и последнего изображения. Выберите оптимальный для задания номер слайса.
- Нажмите кнопку Начать эксперимент , чтобы приобрести выбранный z стека.
- Когда это делается, сохраните изображение в формате .czi.
-
Обработка изображений (опционально)
- Продолжите с двойной боковой fusion под Lightsheet обработки канал если применяется двойной стороне освещения. MultiView обработки необходим, если мульти взгляды приобретают объединить изображения с нескольких точек зрения.
- Создание 2D изображения, используя данные из высокой интенсивности пикселей вдоль оси проекции под Максимальной интенсивности проекции канал.
- Группе копию канала выберите подмножество для выбора подмножества изображения из исходного набора.
4. Количественная оценка арборизация аксона (30 минут для каждого индивидуального нерва)
- Откройте файл изображения в анализ программного обеспечения обработки изображений (по умолчанию изображение, содержащее данные XYZ открыт в режиме Surpass и как представление 3D-визуализации).
- Настройка изображения цвета, яркости и контрастность с помощью окна Отображения регулировки (Edit | Показать настройку экрана) для выявления нитей, основанные на местных интенсивности контраст.
- Нажмите на иконку Добавить новую нитей и выберите алгоритм Autopath (не петля) в раскрывающемся меню.
- Выберите регион интерес (в данном случае, сегментации аксон интерес). Нажмите кнопку следующий после завершения.
- Определите точки начала и семян, назначив крупнейший и самый тонкий диаметр измерения, которые могут быть измерены с помощью режима срез .
- Назначьте точку отсчета на краю региона интерес. Для достижения ручного добавления или удаления отправной точки, сначала изменить режим указателя (Navigate | Выберите) и затем Shift + щелкните правой кнопкой мыши на интересующие вас вопросы.
- Выберите ручной пороговые значения для семян точек обеспечить, что все видимые арборизация помечен. Изменить режим указателя (Navigate | Выберите) и затем Shift + щелчок левой кнопкой в точках интереса вручную добавлять или удалять Семена точек.
Примечание: Важно, чтобы вручную удалить фоновые шумы и сигналы из соседних нервов. - Установите флажок удалить семена точек вокруг отправной точки.
- Проверьте, Удалить отключения сегментов разрешить исключение пунктов, которые слишком далеко и что может представлять фоновый шум. Указывает Максимальную длину разрыв на следующем шаге определить верхний предел для исключения.
- Отрегулируйте порог для вычитание фона, который использует фильтр Гаусса для оценки интенсивности фон каждого voxel.
- Автоматическое порога для диаметра дендритов, с использованием алгоритма приблизительное сечение .
- Пропустите шаги расчета позвоночника.
- Закончить процесс и выбрать нужный стиль и цвет.
- Снимите флажок тома в Свойства , чтобы просмотреть только реконструированный аксоны.
- На вкладке Статистика выберите Detailed. Использование накаливания нет Dendrite терминал точек для количественного определения двигательного нерва терминалов как индикатор мотор аксона арборизация.
Примечание: Статистические заметки могут быть добавлены при необходимости. - Экспортируйте образ реконструированный axon в формате .tif.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
LSFM предоставляет подробные 3D визуализация MN траектории и аксон арборизация в мыши эмбрионов. Под ярким полем тканей появляются полностью прозрачным после погружения в коммерческой очистки реагента. Нет усадки или припухлость образца было замечено после хранения в очистке реагента до изображений до одной недели. Под каналом флуоресценции моторные нейроны помечены transgenically выраженной GFP (фильм 1). В некоторых экземпляра сведения о структуре аксон оказываются под угрозой. Например Рисунок 2 представляет низкого качества изображений. Несколько факторов могут препятствовать визуализации качества. Во-первых недостаточно permeabilization и мойки шаги могут привести к высокой фонового сигнала. Во-вторых рассеяние света через неадекватно очищенных ткани приведет к размытые изображения. И наконец субоптимальные пример позиционирования во время загрузки изображений может увеличить рассеяние света или блокировать пути света.
Чтобы изображение аксона арборизация более подробно и выполнять количественной оценки, увеличение может быть скорректирована таким образом, чтобы каждый мелко arborized структура может быть выявлено (фильм 2). Изображения, одно - и двойной стороне освещения следует сравнивается, чтобы определить оптимальное разрешение арборизация шаблон (рис. 3). Изображений программное обеспечение для анализа затем может использоваться для воссоздания аксона арборизация шаблоны для индивидуальных передних конечностей нервов (рис. 4). Путем определения отправной точкой и диаметра для обнаружения точки семян, эти arborized структуры можно полуавтоматически обнаружен и вычисляется во время фоновой сигналы вручную удалены. Мы использовали «накаливания – нет Режим функции Dendrite терминала Pts» для вычисления общего мотора нервные окончания отдельных нервов как индикатор мотор аксона арборизация. Кроме того, длина ветви, средний диаметр и тома могут быть рассчитаны с помощью «Накаливания – дендритов длина», «Накаливания – дендритов означает диаметр» и «Накаливания – дендритов объем», соответственно.
Рисунок 1: графическая иллюстрация образца set-up. (A) во время подготовки проб, эмбрионы сначала обезглавлены и лишить. Передние конечности разделяются по пунктирной линии. (B) в зале образец образцы расположены сохранить весь регион вдоль пути света. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Фильм 1: свет лист микроскопии флуоресцирования большие поля зрения верхней половины эмбриона трансгенные мыши E12.5 (Hb9::GFP). Фильм явно демонстрирует двигательных нервов, выходящий из спинного мозга к innervating цели. 3D-изображения сначала приобретается по 0,3 X увеличением с одной стороне освещение и 30 мс время экспозиции и позднее перерабатывается в видео с помощью программного обеспечения для анализа изображений. Линейки шкалы представляет 500 мкм. пожалуйста нажмите здесь для просмотра этого видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)
Рисунок 2: пример изображения низкого качества с высоким фонового сигнала и размытым регионов (синие стрелки). Неправильное шаги во время приобретения подготовки и изображения образца может привести к качество зрением изображения поставить под угрозу точность любой последующей количественной оценки арборизация аксона. Линейки в изображении представляет 200 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Фильм 2: Визуализация E12.5 передних конечностей нервы до 488 нм возбуждения с двойной стороне освещения с увеличением 0,6 х. Увеличенной в кино позволяет ясно и панорамный визуализации каждый штраф arborized структур на отдельных нервов. Линейки шкалы представляет собой 300 µm. пожалуйста нажмите здесь для просмотра этого видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)
Рисунок 3: сравнение между одно - и двойной стороне освещения. Левого и правого истолкования отображение сведений только для некоторых регионов (красные стрелки), тогда как комбинированное изображение от истолкования двойной стороне обеспечивает более полное представление о структуре арборизация. Однако сингл стороне освещения может быть достигнуто в короткие сроки обработки изображений, а иногда и с лучшим качеством изображения. Это связано с тем, что освещение пути с обеих сторон не может совершенно лежат на одной плоскости, результате размытия при двойной стороне истолкования. Изображения показываются как проекция максимальной интенсивности. Линейки шкалы представляет 200 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: реконструирован аксона арборизация нервов отдельных передних конечностей, цветом следующим образом: suprascapular (красный), подмышечные (розовый), радиальные (синий), задняя плечевая кожный (фиолетовый). Арборизация сложности была рассчитана по количеству терминала конечные обнаружил наш полуавтоматическим методом. Алгоритм Autopath (не петля) следы нитей и обнаруживает точек семян от определяемых пользователем отправные точки. Линейки в оба изображения представляет 200 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Несколько шагов в протоколе могут подвергаться изменениям при определенных обстоятельствах. Например длительность фиксации зависит от возраста эмбрионов, колеблется от 2 h 1 или более дней, используя свежеприготовленные параформальдегида. Так как фиксация осуществляется до вся гора иммуноокрашивания, антитела, которые чувствительны к белка сшивки, метанол может использоваться как альтернативный фиксирующие агент. Для высокое соотношение сигнал шум после окрашивания, необходимо оптимизировать моющего средства концентрации (от 0,1-0,5%). Дополнительные Стиральная шаги до и после инкубации антитела может также увеличить соотношение сигнал шум. Кроме того ткани Очистка шаг важен для обеспечения что свет путь разблокирован во всем глубоко аксональное прогнозы. Для повышения прозрачности ткани, важно обеспечить минимальный введение PBS во время инкубации в коммерческих таможенного агента, как эффект очистки сторнируется, повторно погружая образцы в буферных растворов. В противном случае рекомендуется очистка реагента с более высоким индексом преломления или более длительного периода очистки. Тем временем параметры во время захвата изображений варьируются среди различных образцов. Двойной стороне освещения и multiview изображений может позволить изображений с большей глубины резкости и более подробно. Однако поскольку одновременно приобретается освещения с разных ракурсов, односторонняя освещения является более эффективным для небольших образцов или перемещение образцов. Хорошее качество изображения обеспечивает точность для следующих количественного анализа.
Предыдущие исследования, в том числе нашей группой, использовали конфокальная томография или два Фотон микроскопии соблюдать двигателя аксона навигации процесс или арборизация шаблон в Hb9::GFP эмбрионы10,15, 16 , 17. Основываясь на нашем опыте, мы считаем LSFM превосходство в этих двух других методов с момента: 1) Imaging время значительной степени уменьшается как LSFM предлагает более быстрый и более высокого качества изображения, при минимизации фотоповреждения и Фототоксичность образцов. Образцы подсвечиваются со стороны с листом тонкий свет, создавая тем самым внутренние оптические раздел14,18,19. Центр света листа сходится с фокальной плоскости системы обнаружения, которая является ортогональной ось освещения. Следовательно вне фокус света уменьшается, и только флуорофоров в пределах фокальной плоскости освещаются для каждого изображения, то есть, вместо всего образца, тем самым снизить Фотообесцвечивание20. 2) сведения о шаблоне арборизация намного лучше иллюстрируется, как LSFM позволяет multiview изображений. Вместо того, чтобы образец монтируется на слайд он прилагается таким образом, что вращение вокруг вертикальной оси, возможно, как движения вдоль x, y и z измерения. Изображения из различных плоскостях и представления укладываются производить больше изотропной 3D-изображений. Однако LSFM также имеет ограничение по сравнению с конфокальных и два Фотон подходов с точки зрения размер массивные файла для каждого изображения. Эти плюсы и минусы должны быть взвешены при определении способа визуализации для использования, но в конечном итоге выбор будет зависеть какой микроскопических аппаратное и программное обеспечение предоставляются по запросу.
Короче говоря, этот протокол совмещает целом гора иммуноокрашивания, состояние искусства свет лист 3D визуализации, вместе с количественной оценки в программное обеспечение для анализа изображений. Мы считаем, что этот протокол не только обеспечивает новую парадигму для визуализации мотор аксона навигации и траекторий в эмбрионов с количественный аксона арборизация сложности, но может также применяться к другим системам нейрон (то есть, Сенсорные нейроны) с соответствующие трансгенных мышей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
LSFM экспериментов и анализ данных проводились в части с помощью передовых оптических микроскопов службу отдела инструмент в Синика и при содействии г-жи Шу-Чэнь Шэн. Мы благодарим г-жа Сью-пинг ли от Imaging основного объекта IMB для значительной технической помощи с анализа изображений Imaris. IMB научных Английский редактирования основных рассмотрел рукопись. Эта работа финансируется Academia хвощевой карьеры развитию премии (CDA-107-L05), наиболее (104-2311-B-001-030-MY3) и национальных правозащитных учреждений (НПУ-EX106-10315NC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hb9::GFP | The Jackson labortory | 005029 | Collect embryos of embryonic day 12.5 (E12.5) |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) | For 200ml: Add 20ml 10X PBS, 8g PFA in ddH2O. Adjust pH to 7.4 with NaOH (10N). Filter sterilize and store at -20 °C. | ||
| Phosphate buffer saline 10X (PBS 10X) | For 1L: Add 80 g NaCl, 2 g KCl,14.4g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4 and top up with ddH2O. Autoclave and store at RT. | ||
| Triton X-100 | Sigma | X100-500ML | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 26140079 | |
| Sheep polyclonal anti-GFP | AbD Serotec | 4745-1051 | 1:1000 |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep | Invitrogen | A-11015 | 1:1000 |
| RapiClear 1.49 clearing reagent | SunJin Lab | RC149001 | |
| 1.5ml micro tube | Sarstedt | 72.690.001 | |
| 24 wells plate | ThermoFisher | 142475 | |
| 5 SA Tweezer | ideal-tek | 3480641 | |
| Iris Scissors striaght sharp/sharp | Aesculap | BC110R | |
| Microsurgery Scalpels, single use | Aesculap | BA365 | |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ800 | |
| Shaker | TKS | RS-01 | |
| Lightsheet Z.1 microscope | Carl Zeiss Microscopy | ||
| Imaris 8.4.0 image analysis software | Bitplane, Zurich, Switzerland | ||
| B6.Cg-Tg(Hlxb9-GFP)1Tmj/J (Hb9::GFP mice) | The Jackson Laboratory | 005029 |
References
- Davis-Dusenbery, B. N., Williams, L. A., Klim, J. R., Eggan, K. How to make spinal motor neurons. Development. 141, 491-501 (2014).
- Stifani, N. Motor neurons and the generation of spinal motor neuron diversity. Front Cell Neurosci. 8, 293 (2014).
- Kania, A., Jessell, T. M. Topographic motor projections in the limb imposed by LIM homeodomain protein regulation of ephrin-A:EphA interactions. Neuron. 38, 581-596 (2003).
- Livet, J., et al. ETS gene Pea3 controls the central position and terminal arborization of specific motor neuron pools. Neuron. 35, 877-892 (2002).
- Kanning, K. C., Kaplan, A., Henderson, C. E. Motor neuron diversity in development and disease. Annu Rev Neurosci. 33, 409-440 (2010).
- Matsumoto, S., Kiryu-Seo, S., Kiyama, H. Motor Nerve Arborization Requires Proteolytic Domain of Damage-Induced Neuronal Endopeptidase (DINE) during Development. J Neurosci. 36, 4744-4757 (2016).
- Nagata, K., et al. ECEL1 mutation implicates impaired axonal arborization of motor nerves in the pathogenesis of distal arthrogryposis. Acta Neuropathol. 132, 111-126 (2016).
- Catela, C., Shin, M. M., Lee, D. H., Liu, J. P., Dasen, J. S. Hox Proteins Coordinate Motor Neuron Differentiation and Connectivity Programs through Ret/Gfralpha Genes. Cell Rep. 14, 1901-1915 (2016).
- Bonanomi, D., et al. Ret is a multifunctional coreceptor that integrates diffusible- and contact-axon guidance signals. Cell. 148, 568-582 (2012).
- Tung, Y. T., et al. Mir-17 approximately 92 Governs Motor Neuron Subtype Survival by Mediating Nuclear PTEN. Cell Rep. 11, 1305-1318 (2015).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
- Jonkman, J., Brown, C. M. Any Way You Slice It-A Comparison of Confocal Microscopy Techniques. J Biomol Tech. 26, 54-65 (2015).
- Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists. Nat Methods. 12, 30-34 (2015).
- Santi, P. A. Light sheet fluorescence microscopy: a review. J Histochem Cytochem. 59, 129-138 (2011).
- Hanley, O., et al. Parallel Pbx-Dependent Pathways Govern the Coalescence and Fate of Motor Columns. Neuron. 91, 1005-1020 (2016).
- De Marco Garcia, N. V., Jessell, T. M. Early motor neuron pool identity and muscle nerve trajectory defined by postmitotic restrictions in Nkx6.1 activity. Neuron. 57, 217-231 (2008).
- Li, C. J., et al. MicroRNA filters Hox temporal transcription noise to confer boundary formation in the spinal cord. Nat Commun. 8, 14685 (2017).
- Swoger, J., Pampaloni, F., Stelzer, E. H. Light-sheet-based fluorescence microscopy for three-dimensional imaging of biological samples. Cold Spring Harb Protoc. 2014, 1-8 (2014).
- Pantazis, P., Supatto, W. Advances in whole-embryo imaging: a quantitative transition is underway. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 327-339 (2014).
- Reynaud, E. G., Tomancak, P. Meeting report: first light sheet based fluorescence microscopy workshop. Biotechnol J. 5, 798-804 (2010).
