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Neuroscience

मोटर Axon नेविगेशन और माउस के ठहराव में Axon Arborization के दृश्य प्रकाश शीट प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का प्रयोग भ्रूण

Published: May 11, 2018 doi: 10.3791/57546
Automatic Translation
*1,2, *2,3, 1,2
1Molecular and Cell Biology, Taiwan International Graduate Program, Academia Sinica and Graduate Institute of Life Sciences, National Defense Medical Center, 2Institute of Molecular Biology, Academia Sinica, 3Institute of Biotechnology, College of Bio-Resources and Agriculture, National Taiwan University
* These authors contributed equally

Summary

यहां, हम ट्रांसजेनिक Hb9 में मोटर ंयूरॉन प्रक्षेपण और axon arborization visualizing के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन :: GFP माउस भ्रूण । मोटर न्यूरॉन्स के लिए immunostaining के बाद, हम बाद मात्रात्मक विश्लेषण के लिए छवि भ्रूण के लिए प्रकाश शीट प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का इस्तेमाल किया. इस प्रोटोकॉल केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में अंय ंयूरॉन नेविगेशन प्रक्रियाओं के लिए लागू है ।

Abstract

स्पाइनल मोटर न्यूरॉन्स (मनसे) अपने innervating लक्ष्य के साथ संवाद करने के लिए अपने axons का विस्तार, जिससे रीढ़ में आंदोलन और जटिल कार्यों को नियंत्रित. इस प्रकार, यह महत्वपूर्ण है के आणविक तंत्र को उजागर कैसे मोटर axons नेविगेट करने के लिए, arborize, और अंदर आना उनके परिधीय मांसपेशी लक्ष्य के दौरान विकास और अध... हालांकि ट्रांसजेनिक Hb9:: GFP माउस लाइनों लंबे समय के लिए भ्रूण के विकास के दौरान मोटर axon पथ कल्पना सेवा की है, axon टर्मिनल arborization की पूर्ण स्पेक्ट्रम की विस्तृत विवरण पैटर्न जटिलता के कारण अधूरा रह और वर्तमान ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी की सीमाएं । यहाँ, हम गुणात्मक और मात्रात्मक मोटर axons के विकास की कल्पना करने के लिए प्रकाश शीट प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (LSFM) और मजबूत छवि विश्लेषण को जोड़ती है कि एक बेहतर प्रोटोकॉल का वर्णन. इस प्रणाली को आसानी से आनुवंशिक म्यूटेंट या Hb9 के साथ MN रोग मॉडल पार करने के लिए अपनाया जा सकता है :: GFP लाइंस, उपंयास आणविक तंत्र है कि मोटर axon नेविगेशन और arborization में दोषों को जंम खुलासा ।

Introduction

रीढ़ की हड्डी MNs केंद्रीय तंत्रिका तंत्र का हिस्सा है लेकिन अंदर आना परिधीय मांसपेशियों को नियंत्रित करने के लिए आंदोलन कर रहे हैं । विकासशील रीढ़ की हड्डी में, MN progenitors (pMNs) notochord और आसंन somites से उत्पंन संकेतों के अनुसार स्थापित कर रहे हैं । सभी विभेदित पोस्ट-mitotic MNs तो pMNs से उत्पंन कर रहे हैं, अंततः रीढ़ की हड्डी के rostrocaudal अक्ष के साथ MN उपप्रकार की एक श्रृंखला को जंम दे1,2। स्पाइनल अजेंडे स्थलाकृतिक और anatomically अच्छी तरह से आयोजित कर रहे हैं । उनकी रूपात्मक व्यवस्था3परिधि में उनके संबंधित लक्ष्य की स्थिति के साथ संबद्ध है । उनकी मांसपेशी लक्ष्य तक पहुंचने पर, axons सेलुलर और exogenous neurotrophic कारकों प्राप्त है कि उंहें बढ़ाने के लिए प्रेरित और मांसपेशियों में आगे शाखा । इन्नेर्वतिओन और बंटी दोष neuromuscular जंक्शनों (NMJ) के रूप में विफलता के लिए योगदान कर सकते हैं । उदाहरण के लिए, glial व्युत्पंन neurotrophic कारकों (GDNF)-प्रेरित Pea3 axon arborization के लिए त्वचा के नीचे maximus (सेमी) और latissimus डोरसी (LD) मांसपेशियों4,5में अपरिहार्य है । इसके अलावा, भोजन पीटकर माउस भ्रूण डायाफ्राम में phrenic नसों की दोषपूर्ण arborization दिखाने के लिए, सांस की विफलता और जंम के तुरंत बाद मृत्यु6,7। इसलिए, MN परिपक्वता के इस अंतिम चरण (यानी, axonal प्रक्षेपण और शाखाओं में बंटी) ंयूरॉंस और लक्ष्य कोशिकाओं के बीच संचार सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है ।

arborization पैटर्न को देखने के लिए, शोधकर्ताओं ने आम तौर पर फोकल इमेजिंग या दो-फोटॉन प्रतिदीप्ति प्रकाश माइक्रोस्कोपी का संचालन या पूरे माउंट नमूने8,9,10. इन सूक्ष्म तकनीक के दोनों स्वीकार्य संकल्प और गहराई पैठ उत्पंन करते हैं । दो फोटॉन प्रतिदीप्ति प्रकाश माइक्रोस्कोपी दो कम ऊर्जा फोटॉनों11के एक साथ अवशोषण द्वारा fluorophores के उत्तेजना शामिल है । के बाद से दो-फोटॉन उत्तेजना के पास अवरक्त विकिरण का उपयोग करता है, घटी हुई उत्तेजना आवृत्ति को कम तितर बितर और बेहतर ऊतक प्रवेश के लिए योगदान ऊतक में 1 मिमी, इस प्रकार अधिक गहराई के साथ इमेजिंग की अनुमति । फोकल माइक्रोस्कोपी फिल्टर द्वारा बाहर के-फोकस संकेतों को हटा और केवल फोकल विमान12के भीतर प्रकाश एकत्र करता है । इस दृष्टिकोण के साथ, विभिंन फोकल विमानों से नमूनों की छवियों के लिए एक जेड-स्टैक समारोह के माध्यम से एक तीन आयामी (3 डी) छवि का उत्पादन करने के लिए संयुक्त किया जा सकता है । फिर भी, संकेत तीव्रता के रूप में प्रकाश की सबसे कम है अवरुद्ध है और उच्च संख्यात्मक एपर्चर गहराई के क्षेत्र अस्पष्ट । इससे भी महत्वपूर्ण बात, दोनों तकनीक गंभीर धूप और phototoxicity के लिए योगदान के बाद से पूरे नमूना रोशनी प्राप्त करता है, जब केवल एक विमान एक निश्चित समय में imaged है ।

इन कमियों को दरकिनार, LSFM एक इष्ट विकल्प बन गया है, तेजी से होने के फायदे के साथ, प्रकाश कुशल, और कम phototoxic13,14। इसके अलावा, LSFM बहु दृश्य इमेजिंग की अनुमति देता है । इस दृष्टिकोण विशेष रूप से वे 3 डी अंतरिक्ष के माध्यम से फैल के रूप में मोटर axons और उनके dispersing टर्मिनल visualizing के लिए अनुकूल है । LSFM अंय दो विकल्प का प्रदर्शन करता है क्योंकि नमूने एक मंच है कि एक्स, वाई, और जेड अक्षों के साथ एक ऊर्ध्वाधर अक्ष और आंदोलनों के आसपास रोटेशन की अनुमति देता है पर बढ़ रहे हैं । इस सेट अप न केवल नमूने की एक ंयूनतम अवरुद्ध दृश्य के लिए अनुमति देता है, लेकिन यह भी एक वांछनीय रोशनी पथ, दो की एक कमी-फोटॉन और फोकल माइक्रोस्कोपी की पसंद, दोनों जिनमें से एक फ्लैट स्लाइड पर नमूनों के बढ़ते की आवश्यकता होती है । इसलिए, LSFM axon arborization के 3 डी इमेजिंग के लिए सबसे उपयुक्त उपकरण और माउस भ्रूण में मोटर तंत्रिका टर्मिनलों के ठहराव के लिए है ।

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Protocol

जीवित पशुओं के सभी एक विशिष्ट रोगज़नक़ मुक्त (SPF) पशु सुविधा में रखा गया था, अनुमोदित और जगत् Sinica के IACUC द्वारा सर्वेसर्वा ।

1. निर्धारण

  1. भ्रूण भ्रूण दिवस १२.५ के ले लीजिए (12.5 ई) इसके बाद decapitate और अंतड़ी ।
  2. भ्रूण को व्यक्तिगत रूप से 24-अच्छी तरह प्लेटों में 1 मिलीलीटर के साथ ठीक करें/रात भर 1x फास्फेट बफर खारा (पंजाब) में हौसले से तैयार 4% paraformaldehyde । एक शेखर पर 4 डिग्री सेल्सियस पर मशीन ।
  3. 5-10 मिनट के लिए, एक शेखर पर अवशिष्ट paraformaldehyde को दूर करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर की मशीन के साथ 1 से कम 3x, प्रत्येक के लिए निश्चित भ्रूण धो लें ।

2. पूरे-माउंट Immunostaining

  1. Permeabilize प्रत्येक भ्रूण के 1 मिलीलीटर में ०.५% पंजाबियों-ट्राइटन-X-१०० (PBST) रातोंरात 4 डिग्री सेल्सियस पर एक शेखर पर ।
  2. एक बरतन पर 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात 1x पंजाब में तैयार 10% FBS के 1 मिलीलीटर के साथ प्रत्येक नमूना ब्लॉक ।
  3. विरोधी के 1 मिलीलीटर GFP प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ भ्रूण मशीन (1:1000 कमजोर पड़ने 10% FBS में) 4 डिग्री सेल्सियस पर ७२ एच के लिए लगातार झटकों के साथ मोटर नसों के GFP संकेत तेज ।
  4. प्राथमिक एंटीबॉडी की मशीन के बाद, एक शेखर पर 1-2 दिन के पाठ्यक्रम पर ०.५% PBST के 1 मिलीलीटर से धो लें, ०.५% PBST कम से तीन बार बदल रहा है ।
  5. माध्यमिक एंटीबॉडी के 1 मिलीलीटर (1:10% FBS में 1000 कमजोर पड़ने) लागू करें और लगातार झटकों के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में रात भर गर्मी ।
  6. 2-3 दिन के दौरान एक शेखर पर 4 डिग्री सेल्सियस पर ०.५% PBST के 1 मिलीलीटर के साथ 3x धो लें । इमेजिंग से पहले दिन तक 4 डिग्री सेल्सियस पर 1x पंजाब में नमूने रखें ।
    नोट: भ्रूण समाशोधन से पहले छोटे क्षेत्रों में विच्छेदित किया जा सकता है, जो भ्रूण के भाग के आधार पर छवि होगी । Forelimbs इस प्रायोगिक दृष्टिकोण (चित्र 1a) में संरक्षित हैं ।
  7. एक वाणिज्यिक समाशोधन रिएजेंट में एक अपवर्तन सूचकांक में १.४९ nD के साथ एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब, कमरे के तापमान पर रात भर प्रकाश से सुरक्षित, इमेजिंग के लिए भ्रूण पारदर्शी प्रदान करने में भ्रूण मशीन ।
    ध्यान दें: क्लियरिंग एजेंट का वॉल्यूम नमूना वॉल्यूम का लगभग पांच बार है ।

3. LSFM (2 – 3 एच)

  1. नमूना सेट-अप
    1. 5x/0.1 दीप्ति प्रकाशिकी और 5x/0.16 खोज प्रकाशिकी सेट अप । नमूना धारक और नमूना केशिका (१.५ mm आंतरिक व्यास, हरा) इकट्ठा और उन्हें माइक्रोस्कोप में जगह है ।
      नोट: विस्तृत सेट-अप प्रक्रियाओं के लिए माइक्रोस्कोप का संचालन मैनुअल देखें.
    2. इस प्रकार के रूप में भ्रूण माउंट:
      1. यह केशिका के व्यास फिट बैठता है और नमूना लगाव के लिए कहा भाग (~ 3 मिमी) को दूर ताकि ऊपरी हिस्सा काटने से P200 पिपेट टिप तैयार करें ।
      2. एक छोटी सी लौ का उपयोग कर पिपेट टिप के कुंद अंत पिघला ।
      3. आग बुझाने और जल्दी से पिघला अंत पर खड़ी भ्रूण संलग्न ।
      4. नमूना केशिका के साथ पिपेट टिप के ऊपरी भाग फिट ।
    3. चैंबर बफर 1 मिनट के लिए भ्रूण के साथ equilibrate करने के लिए बंद मलबे या बुलबुले साफ करने की अनुमति दें ।
    4. इमेजिंग सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके, स्थिति जानें टैब के अंतर्गत केशिका ढूंढें चुनें और x, y, z अक्षों को नमूना केशिका स्थिति में समायोजित करें ।
    5. का चयन करें नमूना की स्थिति जानें और भ्रूण पर ध्यान केंद्रित करने के लिए 0.6 x ज़ूम । यह सुनिश्चित करने के लिए कि छवि वाले अंग की लंबी धुरी दो प्रकाश स्रोतों (चित्र 1b) के प्रकाश पथ के साथ संरेखित करता है भ्रूण घुमाएं ।
  2. छवि अधिग्रहण
    1. प्राप्ति टैब के तहत, प्रकाश पथ पैरामीटर्स जैसे खोज उद्देश्य, लेज़र ब्लॉकिंग फ़िल्टर, बीम अलगानेवाला, कैमरा और लेज़र्स को परिभाषित करें ।
      नोट: GFP चैनल इस प्रयोग में प्रयोग किया जाता है (उत्तेजना तरंग दैर्ध्य: ४८८ एनएम; उत्सर्जन फ़िल्टर: BP ५०५ ५४५ एनएम, बीम अलगानेवाला: एसपीएस LP ५६०) ।
    2. छाया कमी के लिए पिवट स्कैन चेकबॉक्स को चेक करें ।
    3. अधिग्रहण सेटिंग्स निर्धारित करें: बिट गहराई, 16 बिट; ज़ूम, 0.36-0.7 x; एक तरफ रोशनी (बाएं/दाएं) या दोहरी पक्ष रोशनी ।
    4. निरंतर क्लिक करें और तीव्र छवियां प्राप्त करने के लिए लेज़र तीव्रता, एक्सपोज़र समय, लेज़र पावर, और लाइट शीट स्थिति सेट कर रहे हैं ।
      नोट: लेजर शक्ति के रूप में कम संभव के रूप में रखा है धूप को कम करने के लिए ।
    5. छवि प्राप्ति को समाप्त करने के लिए रोकें दबाएं ।
  3. बहुआयामी अर्ज
    1. z-स्टैक को पहले और अंतिम छवि के लिए z स्थिति ले जाकर परिभाषित करें । स्लाइस संख्या सेट करने के लिए इष्टतम क्लिक करें ।
    2. चयनित z-स्टैक प्राप्त करने के लिए प्रारंभ प्रयोग क्लिक करें ।
    3. जब यह किया जाता है, तो. czi स्वरूप में छवि सहेजें ।
  4. छवि प्रसंस्करण (वैकल्पिक)
    1. दोहरी पक्ष रोशनी लागू किया जाता है अगर Lightsheet प्रसंस्करण चैनल के तहत दोहरी पक्ष संलयन के साथ आगे बढ़ें । बहु-विचार कई कोणों से छवियों गठबंधन करने के लिए प्राप्त कर रहे हैं, तो Multiview प्रसंस्करण आवश्यक है ।
    2. अधिकतम तीव्रता प्रोजेक्शन चैनल के अंतर्गत प्रोजेक्शन अक्ष के साथ उच्चतम तीव्रता पिक्सेल के डेटा का उपयोग करके 2d छवि बनाएं ।
    3. प्रतिलिपि बनाएं चैनल के अंतर्गत, मूल सेट से छवियों के सबसेट का चयन करने के लिए उप समुच्चय क्लिक करें ।

4. ठहराव Axon Arborization (प्रत्येक व्यक्तिगत तंत्रिका के लिए 30 मिनट)

  1. छवि फ़ाइल को इमेजिंग विश्लेषण सॉफ़्टवेयर में खोलें (डिफ़ॉल्ट रूप से, XYZ डेटा वाली छवि को पार मोड में और 3d रेंडर किए गए दृश्य के रूप में खोला जाता है) ।
  2. प्रदर्शन समायोजन विंडो का उपयोग करके छवि रंग, चमक और कंट्रास्ट समायोजितकरें (संपादन । प्रदर्शन समायोजन दिखाएँ) स्थानीय तीव्रता कंट्रास्ट के आधार पर रेशा का पता लगाने के लिए.
  3. नया रेशा जोड़ें आइकन पर क्लिक करें और ड्रॉप-डाउन मेनू में पथ (कोई लूप नहीं) एल्गोरिथ्म चुनें ।
  4. ब्याज के क्षेत्र का चयन करें (इस मामले में, ब्याज की सेगमेंटिंग axon). समाप्त होने पर अगला क्लिक करें ।
  5. सबसे बड़ा और पतले व्यास माप, जो स्लाइस मोड का उपयोग कर मापा जा सकता है निर्दिष्ट द्वारा प्रारंभिक और बीज अंक परिभाषित करें ।
  6. ब्याज के क्षेत्र के किनारे पर एक प्रारंभिक बिंदु निरुपित । मैनुअल के अलावा या शुरू अंक के हटाने को प्राप्त करने के लिए, पहले सूचक मोड बदलें (नेविगेट । चयन करें) और फिर ब्याज के बिंदुओं पर Shift + दायां-क्लिक करें ।
  7. सभी दृश्यमान arborization को चिह्नित किया गया है, यह सुनिश्चित करने के लिए बीज बिंदुओं के लिए मैंयुअल थ्रेशोल्ड चुनें । सूचक मोड परिवर्तित करें (नेविगेट करें । चुनें) और फिर बीज बिंदुओं को मैन्युअल रूप से जोड़ने या निकालने के लिए ब्याज के बिंदुओं पर Shift + बाएँ-क्लिक करें .
    नोट: यह मैंयुअल रूप से पड़ोसी नसों से पृष्ठभूमि शोर और संकेतों को दूर करने के लिए महत्वपूर्ण है ।
  8. प्रारंभिक बिंदुओं के आसपास बीज बिंदुओं को निकालेंबॉक्स चेक करें ।
  9. चेक डिस्कनेक्ट खंडों को निकालें उन बिंदुओं के बहिष्करण की अनुमति देने के लिए जो बहुत दूर हैं और जो पृष्ठभूमि शोर का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं । बहिष्करण के लिए ऊपरी सीमा निर्धारित करने के लिए अगले चरण में अधिकतम अंतर लंबाई इंगित करें ।
  10. पृष्ठभूमि घटाव, जो हर voxel की पृष्ठभूमि तीव्रता का अनुमान लगाने के लिए एक गाऊसी फिल्टर का उपयोग करता है के लिए दहलीज समायोजित करें ।
  11. अनुमानित क्रॉस-अनुभाग क्षेत्र एल्गोरिथ्म का उपयोग करके dendrite व्यास के लिए स्वचालित थ्रेशोल्ड सेट करें ।
  12. रीढ़ की गणना के लिए कदम छोड़ें ।
  13. इस प्रक्रिया को समाप्त करने और वांछित शैली और रंग का चयन करें ।
  14. केवल खंगाला गया axons देखने के लिए गुण में वॉल्यूम बॉक्स को अनचेक करें ।
  15. आंकड़े टैब के अंतर्गत, विस्तृतका चयन करें । रेशा का उपयोग करें No. Dendrite टर्मिनल अंक मोटर axon arborization के एक संकेतक के रूप में मोटर तंत्रिका टर्मिनलों को बढ़ाता है ।
    नोट: सांख्यिकीय एनोटेशन जोड़ा जा सकता है अगर वांछित ।
  16. एक. tif फ़ाइल के रूप में खंगाला axon की छवि निर्यात करें ।

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Representative Results

LSFM माउस भ्रूण में MN पथ और axon arborization के विस्तृत 3 डी दृश्य प्रदान करता है । चमकदार क्षेत्र के तहत, ऊतकों वाणिज्यिक समाशोधन एजेंट में डूबे होने के बाद पूरी तरह से पारदर्शी दिखाई देते हैं । कोई संकोचन या नमूने की सूजन इमेजिंग से पहले एजेंट समाशोधन में भंडारण के एक सप्ताह तक के बाद देखा गया था । प्रतिदीप्ति चैनल के तहत, मोटर न्यूरॉन्स GFP (फिल्म 1) व्यक्त transgenically के साथ लेबल कर रहे हैं. कुछ उदाहरण में, axon संरचना का विवरण समझौता कर रहे हैं । उदाहरण के लिए, आरेख 2 निंन गुणवत्ता इमेजिंग का प्रतिनिधित्व करता है । कई कारकों इमेजिंग गुणवत्ता में बाधा कर सकते हैं । सबसे पहले, अपर्याप्त permeabilization और धुलाई कदम उच्च पृष्ठभूमि संकेत करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । दूसरे, अपर्याप्त के माध्यम से प्रकाश बिखरने ऊतक साफ धुंधला छवियों में परिणाम होगा । अंत में, छवि अधिग्रहण के दौरान इष्टतम नमूना स्थिति प्रकाश बिखरने या प्रकाश पथ ब्लॉक बढ़ सकता है ।

छवि axon arborization अधिक विस्तार में करने के लिए और ठहराव प्रदर्शन करने के लिए, आवर्धन इतना समायोजित किया जा सकता है कि हर पतले arborized संरचना (फिल्म 2) प्रगट किया जा सकता है । एकल और दोहरी की ओर रोशनी की छवियां arborization पैटर्न के इष्टतम संकल्प का निर्धारण करने के लिए तुलना की जानी चाहिए (चित्रा 3) । इमेजिंग विश्लेषण सॉफ्टवेयर तो व्यक्तिगत forelimb नसों (चित्रा 4) के लिए axon arborization पैटर्न पुनर्निर्माण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । प्रारंभिक बिंदु और बीज बिंदु का पता लगाने के लिए व्यास को परिभाषित करके, इन arborized संरचनाओं अर्द्ध स्वचालित रूप से पाया जा सकता है और पृष्ठभूमि संकेतों को मैन्युअल रूप से हटा रहे हैं, जबकि गणना । हम "रेशा-नहीं इस्तेमाल किया । Dendrite टर्मिनल अंक "समारोह मोड मोटर axon arborization के एक संकेतक के रूप में व्यक्तिगत तंत्रिकाओं के कुल मोटर तंत्रिका टर्मिनलों की गणना करने के लिए । इसके अतिरिक्त, शाखा लंबाई, मतलब व्यास, और मात्रा "रेशा-Dendrite लंबाई", "रेशा-Dendrite मतलब व्यास" और "रेशा-Dendrite मात्रा", क्रमशः का उपयोग कर की गणना की जा सकती है ।

Figure 1
चित्र 1: नमूना सेट-अप का ग्राफ़िकल चित्रण. (क) नमूना तैयारी के दौरान, भ्रूण पहले decapitated और eviscerated हैं. Forelimbs डैश्ड लाइन के साथ विच्छेदित कर रहे हैं । (ख) नमूना कक्ष में, नमूनों को प्रकाश पथ के साथ हित के पूरे क्षेत्र को रखने के लिए तैनात हैं. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Movie 1
मूवी 1: प्रकाश शीट एक ई 12.5 ट्रांसजेनिक माउस भ्रूण के ऊपरी आधे के देखने के एक बड़े क्षेत्र के प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (Hb9:: GFP) । फिल्म स्पष्ट रूप से मोटर रीढ़ की हड्डी से अपने innervating लक्ष्यों को पेश नसों दर्शाता है । 3 डी छवि पहले एकल पक्ष रोशनी और 30 एमएस जोखिम समय के साथ 0.3 x आवर्धन के तहत प्राप्त की है और बाद में छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर वीडियो में कार्रवाई की है । स्केल बार का प्रतिनिधित्व करता है ५०० µm. कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

Figure 2
चित्रा 2: उच्च पृष्ठभूमि संकेत और धुंधला क्षेत्रों (नीले तीर) के साथ एक कम गुणवत्ता वाली छवि का उदाहरण. नमूना तैयारी और छवि अधिग्रहण के दौरान अनुचित कदम बिगड़ा छवि गुणवत्ता के लिए नेतृत्व करने के लिए axon arborization के किसी भी बाद ठहराव की सटीकता ख़तरे में डालना हो सकता है । छवि में स्केल बार का प्रतिनिधित्व करता है २०० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Movie 2
2 मूवी: ई के दृश्य 12.5 forelimb नसों के तहत ४८८ एनएम उत्तेजना के साथ दोहरी ओर रोशनी 0.6 x का इज़ाफ़ा पर । ज़ूम-इन मूवी व्यक्तिगत तंत्रिकाओं पर हर ठीक arborized संरचनाओं के स्पष्ट और मनोरम दृश्य की अनुमति देता है । स्केल बार का प्रतिनिधित्व करता है ३०० µm. कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

Figure 3
चित्रा 3: एकल और दोहरी पक्ष रोशनी के बीच तुलना. दोनों बाएँ और दाएँ रोशनी केवल (लाल तीर) कुछ क्षेत्रों का विवरण प्रदर्शित करते हैं, दोहरी पक्ष रोशनी से एक संयुक्त छवि arborization पैटर्न का एक और पूरा दृश्य प्रदान करता है. हालांकि, एक ओर रोशनी एक छोटी इमेजिंग समय में प्राप्त किया जा सकता है और बेहतर छवि गुणवत्ता के साथ कभी-कभार । इस तथ्य के कारण है कि दोनों पक्षों से रोशनी पथ पूरी तरह से एक भी विमान पर झूठ नहीं हो सकता है, दोहरी पक्ष रोशनी के दौरान धुंधला में जिसके परिणामस्वरूप । चित्र अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण के रूप में दिखाए जाते हैं । स्केल बार का प्रतिनिधित्व करता है २०० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: व्यक्तिगत forelimb नसों के axon arborization खंगाला, रंग-कोडित के रूप में इस प्रकार है: suprascapular (लाल), कांख (गुलाबी), रेडियल (नीला), पीछे बाहु त्वचा के नीचे (बैंगनी). Arborization जटिलता हमारे अर्द्ध स्वचालित विधि का उपयोग कर पाया टर्मिनल अंत अंक की संख्या के अनुसार गणना की गई थी । स्वतः पथ (कोई लूप) एल्गोरिथ्म तंतुओं और उपयोगकर्ता-निर्धारित प्रारंभिक बिंदुओं से बीज बिंदुओं का पता लगाता है । दोनों छवियों में स्केल बार २०० µm का प्रतिनिधित्व करता है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

प्रोटोकॉल में कई कदम कुछ परिस्थितियों में परिवर्तन के अधीन किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, निर्धारण की अवधि भ्रूण की आयु पर निर्भर करती है, 2 ज से 1 या अधिक दिन हौसले से निर्मित paraformaldehyde का उपयोग करने के लिए बदलती है । चूंकि निर्धारण पूरे माउंट immunostaining से पहले किया जाता है, एंटीबॉडी के लिए जो प्रोटीन crosslinking के प्रति संवेदनशील होते हैं, मेथनॉल एक वैकल्पिक निर्धारण एजेंट के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । एक उच्च संकेत के लिए-धुंधला पर शोर अनुपात के लिए, यह आवश्यक है के लिए डिटर्जेंट एकाग्रता का अनुकूलन (0.1 के बीच 0.5%) । अतिरिक्त धुलाई कदम से पहले और बाद एंटीबॉडी गर्मी भी संकेत करने के लिए शोर अनुपात में वृद्धि कर सकते हैं । इसके अलावा, एक ऊतक समाशोधन कदम यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है कि प्रकाश पथ गहरी axonal अनुमानों भर में जुदा है । ऊतक पारदर्शिता बढ़ाने के लिए, यह वाणिज्यिक समाशोधन एजेंट में मशीन के दौरान पंजाब के न्यूनतम परिचय सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है, समाशोधन प्रभाव बफर समाधान में फिर से डूबे नमूनों द्वारा उलट है के रूप में. अंयथा, एक उच्च अपवर्तन सूचकांक या अब समाशोधन अवधि के साथ एक समाशोधन एजेंट की सिफारिश की है । इस बीच, छवि अधिग्रहण के दौरान मापदंडों अलग नमूनों के बीच बदलती हैं । दोहरे पक्ष प्रदीप्ति और multiview इमेजिंग अधिक गहराई के साथ इमेजिंग की अनुमति हो सकती है-क्षेत्र और बढ़ाया विस्तार से । हालांकि, के बाद से अलग कोणों से रोशनी एक साथ अधिग्रहण कर लिया है, एक तरफ रोशनी छोटे नमूनों या चलती नमूनों के लिए और अधिक कुशल है । एक अच्छी गुणवत्ता छवि निंनलिखित मात्रात्मक विश्लेषण के लिए सटीकता सुनिश्चित करता है ।

हमारे समूह द्वारा उन सहित पिछले अध्ययन, या तो फोकल इमेजिंग या दो फोटॉन माइक्रोस्कोपी के लिए मोटर axon नेविगेशन प्रक्रिया या Hb9 में arborization पैटर्न का पालन का उपयोग किया है :: GFP भ्रूण10,15, 16 , 17. हमारे अनुभव के आधार पर, हम LSFM के बाद से इन अंय दो तरीकों से बेहतर माना जाता है: 1) इमेजिंग समय काफी हद तक LSFM अधिक तेजी से और उच्च गुणवत्ता इमेजिंग प्रदान करता है के रूप में कम है, धूप और नमूनों की phototoxicity कम whilst । नमूनों की ओर से एक पतली प्रकाश शीट के साथ प्रबुद्ध हैं, जिससे एक आंतरिक ऑप्टिकल धारा14,18,19बनाने । प्रकाश चादर के केंद्र का पता लगाने प्रणाली है, जो रोशनी धुरी को ओर्थोगोनल है की फोकल विमान के साथ एकाग्र । नतीजतन, बाहर का ध्यान प्रकाश कम है और केवल फोकल विमान के भीतर fluorophores हर छवि के लिए प्रबुद्ध हैं, यानी, बल्कि पूरे नमूना है, जिससे photobleaching20को कम करने । 2) arborization पैटर्न का ब्यौरा बहुत बेहतर है LSFM multiview इमेजिंग की अनुमति देता है के रूप में सचित्र । नमूना के बजाय एक स्लाइड पर रखा जा रहा है, यह इस तरह से जुड़ा हुआ है कि एक ऊर्ध्वाधर धुरी के आसपास रोटेशन संभव है, के रूप में एक्स, वाई, और जेड आयामों के साथ आंदोलनों रहे हैं । विभिन्न विमानों और विचारों से छवियों को और अधिक आइसोट्रोपिक 3 डी छवियों का उत्पादन करने के लिए खड़ी कर रहे हैं । हालांकि, LSFM भी एक सीमा के लिए फोकल और दो बड़े पैमाने पर फ़ाइल प्रत्येक छवि के लिए बनाया आकार के संदर्भ में फोटॉन दृष्टिकोण की तुलना में है । ये पेशेवरों और विपक्ष की जरूरत है जब तय करने के लिए जब जो इमेजिंग विधि का उपयोग करने का निर्णय है, लेकिन अंततः विकल्प निर्भर करेगा जो सूक्ष्म हार्डवेयर पर सॉफ्टवेयर/

संक्षेप में, इस प्रोटोकॉल पूरे माउंट immunostaining, राज्य के अत्याधुनिक लाइट शीट 3d इमेजिंग, एक साथ छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर में ठहराव के साथ । हमारा मानना है कि इस प्रोटोकॉल न केवल मोटर axon नेविगेशन और axon arborization जटिलता के quantitation के साथ भ्रूण में पथ visualizing के लिए एक नया प्रतिमान प्रदान करता है, लेकिन यह भी अंय ंयूरॉन प्रणालियों के लिए लागू किया जा सकता है (यानी, संवेदी ंयूरॉंस के साथ) उपयुक्त ट्रांसजेनिक चूहों ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

LSFM प्रयोगों और डेटा विश्लेषण भाग में शिक्षा Sinica में साधन सेवा के विभाजन के उंनत ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप का उपयोग कर और सुश्री शू-चेन शेन की सहायता से किया गया । हम सुश्री मुकदमा-पिंग Imaris छवि विश्लेषण के साथ काफी तकनीकी सहायता के लिए IMB की इमेजिंग कोर सुविधा से ली धंयवाद । IMB के वैज्ञानिक अंग्रेजी संपादन कोर ने पांडुलिपि की समीक्षा की । यह कार्य जगत् Sinica कैरियर विकास पुरस्कार (सीडीए-१०७-L05), सर्वाधिक (104-2311-बी-001-030-MY3), और NHRI (NHRI-EX106-10315NC) द्वारा वित्तपोषित है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hb9::GFP The Jackson labortory 005029 Collect embryos of embryonic day 12.5 (E12.5)
4% Paraformaldehyde (PFA) For 200ml: Add 20ml 10X PBS, 8g PFA in ddH2O. Adjust pH to 7.4 with NaOH (10N). Filter sterilize and store at -20 °C.
Phosphate buffer saline 10X (PBS 10X) For 1L: Add 80 g NaCl, 2 g KCl,14.4g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4 and top up with ddH2O. Autoclave and store at RT.
Triton X-100 Sigma X100-500ML
Fetal Bovine Serum ThermoFisher 26140079
Sheep polyclonal anti-GFP AbD Serotec 4745-1051 1:1000
Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep Invitrogen A-11015 1:1000
RapiClear 1.49 clearing reagent SunJin Lab RC149001
1.5ml micro tube Sarstedt 72.690.001
24 wells plate ThermoFisher 142475
5 SA Tweezer ideal-tek 3480641
Iris Scissors striaght sharp/sharp Aesculap BC110R
Microsurgery Scalpels, single use Aesculap BA365
Dissecting microscope Nikon SMZ800
Shaker TKS RS-01
Lightsheet Z.1 microscope Carl Zeiss Microscopy
Imaris 8.4.0 image analysis software Bitplane, Zurich, Switzerland
B6.Cg-Tg(Hlxb9-GFP)1Tmj/J (Hb9::GFP mice) The Jackson Laboratory 005029

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक १३५ मोटर ंयूरॉन axon नेविगेशन axon पथ axon arborization प्रकाश शीट माइक्रोस्कोपी रीढ़ की हड्डी IMARIS
मोटर Axon नेविगेशन और माउस के ठहराव में Axon Arborization के दृश्य प्रकाश शीट प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का प्रयोग भ्रूण
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Liau, E. S., Yen, Y. P., Chen, J. A. … More

Liau, E. S., Yen, Y. P., Chen, J. A. Visualization of Motor Axon Navigation and Quantification of Axon Arborization In Mouse Embryos Using Light Sheet Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (135), e57546, doi:10.3791/57546 (2018).

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