Summary
Burada, motor nöron projeksiyon ve transgenik Hb9::GFP fare embriyo axon arborization görüntülenmesi için bir protokol açıklayın. Motor nöronlar için immunostaining sonra hafif levha Floresans mikroskobu Image embriyolar için sonraki kantitatif analiz için kullanılan. Bu iletişim kuralı diğer nöron gezinti süreçlerinde merkezi sinir sistemi için geçerlidir.
Abstract
Omurilik motor nöronlar (MNs) böylece hareket ve karmaşık görevleri omurgalılarda kontrol innervating hedefleri, iletişim kurmak için onların aksonlar genişletir. Böylece, akson gidin, arborize ve periferik onların kas innervate motor geliştirme ve dejenerasyon sırasında nasıl hedefler moleküler mekanizmaları ortaya çıkarmak için önemlidir. Transgenik Hb9::GFP fare hatları uzun motor axon yörüngeleri embriyonik gelişim sırasında görselleştirmek için hizmet etmiş olsa da, terminal akson arborization tam spektrum ayrıntılı açıklamaları desen karmaşıklığı nedeniyle eksik kalır ve sınırlamalar geçerli optik mikroskobu. Burada, hafif levha Floresans mikroskobu (LSFM) ve nitelik ve nicelik motor aksonlar geliştirme görselleştirmek için sağlam görüntü analizi bir araya getiren gelişmiş bir iletişim kuralı açıklar. Bu sistem kolayca genetik mutantlar veya MN hastalık modelleri motor axon gezinti ve arborization yol açan yeni moleküler mekanizmalar açığa Hb9::GFP çizgilerle geçmek için kabul edilebilir.
Introduction
Omurilik MNs merkezi sinir sisteminin parçası olan ancak hareketini denetlemek için periferik kasları innervate. Gelişmekte olan omurilik içinde MN ataları (pMNs) notochord ve bitişik somites yayılan sinyaller göre kurulur. Tüm sonrası Mitotik MNs ayrıştırılan sonra pMNs, sonunda bir dizi omurilik1,2rostrocaudal ekseni boyunca MN türlerinden sebebiyet veren oluşturulur. Omurilik MNs arazi ve anatomik olarak de düzenlenmektedir. Morfolojik düzenleri onların anılan sıraya göre hedef konumunu çevre3ile karşılıklı olarak ilişkilendirir. Kas hedeflerine ulaştıktan sonra akson genişletmek ve şube için onları teşvik hücresel ve eksojen Nörotrofik faktör almak kas içine daha fazla. İnnervasyon ve dallanma kusurları nöromüsküler kavşak (NMJ) oluşturmak için başarısızlık için katkıda bulunabilir. Örneğin, gliyal kaynaklı Nörotrofik faktörler (GDNF)-indüklenen Pea3 axon arborization Kutanöz maximus (CM) içine için vazgeçilmez ve latissimus dorsi (LD) kas4,5. Buna ek olarak, DINE nakavt fare embriyo solunum yetmezliği ve ölüm hemen doğum6,7sonra neden diyafram, frenik sinir arızalı arborization gösterir. Bu nedenle, bu son adım MN olgunlaşma (Yani, aksonlar projeksiyon ve dallanma) nöronlar ve hedef hücreler arasındaki iletişimi sağlamak için önemlidir.
Arborization desenleri görüntülemek için araştırmacılar normalde confocal görüntüleme veya İki fotonlu Floresan ışık mikroskobu kesitli veya bütün-bağlama örnekleri8,9,10kuralları. Bu mikroskobu tekniklerin her ikisi de kabul edilebilir çözünürlük ve derinlik penetrasyonu oluşturmak. İki fotonlu Floresan ışık mikroskobu, iki alt-enerji fotonlar11eşzamanlı absorpsiyonu ile fluorophores uyarma içerir. İki fotonlu uyarma yakın kızılötesi radyasyon kullandığından, azalan uyarma sıklığını azaltılmış saçılma ve daha iyi doku penetrasyonu 1 mm doku, böylece daha büyük derinlik ile görüntülemede izin katkıda bulunur. Confocal mikroskobu odak out ve sinyalleri sadece odak düzlemi12içinde ışık toplar filtreleri kaldırır. Bu yaklaşım ile örnekleri farklı odak uçak görüntülerini bir Z-yığın fonksiyonu üzerinden üç boyutlu (3D) görüntü üretmek için kombine edilebilir. Yine de, sinyal şiddeti ışık çoğunu engellenir ve yüksek sayısal açıklık alan derinliği belirsiz olarak azalır. Daha da önemlisi, herhangi bir anda yalnızca bir uçak bile görüntüsü aydınlatma bütün numune alır bu yana her iki tekniğin de şiddetli duyarlilik ve fototoksisite katkı.
Bu eksikliklerini aşmak için LSFM hızlı, ışık verimli olmanın avantajı ile tercih edilen bir alternatif ve daha az Fototoksik13,14haline gelmiştir. Ayrıca, LSFM çok görünüm görüntüleme sağlar. Bu yaklaşım Özellikle onlar 3D uzayda yaymak gibi motor aksonlar ve dispersiyon onların terminalleri görüntülenmesi için uygundur. Örnekleri x, y ve z eksenleri boyunca hareketler ve bir dikey ekseni çevresinde döndürme sağlar bir sahnede monte edilir çünkü LSFM diğer iki seçenek daha iyi performans. İkisi de montaj örnekleri düz bir slaytta gerektiren bu kurulum sadece örnek en az engellenen bir görünümünü aynı zamanda bir arzu edilen aydınlatma yol, İki fotonlu ve confocal mikroskobu, bir eksiklik seçimi sağlar. Bu nedenle, LSFM en uygun miktar motor sinir Terminal içinde fare embriyo ve akson arborization 3D görüntüleme için bir araçtır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Canlı hayvanların hepsi onaylanmış ve IACUC Academia Sinica tarafından denetlenecektir belirli patojen ücretsiz (SPF) hayvan tesisinde, tutuldu.
1. fiksasyon
- Embriyo embriyonik gün 12.5 (E12.5) toplamak sonra başını kesmek ve onları alt.
- Embriyolar tek tek 24-şey levha ile 1 mL/taze hazırlanmış %4 paraformaldehyde fosfat tampon serum (PBS) x 1'in de gecede düzeltmek. Bir shaker üzerinde 4 ° C'de kuluçkaya.
- Sabit Embriyolardan en az 3 x, her biri için 5-10 dk, 1 mL 1 x PBS ile yıkama ve gecede 4 ° c üzerinde kalan paraformaldehyde kaldırmak için bir shaker kuluçkaya.
2. bütün Dağı Immunostaining
- Her embriyo % 0,5 1 ml permeabilize PBS-Triton-X-100 (PBST) bir gecede 4 ° C'de bir shaker üzerinde.
- Her örnek 1 mL 1 x PBS gecede 4 ° C'de bir shaker üzerinde FBS hazırlanan % 10 ile engelleyin.
- 1 mL anti-GFP birincil antikor ile embriyo kuluçkaya (1:1, % 10 000 seyreltme FBS) 4 ° c sabit motor sinirler GFP sinyalinin yoğunlaştırmaya sallayarak ile 72 h için.
- Birincil antikor kuluçka sonra % 0,5 ile 1 mL yıkamak %0,5 değiştirme PBST bir shaker üzerinde 4 ° C'de 1-2 gün boyunca PBST en az üç kez.
- İkincil antikor 1 mL uygulamak (1:1, % 10 000 seyreltme FBS) ve gecede 4 ° C'de sabit sallayarak ile karanlıkta kuluçkaya.
- 3 x 1 mL % 0,5 ile yıkayın bir shaker 2-3 gün boyunca üzerinde 4 ° C'de PBST. Örnekleri 1 x PBS 4 ° C'de görüntüleme önceki gün kadar devam et.
Not: Takas, bağlı olarak bölüm embriyoların yansıması önce küçük parçalara embriyo disseke. Ön ayakları bu deneysel yaklaşım (şekil 1A) korunur. - Bir ticari takas reaktif bir Kırılma indisi ışık oda sıcaklığında gecede, embriyo görüntüleme için şeffaf işlemek için korumalı bir 1,5 mL tüp 1,49 ND ile embriyo kuluçkaya.
Not: Takas reaktif hacmi yaklaşık beş kez numune hacmi ki.
3. LSFM (2-3 h)
-
Örnek kurulum
- 5 X / 0.1 ayarla aydınlatma optik ve 5 X / 0,16 algılama optik. Örnek sahibi ve örnek kılcal (1.5 mm iç çapı, yeşil) Montaj ve onları mikroskop yer.
Not: ayrıntılı kurulum yordamları için mikroskop'ın işletim kılavuzuna bakın. - Embriyo aşağıdaki gibi bağlayın:
- P200 pipet ucu kılcal damar çapını sığması uzakta üst kısmı keserek hazırlamak ve çıkarmak sivri bölüm (~ 3 mm) örnek ek için.
- Küçük bir alev kullanarak pipet ucu körelmenin sona eriyor.
- Alev söndürmek ve hızlı bir şekilde dikey olarak üzerine eritilmiş sonunda embriyo ekleyebilirsiniz.
- Örnek kapiller pipet ucuyla üst kısmındaki uygun.
- Enkaz veya baloncuklar temizlemek 1 dk için embriyo ile equilibrate odası arabellek izin.
- Görüntüleme yazılımı kullanarak, yerleştirme kapiller bulun sekmesi altında seçmek ve ayarlamak x, y, z eksenleri boyunca örnek kılcal konumlandırmak için.
- Yerleştirme örnek seçin ve embriyo üzerinde odaklanmak için 0,6 X yakınlaştırma. Görüntülü bacak uzun ekseninin iki ışık kaynağı (şekil 1B) ışık yolu ile hizalandığından emin olun embriyo döndürün.
- 5 X / 0.1 ayarla aydınlatma optik ve 5 X / 0,16 algılama optik. Örnek sahibi ve örnek kılcal (1.5 mm iç çapı, yeşil) Montaj ve onları mikroskop yer.
-
Resim alma
- Satın alma sekmesinin altındaki algılama hedefleri gibi ışık yolunu parametreleri tanımlamak, engelleme filtresi, ışın bölücü, fotoğraf makinesi ve lazer lazer.
Not: Bu deneyde GFP kanal kullanılır (uyarma dalga boyu: 488 nm; emisyon filtresi: BP 505-545 nm, ışın splitter: SPS LP 560). - Gölge azaltılması için Özet inceden inceye gözden geçirmek onay kutusunu işaretleyin.
- Satın alma ayarlarını tanımlayın: bit derinliği, 16 bit; Büyütme, 0,36-0,7 X; tek taraflı aydınlatma (sol/sağ) veya çift tarafı aydınlatma.
- Sürekli ' yi tıklatın ve lazer yoğunluğu, pozlama süresi, lazer güç ve hafif levha pozisyon daha net görüntüler elde etmek için ayarlayın.
Not: Lazer güç duyarlilik en aza indirmek mümkün olduğunca düşük tutulur. - Resim alma bitirmek için Dur tuşuna basın.
- Satın alma sekmesinin altındaki algılama hedefleri gibi ışık yolunu parametreleri tanımlamak, engelleme filtresi, ışın bölücü, fotoğraf makinesi ve lazer lazer.
-
Çok boyutlu edinme
- Z-yığın Z pozisyon için ilk ve son görüntü hareket ettirerek tanımlayın. Dilim numarasını ayarlamak için Optimal ' ı tıklatın.
- Seçili z-yığın kazanmak için Deneme başlatmak'ı tıklatın.
- Bittiğinde, resmi .czi biçiminde kaydedin.
-
Görüntü işleme (isteğe bağlı)
- Çift tarafı aydınlatma uygulanırsa çift yan füzyon ile Lightsheet işleme kanal altında devam edin. MultiView işleme birden çok açılardan görüntüleri birleştirmek için çoklu gösterim aldıysanız gereklidir.
- Bir 2B görüntü En fazla yoğunluk projeksiyon kanalın altında projeksiyon eksen boyunca yüksek yoğunluğu piksel verilerini kullanarak oluşturun.
- Kopya kanal altında görüntüleri alt kümelerine özgün kümesinden seçmek için alt küme küme küme ' ı tıklatın.
4. miktar Axon Arborization (tek tek her sinir için 30 dk)
- Görüntü dosyasını görüntüleme analizi yazılımı açın (varsayılan olarak, görüntü XYZ veri içeren Surpass modunda ve 3D render görünümü olarak açılır).
- Görüntü renk, parlaklık, ayarlamak ve Ekran ayarlaması penceresi kullanarak kontrast (Edit | Ekran ayarlama göstermek) yerel yoğunluğu Karşıtlık'dayalı filamentler algılamak için.
- Eklemek yeni filamentler simgesine tıklayın ve açılan menüde Autopath (döngü) algoritma seçin.
- Faiz (Bu durumda, ilgi segmenting akson) seçin. Bittiğinde İleri ' yi tıklatın.
- Başlangıç ve tohum Puan dilim modunu kullanarak ölçülen en büyük ve en ince çapı ölçümleri atayarak tanımlayın.
- İlgi alanının kenarında bir başlangıç noktası atayın. El ile ekleme ya da kaldırma başlangıç noktası, elde etmek için ilk işaretçi modunu değiştirmek (Kayıt bul | SELECT) ve ardından üst karakter + sağ tıklatın olarak ilgi noktaları.
- Tüm görünür arborization işaretlenmiş emin olmak tohum puan için el ile eşikler seçin. İşaretçi modunu değiştirmek (Kayıt bul | SELECT) ve tohum noktaları el ile ekleyip sonra Shift + sol tıklayın olarak ilgi noktaları.
Not: Arka plandaki gürültüleri ve sinyalleri komşu sinirler el ile kaldırmak önemlidir. - Başlangıç noktası etrafında tohum noktalarını kaldırmakkutuyu işaretleyin.
- Bu çok uzakta olmaları ve bu arka plan gürültü temsil edebilir Puan hariç tutulmasına izin için Kaldır bağlantısı kesilmiş parçaları kontrol edin. Dışlama için üst sınırı tanımlamak için Gap uzunluğu en fazla sırada gösterir.
- Her Voksel arka plan yoğunluğunu tahmin etmek için bir Gauss filtre kullanan arka plan çıkarma için eşik ayarlayın.
- Dendrite çapı yaklaşık kesit alanı algoritmasıyla için Otomatik eşik ayarlayın.
- Omurga hesaplaması için adımları atlayın.
- İşlemi tamamlamak ve istenen stilini ve rengini seçin.
- Sadece yeniden oluşturulan aksonlar görüntülemek için Özellikler birim kutusunda onay kutusunu temizleyin.
- Detaylı İstatistikler sekmesinde seçin. Tel No kullanmak Dendrite Terminal Puan motor sinir terminallerine motor axon arborization bir göstergesi olarak ölçmek için.
Not:-Ebilmek var olmak mülhak istatistiksel ek açıklama isterseniz. - Yeniden oluşturulan axon görüntüsünü bir .tif dosyası olarak verin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
LSFM embriyo MN yörünge ve akson arborization Mouse ayrıntılı 3D görselleştirme sağlar. Parlak alan altında doku ticari takas reaktif batırılır sonra tamamen şeffaf görünür. Hiçbir büzülme veya örnek şişmesi reaktif görüntüleme önce takas depolama bir hafta kadar sonra fark edildi. Floresans kanal altında motor nöronlar transgenically ifade GFP (film 1) ile etiketlenir. Bazı örnek ayrıntıları axon yapısının bozulması. Örneğin, Şekil 2 düşük kalitede görüntüleme temsil eder. Çeşitli faktörler görüntüleme kalitesi engelleyebilir. İlk olarak, yetersiz permeabilization ve adımları yıkama yüksek arka plan sinyal için yol açabilir. İkinci olarak, yeterli ölçüde temizlenen doku aracılığıyla ışık saçılma bulanık görüntüleri neden olur. Son olarak, suboptimal örnek resim alma sırasında konumlandırma ışık saçılma artırmak veya ışık yolunu engellemek.
Görüntü axon arborization için daha ayrıntılı ve miktar gerçekleştirmek için böylece her ince arborized yapısını büyütme ayarlanabilir (Movie 2) saptandı. Tek ve çift taraflı aydınlatma görüntülerini arborization desen (şekil 3) en iyi çözünürlük belirlemek için karşılaştırılmalıdır. Görüntüleme analizi yazılımı daha sonra axon arborization desenleri bireysel forelimb sinirler (şekil 4) için yeniden oluşturmak için kullanılabilir. Başlangıç noktası ve tohum nokta algılama için çapı tanımlayarak, bu arborized yapılar yarı otomatik olarak algılanabilir ve hesaplanan süre arka plan sinyalleri el ile kaldırılır. Biz "Filament - No kullanılır Toplam motor sinir terminallerine bireysel sinir motor axon arborization bir göstergesi olarak hesaplamak için işlev modu dendrite Terminal puan". Ayrıca, branş uzunluğu, ortalama çapı ve hacmi "Filament - Dendrite uzunluk", "Filament - Dendrite demek çapı" ve "Filament - Dendrite hacim", sırasıyla kullanılarak hesaplanabilir.
Şekil 1: örnek tuzak grafik illüstrasyon. (A)numune hazırlama sırasında embriyo ilk kafası parçalanmış ve. Ön ayakları Kesikli çizgi kesmiştim. (B) tüm bölge ışık yol boyunca ilgi tutmak için örnekleri örnek odasında konumlandırılır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Film 1: hafif levha Floresans mikroskobu, geniş bir görüş alanı E12.5 transgenik fare embriyonun (Hb9::GFP) üst yarısında. Film motor sinirler spinal kord innervating hedeflerine projelendirme açıkça göstermektedir. 3D görüntü ilk 0.3 X büyütme tek taraflı aydınlatma ve 30 ms çekim hızı ile video görüntü analiz yazılımı kullanarak işlenir altında kazanılır. Ölçek çubuğu 500 µm. lütfen buraya tıklayın bu videoyu izlemek için temsil eder. (İndirmek için sağ tıklatın.)
Şekil 2: yüksek arka plan sinyal ve bulanık bölgelerini (mavi oklar) içeren bir düşük kaliteli görüntü örneği. Örnek hazırlama ve görüntü alma sırasında yanlış adımlar bozulmuş görüntü kalitesi ile axon arborization sonraki herhangi bir miktar doğruluğunu tehlikeye neden olabilir. Ölçek çubuğu görüntüyü temsil eden 200 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Movie 2: görsel E12.5 forelimb olarak sinirler küçük 488 nm uyarma 0,6 büyütme, çift tarafı aydınlatmalı Yakınlaştırılmış film bireysel sinirler üzerinde açık ve panoramik görselleştirme her iyi arborized yapıları sağlar. Ölçek çubuğu 300 µm. lütfen buraya tıklayın bu videoyu izlemek için temsil eder. (İndirmek için sağ tıklatın.)
Şekil 3: tek ve çift taraflı aydınlatma arasında karşılaştırma. Çift taraflı Aydınlatmaları kombine bir görüntüden arborization desen daha eksiksiz bir görünümünü sağlar, ancak sol ve sağ Aydınlatmaları yalnızca belirli bölgelerde (Kırmızı oklar), ayrıntılarını görüntüler. Ancak, tek taraflı aydınlatma daha kısa bir görüntüleme süresi ve bazen daha iyi görüntü kalitesi ile elde edilebilir. Gerçeğini aydınlatma yolları her iki taraftan mükemmel çift tarafı Aydınlatmaları sırasında bulanıklık ortaya çıkan bir tek uçakta yalan olabilir değil nedeni bu. Görüntüleri maksimum yoğunluk projeksiyon olarak gösterilir. Ölçek çubuğu temsil eden 200 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: axon arborization aşağıdaki gibi renk kodlu bireysel forelimb sinirlerin yeniden: Supraskapular (kırmızı), aksiller (pembe), Radyal (mavi), posterior Brakiyal Kutanöz (mor). Arborization karmaşıklık tespit bizim yarı otomatik yöntemini kullanarak terminal endpoints sayısına göre hesaplanır. Autopath (döngü) algoritması filamentler izler ve kullanıcı tarafından tanımlanan başlangıç noktaları Puan tohum algılar. Ölçek çubuğu her iki görüntülerde temsil eden 200 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
İletişim kuralı birkaç adımda belirli koşullar altında değişikliklere tabi olabilir. Örneğin, fiksasyon süresi 2 h paraformaldehyde taze yapılmış kullanarak 1 veya daha fazla gün için değişen embriyo yaşın üzerinde bağlıdır. Fiksasyon için protein crosslinking, hassas antikorlar için bütün Dağı immunostaining önce yürütülen metanol alternatif bir sabitleştirici ajan olarak kullanılabilir. Boyama üzerine bir yüksek sinyal gürültü oranı için deterjan toplama en iyi duruma getirmek gereklidir (0,1-0,5 arasında %). Ek yıkama adımları öncesi ve sonrası antikor kuluçka de sinyal-gürültü oranı artırabilir. Buna ek olarak, bir doku Temizleme adım ışık yolu derin aksonal projeksiyonlar engellenmemiş olduğundan emin olmak önemlidir. Takas etkisi ters bir tampon çözeltiler örnekleri yeniden çeker tarafından gibi doku şeffaflık geliştirmek için bu PBS en az giriş sırasında kuluçka ticari takas Agent'taki sağlamak önemlidir. Aksi halde, daha yüksek bir Kırılma indisi veya daha uzun bir takas süre ile takas reaktif tavsiye edilir. Bu arada, resim alma sırasında parametre farklı örnekleri arasında değişebilir. Çift tarafı aydınlatma ve multiview görüntüleme görüntüleme derinliği alan büyük ve gelişmiş detay izin verebilir. Ancak, farklı açılardan aydınlatma aynı anda satın beri tek taraflı aydınlatma daha küçük örnekler veya hareketli örnekleri için daha verimli olur. Kaliteli görüntü aşağıdaki kantitatif analizleri için doğruluk sağlar.
Önceki çalışmalar, bizim grup tarafından da dahil olmak üzere confocal görüntüleme veya İki fotonlu mikroskobu motor axon gezinme işlemi veya arborization desenli Hb9::GFP embriyo10,15, gözlemlemek için kullanılan 16 , 17. bizim deneyime dayalı, diğer iki yöntemden beri bunlar için üstün olmak için LSFM inanıyorum: 1) zaman Imaging büyük ölçüde azalır olarak LSFM, Imaging duyarlilik ve örneklerin fototoksisite minimize ederken daha hızlı ve daha yüksek kalite sunuyor. Numune--dan ince bir ışık levha ile yan böylece bir içsel optik bölüm14,18,19oluşturma aydınlatılmış. Aydınlatma eksenine dik algılama sisteminin odak düzlemi ile hafif sayfanın ortasına yakınsar. Sonuç olarak, odak ışık azalır ve odak düzlemi içinde tek fluorophores için her görüntü, Yani, tercihan--dan tüm numune, böylece azaltarak photobleaching20aydınlatılmış. 2) arborization desen çok LSFM multiview görüntüleme sağlar daha iyi resimli ayrıntılardır. Örnek bir slayt monte yerine, hareketleri x, y ve z boyutları boyunca olduğu gibi dikey ekseni çevresinde döndürme, mümkün böyle bir şekilde bağlı. Farklı uçak ve Gösterim görüntülerden daha fazla izotropik 3D görüntüler üretmek için dizilir. Ancak, LSFM de confocal ve iki fotonlu yaklaşımlar her görüntü için oluşturulan büyük dosya boyutu açısından karşılaştırıldığında bir sınırlama vardır. Bu artılarını ve eksilerini kullanılacak görüntüleme yöntemi karar verirken tartılması gerekir, ancak sonuçta seçim hangi mikroskobik donanım/yazılım istek üzerine bağlıdır.
Kısacası, bu iletişim kuralını bütün-mount immunostaining, state-of--art birleştirir hafif levha 3D görüntüleme, görüntü analiz yazılımı miktar ile birlikte. Bu iletişim kuralı sadece motor axon gezinti ve Nefelometri axon arborization karmaşıklığı ile embriyo yörüngeleri görüntülenmesi için yeni bir paradigma sağlar ama aynı zamanda diğer nöron sistemleri (örneğin, duyusal sinir hücreleri) ile uygulanan olabilir inanıyoruz uygun transgenik fareler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
LSFM deneyleri ve veri analizi kısmen enstrüman hizmet bölümü gelişmiş optik mikroskoplar kullanarak Academia Sinica ve Bayan Shu-Chen Shen yardımı ile yapıldı. Bayan Sue-Ping Lee Imaging Core tesis, IMB Imaris görüntü analizi ile önemli teknik destek için teşekkür ediyoruz. IMB'ın bilimsel İngilizce düzenleme Core el yazması inceledim. Bu eser Academia Sinica kariyer geliştirme Ödülü (CDA-107-L05), en (104-2311-B-001-030-MY3) ve NHRI (NHRI-EX106-10315NC) tarafından finanse edilmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hb9::GFP | The Jackson labortory | 005029 | Collect embryos of embryonic day 12.5 (E12.5) |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) | For 200ml: Add 20ml 10X PBS, 8g PFA in ddH2O. Adjust pH to 7.4 with NaOH (10N). Filter sterilize and store at -20 °C. | ||
| Phosphate buffer saline 10X (PBS 10X) | For 1L: Add 80 g NaCl, 2 g KCl,14.4g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4 and top up with ddH2O. Autoclave and store at RT. | ||
| Triton X-100 | Sigma | X100-500ML | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 26140079 | |
| Sheep polyclonal anti-GFP | AbD Serotec | 4745-1051 | 1:1000 |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep | Invitrogen | A-11015 | 1:1000 |
| RapiClear 1.49 clearing reagent | SunJin Lab | RC149001 | |
| 1.5ml micro tube | Sarstedt | 72.690.001 | |
| 24 wells plate | ThermoFisher | 142475 | |
| 5 SA Tweezer | ideal-tek | 3480641 | |
| Iris Scissors striaght sharp/sharp | Aesculap | BC110R | |
| Microsurgery Scalpels, single use | Aesculap | BA365 | |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ800 | |
| Shaker | TKS | RS-01 | |
| Lightsheet Z.1 microscope | Carl Zeiss Microscopy | ||
| Imaris 8.4.0 image analysis software | Bitplane, Zurich, Switzerland | ||
| B6.Cg-Tg(Hlxb9-GFP)1Tmj/J (Hb9::GFP mice) | The Jackson Laboratory | 005029 |
References
- Davis-Dusenbery, B. N., Williams, L. A., Klim, J. R., Eggan, K. How to make spinal motor neurons. Development. 141, 491-501 (2014).
- Stifani, N. Motor neurons and the generation of spinal motor neuron diversity. Front Cell Neurosci. 8, 293 (2014).
- Kania, A., Jessell, T. M. Topographic motor projections in the limb imposed by LIM homeodomain protein regulation of ephrin-A:EphA interactions. Neuron. 38, 581-596 (2003).
- Livet, J., et al. ETS gene Pea3 controls the central position and terminal arborization of specific motor neuron pools. Neuron. 35, 877-892 (2002).
- Kanning, K. C., Kaplan, A., Henderson, C. E. Motor neuron diversity in development and disease. Annu Rev Neurosci. 33, 409-440 (2010).
- Matsumoto, S., Kiryu-Seo, S., Kiyama, H. Motor Nerve Arborization Requires Proteolytic Domain of Damage-Induced Neuronal Endopeptidase (DINE) during Development. J Neurosci. 36, 4744-4757 (2016).
- Nagata, K., et al. ECEL1 mutation implicates impaired axonal arborization of motor nerves in the pathogenesis of distal arthrogryposis. Acta Neuropathol. 132, 111-126 (2016).
- Catela, C., Shin, M. M., Lee, D. H., Liu, J. P., Dasen, J. S. Hox Proteins Coordinate Motor Neuron Differentiation and Connectivity Programs through Ret/Gfralpha Genes. Cell Rep. 14, 1901-1915 (2016).
- Bonanomi, D., et al. Ret is a multifunctional coreceptor that integrates diffusible- and contact-axon guidance signals. Cell. 148, 568-582 (2012).
- Tung, Y. T., et al. Mir-17 approximately 92 Governs Motor Neuron Subtype Survival by Mediating Nuclear PTEN. Cell Rep. 11, 1305-1318 (2015).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
- Jonkman, J., Brown, C. M. Any Way You Slice It-A Comparison of Confocal Microscopy Techniques. J Biomol Tech. 26, 54-65 (2015).
- Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists. Nat Methods. 12, 30-34 (2015).
- Santi, P. A. Light sheet fluorescence microscopy: a review. J Histochem Cytochem. 59, 129-138 (2011).
- Hanley, O., et al. Parallel Pbx-Dependent Pathways Govern the Coalescence and Fate of Motor Columns. Neuron. 91, 1005-1020 (2016).
- De Marco Garcia, N. V., Jessell, T. M. Early motor neuron pool identity and muscle nerve trajectory defined by postmitotic restrictions in Nkx6.1 activity. Neuron. 57, 217-231 (2008).
- Li, C. J., et al. MicroRNA filters Hox temporal transcription noise to confer boundary formation in the spinal cord. Nat Commun. 8, 14685 (2017).
- Swoger, J., Pampaloni, F., Stelzer, E. H. Light-sheet-based fluorescence microscopy for three-dimensional imaging of biological samples. Cold Spring Harb Protoc. 2014, 1-8 (2014).
- Pantazis, P., Supatto, W. Advances in whole-embryo imaging: a quantitative transition is underway. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 327-339 (2014).
- Reynaud, E. G., Tomancak, P. Meeting report: first light sheet based fluorescence microscopy workshop. Biotechnol J. 5, 798-804 (2010).
