Summary
Nous décrivons ici un protocole pour la visualisation de projection des motoneurones et arborisation axone dans des embryons de souris transgéniques Hb9::GFP . Après immunostaining des neurones moteurs, nous avons utilisé la microscopie de fluorescence nappe de lumière aux embryons d’image analyse quantitative. Le présent Protocole s’applique à d’autres processus de navigation neurone du système nerveux central.
Abstract
Les neurones moteurs spinaux (MNs) étendent leurs axones pour communiquer avec leurs cibles innervating, contrôlant ainsi le mouvement et les tâches complexes chez les vertébrés. Ainsi, il est essentiel de découvrir les mécanismes moléculaires de comment moteur axones Placez-vous, arborize et innervent leur musculature périphérique cible pendant le développement et la dégénérescence. Bien que les lignées de souris transgéniques Hb9::GFP ont longtemps servi de visualiser les trajectoires de l’axone moteur durant le développement embryonnaire, des descriptions détaillées de l’ensemble de l’arborisation terminale axon restent incomplets en raison de la complexité du modèle et limitations de la microscopie optique actuelle. Nous décrivons ici un protocole amélioré qui combine la microscopie de fluorescence de nappe de lumière (LSFM) et analyse d’images robuste qualitativement et quantitativement visualiser des axones moteurs de développement. Ce système peut être facilement adopté pour traverser mutants génétiques ou des modèles de maladies MN avec des lignes Hb9::GFP , révélant de nouveaux mécanismes moléculaires qui conduisent à des irrégularités dans la navigation de l’axone moteur et arborisation.
Introduction
MNs de la colonne vertébrale sont la partie du système nerveux central mais innervent des muscles périphériques pour contrôler le mouvement. Dans la pays en développement de la moelle épinière, progéniteurs MN (PMN) sont établis selon les signaux émanant de la notochorde et des somites adjacents. Toutes différencient MNs post-mitotiques sont ensuite générés à partir de PMN, éventuellement donnant lieu à une série de sous-types de MN le long de l’axe Rostro de la moelle épinière1,2. La colonne vertébrale MNs sont topographiquement et anatomiquement bien organisés. Leur arrangement morphologique est en corrélation avec la position de leurs cibles respectives dans la périphérie de3. En atteignant leurs objectifs de muscle, axones recevoir des facteurs neurotrophiques cellulaires et exogènes que les inciter à s’étendre et de la branche plus loin dans les muscles. Innervation et défauts ramifications peuvent contribuer à l’échec pour former des jonctions neuromusculaires (NMJ). Par exemple, des facteurs neurotrophiques gliales (GDNF)-Pea3 induite est indispensable pour ces axones dans maximus cutanée (CM) et4,5les muscles grand dorsal (LD). En outre, des embryons de souris knock-out DINE montrent défectueuse arborisation des nerfs phréniques dans le diaphragme, provoquant la mortalité et une insuffisance respiratoire immédiatement après la naissance de6,7. Cette dernière étape de maturation de MN (c.-à-d., projection axonale et ramification) est donc essentielle pour assurer la communication entre les neurones et les cellules cibles.
Pour afficher les modèles de l’arborisation, chercheurs procéder normalement à imagerie confocale ou microscopie de fluorescence biphotonique sectionnés ou entier-montent des échantillons8,9,10. Deux de ces techniques de microscopie génèrent acceptable résolution et profondeur de pénétration. Microscopie de fluorescence biphotonique implique l’excitation des fluorophores par absorption simultanée de deux photons de faible énergie,11. Puisque l’excitation biphotonique utilise le rayonnement infrarouge, la fréquence d’excitation baisse contribue à la diffusion réduite et meilleure pénétration tissulaire jusqu'à 1 mm dans les tissus, permettant ainsi l’imagerie avec une plus grande profondeur. Microscopie confocale supprime par les filtres de signaux de l’out-of-focus et recueille uniquement la lumière dans le plan focal12. Avec cette approche, images des échantillons provenant des plans focaux différents peuvent être combinés pour produire une image tridimensionnelle de (3D) via une fonction de Z-pile. Néanmoins, intensité du signal est réduite car la plupart de la lumière est bloquée et les ouvertures numériques hautes obscurcir la profondeur de champ. Plus important encore, les deux techniques contribuent au photovieillissement sévère et phototoxicité puisque l’échantillon entier reçoit illumination même lorsque qu’un avion est imagé à un moment donné.
Pour contourner ces lacunes, LSFM est devenu une alternative favorisée, avec l’avantage d’être rapide et efficace à la lumière et les moins phototoxique13,14. En outre, LSFM permet l’imagerie multi-vues. Cette approche est particulièrement adaptée à la visualisation des axones moteurs et leurs terminaux de dispersion comme ils se propagent dans l’espace 3D. LSFM surpasse les deux autres options parce que les échantillons sont montés sur une scène qui permet la rotation autour d’un axe vertical et les mouvements le long des x, y et les axes z. Cette configuration permet non seulement pour une vue bloqué au minimum de l’échantillon, mais aussi le choix d’un chemin de l’illumination souhaitable, une lacune de la microscopie biphotonique et confocale, qui nécessitent le montage d’échantillons sur une lame plate. LSFM est donc l’outil plus approprié pour l’imagerie 3D d’arborisation axon et pour la quantification des terminaisons nerveuses moteur dans des embryons de souris.
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Protocol
Tous les animaux vivants ont été entretenus dans un agent pathogène spécifique gratuit (SPF) animalerie, approuvé et supervisé par IACUC de l’Academia Sinica.
1. la fixation
- Recueillir des embryons de jour embryonnaire 12,5 (E12.5) puis décapiter et éviscérer leur.
- Difficulté les embryons individuellement en plaques 24 puits avec 1 mL/puits de paraformaldéhyde fraîchement préparée de 4 % en 1 x solution saline le tampon au phosphate (PBS) du jour au lendemain. Incuber à 4 ° C dans un agitateur.
- Lavez les embryons fixes au moins 3 x, chacun pendant 5-10 min, avec 1 mL de PBS 1 x et incuber une nuit à 4 ° C dans un agitateur pour enlever le paraformaldéhyde résiduelle.
2. ensemble-Mont Immunostaining
- Permeabilize chaque embryon dans 1 mL de 0,5 % PBS-Triton-X-100 (PBST) durant la nuit à 4 ° C dans un agitateur.
- Bloquer chaque échantillon avec 1 mL de 10 % FBS préparé dans du PBS 1 x nuit à 4 ° C dans un agitateur.
- Incuber l’embryon avec 1 mL d’anticorps primaire anti-GFP (1:1, 000 dilution à 10 % FBS) à 4 ° C pendant 72 h avec agitation constante pour intensifier le signal GFP des nerfs moteurs.
- Après l’incubation de l’anticorps primaire, se laver avec 1 mL de 0,5 % PBST au cours des 1-2 jours à 4 ° C dans un agitateur, changeant le 0,5 % PBST au moins trois fois.
- Appliquer 1 mL d’anticorps secondaire (1:1, 000 dilution à 10 % FBS) et incuber pendant la nuit dans l’obscurité à 4 ° C sous agitation constante.
- Laver 3 x avec 1 mL de 0,5 % PBST à 4 ° C dans un agitateur au cours des 2 ou 3 jours. Conserver les échantillons dans du PBS 1 x à 4 ° C jusqu'à la veille de l’imagerie.
Remarque : Les embryons peuvent être disséqués en segments plus petits avant d’effacer, selon celle qui part des embryons sont projeté. Les membres antérieurs sont conservés dans cette approche expérimentale (Figure 1 a). - Incuber l’embryon dans un réactif de compensation commerciale avec un indice de réfraction ND 1.49 dans un tube de 1,5 mL, abri de la lumière à température ambiante pendant la nuit, afin de restituer l’embryon transparent pour l’imagerie.
NOTE : Le volume de la compensation de réactif est environ cinq fois celle du volume de l’échantillon.
3. LSFM (2 – 3 h)
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Montage de l’échantillon
- Mis en place 5 X / 0,1 optique de l’éclairage et 5 X / 0,16 optique de détection. Assemblez le porte-échantillon et le capillaire de l’échantillon (1,5 mm de diamètre intérieur, vert) et placez-les dans le microscope.
Remarque : Reportez-vous au manuel de fonctionnement du microscope pour les procédures d’installation détaillées. - Monter l’embryon comme suit :
- Préparer l’embout de la pipette P200 en coupant la partie supérieure afin qu’elle s’adapte au diamètre du capillaire et enlever la partie triangulaire (~ 3 mm) pour la fixation de l’échantillon.
- Faire fondre la fin mitigée de l’embout de la pipette à l’aide d’une petite flamme.
- Éteindre la flamme et de fixer rapidement l’embryon verticalement sur la fin fondue.
- Monter la partie supérieure de l’embout de la pipette avec l’échantillon capillaire.
- Laisser le tampon de la chambre s’équilibrer avec l’embryon pendant 1 min débarrasser des débris ou des bulles.
- En utilisant le logiciel d’imagerie, sélectionnez Locate capillaire sous l’onglet Rechercher et réglez x, y, axes z pour positionner le capillaire de l’échantillon.
- Sélectionnez l’échantillon de localiser et de zoom à 0,6 X de se concentrer sur l’embryon. Faire pivoter l’embryon pour s’assurer que l’axe longitudinal de la branche image s’aligne sur le trajet optique des deux sources lumineuses (Figure 1 b).
- Mis en place 5 X / 0,1 optique de l’éclairage et 5 X / 0,16 optique de détection. Assemblez le porte-échantillon et le capillaire de l’échantillon (1,5 mm de diamètre intérieur, vert) et placez-les dans le microscope.
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Acquisition d’images
- Sous l’onglet Acquisition , définir les paramètres de parcours lumineux tels que les objectifs de détection, laser blocage filtre séparateur de faisceau, caméras et lasers.
Remarque : Le canal de la GFP est utilisé dans cette expérience (longueur d’onde Excitation : 488 nm ; filtre d’émission : BP 505 à 545 nm, séparateur de faisceau : SPS LP 560). - Cochez la case scan de pivot pour la réduction de l’ombre.
- Définir les paramètres d’acquisition : profondeur de couleur, 16 bits ; Zoom, 0,36-0,7 X ; illumination de simple-côté (gauche/droite) ou double-côté éclairage.
- Cliquez sur continue , puis définir l’intensité du laser, durée d’exposition, puissance laser et position de la nappe de lumière d’acquérir des images plus nettes.
Remarque : La puissance du laser est maintenue aussi basse que possible réduire au minimum le photovieillissement. - Appuyez sur STOP pour mettre fin à une acquisition d’images.
- Sous l’onglet Acquisition , définir les paramètres de parcours lumineux tels que les objectifs de détection, laser blocage filtre séparateur de faisceau, caméras et lasers.
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Acquisition de multidimensionnelle
- Définir la z-pile en déplaçant la position Z pour la première et la dernière image. Cliquez sur Optimal pour définir le nombre de tranche.
- Cliquez sur Démarrer expérience pour acquérir la z-pile sélectionnée.
- Lorsque c’est fait, enregistrez l’image au format .czi.
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Traitement de l’image (facultatif)
- Procéder à la fusion double côté sous le canal de Lightsheet traitement si dual-side illumination est appliquée. MultiView de traitement n’est nécessaire si plusieurs vues sont acquis pour combiner des images sous plusieurs angles.
- Créer une image 2D en utilisant les données de pixels plus hautes intensité le long de l’axe de projection sous le canal de la Projection d’intensité maximale .
- Sous canal de copie , cliquez sur sous-ensemble pour sélectionner des sous-ensembles d’images du jeu original.
4. la quantification de l’arborisation Axon (30 Min pour chaque nerf individuel)
- Ouvrez le fichier image dans le logiciel d’analyse d’imagerie (par défaut, l’image qui contient les données XYZ est ouvert en mode Surpass et comme un point de vue 3D-rendu).
- Ajuster la couleur de l’image, luminosité et contraste à l’aide de la fenêtre de Réglage de l’affichage (Edit | Réglage de l’affichage montrent) pour détecter les filaments basées sur le contraste de l’intensité locale.
- Cliquez sur l’icône Ajouter nouveaux Filaments et sélectionnez l’algorithme Autopath (pas de boucle) dans le menu déroulant.
- Sélectionnez la région d’intérêt (dans ce cas, l’axone segmentation d’intérêt). Cliquez sur suivant lorsque vous avez terminé.
- Définir les points de départ et semences en attribuant les mesures de diamètre plus grand et plus mince, ce qui peuvent être mesurées en utilisant le mode de la tranche .
- Attribuer un point de départ au bord de la région d’intérêt. Pour obtenir le manuel ajout ou la suppression des points de départ, d’abord changer le mode de pointeur (naviguer | Sélectionnez) et puis MAJ + clic-droit sur les points d’intérêt.
- Sélectionnez manuelles seuils pour les points de la graine pour s’assurer que tous l’arborisation visible est marqué. Changer le mode de pointeur (naviguer | Sélectionnez) et puis MAJ + clic gauche sur les points d’intérêt pour manuellement ajouter ou supprimer des points de la graine.
Remarque : Il est important de supprimer manuellement les signaux et les bruits de fond des nerfs voisins. - Cochez la case Supprimer les graines points autour de points de départ.
- Vérifiez supprimer déconnecté segments afin de permettre l’exclusion des points qui sont trop loin et qui peuvent représenter des bruits de fond. Indiquer la Longueur maximale de Gap à l’étape suivante pour définir la limite supérieure de l’exclusion.
- Ajustez le seuil pour la soustraction de fond, qui utilise un filtre gaussien pour estimer l’intensité de l’arrière-plan de chaque voxel.
- La valeur seuil automatique pour diamètre de dendrite en utilisant l’algorithme approximatif transversale .
- Ignorez les étapes pour le calcul de la colonne vertébrale.
- Terminer le processus et choisissez le style désiré et la couleur.
- Décochez la case de volume dans les Propriétés pour afficher uniquement les axones reconstituées.
- Sous l’onglet statistiques , sélectionnez détaillée. Utiliser des filaments de no. Dendrite Terminal Points pour quantifier les terminaisons nerveuses moteur comme indicateur de l’arborisation axone moteur.
NOTE : Les statistique annotation peut être ajoutée si vous le souhaitez. - Exporter l’image de l’axone reconstruit comme un fichier .tif.
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Representative Results
LSFM fournit une visualisation 3D détaillée d’arborisation de trajectoire et axon MN chez la souris embryons. Sous champ lumineux, tissus apparaissent complètement transparents après une immersion dans le réactif de compensation commerciale. Aucun retrait ou gonflement de l’échantillon a été remarqué après une semaine de stockage en apurant réactif avant l’imagerie. Sous le canal de la fluorescence, neurones moteurs sont étiquetés avec GFP transgéniquement expresse (film 1). Dans certains cas, les détails de la structure de l’axone sont compromises. Par exemple, la Figure 2 représente l’imagerie basse qualité. Plusieurs facteurs peuvent entraver la qualité d’image. Tout d’abord, perméabilisation insuffisante et étapes de lavage peuvent conduire au signal de fond élevé. Deuxièmement, la diffusion de la lumière à travers un tissu mal dégagé se traduira par images floues. Enfin, échantillon sous-optimale positionnement au cours de l’acquisition d’images pourrait augmenter la diffusion de la lumière ou bloquer le trajet de la lumière.
D’arborisation axon image plus en détail et faire une quantification, grossissement peut être ajusté pour que chaque structure finement arborisé peut être révélé (film 2). Images d’éclairage simple - et double-côté devraient être comparés afin de déterminer la résolution optimale de mire de l’arborisation (Figure 3). Logiciel d’analyse d’imagerie peut alors servir à reconstruire les patrons arborisation axones des nerfs des membres antérieurs (Figure 4). En définissant le point de départ et le diamètre pour la détection de point de semences, ces structures arborisés soit semi-automatiquement détectés et calculées, alors que les signaux de fond sont retirés manuellement. Nous avons utilisé le « Filament – n° Mode de fonctionnement de dendrite Terminal Pts » pour calculer les bornes de nerf moteur total des nerfs individuels comme indicateur de l’arborisation axone moteur. En outre, la longueur des branches, diamètre moyen et le volume peuvent être calculés à l’aide de « Longueur des filaments – Dendrite », « Filament – diamètre Dendrite signifie » et « Filament – Dendrite Volume », respectivement.
Figure 1 : illustration graphique de configuration exemple. (A) au cours de la préparation de l’échantillon, les embryons sont tout d’abord décapités et éviscérés. Les membres antérieurs sont disséqués le long de la ligne pointillée. (B) dans le compartiment de mesure, les échantillons sont placés pour garder l’ensemble de la région d’intérêt le long du trajet de la lumière. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Movie 1 : lumière microscopie de fluorescence de feuille d’un grand champ de vision de la moitié supérieure d’un embryon de souris transgénique de E12.5 (Hb9::GFP). Le film montre clairement des nerfs moteurs, projetant de la moelle épinière vers leurs cibles innervating. L’image 3D est tout d’abord acquis sous 0,3 X grossissement avec temps de pose éclairage et 30 ms de simple-côté et plus tard est transformé en vidéo à l’aide de logiciels d’analyse image. Barre d’échelle représente 500 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visualiser cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)
Figure 2 : exemple d’une image de mauvaise qualité avec signal de fond élevé et régions floues (flèches bleues). Les étapes incorrects lors de l’acquisition de préparation et de l’image échantillon peuvent conduire à la qualité de l’image altérée de compromettre l’exactitude de n’importe quel dosage ultérieur d’arborisation axon. Barre d’échelle dans l’image représente 200 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Movie 2 : visualisation des membres antérieurs E12.5 nerfs une excitation moins 488 nm avec éclairage dual-side à un grossissement de 0,6 x. Le film agrandie permet la visualisation claire et panoramique de toutes structures arborisés fines sur les nerfs. Barre d’échelle représente 300 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visualiser cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)
Figure 3 : comparaison entre éclairage simple - et double-côté. Illuminations de gauche et de droite affichent les détails de certaines régions seulement (flèches rouges), tandis qu’une image combinée de double-côté enluminures fournit une vision plus complète de la structure de l’arborisation. Toutefois, l’illumination de simple-côté peut être obtenue en moins de temps d’imagerie et parfois avec la meilleure qualité d’image. Cela est dû au fait que chemins d’illumination des deux côtés peuvent se trouver pas parfaitement sur un seul plan, ayant pour résultat flou lors de double-côté illuminations. Images apparaissent comme projection d’intensité maximale. Barre d’échelle représente 200 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : reconstruit ces axones des nerfs des membres antérieurs, code de couleur comme suit : préscapulaire (rouge), axillaire (rose), radial (bleu), brachial cutané postérieur (violet). Complexité de l’arborisation a été calculée selon le nombre de paramètres terminales détecté en utilisant notre méthode semi-automatisée. L’algorithme Autopath (pas de boucle) retrace les filaments et détecte les points de la graine de points de départ définie par l’utilisateur. Barre d’échelle dans les deux images représente 200 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Plusieurs étapes dans le protocole peuvent être soumis à des changements dans certaines circonstances. Par exemple, la durée de fixation varie selon l’âge des embryons, variant de 2 h à 1 ou plusieurs jours à l’aide de paraformaldéhyde fraîchement faites. Étant donné que la fixation est effectuée avant toute monture immunomarquage, des anticorps qui sont sensibles aux protéines de réticulation, méthanol peut servir un autre agent fixateur. Pour un rapport signal sur bruit élevé sur la coloration, il est nécessaire d’optimiser la concentration de détergent (entre 0,1 et 0,5 %). Les étapes de lavage supplémentaire avant et après incubation des anticorps peuvent également augmenter le rapport signal-bruit. En outre, une étape de nettoyage des tissus est importante de s’assurer que le trajet de la lumière est débloqué tout au long des projections axonales profond. Pour accroître la transparence des tissus, il est important assurer minime introduction de PBS pendant l’incubation à l’agent de compensation commerciale, comme l’effet de compensation est renversé en re-immergeant exemples de solutions tampons. Dans le cas contraire, un réactif de compensation avec un indice de réfraction plus élevé ou une plus longue période de compensation est recommandé. Pendant ce temps, les paramètres lors de l’acquisition de l’image varient selon les différents échantillons. Dual-side illumination et imagerie multiview peuvent permettre d’imagerie avec une plus grande profondeur de champ et des détails améliorés. Cependant, puisque l’illumination sous différents angles est acquis en même temps, illumination de simple-côté est plus efficace pour les plus petits spécimens ou échantillons mobiles. Une image de bonne qualité assure la précision pour les analyses quantitatives suivantes.
Des études antérieures, y compris ceux de notre groupe, ont utilisé l’imagerie confocale ou microscopie biphotonique à observer le modèle axone moteur navigation processus ou arborisation en Hb9::GFP embryons10,15, 16 , 17. d’après notre expérience, nous croyons LSFM supérieur à ces deux autres méthodes depuis : 1) temps d’imagerie est largement réduit comme LSFM offre plus rapide et de meilleure qualité image, tout en minimisant le photovieillissement et phototoxicité des échantillons. Spécimens sont éclairés par le côté avec une mince nappe de lumière, créant ainsi une coupe optique intrinsèque14,18,19. Le centre de la nappe de lumière converge avec le plan focal du système de détection, qui est orthogonal à l’axe d’éclairage. Par conséquent, out-of-focus lumière est réduite, et le seuls fluorophores dans le plan focal sont illuminés pour chaque image, par exemple, plutôt que le spécimen entier, réduisant le photoblanchiment20. 2) les détails du modèle d’arborisation sont beaucoup mieux illustrés que LSFM permet l’imagerie multiview. Au lieu de l’échantillon étant monté sur une lame, il est fixé de telle façon que la rotation autour d’un axe vertical est possible, comme le sont les mouvements le long de le x, y et z dimensions. Les images des différents plans et vues sont empilés pour produire des images 3D plus isotropes. Cependant, LSFM a également une limitation par rapport aux approches confocale et deux photons en fonction de la taille du fichier massive créé pour chaque image. Ces avantages et les inconvénients doivent être pesés pour décider quelle méthode d’imagerie à utiliser, mais en fin de compte le choix dépendra de quel logiciel/matériel microscopique est disponible sur demande.
En bref, ce protocole combine ensemble monture immunomarquage, state-of-the-art lumière imagerie 3D feuille, ainsi que la quantification dans le logiciel d’analyse image. Nous croyons que ce protocole non seulement fournit un nouveau paradigme pour la visualisation de navigation de l’axone moteur et trajectoires dans des embryons avec quantification de la complexité de ces axones, mais pourrait également être appliqué à d’autres systèmes de neurone (c.-à-d., les neurones sensoriels) avec souris transgéniques appropriés.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
LSFM expériences et analyse des données ont été réalisées en partie en utilisant les microscopes optiques avancés de la Division du Service de l’Instrument à l’Academia Sinica et avec l’aide de Mme Shen Shu-Chen. Nous remercions Mme Sue-Ping Lee de l’Imaging Core Facility de IMB pour une assistance technique considérable avec l’analyse d’image Imaris. Scientifique anglais édition Core les microbilles ont examiné le manuscrit. Ce travail est financé par l’Academia Sinica Career Development Award (CDA-107-L05), plus (104-2311-B-001-030-MY3) et INDH (INRH-EX106-10315NC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hb9::GFP | The Jackson labortory | 005029 | Collect embryos of embryonic day 12.5 (E12.5) |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) | For 200ml: Add 20ml 10X PBS, 8g PFA in ddH2O. Adjust pH to 7.4 with NaOH (10N). Filter sterilize and store at -20 °C. | ||
| Phosphate buffer saline 10X (PBS 10X) | For 1L: Add 80 g NaCl, 2 g KCl,14.4g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4 and top up with ddH2O. Autoclave and store at RT. | ||
| Triton X-100 | Sigma | X100-500ML | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 26140079 | |
| Sheep polyclonal anti-GFP | AbD Serotec | 4745-1051 | 1:1000 |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep | Invitrogen | A-11015 | 1:1000 |
| RapiClear 1.49 clearing reagent | SunJin Lab | RC149001 | |
| 1.5ml micro tube | Sarstedt | 72.690.001 | |
| 24 wells plate | ThermoFisher | 142475 | |
| 5 SA Tweezer | ideal-tek | 3480641 | |
| Iris Scissors striaght sharp/sharp | Aesculap | BC110R | |
| Microsurgery Scalpels, single use | Aesculap | BA365 | |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ800 | |
| Shaker | TKS | RS-01 | |
| Lightsheet Z.1 microscope | Carl Zeiss Microscopy | ||
| Imaris 8.4.0 image analysis software | Bitplane, Zurich, Switzerland | ||
| B6.Cg-Tg(Hlxb9-GFP)1Tmj/J (Hb9::GFP mice) | The Jackson Laboratory | 005029 |
References
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