Summary
在这里, 我们描述了一个协议, 以可视化的运动神经元投射和轴突树枝状在转基因 Hb9::GFP 小鼠胚胎. 在对运动神经元进行染色后, 我们用光片荧光显微镜对图像胚胎进行了定量分析。本协议适用于中枢神经系统的其它神经元导航过程。
Abstract
脊髓运动神经元 (MNs) 扩展其轴突, 以与其支配目标进行沟通, 从而控制脊椎动物的运动和复杂任务。因此, 在发育和变性过程中, 揭示运动神经轴突如何定位、arborize 和支配其周围肌肉靶点的分子机制至关重要。尽管转基因的Hb9::GFP鼠标线长期用于可视化胚胎发育过程中的马达轴突轨迹, 但由于模式复杂, 对轴突终端树枝状的详细描述仍然不完整,目前光学显微镜的局限性。在这里, 我们描述了一个改进的协议, 结合光片荧光显微镜 (LSFM) 和稳健的图像分析, 定性和定量可视化发展电机轴突。该系统可以很容易地用于交叉遗传突变体或锰疾病模型与Hb9::GFP线, 揭示了新的分子机制, 导致缺陷的电机轴突导航和树枝状。
Introduction
脊髓的 MNs 是中枢神经系统的一部分, 但支配周围的肌肉来控制运动。在发育中的脊髓中, 根据脊索和相邻胚胎背部发出的信号建立锰祖细胞 (pMNs)。所有分化后有丝分裂后的 MNs, 然后产生从 pMNs, 最终产生一系列锰亚型沿 rostrocaudal 轴的脊髓1,2。脊髓的地形和解剖良好组织。它们的形态学排列与各自目标在外围3中的位置相关。在达到他们的肌肉目标, 轴突接收细胞和外源性神经营养因子, 促使他们扩大和分支进一步进入肌肉。神经支配和分支缺陷可能导致无法形成肌电结 (NMJ)。例如, 神经胶质源性神经营养因子 (GDNF) 诱发的 Pea3 是必不可少的轴突树枝状到皮肤阔肌 (CM) 和后背筋 (LD) 肌肉 4, 5.此外,进餐挖空小鼠胚胎显示膈神经有缺陷的树枝状在隔膜, 导致呼吸衰竭和死亡后立即出生 6, 7.因此, 这最后一步的锰成熟 (即, 轴突投射和分支) 是至关重要的, 以确保神经元之间的沟通和目标细胞。
为了查看树枝状模式, 研究人员通常进行共焦成像或双光子荧光显微镜的切片或全挂载样本 8, 9, 10.这两种显微技术都能产生可接受的分辨率和深度穿透力。双光子荧光光镜涉及显影的激发, 同时吸收两个低能光子11。由于双光子激励使用近红外辐射, 减少的激发频率有助于减少散射和更好的组织穿透多达1毫米的组织, 从而使成像更深入。共焦显微镜通过过滤出焦点信号并在焦点平面12中收集光来消除。通过这种方法, 可以将来自不同焦平面的样本图像组合起来, 通过 Z 堆栈函数生成三维 (3D) 图像。然而, 由于大部分光线被堵塞, 而且高数值孔径掩盖了景深, 信号强度降低。更重要的是, 这两种技术都有助于严重的光损伤和毒性, 因为整个标本接受照明, 即使只有一架飞机是在给定的时间成像。
为了规避这些缺点, LSFM 已成为一种受青睐的替代方案, 具有快速、高效、光毒性13、14等优点.此外, LSFM 还允许多视图成像。这种方法特别适合于可视化电机轴突及其分散终端, 因为它们分布在3D 空间。LSFM 优于其他两个选项, 因为示例安装在允许围绕垂直轴旋转和沿 x、y 和 z 轴移动的舞台上。这种设置不仅允许对样本进行最小的屏蔽, 而且还可以选择理想的光照路径、双光子和共焦显微镜的缺点, 这两种方法都需要在平面滑动上安装样品。因此, LSFM 是最合适的工具, 3D 成像的轴突树枝状和量化的运动神经终端的小鼠胚胎。
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Protocol
所有活的动物都保存在一个特定的病原体免费 (SPF) 动物设施, 批准和监督的 IACUC 研究院。
1. 固定
- 收集胚胎12.5 天 (E12.5) 然后斩首和阉割他们。
- 在1x 磷酸缓冲盐水 (PBS) 一夜之间, 将胚胎单独固定在24井板上, 1 毫升/井的新鲜制备的4% 多聚甲醛。在一个振动筛上孵化4摄氏度。
- 将固定的胚胎至少洗 3x, 每5-10 分钟, 用1毫升 1x PBS, 并在4摄氏度在一夜床上孵化, 以除去残留的多聚甲醛。
2. 全芒染色
- Permeabilize 每个胚在1毫升 0.5% PBS-Triton-X-100 (PBST) 过夜在4°c 在一个振动筛。
- 在 1x PBS 中, 每晚在4摄氏度的一个振动筛上, 用1毫升10% 胎的样品来阻断每个样本。
- 用1毫升的抗 GFP 原抗体 (1:1, 000 稀释10% 血清) 在4摄氏度上孵化胚胎, 持续晃动以强化运动神经神经的 GFP 信号。
- 在主抗体孵化后, 用1毫升 0.5% PBST, 在1-2 天的时间内, 在4摄氏度的振动筛上冲洗, 改变 0.5% PBST 至少三次。
- 应用1毫升二次抗体 (1:1, 000 稀释在10% 血清) 和孵化夜间在黑暗中在4°c 与恒定的震动。
- 洗涤3x 与1毫升 0.5% PBST 在4°c 在一个振动筛在2-3 天期间。将样品保持在 1x PBS 的4摄氏度, 直到成像前一天。
注意: 胚胎在清除前可以解剖成较小的部分, 这取决于胚胎的哪个部分会被成像。前肢是保存在这个实验方法 (图 1A)。 - 在一个具有1.49 和1.5 毫升管的折射率的商业清除试剂中孵化胚胎, 在室温下防止夜间的光线, 从而使胚胎成像透明。
注: 清除试剂的体积约为样品体积的五倍。
3. LSFM (2–3 h)
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示例设置
- 设置 5 x/0.1 照明光学和 5 x/0.16 检测光学。组装样品持有人和样品毛细管 (1.5 毫米内径, 绿色), 并把它们放到显微镜。
注: 请参阅显微镜的操作手册, 以进行详细的设置程序。 - 安装胚胎如下:
- P200 吸管尖端的切割, 使其适合毛细管直径, 并删除尖部 (~ 3 毫米) 的样品附件。
- 用小火焰融化吸管尖端的钝端。
- 熄灭火焰, 并迅速将胚胎垂直附着在融化的末端上。
- 将吸管尖端的上部与样品毛细管配合使用。
- 允许室缓冲与胚胎平衡1分钟清除碎片或气泡。
- 使用成像软件, 在定位选项卡下选择定位毛细管, 并调整 x、y、z 轴以定位毛细管。
- 选择定位示例并缩放到0.6X 以关注胚胎。旋转胚胎以确保成像肢体的长轴与两个光源 (图 1B) 的光路径对齐。
- 设置 5 x/0.1 照明光学和 5 x/0.16 检测光学。组装样品持有人和样品毛细管 (1.5 毫米内径, 绿色), 并把它们放到显微镜。
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图像采集
- 在获取选项卡下, 定义光路径参数, 如检测目标、激光阻挡过滤器、光束分配器、照相机和激光器。
注: GFP 通道用于本实验 (激发波长: 488 nm; 发射过滤器: BP 505 至 545 nm, 分束: SPS LP 560)。 - 选中 "透视扫描" 复选框以减少阴影。
- 定义采集设置: 位深度, 16 位;变焦, 0.36-0, 7 x;单侧照明 (左/右) 或双侧照明。
- 单击连续并设置激光强度、曝光时间、激光功率和光片位置以获取更清晰的图像。
注: 激光功率保持尽可能低, 以最小化光损伤。 - 按停止结束图像获取。
- 在获取选项卡下, 定义光路径参数, 如检测目标、激光阻挡过滤器、光束分配器、照相机和激光器。
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多维获取
- 通过移动第一个和最后一个图像的 z 位置来定义 z 堆栈。单击最佳设置切片编号。
- 单击开始实验获取选定的 z 堆栈。
- 完成后, 将图像保存为. czi 格式。
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图像处理 (可选)
- 如果应用了双侧光照, 则在Lightsheet 处理通道下进行双侧融合。如果获取多视图来组合多个角度的图像, 则需要Multiview 处理。
- 使用最大强度投影通道中沿投影轴的最高强度像素的数据创建2D 图像。
- 在复制通道下, 单击子集从原始集选择图像子集。
4. 轴突树枝状的定量 (每个人神经30分钟)
- 在成像分析软件中打开图像文件 (默认情况下, 包含 XYZ 数据的图像将以超越模式打开, 并作为3维渲染视图)。
- 使用显示调整窗口调整图像颜色、亮度和对比度 (编辑 |显示调整) 以根据局部强度对比度检测花丝。
- 单击添加新细丝图标, 然后在下拉菜单中选择Autopath (无循环)算法。
- 选择感兴趣的区域 (在这种情况下, 细分轴的兴趣)。完成后, 单击下一步。
- 通过指定最大和最薄直径测量来定义起始和种子点, 可以使用切片模式对其进行测量。
- 在感兴趣区域的边缘分配一个起始点。要实现手动添加或删除起始点, 请首先更改指针模式 (导航 |选择), 然后Shift + 右键单击在感兴趣的点。
- 为种子点选择手动阈值, 以确保标记了所有可见的树枝状。更改指针模式 (导航 |选择), 然后Shift + 左键单击在感兴趣的点, 以手动添加或删除种子点。
注意: 手动删除周围神经的背景噪声和信号是很重要的。 - 选中在起始点周围移除种子点复选框。
- 检查删除断开连接的段以允许排除距离太远且可能表示背景噪音的点。指示下一步骤中的最大间隙长度, 以定义排除的上限。
- 调整背景减法的阈值, 使用高斯滤波器估计每个体素的背景强度。
- 使用近似截面面积算法设置枝晶直径的自动阈值。
- 跳过脊柱计算的步骤。
- 完成该过程并选择所需的样式和颜色。
- 取消选中属性中的卷框以仅查看重建的轴突。
- 在统计选项卡下, 选择详细。使用灯丝号。枝晶末端点量化电机神经终端作为电机轴突树枝状的指示器。
注意: 如果需要, 可以添加统计注释。 - 将重建后轴突的图像导出为. tif 文件。
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Representative Results
LSFM 提供详细的3D 可视化的锰弹道和轴突树枝状在小鼠胚胎。在明亮的领域, 在被浸泡在商业清除试剂之后, 组织显得完全透明。无收缩或肿胀的样本被发现后, 一个星期的存储在清除试剂成像前。在荧光通道下, 电机神经元被标记为 transgenically 表达的 GFP (影片 1)。在某些情况下, 轴突结构的细节被破坏。例如,图 2表示低质量映像。有几个因素会阻碍成像质量。首先, 通透和洗涤步骤不足会导致高背景信号。其次, 光散射通过不充分清除组织将导致图像模糊。最后, 图像采集过程中的次优采样定位可能会增加光散射或阻挡光路。
为了更详细地描述轴突树枝状, 并进行量化, 可以调整放大倍数, 使每个精细的 arborized 结构都可以显示 (影片2)。应比较单和双侧光照图像, 以确定树枝状模式的最佳分辨率 (图3)。然后, 成像分析软件可以用于重建单个前肢神经的轴突树枝状模式 (图4)。通过定义种子点检测的起始点和直径, 可以在手动移除背景信号的情况下, 对这些 arborized 结构进行半自动检测和计算。我们用了 "灯丝-不"树枝状末端分枝 "功能模式, 以计算单个神经的总运动神经端作为运动轴突树枝状的指示器。此外, 分枝长度、平均直径和体积可以用 "灯丝-枝晶长度"、"灯丝-枝晶平均直径" 和 "灯丝-枝晶体积" 来计算。
图 1: 示例设置的图示.(A) 在样品准备过程中, 胚胎首先被斩首和切除。前肢沿虚线解剖。(B) 在取样室中, 样品放置在光路沿线, 以保持整个区域的兴趣。请单击此处查看此图的较大版本.
影片 1: E12.5 转基因小鼠胚上半部大视野的光片荧光显微镜 (Hb9::GFP).这部电影清楚地展示了从脊髓投射到其支配靶的马达神经。3D 图像首先获得0.3X 放大的单侧照明和30毫秒曝光时间, 后来被处理成视频使用图像分析软件。缩放栏代表500µm.请单击此处查看此视频。(右键单击可下载)
图 2: 具有高背景信号和模糊区域 (蓝色箭头) 的低质量图像的示例.在样品制备和图像采集过程中不适当的步骤可能会导致图像质量受损, 从而危及任何随后的轴突树枝状量化的准确性。图像中的缩放条表示200µm.请单击此处查看此图的较大版本.
影片 2: E12.5 前肢神经在 488 nm 激励下的可视化, 双侧光照放大 0.6X.放大的电影允许清晰和全景可视化每一个细微的 arborized 结构的个人神经。缩放栏代表300µm.请单击此处查看此视频。(右键单击可下载)
图 3: 单侧和双面照明的比较.左和右照明仅显示某些区域的详细信息 (红色箭头), 而双侧照明的组合图像提供了树枝状模式的更完整视图。然而, 单侧照明可以在较短的成像时间内实现, 有时具有较好的图像质量。这是由于这一事实, 双方的照明路径可能不会完全位于一个单一的平面上, 导致模糊在双侧照明。图像显示为最大强度投影。缩放栏代表200µm.请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: 重建单个前肢神经的轴突树枝状, 颜色编码如下: 肩胛 (红色), 腋生 (粉红色), 径向 (蓝色), 后臂皮肤 (紫色) 。树枝状的复杂性是根据使用我们的半自动方法检测到的终端端点数计算出来的。Autopath (无环路) 算法跟踪细丝并从用户定义的起始点检测种子点。两个图像中的缩放条表示200µm.请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
在某些情况下, 议定书中的若干步骤可能会受到变化。例如, 固定时间取决于胚胎的年龄, 从2小时到1天或更多的时候使用新鲜的多聚甲醛。由于固定是在整个染色之前进行的, 对于蛋白质交联敏感的抗体, 甲醇可以用作替代的固液剂。对于染色时的高信噪比, 必须优化洗涤剂浓度 (0.1-0.5%)。抗体孵化前后的额外洗涤步骤也可以增加信噪比。此外, 组织清除步骤对于确保在整个深轴突投影中的光路畅通是很重要的。为了提高组织透明度, 重要的是要确保最小的引入 PBS 在孵化期间的商业结算代理, 因为清除效果是逆转, 重新浸泡样品的缓冲液。否则, 建议使用具有较高折射率或较长清除周期的清除试剂。同时, 图像采集过程中的参数随样本的不同而变化。双侧照明和 multiview 成像可以使成像具有更大的景深和增强的细节。然而, 由于不同角度的光照同时获得, 单侧光照对较小的试样或移动样品更有效。良好的质量图像确保了以下定量分析的准确性。
以前的研究, 包括我们的小组, 已经利用共聚焦成像或双光子显微镜观察电机轴突导航过程或树枝状模式在 Hb9::GFP 胚胎 10, 15, 16,17. 根据我们的经验, 我们认为 LSFM 优于其他两种方法, 因为: 1) 成像时间大大减少, 因为 LSFM 提供更快速和更高质量的成像, 同时尽量减少光损伤和毒性的样本。标本用薄光片从侧面照亮, 从而创建一个内部光学部分14,18,19。光片的中心与检测系统的焦平面会聚, 它与照明轴是正交的。因此, 聚焦光减少, 只有在焦平面内的显影为每个图像,即, 而不是整个样本, 从而减少漂白20。2) 树枝状模式的细节更能说明, 因为 LSFM 允许 multiview 成像。与其将试样装入幻灯片上, 不如将其附加在垂直轴周围旋转的方式, 如沿 x、y 和 z 尺寸的运动。从不同的平面和视图的图像堆积, 以产生更各向同性的3D 图像。然而, 与共聚焦和双光子方法相比, LSFM 在为每个图像创建的海量文件大小方面也有局限性。这些利弊需要权衡时, 决定使用哪种成像方法, 但最终的选择将取决于哪些微观硬件/软件可根据要求。
简而言之, 该协议结合了全安装染色, 最先进的光片3D 成像, 以及量化的图像分析软件。我们相信这个协议不仅提供了一个新的范式, 以可视化的运动轴突导航和轨迹的胚胎与定量的轴突树枝状复杂性, 但也可以应用于其他神经元系统 (即, 感官神经元) 与合适的转基因小鼠。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
LSFM 实验和数据分析部分采用先进的光学显微镜, 在中央研究院仪器服务部门, 并在舒沈女士的协助下进行。我们感谢 IMB 的成像核心设施, Imaris 图像分析的大量技术援助苏女士。IMB 的科学英语编辑核心审查了手稿。这项工作由中央研究院职业发展奖 (CDA-107-L05)、多数 (104-2311-001-030-MY3) 和人权机构 (NHRI-EX106-10315NC) 资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hb9::GFP | The Jackson labortory | 005029 | Collect embryos of embryonic day 12.5 (E12.5) |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) | For 200ml: Add 20ml 10X PBS, 8g PFA in ddH2O. Adjust pH to 7.4 with NaOH (10N). Filter sterilize and store at -20 °C. | ||
| Phosphate buffer saline 10X (PBS 10X) | For 1L: Add 80 g NaCl, 2 g KCl,14.4g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4 and top up with ddH2O. Autoclave and store at RT. | ||
| Triton X-100 | Sigma | X100-500ML | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 26140079 | |
| Sheep polyclonal anti-GFP | AbD Serotec | 4745-1051 | 1:1000 |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep | Invitrogen | A-11015 | 1:1000 |
| RapiClear 1.49 clearing reagent | SunJin Lab | RC149001 | |
| 1.5ml micro tube | Sarstedt | 72.690.001 | |
| 24 wells plate | ThermoFisher | 142475 | |
| 5 SA Tweezer | ideal-tek | 3480641 | |
| Iris Scissors striaght sharp/sharp | Aesculap | BC110R | |
| Microsurgery Scalpels, single use | Aesculap | BA365 | |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ800 | |
| Shaker | TKS | RS-01 | |
| Lightsheet Z.1 microscope | Carl Zeiss Microscopy | ||
| Imaris 8.4.0 image analysis software | Bitplane, Zurich, Switzerland | ||
| B6.Cg-Tg(Hlxb9-GFP)1Tmj/J (Hb9::GFP mice) | The Jackson Laboratory | 005029 |
References
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