Summary
השתלת הלבלב איון היא דרך להשיג normoglycemia על סוכרת מסוג 1. מאמר זה מתמקד בטכניקה השתלת מהנתיב intraportal כדי לשמור על רמות גלוקוז נורמלי בעכברים סוכרתיים.
Abstract
השתלת הלבלב איון להפחית היפרגליקמיה היא מצליחה מאוד בחולדות עם סוכרת בהשפעת כימיקלים. האתר השתלת הנפוץ ביותר השתלת איון ניסיוני הוא הקפסולה כליות. עם זאת, פחות הידוע על האינטראקציה של לנגרהנס עם מרכיבי דם, זה גם הגיוני לנצל את הגישה וריד שער הכבד השתלת איון ניסיוני.
פרוטוקול זה מדגים שיטת השתלת איון intraportal בעכברים עירום NMRI. Streptozotocin (180 מ"ג/ק"ג) מוזרק intraperitoneally לזירוז היפרגליקמיה בעכברים הנמען. הם נחשבים כמו סוכרת ברמת הגלוקוז בדם ללא צום גדול מ- 20 mmol/ל' יום אחד לפני ההשתלה, העכבר לנגרהנס הם בודדו אותנו מהמתרחש הלבלב התורם על ידי עיכול collagenase; מינימום של 350 איונים מנוצלים לכל נמען סוכרתית. בהתאם התשואה בידוד איון, עכברים התורם שניים או יותר מנוצלים לכל נמען. לאחר לילה תרבות ב 37 מעלות צלזיוס, איונים מנוהלים לתוך הכבד נמענים דרך וריד שער הכבד. לאחר הניתוח, העכברים מוגן בבתים Makrolon אדום והנצפית עד ערה. פרוטוקול זה שומר על הבקרה הגליקמית עבור 120 ימים בעכברים syngeneic ו- 15 ימים בעכברים allogeneic.
Introduction
השתלת איון היא גישה מבטיחה לטיפול סוג 1 סוכרת1. הניסיון הראשון להעביר קטע הלבלב כבשים לתוך לחולה סוכרת בוצע על ידי ווטסון ויליאמס בשנת 1893. עם זאת, פריצת דרך השתלת איון קליני הושגה עם פרוטוקול אדמונטון, לאחר מכן, סדרה של תוכניות לאומיות היו מפותחות2. בעבר, מספר אתרים, כגון מח העצם, נרתיק עם פגיעה, אזור תוך שרירית, השטח הרירית קיבה, טחול וכן כליה כמוסה, היו בציורו במודלים פרה, אבל וריד נחשב לאחד של אתר מתאים ויעיל עבור תוכניות קליני3,4,5,6.
הממשל אקסוגני של אינסולין יכול להיות מוחלף על ידי אינפוזיה איון לתוך וריד שער הכבד. מצב זה נחשב אתר מועדף בגלל לאספקת החמצן דומה לזו בלבלב יליד בשל המיקום במורד הזרם של המפגש של פורטל עורק, וריד. יתר על כן, יש פני שטח גדול, כך למבנה התלת ממדי של ע עשוי להישמר, vascularization יכול להיות מונחה5. עכבר סוכרתית הנמען, 2,000 בני אדם או חזירי איון מקבילות או העכבר 350 איונים סבירים להפוך את המדינה hyperglycemic7,8. רמות Euglycemic דווחו על 15 ימים במודל עכבר הנמען של איים קטנים xenogeneic, במודל עכבר allogeneic ועל יותר מ 120 ימים בהשתלת syngeneic העכבר-העכבר.
גורמים הקשורה היעילות של השתלת איון דרך וריד שער הכבד הם המתאימים הרדמה, שיטה של דקירה, hemostasis9. הרדמה יכולה להיגרם על ידי שאיפת (5% איזופלוריין) או הזרקה (קטמין, חריגות השירותים הווטרינריים או פנטוברביטל), החומרים משולבים לעתים קרובות. שליטה על עומק וזמן של הרדמה, תשומת הלב צריך להיות משולם למצב של העכבר, כגון הצבע של קרום רירי, עין מכסה, רפלקס המצמוץ, קצב נשימה, טמפרטורת הגוף. חשוב לוודא כי החיה לא נאבק, הוא שורד את הניתוח. הטמפרטורה יכול להישמר על ידי מכשירי חימום שונים, כגון כריות חימום, אדום-נורות, צלחת תרמיים חמים וכו א שימש כדי לשמור על חום של 25-30 מעלות צלזיוס בין השולחן המבצע, אשר מונע את המופע של העכבר היפותרמיה. המינונים בהרדמה חשובים, כמו כולן הן מטבוליזם על ידי הכבד, תפקוד הכבד עשוי להיות מגרה transiently מאת לעירוי של המתלה איון. נקודת חדירה אידיאלי עבור וריד שער הכבד הוא המיקום בין הווריד אחד מיובליו של הראשון והשני.
מספר איים קטנים ונפח הזרקת המיועד להשפיע גם התוצאה של ההשתלה, כמו אמצעי מופרז עלול להגביר את מאמץ גזירה. אמצעי אחסון 0.2-mL נחשבת מתאימה השתלת איון לתוך וריד שער הכבד. הפצע puncturing (מחט בקוטר 26) גורם לדמם וריד שער הכבד, אשר צריך לעצור באופן מתוזמן ויעיל. גזה סטרילית או אצבע יכול להיות מיושם עם לחץ מינימלי באתר של הניקוב למשך כ 6 דקות לעצור את הדימום. איון ביחד, פורטל לקח זריקה יעיל ומספק רגולציה על רמות הגלוקוז בדם במודלים של העכבר סוכרת כימית המושרה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
לכל השגרות פרוטוקול זה אושרו על-ידי חוק רווחת בעלי חיים גרמנית והנחיות. שקול להשתמש 10 - עד השבוע ה-12 NMRI עכברים עירום ועכברים C57Bl/6 (התורם: מהמושב; הנמען: זכר) לאורך כל הניסויים. השתמש NMRI עכברים בעירום עבור בידוד איון. לשמור על העכברים בתנאים מוגדרים לפי תקנות מתקן בעלי חיים מקומיים.
1. אינדוקציה של סוכרת על ידי Streptozotocin
- ביום-4, למדוד את המשקולות הגוף 10 עכברים עירום NMRI בת שבוע 12 ועכברים C57Bl/6 שימוש במכונה במשקל.
- על פי משקל הגוף נמדד, להכין מנה 180 מ"ג/ק"ג של streptozotocin ב 0.1 מ"ל של תמיסת מלח לכל העכבר.
הערה: Streptozotocin צריך להיות טרי שהוכן לפני השימוש, מכוסה ברדיד אלומיניום, גם ככה רגישים לאור. - . להזריק העכברים syngeneic ו allogeneic כל אחד עם מנה אחת של 0.1 מ"ל של streptozotocin (180 מ"ג/ק"ג) intraperitoneally באמצעות מחט 26-G.
- ביום-3-2 ו-1 לאסוף 2-4 µL של דם על ידי ניקב את הוורידים הזנב של עכברים שאינם התענה.
- להשתמש 2-4 µL של דגימת דם לכל רצועת הבדיקה כדי למדוד את רמת הסוכר בדם NMRI עכברים עירום ועכברים C57Bl/6
הערה: בשלב זה, 80% מהעכברים צריך להיות סוכרתית (20 mmol/L).- השתמש עכברים על השתלת איון כאשר רמות הגלוקוז בדם שלהם להגיע 20 mmol/ל'
2. בידוד של לנגרהנס של עכברים
- עזים ומתנגד העכברים עם קטמין (100 מ"ג/ק"ג משקל גוף), חריגות השירותים הווטרינריים (20 מ"ג/ק"ג משקל גוף) על ידי הזרקת בקרום הבטן עם מחט 26-G.
הערה: אמצעי האחסון של קטמין, חריגות השירותים הווטרינריים היו נחושים לפי העובי הגוף של בעלי החיים (0.10 mL של 10 גרם). - לשמור על העכברים במצב פרקדן ולחטא עם povidone יוד פתרון. לאשר שהנהלים בבדיקת את רפלקס פדלים.
הערה: במקרה של C57Bl/6 לגלח אזור הבטן. - להחזיק את העור עם מלקחיים בסדר, עושים חתך קו האמצע עם מספריים כדי לחשוף את חלל הבטן. מניחים את סיטוס במעי לשמאל, מחוץ חלל הבטן על קומפרס גזה סטרילית.
- להתאים את הקיבה בכיוון אחר כדי לאתר את הלבלב ואת אחרים הקשורים לרקמות.
- להגיע אבי העורקים, חותך חתך קטן כדי לנקז את הדם. להשתמש גזה סטרילית לקליטה דם.
- הסר בזהירות את המעי. להפריד בין הלבלב לבין הבטן וה טחול.
- בלו הלבלב ולמקם אותו בצלוחית טריים. הסר את כל החומרים לא רצויות, כגון שומן, באמצעות מלקחיים.
- ממלאים מזרק 5 מ עם 4 מיליליטר collagenase ולהזריק לתוך הלבלב עם מחט 26-G (במניה פתרון: 30 מ"ג של collagenase ב- 12 מ של הפתרון של האנק).
- מינצ הלבלב עם מספריים כדי להגדיל את שטח הפנים לעיכול משופרת, העברת צינור כובע אדום 12 מ.
הערה: של האנק מאוזנת תמיסת מלח: HBSS 10 x (100 מ"ל), פניצילין-סטרפטומיצין (10 מ"ל), Gentamycin (1 מ"ל), ציפרופלוקסאצין (10 מ"ל), HEPES (35 מ ל), מזוקק H2O (900 מ ל) - ביצוע של מערכת העיכול 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בתוך אמבט מים חזק. מערבולת המדגם שלוש פעמים על בסיס מרווח קבוע עבור 15 s.
- מערבבים הלבלב מתעכל היטב על ידי היד למשך 3 דקות ומניחים אותו על קרח במשך 10 s.
- להוסיף 6 מ של הפתרון של האנק קר כדי לעצור את התגובה עיכול צנטריפוגה ב 560 x g למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר.
- הסר את תגובת שיקוע, להמיס בגדר ב 10 מ"ל של פרקר/העוברי עגל בינונית סרום (P/FCS) בטמפרטורת החדר.
הערה: P/FCS בינוני: TCM-199 10 x (100 מ"ל), FCS (50 מ"ל), פניצילין-סטרפטומיצין (10 מ"ל), HEPES (20 מ ל), מזוקק H2O (900 מ ל) - לזהות את איונים בהתבסס על המורפולוגיה שלהם (ספרואיד, צבע חום-זהוב) תחת מיקרוסקופ אור. להימנע איים קטנים עם מרכזי כהה. בדוק טוהר ואת הכדאיות בביצוע dithizone מכתים תחת מיקרוסקופ אור.
הערה: Dithizone נקשר יון אבץ ומספק כתם בצבע אדום כדי ע. - השתמש פיפטה 1-mL לספור, לבחור. לאישתך איונים תחת מיקרוסקופ אור ולהעביר אותם על צלחת פטרי טריים (60 מ"מ x 15 מ"מ) המכיל 4 מיליליטר בינוני P/FCS.
הערה: הנפח של P /FCS בינוני בצלוחית הפטרי לא יחרוג מ ל 4 על מנת להבטיח זמינות חמצן. - שמור את איים מבודדים 4 מיליליטר P/FCS בינוני בן לילה ב 37 מעלות צלזיוס בתוך אינקובטור.
3. הכנה של חיות השתלת איון
- להסיר את איים מבודדים מן החממה 37 ° C ולמקם אותם תחת הספסל זרימה. מרכז את איים עם תנועה מעגלית מתנדנדים של הפטרי.
- ממלאים מזרק 1-mL (מחט 23-G כחול) מ 0.1 ל P/FCS בינוני. לאחר מכן, הוסף איונים 350 mL 0.3 של הפתרון של האנק. שמור את המזרק בצורה מאונכת כדי לאפשר את איונים להתיישב.
- הנמך את הנפח עד 0.05 מ"ל ולהחליף את המחט 23-G כחול עם מחט 26-G חום. כדי המזרק אותו, להוסיף 0.15 מ של Ficoll (צפיפות צבע בינוני) לפסגה כדי להגיע נפח סופי של 0.2 מ"ל במזרק. להימנע בועות אוויר.
- לשמור את המזרק במצב אנכי, לסובב אותו מעט כדי למנוע את הצליעה של איים קטנים. ע יסדר בקונוס של המזרק בתוך 2-3 דקות.
- למדוד את הגוף והמשקל דם רמות הגלוקוז של העכברים הנמען; רמות הגלוקוז בדם צריכה להיות בערך 20 mmol/ל'
- עזים ומתנגד העכברים עם קטמין (100 מ"ג/ק"ג משקל גוף), חריגות השירותים הווטרינריים (20 מ"ג/ק"ג משקל גוף) על ידי הזרקת בקרום הבטן עם המחט 26-G.
- הצב והעכברים במצב פרקדן על צלחת תרמיים חמים (37 מעלות צלזיוס). בדוק את עומק הרדמה על ידי צובט את הבוהן.
- לנקות את אזור הבטן עם povidone יוד פתרון (חיטוי העור). כדי למנוע ייבוש העיניים, לשמור אותם לחות עם משחה העין.
הערה: במקרה של C57Bl/6 לגלח אזור הבטן.
4. השתלת איון דרך המסלול Intraportal
- ביום 0, להתחיל עם פתיחה של הבטן על-ידי החזקת את העור עם מלקחיים וביצוע של 2-3 ס מרב קו האמצע החתך עם מספריים. המקום גזה סטרילית רטובה לדחוס בקצוות הפצע כדי לשמור על לחות.
- מניחים את סיטוס במעי שמאלה ומחוץ חלל הבטן על הקומפרס גזה סטרילית.
הערה: לשמור את המעי לחות לאורך כל ההליך עם מראש ומחוממת 0.9% NaCl פתרון או גזה סטרילית טבול תמיסת מלח. - להזיז התריסריון ואתר הלבלב. אתר את וריד שער הכבד ממוקם במתחם הגחון על ידי דחיפת הלבלב כלפי מעלה. להשתמש אצבע כדי לחשוף את וריד שער הכבד, ברגע נחשף, לנקב אותו ליד הכבד.
- בתוך 1 דקות, לאט ובזהירות להזריק את איים קטנים (0.2 מ"ל מהשלב 3.4) לתוך וריד שער הכבד תחת הבדיקה של זכוכית מגדלת כדי למנוע דליפה כלשהי של איים קטנים.
הערה: לאחר הזרקת, תמיד בדוק איונים הנותרים במזרק. לקחת 1 מ"ל של מדיה P/FCS מזרק, סומק לתוך צלחת פטרי טריים הספירה תחת מיקרוסקופ. - מקום סטרילי לאמוד החדירה והפעילו לחץ עם האצבע המורה (עומק החדירה: 0.5-1 ס מ) עבור 6 דקות לעצור את הדימום.
הערה: אמצעי האחסון מוזרק לא יעלה 0.2 מ"ל. הלחץ ונפח מופרז עלול לגרום נזק על איונים עקב מאמץ גזירה. - בזהירות המקום את המעי סיטוס הצפק, שכבה שריר הבטן, fascia סמיכה.
- באמצעות מלקחיים, להרים את העור, סגירת החתך שריר שנספג בתפר משי, ואת שכבת העור העליונה עם 2-3 סרטונים.
- לנקות את השטח עם חומר חיטוי העור, החל מרפא את הפצע, ולמקם את העכברים בכלובים בודדים. מרפא את הפצע מספק שכבה אקרילט עמיד במים, להגן מפני השרייה, שאורכה, זיהום משני.
הערה: להתבונן העכברים עד שהם יש חזרה להכרה מספקת, לספק טרמדול (0.2 מ ג לכל עכבר) יחד עם נוזלים. פרוטוקול זה, עכברים התאוששה מן ההרדמה במהירות, טרמדול המינהל מופחתת לכאב. לאחר 7 ימים, צריך לרפא הפצע. - להאכיל את העכברים עם מים ואוכל רגיל. מזון ומים צריכת ושתן הפרשה יגדל לאחר הזריקה streptozotocin.
- למדוד את רמות הגלוקוז בדם כל יום במשך השבוע הראשון, אז פעם בשבוע בעכברים syngeneic. בעכברים allogeneic, למדוד את רמות הגלוקוז בדם שלוש פעמים בשבוע למשך עד 15 ימים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כשירות של המושתלים איונים נחקרה כימית המושרה בעכברים סוכרתיים. ע הושתלו דרך וריד במודל בעכברים סוכרתיים. היחס בין התורם-המטופל היה 2:1. במודל עכבר syngeneic, נוצלו שני עכברים התורם להשגת איונים 350. ע הושתלו ואז לתוך בעכברים סוכרתיים. ירידה ברמת הגלוקוז בדם נצפתה ביום 1 לאחר ההשתלה, רומז תפקיד של המושתלים לנגרהנס להפחתת רמת הסוכר בדם. Streptozotocin גדלה רמת הסוכר בדם עד כ-22 mmol/ל' ירידת רמת הסוכר בדם כדי 4.6 mmol/L (יום 1) נצפתה לאחר השתלת איון (איור 1 א'). Normoglycemia נשמר עד 121 ימים, כפי שמוצג באיור 1A. משקל הגוף ורמת גלוקוז בדם בעקבות בערך אותו דפוס. לאחר הזרקת streptozotocin הניתוח, ירד משקל הגוף. יום 2 ואילך זה נטו לעלות לכיוון רגיל, מ- 25.3 g (יום ד') כדי 29.7 g (יום 121), כפי שמוצג איור 1B.
במקרה של מרכזי histocompatibility (MHC) עכברים תואמים, איים 350 מתוך שני עכברים C57Bl/6 (H2d) היו מושתלים לתוך בעכברים סוכרתיים BALB/c (H2b). לאחר הזרקת streptozotocin, הסוכר גדל עד 26.6 mmol/ל' לאחר השתלת איון, רמת הסוכר בדם ירד ל 4.4 mmol/L (יום 1; איור 2A). Normoglycemia (4.44 ל 7.2 mmol/L) נצפתה עד 10 ימים, אך לא לאחר 15 ימים (20.1 mmol/L). משקל הגוף בעכברים סוכרתיים ירד מ 26 g (יום-3) 23 גרם (יום 0), בנוסף 21.5 g (יום 1). לאחר ההשתלה, משקל הגוף בהדרגה התאוששה 23 גרם (יום 2) ל 25 גרם (יום 10). עקב MHC-אי-התאמה, רמת הסוכר בדם גדל, משקל הגוף ירד 10 ימים לאחר השתלת איון (איור 2B).
איור 1 : ההשפעה של השתלת איון syngeneic. (א) רמת הסוכר בדם נמדד בנקודות זמן שונות בעכברים סוכרתיים הנוצרות על-ידי streptozotocin (n = 3). מנה אחת של streptozotocin (180 מ"ג/ק"ג) היה מוזרק לפני השתלת של 350 איונים כל נמען (יום 0). רמת הסוכר בדם (mmol/L) נמדדה עד 121 ימים (יום-3: 17 ± 2.3; יום 0: 22.6 ± 1; יום ± 1: 4.6 0.3; יום 5: 7.5 ± 0.4; ו ± 121: 5.3 יום 0.09). (B) עלייה במשקל הגוף לאחר השתלת איון. הנתונים הנ ל מייצג את זאת אומרת ± סטיית התקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : ההשפעה של השתלת איון allogeneic. (א) רמת הסוכר בדם נמדד בנקודות זמן שונות בעכברים סוכרתיים הנוצרות על-ידי streptozotocin (n = 2). מנה אחת של streptozotocin (180 מ"ג/ק"ג) היה מוזרק לפני השתלת של 350 לנגרהנס (יום 0). רמת הסוכר בדם (mmol/L) נמדדה עד 15 ימים (יום-1: 25.5 ± 5.3; יום 0: 26.6 ± 1.4; יום 2:8 ± 0.9; יום 10: 6.2 ± 0.08; ו יום 15: 20.1 ± 1.6). Normoglycemic המדינה נשמר במשך 10 ימים, ולאחר מכן, גדל ריכוז הגלוקוז בדם. המשך טיפול של משקל הגוף לפני ואחרי השתלת איון (B). הנתונים מייצגים את זאת אומרת ± סטיית התקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : נציג immunostaining תמונה של המושתלים לנגרהנס לתוך הכבד: לשטוף את המקטע כבד (5 מיקרומטר) עם PBS, בלוק עם 10% חמור סרום ואחריו הדגירה לילה ב 4 ° C עם נוגדן ראשוני של אינסולין (שבערך), טסית דם תא אנדותל אדהזיה מולקולה PECAM-1 ראשי נוגדנים (1: 100). ביום למחרת, הכתם עם נוגדנים משניים עבור 1 h, לשטוף עם PBS, מונה הכתם עם Hoechst, לכידת התמונות עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי Leica. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
במחקר זה, התוואי intraportal של השתלת איון בחנו. פרוטוקול זה יעיל ביותר להקלת הלחץ סוכרתית ומספק הזדמנות מעמיק לחקור מחקרים השתלת איון. פרוטוקול זה מאשרת כי כ-350 איונים מאתר מסוגלים היפוך המדינה hyperglycemic. יתר על כן, אף אחד העכברים מתו במהלך ההליך, הבקרה הגליקמית הושג לכל הנמענים. משקל הגוף ורמות גלוקוז בדם נרשמו באופן קבוע כדי לשקף את מיומנות, תקן והפונקציונליות של המושתלים איונים היפוך היפרגליקמיה. בעכברים syngeneically מושתל, נמדדו רמות הגלוקוז בדם כל יום במשך השבוע הראשון, ובשבוע לאחר מכן. לאחר השתלת איונים, תנאי ובשפתיים ועוד גורמים מפעילים תאי אנדותל להפריש pro-אנגיוגנזה גורמים כגון VEGF לאחר 14 ימים, ובכך להגדיל את engraftment כלי הדם בכבד, כפי שמוצג באיור3. בעכברים allogeneic, נמדדו רמות הגלוקוז בדם שלוש פעמים בשבוע למשך עד 15 ימים. לאחר 15 ימים, איונים המושתלים נדחו במודל allogeneic כתוצאה מתקיפה המערכת החיסונית, אלא אם כן תרופות לדיכוי המערכת החיסונית מנוהלים
ישנם מספר פרוטוקולים בידוד איון לאור ספרות10,11. הברור ביותר הוא לבחור איונים באופן ידני על בסיס גודל של המורפולוגיה שלהם לאחר עיכול collagenase. זהו אחד השלבים המכריעים לבחירת רק איים קטנים, כדי להימנע תאים אקסוקרינית, פסולת, איונים נבחרות וכו צריך להישמר ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה בתוך אינקובטור לאפשר להם להתאושש מכאניים נתקלה במהלך העיכול נוהל. הבחירה של המינון streptozotocin ואת השתלת איון intraportal הם גם מפתח את פרוטוקול זה. טמפרטורת הגוף צריכה להיות מוסדרת ומתוחזק בעזרת צלחת תרמי לאורך כל הליך כירורגי. צריך להיות מיושם גזה סטרילית עם לחץ מינימלי על 6 דקות באתר פנצ'רים כדי למנוע דימום. עכברים יש לשמור תחת השגחה עד שהם ישובו להכרה מספקת.
שלבים מסוימים של פרוטוקול זה יכול להיות שונה. לדוגמה, אופטימיזציה של זמן עיכול ונפח collagenase עשוי להגדיל את התשואה של איים בזני עכברים שונים. במקום אינדוקציה מהירה של סוכרת (streptozotocin 180 מ"ג/ק"ג), הולכת וגדלה בהדרגה היפרגליקמיה יכולה להיגרם תוך שימוש במינון נמוך על פני תקופה ארוכה של זמן (למשל, 40 מ"ג/ק"ג/יום streptozotocin במשך 5 ימים רצופים). זה יכול לספק יותר engraftment של איים המושתלים. ניתן לסייר באתרים אחרים, כמו מח העצם, נרתיק עם פגיעה, אזור תוך שרירית, השטח הרירית קיבה, בטחול כחלופות לוריד intraportal.
Engraftment המסכן של איים המושתלים הוא עדיין דאגה עיקרית בניסויים קליניים. אחרים כוללים מחסור של תורמים, חוסר עקביות בשמירה על רמות הגלוקוז בדם לאחר השתלת החיסוני, בתיווך דם תגובות12,13. חוסר שיטות להערכת engraftment תקין הוא מכשול נוסף. מעקב אחר איונים מהתורם באמצעות תהודה מגנטית או הדמיה ביולומינסנציה יכול להחליף שיטות קלאסיות כגון בדיקת הגלוקוז סובלנות או c-פפטיד. בעתיד, תאי גזע מושתלים יחד עם איים עשוי לספק תזונה ותמיכה immunomodulating14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
כל המחברים מצהירים כי יש להם אין ניגוד אינטרסים.
Acknowledgments
ברצוננו להודות Gundula Hertl לתמיכה שלה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57Bl/6 mice | Charles River (Sulzfeld, Germany) | (10-12 weeks) | |
| BALB/c mice | Charles River (Sulzfeld, Germany) | (10-12 weeks) | |
| NMRI nude mice | Charles River (Sulzfeld, Germany) | (10-12 weeks) | |
| Ketamine | Bela-pharm | ||
| Xylazine | CEVA TIERGESUNDHEIT GmbH | ||
| Syringe, 23G and 26G needle | BD | ||
| Petri Dish | Falcon | 303800 | |
| NaCl | Carl Roth | 351007 | |
| Sterile Gauze | Fuhrmann | 7647-14-5 | |
| Shaking Water bath | Kotterman | 1501 | |
| Scissors | Braun | 1501 | |
| Glucose Meter | One Touch | ||
| Warm Thermal Plate | Thermo Fisher | ||
| Braunol (povidone-iodide solution) | B.Braun Melsungen AG | 3864154 | |
| Liposic Edo - Sprinkled Ointment (eye ointment) | Dr. G Mann Chem.-Pharm. GmbH | ||
| Incubator | Fa. Roth | ||
| Flow Bench | Herdus | ||
| Ficoll | Sigma-Aldrich | 10771 | |
| 5-0 Silk Suture Vicryl | Braun | (7.5 *1.75mm) | |
| Michel Clamps (clips) | Aesculap | BN507R | |
| P/FCS Solution | Gibco | 21180-021 | |
| TCM-199 (10x) | Gibco | 21180-021 | |
| FCS | Biowest | S1810-500 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| HEPES (1 M) | Biochrom | L 1613 | |
| Gentamycin | Ratiopharm | ||
| Ciprofloxacin | Fresenius Kabi | ||
| Hank's Solution | Gibco | 14060-040 | |
| Collagenase | Roche | 11213865001 | |
| Streptozotocin | Calbiochem | 572204 | |
| OPSITE-spray (wound healer) | Smith and nephew | 66004978 | |
| Reugular food | Altromin | ||
| Head light LED 16042 (magnifying glass) | Eschenbach | 16042 | |
| Rat anti-mouse PECAM-1(CD31) monoclonal primary antibody | Millipore, Chemicon | CBL1337 | Dilution (1:100) |
| Donkey anti-rat secondary antibody | Dianova | 712095153 | Dilution (1:400) |
| Polyclonal guinea pig anti-insulin primay antibody | Dako | A0564 | Dilution (1:500) |
| Donkey anti-guinea pig secondary antibody | Dianova | 706-259-148 | Dilution (1:400) |
References
- McCall, M., Shapiro, A. M. Update on islet transplantation. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (7), a007823 (2012).
- Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. New England Journal of Medicine. 343 (4), 230-238 (2000).
- Cantarelli, E., et al. Bone marrow as an alternative site for islet transplantation. Blood. 114 (20), 4566-4574 (2009).
- Echeverri, G. J., et al. Endoscopic gastric submucosal transplantation of islets (ENDO-STI): technique and initial results in diabetic pigs. American Journal of Transplantation. 9 (11), 2485-2496 (2009).
- Korsgren, O., et al. Optimising islet engraftment is critical for successful clinical islet transplantation. Diabetologia. 51 (2), 227-232 (2008).
- Merani, S., Toso, C., Emamaullee, J., Shapiro, A. M. Optimal implantation site for pancreatic islet transplantation. British Journal of Surgery. 95 (12), 1449-1461 (2008).
- Lingwal, N., et al. Inhibition of gelatinase B (matrix metalloprotease-9) activity reduces cellular inflammation and restores function of transplanted pancreatic islets. Diabetes. 61 (8), 2045-2053 (2012).
- Chen, C., et al. Improved intraportal islet transplantation outcome by systemic IKK-beta inhibition: NF-kappaB activity in pancreatic islets depends on oxygen availability. American Journal of Transplantation. 11 (2), 215-224 (2011).
- Wang, Y., Wang, T., Zhang, L. Three aspects are critical for carrying out intraportal islet transplants successfully in a diabetes mouse model. Experimental and Clinical Transplantation. 10 (3), 302-304 (2012).
- Neuman, J. C., Truchan, N. A., Joseph, J. W., Kimple, M. E. A method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular cAMP determination. Journal of Visualized Experiments. (88), e50374 (2014).
- Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. Journal of Visualized Experiments. (50), (2011).
- Rother, K. I., Harlan, D. M. Challenges facing islet transplantation for the treatment of type 1 diabetes mellitus. Journal of Clinical Investigation. 114 (7), 877-883 (2004).
- Su, Z., et al. Small islets are essential for successful intraportal transplantation in a diabetes mouse model. Scandinavian Journal of Immunology. 72 (6), 504-510 (2010).
- Rekittke, N. E., Ang, M., Rawat, D., Khatri, R., Linn, T. Regenerative Therapy of Type 1 Diabetes Mellitus: From Pancreatic Islet Transplantation to Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells International. 2016, 22 (2016).
