Het doel van dit protocol is spectrophotometrically trans-plasma membraan elektronentransport met behulp van extracellulaire elektronen acceptoren controleren en analyseren van enzymatische interacties die bij deze extracellulaire elektronen acceptoren optreden kunnen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Meten van Trans-Plasma membraan elektronentransport door C2C12 Myotubes
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Trans-plasma membraan elektronentransport (tPMET) speelt een rol in de bescherming van de cellen van intracellulaire reductieve stress, alsmede bescherming tegen schade door extracellulaire oxidanten. Dit proces van het vervoer van elektronen van intracellulaire reductants naar extracellulaire oxidanten is niet goed gedefinieerd. Hier presenteren we spectrofotometrische tests door C2C12 myotubes om te controleren met behulp van de extracellulaire elektronen acceptoren tPMET: wateroplosbare tetrazolium zout-1 (WST-1) en 2,6-dichlorophenolindophenol (DPIP of DCIP). Door middel van vermindering van deze elektronen acceptoren kunnen we controleren dit proces in een real-time analyse. Met de toevoeging van enzymen zoals ascorbaat oxidase (AO) en superoxide dismutase (SOD) aan het testen, kunnen we bepalen welk gedeelte van de tPMET is te wijten aan ascorbaat export of superoxide productie, respectievelijk. Terwijl WST-1 werd getoond aan stabiele resultaten met lage achtergrond, kon DPIP worden opnieuw geoxideerde na toevoeging van AO en SOD, die werd aangetoond met spectrofotometrische analyse. Deze methode geeft aan een real-time, multi goed, snelle spectrofotometrische bepaling met voordelen ten opzichte van andere methoden gebruikt voor het controleren van tPMET, zoals Hexacyanoferraat (FeCN) en c vermindering van de ferricytochrome.
Inleiding
Het vermogen van gezuiverde plasma membranen te beperken van elektronen acceptoren heeft geleid tot de mening dat het plasma-membraan een inherente redox capaciteit1 heeft. Eerder gezien in schimmels, planten en dieren, is tPMET een proces voor meerdere organismen2,3,4,5. Specifiek, heeft dit proces aangetoond in Saccharomyces cerevisiae, wortel cellen, erytrocyten, lymfocyten, Osteosarcoom, melanoom, macrofagen, skeletspieren en neutrofielen2,3,....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Opmerking: Zie afbeelding 1 voor een schematisch overzicht van de belangrijkste stappen.
1. WST-1 vermindering Assay
- Groeien en differentiëren C2C12 Adherente cellen gebruik standaard cel cultuur procedures7 in een 96-wells-plaat met behulp van rijen A-F.
- Het gebruik van een medium van de differentiatie van de Dulbecco bewerkt Eagle's Medium (DMEM) aangevuld met 2% paard serum, 100 U/mL penicilline en 0,1 mg/mL streptomycine bestaande. Incubeer de cellen bij 37 ° C met 5% CO2.
- Bij het toezicht op ascorbaat betrokkenheid in tPMET, een aanvulling op ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Statistieken werden uitgevoerd met ANOVA met herhaalde maatregelen met behulp van RStudio statistische software25. Omvang van de steekproeven zijn aangegeven in de figuur legendes.
Voor het controleren van tPMET, werden C2C12 myotubes gebruikt samen met de extracellulaire elektronen acceptoren, WST-1 en DPIP. AO werd gebruikt om te bepalen welk gedeelte van WST-1 en DPIP vermindering was te wijten aan asc.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
We hebben twee methoden voor het gebruik van extracellulaire elektronen acceptoren, WST-1 en DPIP, in spectrofotometrische testen om te controleren van de tPMET in C2C12 myotubes gepresenteerd. Met de groei van de cellijnen in standaard cultuur procedures en een afleesapparaat spectrofotometer is het mogelijk om te controleren tPMET met deze elektronen acceptoren in een eenvoudige microplate-assay. WST-1 vermindering van goed-te-goed binnen een bepaling reproduceerbaar is, maar er is dagelijkse variabiliteit. De dagelijk.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Wij wil Thomas Bell, Lyn Mattathil, Mark Mannino en Neej Patel Dank voor hun technische ondersteuning. Dit werk werd gesteund door de Verenigde Staten Public Health Service award R15DK102122 van het nationale Instituut van Diabetes en de spijsverterings en ziekten van de nier (NIDDK) aan Jonathan Fisher. De inhoud van het manuscript is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijk de officiële standpunten van de NIDDK of de National Institutes of Health.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| C2C12 myoblasts | American Type Culture Collection | CRL-1772 | |
| Dulbecco's aangepast arendsmedium - lage glucose | Sigma | D6046 | |
| Fetal Plex dierenserumcomplex | Gemini Bio-Products | 100-602 | |
| penicilline-streptomycine | Sigma | 516106 | |
| paardenserum | Gibco Technologies | 16050-130 | |
| Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing | Sigma | D8537 | |
| trypsine-EDTA | Sigma | T4049 | |
| 15 cm kweekschalen | TPP | 93150 | |
| 96-well kweekplaten | TPP | 92096 | |
| 2-(4-Iodofenyl)-3-(4-nitrofenyl)-5-(2,4-disulfofenyl)-2H-tetrazoliunatriumzout (WST-1) | Accela ChemBio Inc | SY016315 | |
| fenazinemethosulfaat | Sigma | P9625 | |
| L-ascorbinezuur | Sigma | A5960 | |
| ascorbaatoksidase | Sigma | A0157 | |
| superoxide dismutase | Sigma | S5395 | |
| 2,6-dichioroindofenol natriumzout | ICN Biomedicals | 215011825 | |
| D-(+)-glucose | Sigma | G7528 | |
| HEPES natriumzout | Sigma | H3784 | |
| natriumchloride | Sigma | S7653 | |
| kaliumchloride | Fisher Scientific | BP366 | |
| magnesiumsulfaat heptahydraat | Sigma | M5921 | |
| calciumchloride dihydraat | Sigma | C7902 | |
| kaliumfosfaat | Fisher Scientific | BP363 | |
| Pierce BCA Eiwit Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Powerwave X-I spectrofotometer | Biotek Insturments | discontinued | |
| Spectronic Genesys 5 Spectrofotometer | Thermo Scientific | 336001 | |
| PureGrade 96-well microplate, F-bodem, helder, onbehandeld, niet-steriel | MidSci | 781602 | |
| IJzer (II) chloride tetrahydraat | Sigma | 220299 | |
| IJzer (II) sulfaat heptahydraat | Sigma | 215422 | |
| hypoxanthine | Sigma | H9636 | |
| xanthine oxidase | Sigma | X4500 | |
| Excel | Microsoft | ||
| R Studio | Rstudio | https://www.rstudio.com/products/rstudio/ | |
| KC4 | Biotek Insturments | discontinued |
Referenties
- Kilberg, M. S., Christensen, H. N. Electron-transferring enzymes in the plasma membrane of the Ehrlich ascites tumor cell. Biochemistry. 18 (8), 1525-1530 (1979).
- Crane, F. L., Roberts, H., Linnane, A. W., Low, H. Transmembrane ferricyanide ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
