Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Meten van Trans-Plasma membraan elektronentransport door C2C12 Myotubes

Published: May 4, 2018 doi: 10.3791/57565
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Biology, Saint Louis University
* These authors contributed equally

Summary

Het doel van dit protocol is spectrophotometrically trans-plasma membraan elektronentransport met behulp van extracellulaire elektronen acceptoren controleren en analyseren van enzymatische interacties die bij deze extracellulaire elektronen acceptoren optreden kunnen.

Abstract

Trans-plasma membraan elektronentransport (tPMET) speelt een rol in de bescherming van de cellen van intracellulaire reductieve stress, alsmede bescherming tegen schade door extracellulaire oxidanten. Dit proces van het vervoer van elektronen van intracellulaire reductants naar extracellulaire oxidanten is niet goed gedefinieerd. Hier presenteren we spectrofotometrische tests door C2C12 myotubes om te controleren met behulp van de extracellulaire elektronen acceptoren tPMET: wateroplosbare tetrazolium zout-1 (WST-1) en 2,6-dichlorophenolindophenol (DPIP of DCIP). Door middel van vermindering van deze elektronen acceptoren kunnen we controleren dit proces in een real-time analyse. Met de toevoeging van enzymen zoals ascorbaat oxidase (AO) en superoxide dismutase (SOD) aan het testen, kunnen we bepalen welk gedeelte van de tPMET is te wijten aan ascorbaat export of superoxide productie, respectievelijk. Terwijl WST-1 werd getoond aan stabiele resultaten met lage achtergrond, kon DPIP worden opnieuw geoxideerde na toevoeging van AO en SOD, die werd aangetoond met spectrofotometrische analyse. Deze methode geeft aan een real-time, multi goed, snelle spectrofotometrische bepaling met voordelen ten opzichte van andere methoden gebruikt voor het controleren van tPMET, zoals Hexacyanoferraat (FeCN) en c vermindering van de ferricytochrome.

Introduction

Het vermogen van gezuiverde plasma membranen te beperken van elektronen acceptoren heeft geleid tot de mening dat het plasma-membraan een inherente redox capaciteit1 heeft. Eerder gezien in schimmels, planten en dieren, is tPMET een proces voor meerdere organismen2,3,4,5. Specifiek, heeft dit proces aangetoond in Saccharomyces cerevisiae, wortel cellen, erytrocyten, lymfocyten, Osteosarcoom, melanoom, macrofagen, skeletspieren en neutrofielen2,3, 4 , 5 , 6 , 7. in een proces dat de elektronen in het plasma-membraan om extracellulaire oxidanten vervoert, tPMET is betrokken bij veel cellulaire functies waaronder:5,8van de groei van de cel, cel levensvatbaarheid9, ijzer metabolisme10, cel11,12,13, en bescherming van reactieve zuurstof soorten12,14,15-signalering. Als gevolg van de tPMET de betrokkenheid in veel cellulaire functies, een verstoring van de tPMET heeft zijn hypothetische om bij te dragen aan de ontwikkeling van sommige ernstige hygiënische omstandigheden, met inbegrip van kanker16, hart-en vaatziekten17, en metabole Syndroom van18.

Er zijn meerdere manieren om te controleren van de overdracht van elektronen in het plasma-membraan, maar de meest gebruikte techniek is om te beoordelen van de vermindering van de extracellulaire elektronen acceptoren via colorimetrische testen. Veelgebruikte extracellulaire elektronen acceptoren zijn tetrazolium zouten, DPIP en FeCN20c19,ferricytochrome. De meest gebruikte tetrazolium zout is een tweede generatie zout bekend als WST-119. Deze compound is makkelijker te gebruiken in de colorimetrische testen in vergelijking met eerste generatie tetrazolium zouten als gevolg van twee sulfonaat groepen, die haar water oplosbaarheid21te verhogen. WST-1, is in samenhang met de tussenliggende elektron acceptor 1-methoxy-fenazine methosulfate (mPMS), verminderd in twee single-electron transfer gebeurtenissen. Deze verlaging verandert de geoxideerde vorm van zwak-gekleurde van WST-1 tot en met een meer intense, gele formazan20,22. WST-1 heeft een hoge molaire extinctie coëfficiënt van 37 x 103 M-1cm-1, wat leidt tot een hoge assay gevoeligheid21,22. DPIP wordt ook gebruikt als een accepteerder extracellulaire elektron te controleren tPMET. Het is aangetoond dat DPIP extracellularly kan worden verminderd door tPMET zonder de hulp van tussenliggende elektronen acceptoren23,24. Als gevolg van het ontbreken van tussenliggende elektronen acceptoren, DPIP kan rechtstreeks pick-up elektronen uit het plasma-membraan, in tegenstelling tot WST-124. Gelijkaardig aan DPIP, FeCN heeft aangetoond dat op tPMET zonder de hulp van tussenliggende elektronen acceptoren19,24extracellularly tot ferrocyanide worden verminderd. In tegenstelling tot WST-1 en DPIP heeft FeCN een lage molaire extinctie coëfficiënt leidt tot een lagere assay gevoeligheid9. Een andere veelgebruikte extracellulaire elektron acceptor te controleren van de tPMET is ferricytochrome c. vergelijkbaar met WST-1, ferricytochrome c vermindering neemt toe met het gebruik van tussentijdse elektron acceptor, mPMS22. In tegenstelling tot WST-1 echter is de ferricytochrome c methode minder gevoelig als gevolg van een achtergrond van hoge en een lage molaire extinctie coëfficiënt22.

Hier presenteren we een methode voor real-time analyse van tPMET via spectrofotometrische testen. De methode gebruikt de extracellulaire elektronen acceptoren WST-1 en DPIP, zoals ze allebei een hoge molaire extinctie coëfficiënt hebben terwijl zijn minder duur in vergelijking met de andere vaak extracellulaire elektronen acceptoren zoals ferricytochrome c gebruikte. We fenazine methosulfate (PMS) gebruikt in plaats van mPMS hebben ze een vergelijkbare chemische make-up en PMS is veel minder duur. mPMS is een fotochemisch stabiel die is een belangrijk kenmerk voor een commerciële kit die een lange houdbaarheid moet. Echter maken we PMS vers voor elke assay, dus stabiliteit niet een probleem moet. Ook presenteren we een methode voor het evalueren van mogelijke enzymatische interacties (Zie Figuur 1) tussen de extracellulaire elektron acceptor en enzymen die kunnen worden gebruikt om verder het karakteriseren van het proces van tPMET. In het bijzonder bepalen de enzymen AO en SOD kunnen worden gebruikt welk gedeelte van de tPMET is te wijten aan ascorbaat vervoer of extracellulaire superoxide release, twee veelgebruikte methoden voor elektronen worden vervoerd over het plasma-membraan.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Opmerking: Zie afbeelding 1 voor een schematisch overzicht van de belangrijkste stappen.

1. WST-1 vermindering Assay

  1. Groeien en differentiëren C2C12 Adherente cellen gebruik standaard cel cultuur procedures7 in een 96-wells-plaat met behulp van rijen A-F.
    1. Het gebruik van een medium van de differentiatie van de Dulbecco bewerkt Eagle's Medium (DMEM) aangevuld met 2% paard serum, 100 U/mL penicilline en 0,1 mg/mL streptomycine bestaande. Incubeer de cellen bij 37 ° C met 5% CO2.
    2. Bij het toezicht op ascorbaat betrokkenheid in tPMET, een aanvulling op differentiatie media met 100 µM ascorbinezuur. Toestaan dat cellen te broeden in differentiatie media voor ~ 24-48 h.
  2. Bereiden van stamoplossingen van WST-1 en PMS.
    1. Om een voorraad 10 mM van WST-1, Los 0.033 g WST-1 (formule gewicht (FW): 651.34 g/mol) in 5 mL fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Bewaren bij 4 ° C.
    2. Om een 5 mM voorraad van PMS, Los 0.0023 g van PMS (FW: 306.34 g/mol) in 1,5 mL gedeïoniseerd H2O (diH2van O). Bewaren bij-20 ° C en beschermen tegen licht.
  3. Toevoegen van 0.0108 g van glucose voor een eindconcentratie van 5 mM tot 11.4 mL PBS of HEPES zoutoplossing gebufferde (HBS; 20 mM HEPES natrium zout, 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2.5 mM MgSO4, 1 mM CaCl2). Voeg 480 µL van 10 mM WST-1 voor een eindconcentratie van 400 µM en 48 µL van 5 mM PMS voor een eindconcentratie van 20 µM.
  4. Bij het toezicht op ascorbaat betrokkenheid in tPMET, wordt de oplossing in twee 6 mL aliquots verdelen. Één aliquot, voeg 6 µL diH2O en het andere monster toevoegen 6 µL van 2 kU/mL AO voor een eindconcentratie van 2 U/mL.
  5. Bij het toezicht op superoxide betrokkenheid in tPMET, wordt de oplossing in twee 6 mL aliquots verdelen. Één aliquot, voeg 55 µL van 0,1 M KPO4 buffer en het andere monster toevoegen 55 µL van 6.5 kU/mL SOD voor een eindconcentratie van 60 U/mL.
  6. Wassen van de cellen met PBS. De media gecombineerd en voeg 150 µL PBS. Vervolgens gecombineerd de PBS.
    Opmerking: De test wordt gedaan met vergulde, gekoppelde cellen. Dus, is er geen centrifugeren of het gebruik van tripsine in het wasproces.
  7. Voeg 100 µL van WST-1 oplossing (-) SOD of (-) AO naar kolommen 1-6 en voeg 100 µL van WST-1 oplossing (+) SOD of AO (+) op 7-12 kolommen in de 96-wells-plaat. Gebruik rijen G en H als achtergrond controles (dat wil zeggen, om te controleren wijziging in absorptie in het reagens alleen in putten zonder cellen).
  8. Meten van de extinctie waarden met behulp van de spectrofotometer elke 10 min voor 1 h op 438 nm.
  9. Na lezing gecombineerd van de media en elk spoelen met 150 µL van PBS. Vervolgens gecombineerd de PBS.
  10. Bereken de verandering in absorptie voor elk putje door af te trekken van de aanvankelijke extinctie voor een goed van de extinctie op elk punt van de tijd voor dat goed. Het corrigeren van deze wijziging voor de verandering in de extinctie (indien aanwezig) in de achtergrond putten (d.i., putjes met assay oplossing, maar geen cellen) waargenomen.
  11. P.a., normaliseren van de gegevens van de extinctie aan de 60 min controle meting of was putjes met PBS of HBS en voer een bicinchoninic zuur (BCA) eiwit bepaling.
  12. Toevoegen van 2 mg/mL bovien serumalbumine (BSA) standaard (variëren van 0,5-2 µL voor de standaard curve, afhankelijk van de mate van de samenvloeiing van de cellen) de lege putjes (rijen G en H), voegt u de BCA reagens aan alle putjes.
  13. Kwantificeren van de gegevens via nmol van WST-1 vermindering per µg voor eiwit. 37 mM-1 cm-1 22 gebruiken als de coëfficiënt uitsterven voor verminderde WST-1 438 nm.

2. DPIP vermindering Assay

  1. Groeien en differentiëren C2C12 Adherente cellen met dezelfde procedure als stap 1.1.
  2. Voorraad 10 mM DPIP oplossing als volgt voorbereiden. Los 0.029 g DPIP (FW: 290.08 g/mol) in 10 mL diH2O. bevestigen de concentratie van DPIP door het meten van de absorptie bij 600 nm met een spectrofotometer. 1 mM-1 cm-1 23 gebruiken als de coëfficiënt uitsterven voor verminderde DPIP op 600 nm. Bewaren bij 4 ° C.
  3. Voeg 0.0108 g glucose aan 11.880 mL PBS voor een eindconcentratie van 5 mM. Voeg 120 µL van 10 mM DPIP voor een eindconcentratie van 100 µM.
  4. Bij het toezicht op ascorbaat betrokkenheid in tPMET, wordt de oplossing in twee 6 mL aliquots verdelen. Één aliquot, voeg 6 µL diH2O en het andere monster toevoegen 6 µL van 2 kU/mL AO voor een eindconcentratie van 2 U/mL.
  5. Bij het toezicht op superoxide betrokkenheid in tPMET, wordt de oplossing in twee 6 mL aliquots verdelen. Één aliquot, voeg 55 µL van 0,1 M KPO4 buffer en het andere monster toevoegen 55 µL van 6.5 kU/mL SOD voor een eindconcentratie van 60 U/mL.
  6. De media gecombineerd en wassen van cellen in 150 µL van PBS. De PBS gecombineerd en voeg 100 µL van DPIP oplossing (-) SOD of (-) AO naar kolommen 1-6 en voeg 100 µL van DPIP oplossing (+) SOD of AO (+) op 7-12 kolommen in de 96-wells-plaat. Rijen G en H wil gebruiken als achtergrond controles (dat wil zeggen, om te controleren wijziging in absorptie in het reagens alleen in putten zonder cellen).
  7. Meet de extinctie bij het gebruiken van 600 nm spectrofotometer elke 10 min voor 1 h. kwantificeren van de verandering in de extinctie ten opzichte van de controle op 60 min stappen 1.9-1.13 vergelijkbaar.

3. bepaling van of verminderde elektronen acceptoren substraten voor AO of SOD zijn

  1. Voeg aan 5.436 mL PBS of HBS, 240 µL van 10 mM WST-1 voor een eindconcentratie van 400 µM en 24 µL van 5 mM PMS voor een eindconcentratie van 20 µM.
    1. Meng voor DPIP, 60 µL van 10 mM DPIP, voor een eindconcentratie van 100 µM, 5.940 mL PBS of HBS.
  2. Voeg 100 µL van de oplossing voor elk goed in een flat-96-Wells bodemplaat bij gebrek aan cellen en meet de extinctie in een spectrofotometer op 438 nm, voor WST-1 of 600 nm, voor DPIP.
  3. Voeg 1 µL van 10 mM ascorbaat tot de helft van de putten voor een eindconcentratie van 100 μM. Volgen de extinctie totdat het stabiliseert.
  4. Na stabilisatie, voeg 1 µL van 200 U/mL AO voor een eindconcentratie van 2 U/mL aan elk putje of Voeg 1 µL van 6 kU/mL SOD voor een eindconcentratie van 60 U/mL tot elk goed en controleren van de extinctie gedurende 1 uur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Statistieken werden uitgevoerd met ANOVA met herhaalde maatregelen met behulp van RStudio statistische software25. Omvang van de steekproeven zijn aangegeven in de figuur legendes.

Voor het controleren van tPMET, werden C2C12 myotubes gebruikt samen met de extracellulaire elektronen acceptoren, WST-1 en DPIP. AO werd gebruikt om te bepalen welk gedeelte van WST-1 en DPIP vermindering was te wijten aan ascorbaat efflux en SOD werd gebruikt om te bepalen welk deel van de vermindering van de WST-1 werd door extracellulaire superoxide vrijval. Zoals blijkt uit Figuur 2, zijn C2C12 myotubes geschikt voor tPMET zoals gezien door de reductie van WST-1. Met de toevoeging van AO, werd WST-1 vermindering onderdrukt door ~ 30% die aangeeft dat ~ 30% van de tPMET te wijten aan de uitvoer van ascorbaat (figuur 2A was). Met de toevoeging van SOD, werd WST-1 vermindering onderdrukt door ~ 70%, die aangeeft dat ~ 70% van tPMET het gevolg was van extracellulaire superoxide release (figuur 2B). Wanneer DPIP werd gebruikt als een accepteerder extracellulaire elektron met de toevoeging van AO, DPIP vermindering werd onderdrukt meer dan 100% (Figuur 3). Dit vragen met betrekking tot de geldigheid van het gebruik van DPIP met oa te beoordelen van de bijdrage van ascorbaat gesteld.

Om te onderzoeken of verminderde WST-1 een substraat voor AO of SOD is, werd WST-1 verminderd met ascorbinezuur. AO of SOD werd toegevoegd, en de extinctie werd gecontroleerd. Na 1 uur was er geen verandering in absorptie tussen de gereduceerde vorm van WST-1 zonder AO of SOD en de gereduceerde vorm van WST-1 met AO of SOD (figuur 4A, B). Dus, de verminderde WST-1 is niet een substraat voor deze enzymen, en het gebruik van AO of SOD in combinatie met WST-1 is geschikt voor de beoordeling van de rol van ascorbaat of superoxide, respectievelijk.

Om te bepalen of verminderde DPIP een substraat voor AO of SOD, werd DPIP verminderd met ascorbinezuur. Na 20 min, AO is toegevoegd en de extinctie was gevolgd. Verminderde DPIP bleek te zijn een substraat voor AO, zoals te zien in figuur 5A, waar DPIP keert terug naar haar geoxideerde vorm binnen 40 min. SOD is toegevoegd, toen DPIP ook opnieuw geoxideerde (figuur 5B). Daarom is verminderde DPIP een substraat voor deze enzymen en niet een passende extracellulaire elektron accepteerder aan met deze enzymen worden gebruikt.

Figure 1
Figuur 1: een schematische weergave van de belangrijkste stappen van het elektronentransport tests en vastberadenheid van enzymatische interacties met de extracellulaire elektronen acceptoren. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: de toevoeging van AO en SOD onderdrukt WST-1 vermindering door C2C12 myotubes. (A) tPMET was geanalyseerd voor 60 min 400 µM WST-1 en 20 µM PMS met de toevoeging van 2 U/mL AO of diH2O (N = 18/groep). (B) tPMET was geanalyseerd voor 60 min met de toevoeging van 60 U/mL SOD of 0,1 M KPO4 buffer (N = 36/groep). p≥ 0,05 op het aangegeven tijdstip. Foutbalken kunnen vertegenwoordigen de standaardfout van het gemiddelde en te klein om te visualiseren. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: de toevoeging van AO onderdrukt DPIP vermindering door C2C12 myotubes. tPMET was geanalyseerd voor 60 min 100 µM DPIP gebruiken met of zonder de toevoeging van 2 U/mL AO (N = 36/groep). p≥ 0,05 op het aangegeven tijdstip. Foutbalken kunnen vertegenwoordigen de standaardfout van het gemiddelde en te klein om te visualiseren. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: verlaagde WST-1 is niet een substraat voor AO of SOD. (A) WST-1 werd verminderd met ascorbaat. Na 45 min, AO is toegevoegd en de extinctie was gevolgd gedurende 1 uur. Geen verandering in de extinctie was geconstateerd. (B) de procedure is hetzelfde als hierboven, behalve SOD was toegevoegd na 45 min. Geen verandering in de extinctie was geconstateerd (N = 24/groep). Foutbalken kunnen vertegenwoordigen de standaardfout van het gemiddelde en te klein om te visualiseren. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5: verminderde DPIP is een substraat voor AO en SOD. (A) DPIP werd verminderd met ascorbaat. Na 20 min, AO is toegevoegd en de extinctie was gevolgd. Binnen 40 min, de monsters keerde terug naar hun oorspronkelijke absorptie, waarmee wordt aangegeven dat verminderde DPIP een substraat voor AO. (B) DPIP werd verminderd met ascorbaat. Na 20 min, SOD is toegevoegd en de extinctie was gevolgd. Na verloop van tijd de verminderde DPIP was opnieuw geoxideerd, die aangeeft dat verminderd DPIP is een substraat voor SOD (N = 24/groep). Foutbalken kunnen vertegenwoordigen de standaardfout van het gemiddelde en te klein om te visualiseren. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 6
Figuur 6: Schematische afbeelding van tPMET. In dit model van tPMET, de ascorbaat (of een andere drager van het elektron) geëxporteerd door de cel de extracellulaire PMS kan verminderen. Bovendien NADPH oxidasen genereren extracellulaire superoxide, die kan verminderen WST-1 rechtstreeks of niet indirect verminderen via vermindering van PMS. Elektronen van andere donoren plasmamembraan kunnen ook het verminderen van PMS, die elektronen op WST-1 of O2 met verdere verlaging van de WST-1 kunt doneren. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

We hebben twee methoden voor het gebruik van extracellulaire elektronen acceptoren, WST-1 en DPIP, in spectrofotometrische testen om te controleren van de tPMET in C2C12 myotubes gepresenteerd. Met de groei van de cellijnen in standaard cultuur procedures en een afleesapparaat spectrofotometer is het mogelijk om te controleren tPMET met deze elektronen acceptoren in een eenvoudige microplate-assay. WST-1 vermindering van goed-te-goed binnen een bepaling reproduceerbaar is, maar er is dagelijkse variabiliteit. De dagelijkse variatiecoëfficiënt (CV) met behulp van PBS als de buffer is 0.18 en de CV met behulp van de HBS, omdat de buffer 0.23.

Uit de vorige literatuur met behulp van mPMS en WST-1, hebben wij dit protocol, specifiek, aangepast voor het gebruik van PMS. Dus, probleemoplossing opgenomen bepaling van de juiste concentraties van PMS en WST-1 voor gebruik met de myotubes beschreven. Wij ook vastbesloten dat temperatuur (in een bereik van 23-37 ° C) niet een essentieel onderdeel voor de assay, is terwijl schudden van de plaat voorafgaand aan elke lezing absorptie belangrijk is. Echter moeten deze kwesties worden onderzocht voor andere cellijnen waarop de test wordt toegepast. De bevindingen met betrekking tot het vermogen van SOD en AO om direct oxideren verminderde WST-1 suggereren dat screening van nieuwe assay componenten voor deze eigenschap een belangrijk aspect van het oplossen van problemen is.

Onze gegevens blijkt dat PMS moet worden gebruikt in combinatie met WST-1 om te ontlokken optimale WST-1 vermindering. We vonden dat in een volume van 1 mL, 100 µM ascorbaat 322 nmol van WST-1 per minuut in de aanwezigheid van PMS, die vereist voor directe reductie van WST-1 door ascorbaat is vermindert. In een volume van 1 mL oxideert 2 U/mL voor AO ascorbaat met een snelheid van 4.400 nmol/s of 800 keer sneller dan de vermindering van WST-1 door ascorbaat. Enzymatische activiteit voor AO is duidelijk, veel sneller dan het rechtstreeks reduceren van PMS/WST-1 door ascorbaat. Wij verwachten dat hetzelfde voor superoxide en SOD volgen zou, maar we niet een systeem hebben voor het meten van de absolute snelheid van WST-1 vermindering door superoxide.

Om te bepalen of opneming van PMS is van invloed op de vermindering van WST-1 tegen superoxide, gebruikten we een xanthine oxidase (4.5 mU/mL) / hypoxanthine (0.1 mM) superoxide genereren systeem zoals eerder beschreven26,27. Opneming van PMS verdubbelt ongeveer het tempo van de vermindering van de WST-1 door dit systeem. Dus, lijkt het dat PMS overdracht van elektronen van superoxide naar WST-1 bemiddelt.

Als u wilt verder evalueren de eis van PMS voor cellulaire WST-1 vermindering, vehiculumcontrolegroep we vermindering in de aan- of afwezigheid van PMS en WST-1, en vond dat PMS vereist voor de vermindering van de cellulaire WST-1 is. Wanneer cellen worden geïncubeerd in assay reagens met PMS alleen (in het ontbreken van WST-1), is er een toename van de absorptie bij 438 nm. Dit weerspiegelt waarschijnlijk een opeenstapeling van de semiquinone vorm van PMS (PMS-SQ) met een piek extinctie bij 440 nm28. Accumulatie van PMS-SQ suggereert dat PMS sneller dan het elektronen aan O2 doorgeven kunt tot superoxide is gekort. Dus, de accumulatie van PMS-SQ komt overeen met de gerapporteerde langzame vermindering van O2 door PMS-SQ in vergelijking met het tarief voor volledig verminderde PMS28.

Ook hebben wij een protocol om te bepalen of de elektronen acceptoren substraten voor de enzymen die kunnen worden gebruikt voor het controleren van de tPMET gepresenteerd. Door het toezicht op de vermindering van de extracellulaire elektronen acceptoren in een spectrofotometer, gevolgd door de toevoeging van het enzym van belang, is het mogelijk om te bepalen of de acceptor elektron een substraat voor deze enzymen. Via deze methode hebben we aangetoond dat verminderde DPIP een substraat voor AO en SOD die aangeeft is dat er geen een geschikt elektron acceptor voor het toezicht op ascorbaat efflux en superoxide export.

De procedure voor het testen al of niet assay onderdelen zoals SOD of AO artefacten maken is een significante verbetering over bestaande methoden. Verminderde DPIP is bijvoorbeeld een substraat voor SOD, wat suggereert dat de gepubliceerde gegevens verkregen met gebruik van DPIP en SOD dienovereenkomstig moeten worden geïnterpreteerd. Onze bevindingen steunen eerder onderzoek uitgevoerd door Dayan en Dawson waarin de extinctie van leuco 2,6-dichloroindophenol werd gecontroleerd na toevoeging van AO: DPIP was geoxideerd waarmee wordt aangegeven dat het een substraat voor AO29. Echter toevoegen onze bevindingen aan onderzoek olv Tan en Berridge24, evenals Bellavite et al. 30, die gebruikt SOD DPIP vermindering belemmeren. In een studie, uitgevoerd door Tan en Berridge vergelijken de elektronen acceptoren van WST-1, DPIP en FeCN in HeLa cellen, zagen zij dat de vermindering van sommige van de elektronen acceptoren werd onderdrukt in het bijzijn van SOD. De vermindering van WST-1, in combinatie met mPMS, was geremde ~ 80% in de aanwezigheid van SOD, terwijl de vermindering van DPIP was geremd met 40%. De vermindering van FeCN, in combinatie met een alternatieve tussenliggende elektron acceptor, was niet geremd in aanwezigheid van SOD24. Wanneer evaluatie van de wijze van elektronen uitwisseling tussen NADPH oxidasen en DPIP of cytochroom c, Bellavite et al. vond dat DPIP en cytochroom c met NADPH oxidasen zijn verminderd en dat deze vermindering wordt aanzienlijk geremd door SOD30. Berridge en Tan hebben ook aangetoond dat SOD WST-1 vermindering met 80% in de muis cellen lijnen van 32Dcl23, WEHI3B, en J774, evenals menselijke cellijnen van Jurkat, MALME3M en 1436,31kan remmen. Met menselijke primaire neutrofiele cellen was WST-1 vermindering geremde 95% in aanwezigheid van SOD6,32.

Hier de gegevens suggereren dat het belangrijk is om te verifiëren dat de enzymen gebruikt ter beoordeling van de specifieke bijdragen van geëxporteerde moleculen tot tPMET opnieuw de gereduceerde vorm van de extracellulaire elektron acceptor kunnen niet oxideren. We vonden dat de ferro chloride (gegevens niet worden weergegeven) en ferro-sulfaat niet oplosbaar in PBS waren. In de HBS en fenol rood-vrije DMEM, waren ze snel geoxideerd, demonstreren van onverenigbaarheid met HBS of DMEM als assay media. In tegenstelling, gebruik AO en SOD geen kaliumferrocyanide als substraat, suggereert dat er een geschikt extracellulaire elektron acceptor als haar lage uitsterven coëfficiënt geen probleem is.

Een van de belangrijkste beperkingen van deze test is dat PMS/WST-1 en DPIP kan worden verminderd door meerdere donoren van het elektron, zoals NAD (P) H, ascorbaat en flavonoïden zoals quercetine en myricetin19,33,34. Echter, dit kan worden verholpen door de toevoeging van enzymen (b.v., SOD, AO) of remmers te bepalen specifieke bijdragen tot vermindering van PMS/WST-1 of DPIP. Een andere beperking is dat DPIP als een substraat voor AO en SOD fungeren kan. Deze enzymen moeten dus niet worden gebruikt in combinatie met DPIP te controleren tPMET. Een extra belangrijke beperking van deze studie is het vermogen van PMS en andere redox fietsers te produceren superoxide26,35,,36. Dit wordt geïllustreerd in Figuur 6. Aan de andere kant, PMS zich naar verluidt heeft geen directe invloed op de tPMET32. Bovendien, Tan en Berridge32 is gebleken dat de NADPH oxidase (NOX) remmer, diphenyleneiodinium chloride (DPI), de meerderheid van de vermindering van de WST-1, suggereren dat DPI-gevoelige tPMET kan een specifieke maatregel van NOX bijdrage kunt onderdrukken te tPMET. Een andere beperking is dat we kleine veranderingen in de absorptie zien als met behulp van WST-1. We hebben vastgesteld dat wanneer cellen confluente worden WST-1 vers wordt gemaakt en de grootste verandering in absorptie is gezien. Eerdere studies uitgevoerd in P388 cellijnen hebben aangetoond dat de hoeveelheid geproduceerd positief formazan met cel nummer21 correleert. Dus, hoe meer confluente de cellen zijn dan hoe groter de afname van WST-1. Dit kan worden gecorrigeerd door het normaliseren tot microgram van eiwitten voor elk putje.

Een waarschuwing met betrekking tot deze test is dat het vooral is ontworpen voor het beoordelen van de mondiale tPMET. Hoewel het kan worden gemanipuleerd om het controleren van meerdere vormen van tPMET, zoals het voorbeeld van ascorbaat efflux, wellicht meer specifieke tests passender zijn wanneer het doel geen metingen in de context van tPMET vereist. Fox voorbeeld, als superoxide is de belangrijkste rente, zijn er een aantal andere wegen volgen superoxide, zoals gebruik van sondes inclusief TL ondoordringbare sondes, aconitase en nitroblue tetrazolium37.

Bestaande sondes te controleren tPMET zoals DPIP, FeCN en ferricytochrome c, huidige nadelen. Bijvoorbeeld verminderde DPIP is een substraat voor AO en SOD FeCN heeft een lage molaire extinctie-coëfficiënt die zijn nut in realtime testen beperkt en cytochroom c is duur. Bovendien kunnen sommige van deze sondes hoge achtergrond leidt tot lage gevoeligheid bij het meten van een verandering in de extinctie32produceren. WST-1 heeft aangetoond dat het niet op een substraat voor enzymen zoals AO en SOD. Bovendien heeft WST-1 een hoge molaire extinctie coëfficiënt en een lage achtergrond reactie, het creëren van een meer gevoelige tPMET assay. Vooruit, kan deze bepaling worden gebruikt met een breed scala van remmers beter begrijpen van het proces van tPMET, kaart van het pad van het elektronentransport in de lijn van een bepaalde cel, en leiden tot een beter begrip van hoe een cel redox milieu wordt gehandhaafd.

Kritische stappen van dit protocol omvatten om te bepalen dat de cellen klaar voor experimenten (~ 70% heuvels), alsmede het maken van de assay reagentia, specifiek WST-1 en PMS, vers voor elke assay. Het is ook cruciaal voor het wassen van de cellen voor de toevoeging van assay reagentia. De DMEM gebruikt in dit protocol bevat geen ascorbaat, hoewel we differentiatie medium met ascorbaat aanvullen. Een aantal van de beschikbare media bevatten ascorbaat. De cellen zijn echter vóór de toevoeging van de assay reagentia, die ascorbaat-vrij, verwijderen van alle resterende ascorbaat uit het medium gewassen. Als een gedeelte van de tPMET is te wijten aan moleculaire efflux (bijvoorbeeld ascorbaat export), is het belangrijk dat spectrofotometrische lezingen onmiddellijk na de toevoeging van assay reagens om niet te missen van de eerste momenten van efflux. Het is ook cruciaal voor de achtergrond putten voor elke individuele reagens opnemen in een experiment. De bestanddelen van de bepaling in dit document beschreven veroorzaakt te verwaarlozen achtergrond verandering in absorptie. Echter, sommige additieven (bijvoorbeeld phloretin) kunnen bevorderen een aanzienlijke achtergrond reactie. Het is dus belangrijk dat de achtergrond wordt afgetrokken uit wanneer de gegevens worden geanalyseerd om eventuele storende effecten die de reagentia zelf kunnen produceren.

Kortom, het hier gepresenteerde protocol biedt een middel om de beoordeling tPMET en stelt een aantal kanttekeningen en aspecten van het protocol waarmee rekening moet worden gehouden bij de toepassing van de bepaling op verschillende cellijnen en/of beoordeling van specifieke respondenten ( ascorbaat en superoxide hier gebruikt) naar tPMET.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Wij wil Thomas Bell, Lyn Mattathil, Mark Mannino en Neej Patel Dank voor hun technische ondersteuning. Dit werk werd gesteund door de Verenigde Staten Public Health Service award R15DK102122 van het nationale Instituut van Diabetes en de spijsverterings en ziekten van de nier (NIDDK) aan Jonathan Fisher. De inhoud van het manuscript is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijk de officiële standpunten van de NIDDK of de National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C2C12 myoblasts American Type Culture Collection  CRL-1772
Dulbecco's modified eagle's medium - low glucose Sigma D6046
Fetal Plex animal serum complex Gemini Bio-Products  100-602
penicillin-streptomycin Sigma 516106
horse serum Gibco Technologies 16050-130
Dulbecco's phosphate buffered saline Sigma D8537
trypsin-EDTA Sigma T4049
15 cm culture dishes TPP 93150
96 well culture plates TPP 92096
2-(4-Iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium Sodium Salt (WST-1) Accela ChemBio  Inc SY016315
phenazine methosulfate  Sigma P9625
L-ascorbic acid Sigma A5960
ascorbate oxidase  Sigma A0157
superoxide dismutase  Sigma S5395
2,6-dichloroindophenol sodium salt  ICN Biomedicals 215011825
D-(+)-glucose Sigma G7528
HEPES sodium salt Sigma H3784
sodium chloride Sigma S7653
potassium chloride Fisher Scientific  BP366
magnesium sulfate heptahydrate Sigma M5921
calcium chloride dihydrate Sigma C7902
potassium phosphate Fisher Scientific  BP363
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific 23225
Powerwave X-I spectrophotometer Biotek Insturments discontinued 
Spectronic Genesys 5 Spectrophotometer Thermo Scientific 336001
PureGrade 96-well microplate, F-bottom, clear, untreated, non-sterile MidSci 781602
Iron (II) chloride tetrahydrate Sigma 220299
Iron (II) sulfate heptahydrate Sigma 215422
hypoxanthine Sigma H9636
xanthine oxidase Sigma X4500
Excel Microsoft
R Studio Rstudio https://www.rstudio.com/products/rstudio/
KC4 Biotek Insturments discontinued 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kilberg, M. S., Christensen, H. N. Electron-transferring enzymes in the plasma membrane of the Ehrlich ascites tumor cell. Biochemistry. 18 (8), 1525-1530 (1979).
  2. Crane, F. L., Roberts, H., Linnane, A. W., Low, H. Transmembrane ferricyanide reduction by cells of the yeast Saccharomyces cerevisiae. J Bioenerg Biomembr. 14 (3), 191-205 (1982).
  3. Craig, T. A., Crane, F. L. Evidence for trans-plasma membrane electron transport system in plact cells. Proc. Indiana Acad. Sci. 90, 150-155 (1981).
  4. Mishra, R. K., Passow, H. Induction of intracellular ATP synthesis by extracellular ferricyanide in human red blood cells. J Membr Biol. 1 (1), 214-224 (1969).
  5. Crane, F. L., Sun, I. L., Clark, M. G., Grenbing, C., Low, H. Transplasma-membrane redox systems in growth and development. Biochim Biophys Acta. 811, 233-264 (1985).
  6. Berridge, M. V., Tan, A. S. Trans-plasma membrane electron transport: a cellular assay for NADH- and NADPH-oxidase based on extracellular, superoxide-mediated reduction of the sulfonated tetrazolium salt WST-1. Protoplasma. 205 (1-4), 74-82 (1998).
  7. Eccardt, A. M., et al. Trans-plasma membrane electron transport and ascorbate efflux by skeletal muscle. Antioxidants. 6 (4), 89 (2017).
  8. Sun, I. L., Navas, P., Crane, F. L., Morre, D. J., Low, H. NADH diferric transferrin reductase in liver plasma membrane. J Biol Chem. 262 (33), 15915-15921 (1987).
  9. Larm, J. A., Vaillant, F., Linnane, A. W., Lawen, A. Up-regulation of the plasma membrane oxidoreductase as a prerequisite for the viability of human Namalwa rho 0 cells. J Biol Chem. 269 (48), 30097-30100 (1994).
  10. Inman, R. S., Coughlan, M. M., Wessling-Resnik, M. Extracellular ferrireductase activity of K562 cells is coupled to transferrin-independent iron transport. Biochemistry. 33, 11850-11857 (1994).
  11. Castillo-Olivares, A., Esteban del Valle, A., Marquez, J., Nunez de Castro, I., Medina, M. A. Ehrlich cell plasma membrane redox system is modulated through signal transduction pathways involving cGMP and Ca2+ as second messengers. J Bioenerg Biomembr. 27 (6), 605-611 (1995).
  12. Medina, M. A., del Castillo-Olivares, A., Nunez de Castro, I. Multifunctional plasma membrane redox systems. Bioessays. 19 (11), 977-984 (1997).
  13. Medina, M. A., del Castillo-Olivares, A., Schweigerer, L. Plasma membrane redox activity correlates with N-myc expression in neuroblastoma cells. FEBS Lett. 311 (2), 99-101 (1992).
  14. Diaz-Gomez, C., Villalba, J. M., Perez-Vicente, R., Crane, F. Ascorbate Stabilization Is Stimulated in rho(0)HL-60 Cells by CoQ10 Increase at the Plasma Membrane. Biochem Biophys Res Commun. 234 (0), 79-81 (1997).
  15. Navarro, F., et al. Protective role of ubiquinone in vitamin E and selenium-deficient plasma membranes. Biofactors. 9 (2-4), 163-170 (1999).
  16. Herst, P. M., Berridge, M. V. Cell surface oxygen consumption: a major contributor to cellular oxygen consumption in glycolytic cancer cell lines. Biochim Biophys Acta. 1767 (2), 170-177 (2007).
  17. Baoutina, A., Dean, R. T., Jessup, W. Trans-plasma membrane electron transport induces macrophage-mediated low density lipoprotein oxidation. FASEB J. 15 (9), 1580-1582 (2001).
  18. Furukawa, S., et al. Increased oxidative stress in obesity and its impact on metabolic syndrome. J Clin Invest. 114 (12), 1752-1761 (2004).
  19. Del Principe, D., Avigliano, L., Savini, I., Catani, M. V. Trans-plasma membrane electron transport in mammals: functional significance in health and disease. Antioxid Redox Signal. 14 (11), 2289-2318 (2011).
  20. Berridge, M. V., Tan, A. S. High-Capacity Redox Control at the Plasma Membrane of Mammalian Cells Trans-Membrane, Cell Surface, and Serum NADH-Oxidases. Antioxidants & Redox Signaling. 2 (2), 231-242 (2000).
  21. Ishiyama, M., Shiga, M., Sasamoto, K., Mizoguchi, M., He, P. G. A New Sulfonated Tetrazolium Salt That Produces a Highly Water-Soluble Formazan Dye. Chemical & Pharmaceutical Bulletin. 41 (6), 1118-1122 (1993).
  22. Berridge, M. V., Herst, P. M., Tan, A. S. Tetrazolium dyes as tools in cell biology: New insights into their cellular reduction. Biotechnology Annual Review. 11, 127-152 (2005).
  23. Gurtoo, H. L., Johns, D. G. On the interaction of the electron acceptor 2,6-dichlorophenolindophenol with bovine milk xanthine oxidase. J Biol Chem. 246 (2), 286-293 (1971).
  24. Tan, A. S., Berridge, M. V. Distinct trans-plasma membrane redox pathways reduce cell-impermeable dyes in HeLa cells. Redox Rep. 9 (6), 302-306 (2004).
  25. R: A language and environment for statistical computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. (2013).
  26. Peskin, A. V., Winterbourn, C. C. A microtiter plate assay for superoxide dismutase using a water-soluble tetrazolium salt (WST-1). Clinica Chimica Acta. 293 (1-2), 157-166 (2000).
  27. Higaki, Y., et al. Oxidative stress stimulates skeletal muscle glucose uptake through a phosphatidylinositol 3-kinase-dependent pathway. Am J Physiol Endocrinol Metab. 294 (E889-E897), (2008).
  28. Zuagg, W. Spectroscopic characteristics and some chemical propertiesof N-methylphenazinium methyl sulfate (phenazine methosulfate) and pyocyanine at the oxidation level. J Biol Chem. 239 (11), 3964-3970 (1964).
  29. Dayan, J., Dawson, C. R. Substrate specificity of ascorbate oxidase. Biochem Biophys Res Commun. 73 (2), 451-458 (1976).
  30. Bellavite, P., della Bianca, V., Serra, M. C., Papini, E., Rossi, F. NADPH oxidase of neurtrophils forms superoxide anion but does not reduce cytochrome c and dichlorophenolindophenol. FEBS. 170 (1), 157-161 (1984).
  31. Berridge, M. V., Tan, A. S., McCoy, K. D., Wang, R. The biochemical and cellular basis of cell proliferation assays that use tetrazolium salts. Biochemica. 4, 15-20 (1996).
  32. Tan, A. S., Berridge, M. V. Superoxide produced by activated neutrophils efficiently reduces the tetrazolium salt, WST-1 to produce a soluble formazan: a simple colorimetric assay for measuring respiratory burst activation and for screening anti-inflammatory agents. J Immunol Methods. 238 (1-2), 59-68 (2000).
  33. Phillips, P. A., et al. Myricetin induces pancreatic cancer cell death via the induction of apoptosis and inhibition of the phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) signaling pathway. Cancer Letters. 308 (2), 181-188 (2011).
  34. Altundag, E., et al. Quercetin-induced cell death in human papillary thyroid cancer (B-CPAP) cells. Journal of thyroid research. 2016 (8), (2015).
  35. Ukeda, H., Kawana, D., Maeda, S., Sawamura, M. Spectrophotometric Assay for Superoxide Dismutase Based on the Reduction of Highly Water-soluble Tetrazolium Salts by Xanthine-Xanthine Oxidase. Biosci Biotechnol Biochem. 63 (3), 485-488 (1999).
  36. Halaka, F. G., Babcock, G. T., Dye, J. L. Properties of 5-methylphenazinium methyl sulfate. Reaction of the oxidized form with NADH and of the reduced form with oxygen. J Biol Chem. 257 (3), 1458-1461 (1982).
  37. Maghzal, G. J., Krause, K. H., Stocker, R., Jaquet, V. Detection of reactive oxygen species derived from the family of NOX NADPH oxidases. Free Radic Biol Med. 53 (10), 1903-1918 (2012).

Tags

Biochemie kwestie 135 tPMET WST-1 DPIP ascorbaat superoxide C2C12 myotubes spectrofotometrische bepaling
Meten van Trans-Plasma membraan elektronentransport door C2C12 Myotubes
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kelly, S. C., Eccardt, A. M.,… More

Kelly, S. C., Eccardt, A. M., Fisher, J. S. Measuring Trans-Plasma Membrane Electron Transport by C2C12 Myotubes. J. Vis. Exp. (135), e57565, doi:10.3791/57565 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter