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Biochemistry

Messung der Trans-Plasma Membran Elektronentransport durch C2C12 Myotubes

Published: May 4, 2018 doi: 10.3791/57565
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Biology, Saint Louis University
* These authors contributed equally

Summary

Das Ziel dieses Protokolls ist, spektralphotometrisch Trans-Plasma Membran Elektronentransport Nutzung extrazelluläre Elektronen Akzeptoren überwachen und enzymatische Interaktionen zu analysieren, die mit dieser extrazellulären Elektronen-Akzeptoren auftreten können.

Abstract

Trans-Plasma Membran Elektronentransport (tPMET) spielt eine Rolle im Schutz der Zellen vor intrazellulären reduktiven Stress sowie Schutz vor Schäden durch extrazelluläre Oxidantien. Dieser Prozess für den Transport von Elektronen von intrazellulären Reduktionsmitteln extrazelluläre Oxidantien ist nicht gut definiert. Hier präsentieren wir Ihnen spektralphotometrische Proben von C2C12 Myotubes tPMET unter Verwendung der extrazellulären Elektronen-Akzeptoren zu überwachen: wasserlösliche tetrazoliumsalz Salz-1 (WST-1) und 2,6-Dichlorophenolindophenol (‑Aufklärung oder DCIP). Durch die Reduzierung der diese Elektronen-Akzeptoren sind wir in der Lage, diesen Prozess in eine Echtzeit-Analyse zu überwachen. Mit dem Zusatz von Enzymen wie Ascorbat Oxidase (AO) und Superoxid-Dismutase (SOD) für die Tests können wir bestimmen, welcher Teil des tPMET durch Ascorbat Export oder Superoxid Produktion, bzw. ist. Während WST-1 zu stabilen Ergebnissen mit niedrigen Hintergrund gezeigt wurde, konnte ‑Aufklärung nach der Zugabe von AO und SOD, die photometrische Analyse zeigte wieder oxidiert werden. Diese Methode zeigt einen in Echtzeit, Multi-gut, schnelle photometrische Assay mit Vorteilen gegenüber anderen Methoden verwendet, um tPMET, wie ferricyanid (FeCN) und Ferricytochrome C Reduktion zu überwachen.

Introduction

Die Fähigkeit des gereinigten Plasmamembranen, Elektronen-Akzeptoren reduzieren führte zu der Ansicht, dass der Plasmamembran ein Redox-inhärente Kapazität1hat. Zuvor in Pilzen, Pflanzen und Tiere gesehen, ist tPMET ein Prozess üblich, mehrere Organismen2,3,4,5. Insbesondere wurde dabei in Saccharomyces Cerevisiae, Karotte Zellen, Erythrozyten, Lymphozyten, Osteosarkom, Melanom, Makrophagen, Skelettmuskel und Neutrophilen2,3, nachgewiesen 4 , 5 , 6 , 7. in einem Prozess, der Elektronen über die Plasmamembran extrazelluläre Oxidantien reduzieren transportiert, tPMET engagiert sich in vielen Zellfunktionen einschließlich: Zelle Wachstum5,8, Zelle überleben9, Eisen Stoffwechsel10, Zelle11,12,13, und Schutz vor reaktiven Sauerstoff-Spezies12,14,15. Aufgrund des tPMET Engagements in vielen Zellfunktionen, Hypothese aufgestellt die ein Ungleichgewicht von tPMET als Beitrag zu der Entwicklung von einigen schweren gesundheitlichen Bedingungen, einschließlich Krebs16, Herz-Kreislauf-Krankheit17, und Stoffwechselerkrankungen Syndrom18.

Es gibt mehrere Möglichkeiten, um die Übertragung von Elektronen in der Plasmamembran zu überwachen, aber die am häufigsten verwendete Technik ist die Reduzierung der extrazellulären Elektronen Akzeptoren durch farbmetrische Assays zu beurteilen. Häufig verwendete extrazelluläre Elektronen Akzeptoren sind tetrazoliumsalz Salze, ‑Aufklärung, FeCN und Ferricytochrome C19,20. Das am häufigsten verwendete Tetrazolium-Salz ist als WST-119eine zweite Generation Salz bekannt. Diese Verbindung ist einfacher zu nutzen in farbmetrische Untersuchungen im Vergleich zur ersten Generation tetrazoliumsalz Salze durch zwei Sulfonate Gruppen, die die Wasser Löslichkeit21zu erhöhen. WST-1, wird in Verbindung mit der mittleren Elektron Akzeptor 1-Methoxy-phenazinderivat Methosulfate (Komponenten), in zwei Einzel-Elektronentransfer Ereignisse reduziert. Diese Reduktion ändert die schwach gefärbte oxidierte Form von WST-1 zu einer intensiveren, gelbe Formazan20,22. WST-1 hat eine hohe molare Aussterben Koeffizient von 37 x 103 M-1cm-1, führt zu einer hohen Assay Empfindlichkeit21,22. ‑Aufklärung wird auch als eine extrazelluläre Elektron Akzeptor tPMET Überwachung genutzt. Es hat sich gezeigt, dass ‑Aufklärung tPMET ohne die Hilfe eines zwischengeschalteten Elektronen Akzeptoren23,24extrazellulär gesenkt werden kann. Aufgrund des Fehlens der Mittelstufe Elektronen-Akzeptoren ‑Aufklärung können direkt Pick-up Elektronen aus der Plasmamembran, im Gegensatz zu WST-124. Ähnlich wie bei ‑Aufklärung, FeCN nachweislich extrazellulär tPMET ohne die Hilfe eines zwischengeschalteten Elektronen Akzeptoren19,24, ferrocyanid gesenkt werden. Im Gegensatz zu WST-1 und ‑Aufklärung hat FeCN eine niedrige molare Aussterben Koeffizient führt zu einem geringeren Assay Empfindlichkeit9. Eine andere häufig verwendete extrazelluläre Elektron Akzeptor, tPMET zu überwachen ist Ferricytochrome c. WST-1, Ferricytochrome C Reduktion steigt mit dem Einsatz von mittleren Elektron Akzeptor, Komponenten22ähnlich. Im Gegensatz zu WST-1 ist jedoch die Ferricytochrome C Methode aufgrund hoher Hintergrund und eine niedrige molare Aussterben Koeffizient22weniger empfindlich.

Hier präsentieren wir eine Methode zur Echtzeit-Analyse des tPMET durch photometrische Tests. Die Methode genutzt die extrazelluläre Elektronen-Akzeptoren WST-1 und ‑Aufklärung, da sie beide einen hohen molaren Aussterben Koeffizienten haben, während weniger teuer im Vergleich zu den anderen häufig extrazelluläre Elektronen-Akzeptoren wie Ferricytochrome c eingesetzt. Wir nutzten phenazinderivat Methosulfate (PMS) anstelle von Komponenten haben sie eine ähnliche chemische Zusammensetzung und PMS ist weit weniger teuer. Komponenten ist photochemisch stabilen ein wichtiges Merkmal für eine kommerzielle Kit, die eine lange Haltbarkeit. Jedoch machen wir PMS frisch für jeden Test, damit Stabilität kein Problem sein sollte. Wir präsentieren auch eine Methode zur Evaluierung möglicher enzymatischer Interaktionen (siehe Abbildung 1) zwischen der extrazellulären Elektron Akzeptor und Enzyme, die genutzt werden können, um den Prozess der tPMET weiter zu charakterisieren. Insbesondere ermitteln die Enzyme, die AO und SOD verwendet werden kann, welcher Teil des tPMET ist durch Ascorbat Transport oder extrazellulären Superoxid Version, zwei gängige Methoden für Elektronen über die Plasmamembran transportiert werden.

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Protocol

Hinweis: Siehe Abbildung 1 für einen schematischen Überblick über die wichtigsten Schritte.

1. Reduzierung der WST-1-Assay

  1. Wachsen Sie und differenzieren Sie C2C12 adhärente Zellen mit Standardzellen Kultur Verfahren7 in einer 96-Well-Platte mit Zeilen A-F.
    1. Verwenden Sie eine Differenzierung Medium aus der Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM) mit 2 % Pferd Serum, 100 U/mL Penicillin und 0,1 mg/mL Streptomycin ergänzt. Inkubation der Zellen bei 37 ° C mit 5 % CO2.
    2. Bei der Überwachung von Ascorbat Beteiligung an tPMET ergänzen Sie Differenzierung Medien mit 100 µM Ascorbinsäure. Können Zellen auszubrüten in Differenzierung Medien für ~ 24-48 h.
  2. WST-1 und PMS Stammlösungen vorzubereiten.
    1. Um ein 10 mM Lager von WST-1 machen, lösen 0,033 g WST-1 (Formel Gewicht (FW): 651.34 g/Mol) in 5 mL Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS). Shop bei 4 ° C.
    2. Um einen 5 mM bestand von PMS zu machen, lösen 0,0023 g von PMS (FW: 306.34 g/Mol) in 1,5 mL entionisiertem H2O (DiH2O). Bei-20 ° C lagern und vor Licht schützen.
  3. Fügen Sie 0,0108 g Glukose für eine Endkonzentration von 5 mM bis 11,4 mL PBS oder HEPES Kochsalzlösung gepufferten (HBS; 20 mM HEPES Natrium Salz, 140 mM NaCl, KCl, 2,5 mM MgSO4, 5 mM 1 mM CaCl2). Fügen Sie 480 µL 10 mM WST-1 für eine Endkonzentration von 400 µM und 48 µL 5 mM PMS für eine Endkonzentration von 20 µM.
  4. Bei der Überwachung von Ascorbat Beteiligung an tPMET teilen Sie die Lösung in zwei 6 mL-aliquoten. Eine Aliquote hinzugeben Sie 6 µL DiH2O und die anderen aliquoten fügen Sie 6 µL 2 kU/mL AO für eine Endkonzentration von 2 U/mL hinzu.
  5. Beim Überwachen der Superoxid-Beteiligung an tPMET teilen Sie die Lösung in zwei 6 mL-aliquoten. Eine Aliquote fügen Sie 55 µL 0.1 M KPO4 Puffer hinzu und fügen Sie der anderen aliquoten 55 µL 6,5 kU/mL SOD für eine Endkonzentration von 60 U/mL hinzu.
  6. Waschen Sie die Zellen mit PBS. Aspirieren Sie die Medien und fügen Sie 150 µL PBS hinzu. Dann Aspirieren der PBS.
    Hinweis: Der Test erfolgt mit vergoldeten, angeschlossenen Zellen. So gibt es keine Zentrifugation oder Verwendung von Trypsin im Waschprozess.
  7. Hinzufügen von 100 µL der WST-1-Lösung (-) SOD oder (-) AO, Spalten 1 bis 6 und 100 µL der WST-1-Lösung (+) SOD oder (+) AO Spalten 7 bis 12 in der 96-Well-Platte hinzufügen. Verwenden Sie Zeilen G und H als Hintergrund-Kontrollen (d. h.Änderung überwachen in Absorption in das Reagenz allein im Brunnen ohne Zellen).
  8. Messen Sie die Absorption Werte mit dem Spektralphotometer alle 10 min für 1 h bei 438 nm.
  9. Nach der Lektüre, Aspirieren Sie die Medien und waschen jeweils gut mit 150 µL PBS. Dann Aspirieren der PBS.
  10. Berechnen Sie die Änderung der Extinktion für jedes gut durch Subtraktion der ersten Extinktion für einen Brunnen aus der Extinktion zu jedem Zeitpunkt für das gut. Korrigieren Sie diese Änderung für die Änderung der Extinktion (falls vorhanden) in den Hintergrund-Brunnen (d.h., Brunnen mit Assay Lösung aber keine Zellen) beobachtet.
  11. Für die Analyse normalisieren die Extinktion Daten der Kontrollmessung 60 min oder waschen mit PBS oder HBS und führen Sie dann einen Bicinchoninic Säuren (BCA) Protein Assay.
  12. Hinzufügen von 2 mg/mL Rinderserumalbumin (BSA) Standard (Bereich von 0,5-2 µL für die Standardkurve, je nach dem Grad der Zusammenfluss der Zellen), die leeren Brunnen (Zeilen G und H), fügen Sie das BCA-Reagenz in alle Vertiefungen.
  13. Die Daten über Nmol WST-1 Reduktion pro µg Protein zu quantifizieren. Verwenden Sie 37 mM-1 cm-1 22 als vom Aussterben bedroht-Koeffizient für reduzierte WST-1 438 nm.

2. ‑Aufklärung-Reduktion-Assay

  1. Wachsen und C2C12 adhärente Zellen mit dem gleichen Verfahren wie Schritt 1.1 zu unterscheiden.
  2. Lager 10 mM ‑Aufklärung Lösung wie folgt vorbereiten. Lösen Sie 0,029 g ‑Aufklärung (FW: 290.08 g/Mol) in 10 mL DiH2O. bestätigen die Konzentration des ‑Aufklärung durch Messung der Extinktion bei 600 nm mit einem Spektrophotometer. Verwenden Sie 1 mM-1 cm-1 23 als vom Aussterben bedroht-Koeffizient für reduzierte ‑Aufklärung bei 600 nm. Shop bei 4 ° C.
  3. 11,880 mL PBS für eine Endkonzentration von 5 mM 0,0108 g Glukose hinzufügen. Fügen Sie 120 µL 10 mM ‑Aufklärung für eine Endkonzentration von 100 µM.
  4. Bei der Überwachung von Ascorbat Beteiligung an tPMET teilen Sie die Lösung in zwei 6 mL-aliquoten. Eine Aliquote hinzugeben Sie 6 µL DiH2O und die anderen aliquoten fügen Sie 6 µL 2 kU/mL AO für eine Endkonzentration von 2 U/mL hinzu.
  5. Beim Überwachen der Superoxid-Beteiligung an tPMET teilen Sie die Lösung in zwei 6 mL-aliquoten. Eine Aliquote fügen Sie 55 µL 0.1 M KPO4 Puffer hinzu und fügen Sie der anderen aliquoten 55 µL 6,5 kU/mL SOD für eine Endkonzentration von 60 U/mL hinzu.
  6. Aspirieren Sie die Medien und waschen Sie Zellen in 150 µL PBS. Aspirieren der PBS und 100 µL der ‑Aufklärung Lösung (-) hinzufügen SOD oder (-) AO, Spalten 1 bis 6 und 100 µL der ‑Aufklärung Lösung (+) SOD oder (+) AO Spalten 7 bis 12 in der 96-Well-Platte hinzufügen. Verwenden Sie Zeilen G und H wird als Hintergrund-Kontrollen (d. h.Änderung überwachen in Absorption in das Reagenz allein im Brunnen ohne Zellen).
  7. Messung der Extinktion bei 600 nm mit Spektralphotometer alle 10 min für 1 h quantifizieren die Änderung der Extinktion relativ zum Steuerelement bei 60 min Schritten 1.9 1.13 ähnlich.

3. Ermittlung der ob reduzierte Elektronen Akzeptoren Substrate für AO oder SOD sind

  1. 5,436 mL PBS oder HBS fügen Sie 240 µL 10 mM WST-1 für eine Endkonzentration von 400 µM und 24 µL 5 mM PMS für eine Endkonzentration von 20 µM hinzu.
    1. Fügen Sie für ‑Aufklärung 60 µL 10 mM ‑Aufklärung, für eine Endkonzentration von 100 µM zu 5,940 mL PBS oder HBS hinzu.
  2. Hinzufügen von 100 µL Lösung jeweils gut in eine flach-Boden-96-Well-Platte in der Abwesenheit von Zellen und Messen Sie die Absorption in einem Spektrophotometer bei 438 nm für WST-1 oder 600 nm für ‑Aufklärung.
  3. 1 µL 10 mM Ascorbat hinzu kommt die Hälfte der Brunnen für eine Endkonzentration von 100 μM. Überwachen Sie die Extinktion, bis es stabilisiert.
  4. Nach Stabilisierung 1 µL 200 U/mL AO für eine Endkonzentration von 2 U/mL in jede Vertiefung oder fügen Sie 1 µL 6 kU/mL SOD für eine Endkonzentration von 60 U/mL für jeden gut und überwachen die Extinktion für 1 h hinzu.

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Representative Results

Statistiken wurden mit ANOVA mit wiederholten Messungen mit RStudio Statistiksoftware25durchgeführt. Stichprobengrößen entnehmen Sie bitte der Abbildung Legenden.

Um tPMET zu überwachen, wurden C2C12 Myotubes zusammen mit extrazellulären Elektronen Akzeptoren, WST-1 und ‑Aufklärung eingesetzt. AO wurde verwendet, um festzustellen, welcher Teil der WST-1 und ‑Aufklärung Reduktion wurde durch Ascorbat Ausfluss und SOD wurde verwendet, um festzustellen, welcher Teil der WST-1 Reduktion durch extrazelluläre Superoxid-Veröffentlichung war. Wie in Abbildung 2gezeigt, können C2C12 Myotubes tPMET wie durch die Reduktion der WST-1 zu sehen. Mit dem Zusatz von AO wurde WST-1 Reduzierung von ~ 30 % darauf hinweist, dass ~ 30 % der tPMET durch den Export von Ascorbat (Abbildung 2A) unterdrückt. Mit dem Zusatz von SOD wurde WST-1 Reduzierung von ~ 70 %, darauf hinweist, dass ~ 70 % der tPMET durch extrazelluläre Superoxid-Version (Abb. 2 b) unterdrückt. ‑Aufklärung Reduktion wurde unterdrückt, wenn ‑Aufklärung als eine extrazelluläre Elektron Akzeptor mit dem Zusatz von AO genutzt wurde, über 100 % (Abbildung 3). Dies warf Fragen hinsichtlich der Gültigkeit der mit ‑Aufklärung AO um Beitrag von Ascorbat zu bewerten.

Um zu untersuchen, ob reduzierte WST-1 ein Substrat für AO oder SOD ist, verringerte WST-1 mit Ascorbinsäure. AO oder SOD wurde hinzugefügt, und die Extinktion wurde überwacht. Nach 1 h gab es keine Änderung der Extinktion zwischen die reduzierte Form des WST-1 ohne AO oder SOD und die reduzierte Form des WST-1 mit AO oder SOD (Abbildung 4A, B). Daher reduzierte WST-1 ist kein Substrat für diese Enzyme und die Verwendung von AO oder SOD in Verbindung mit WST-1 eignet sich zur Beurteilung der Rollen von Ascorbat oder Superoxid, beziehungsweise.

Um festzustellen, ob reduzierten ‑Aufklärung ein Substrat für AO oder SOD ist wurde ‑Aufklärung mit Ascorbinsäure reduziert. Nach 20 min AO wurde hinzugefügt, und die Extinktion wurde überwacht. Reduzierte ‑Aufklärung wurde gezeigt, ein Substrat für AO, wie in Abbildung 5A, wo ‑Aufklärung in seiner oxidierten Form innerhalb von 40 Minuten zurückkehrt. Als SOD hinzugefügt wurde, war ‑Aufklärung auch wieder oxidiert (Abb. 5 b). Reduzierten ‑Aufklärung ist daher ein Substrat für diese Enzyme und keine entsprechende extrazelluläre Elektron Akzeptor mit diesen Enzymen genutzt werden.

Figure 1
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Schlüsseletappen des Assays Elektronentransport und Bestimmung der enzymatischen Interaktionen mit der extrazellulären Elektronen-Akzeptoren. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: die Zugabe von AO und SOD unterdrückt WST-1 Reduzierung von C2C12 Myotubes. (A) tPMET wurde analysiert, 60 min mit 400 µM WST-1 und 20 µM PMS mit dem Zusatz von 2 U/mL AO oder DiH2O (N = 18/Gruppe). (B) tPMET wurde für 60 min mit dem Zusatz von 60 U/mL SOD oder 0,1 M KPO4 Puffer analysiert (N = 36/Gruppe). p≥ 0,05 zum angegebenen Zeitpunkt. Fehlerbalken darzustellen Standardfehler des Mittelwerts und möglicherweise zu klein, um sichtbar zu machen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: die Zugabe von AO unterdrückt ‑Aufklärung Reduktion von C2C12 Myotubes. tPMET wurde analysiert, für 60 min. mit 100 µM ‑Aufklärung, mit oder ohne Zusatz von 2 U/mL AO (N = 36/Gruppe). p≥ 0,05 zum angegebenen Zeitpunkt. Fehlerbalken darzustellen Standardfehler des Mittelwerts und möglicherweise zu klein, um sichtbar zu machen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: reduzierte WST-1 ist kein Substrat für AO oder SOD. (A) WST-1 wurde mit Ascorbat reduziert. Nach 45 min AO wurde hinzugefügt, und die Extinktion wurde für 1 h überwacht. Keine Änderung der Extinktion wurde beobachtet. (B) das Verfahren ist dasselbe wie oben, außer SOD nach 45 min hinzugefügt wurde. Keine Änderung der Extinktion wurde beobachtet (N = 24/Gruppe). Fehlerbalken darzustellen Standardfehler des Mittelwerts und möglicherweise zu klein, um sichtbar zu machen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5: reduzierte ‑Aufklärung ist ein Substrat für AO und SOD. (A) ‑Aufklärung mit Ascorbat reduziert wurde. Nach 20 min AO wurde hinzugefügt, und die Extinktion wurde überwacht. Innerhalb von 40 Minuten kehrte die Proben zu ihrer ursprünglichen Extinktion, darauf hinweist, dass reduzierte ‑Aufklärung Substrat für AO. (B) ‑Aufklärung wurde mit Ascorbat reduziert. Nach 20 min SOD wurde hinzugefügt, und die Extinktion wurde überwacht. Im Laufe der Zeit reduzierte ‑Aufklärung war wieder oxidiert, darauf hinweist, dass reduziert ‑Aufklärung ist ein Substrat für SOD (N = 24/Gruppe). Fehlerbalken darzustellen Standardfehler des Mittelwerts und möglicherweise zu klein, um sichtbar zu machen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 6
Abbildung 6: Schematische Darstellung der tPMET. In diesem Modell der tPMET reduzieren Ascorbat (oder ein anderes Elektron Träger) von der Zelle exportiert extrazelluläre PMS. Darüber hinaus generieren NADPH oxidasen extrazelluläre Superoxid, die WST-1 direkt zu reduzieren oder reduzieren sie indirekt durch Reduzierung von PMS. Elektronen von anderen Gebern Plasmamembran können auch PMS, verringern die Elektronen WST-1 oder O2 mit nachträglichen WST-1 Reduzierung Spenden können. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Wir haben zwei Methoden zur Nutzung von extrazellulären Elektronen Akzeptoren, WST-1 und ‑Aufklärung, in spektralphotometrische Untersuchungen zur Überwachung von tPMET in C2C12 Myotubes vorgestellt. Mit dem Wachstum von Zelllinien im standard Kultur Verfahren und ein Spektralphotometer Platte Leser ist es möglich, tPMET mit dieser Elektronen-Akzeptoren in einem einfachen Mikrotestplatte Assay zu überwachen. WST-1 Reduzierung ist reproduzierbar aus Brunnen, Brunnen in einen Test, aber es gibt tägliche Variabilität. Die täglichen Variationskoeffizienten (CV) Verwendung von PBS als Puffer ist 0,18 und die CV HBS nutzen, da der Puffer 0,23 ist.

Aus der bisherigen Literatur Nutzung von Komponenten und WST-1 haben wir dieses Protokolls, insbesondere für den Einsatz von PMS geändert. So Fehlerbehebung enthalten, Bestimmung der entsprechenden Konzentrationen von PMS und WST-1 für die Verwendung mit der Myotubes beschrieben. Wir bestimmt auch, dass die Temperatur (in einem Bereich von 23-37 ° C) ist keine kritische Komponente für den Assay, schütteln die Platte vor jeder Messung der Extinktion ist zwar wichtig. Jedoch sollten diese Probleme für andere Zelllinien untersucht werden, auf denen der Test angewendet wird. Feststellungen in Bezug auf die Fähigkeit der SOD und AO, reduzierte WST-1 direkt oxidieren zufolge Screening Assay-Neuteile für diese Eigenschaft ist ein zentraler Aspekt der Fehlerbehebung.

Unsere Daten legen nahe, dass PMS in Verbindung mit WST-1 genutzt werden sollten, um optimale WST-1 Reduzierung zu entlocken. Wir fanden, dass in einem Volumen von 1 mL, 100 µM Ascorbat 322 Nmol WST-1 pro Minute im Beisein von PMS, die für direkte Reduzierung der WST-1 durch Ascorbat benötigt wird reduziert. In einem 1 mL Volumen oxidiert 2 U/mL AO Ascorbat in Höhe von 4.400 Nmol/s bzw. 800-mal schneller als die Verringerung der WST-1 durch Ascorbat. Klar, ist die enzymatische Aktivität von AO viel schneller als Direktreduktion von PMS/WST-1 durch Ascorbat. Wir erwarten, dass das gleiche für Superoxid und SOD, folgen würden, wenn wir nicht über ein System zur Messung der absoluten Rate der WST-1 Reduzierung von Superoxid.

Um festzustellen, ob die Aufnahme von PMS wirkt sich auf die Reduzierung der WST-1 von Superoxid, verwendeten wir ein Xanthin-Oxidase (4,5 mU/mL) / Hypoxanthin (0,1 mM) Superoxid generieren System wie oben beschrieben26,27. Einbeziehung von PMS verdoppelt ungefähr die Rate der WST-1 Reduzierung von diesem System. So scheint es, dass PMS Übertragung von Elektronen von Superoxid zu WST-1 vermittelt.

Um das Erfordernis der PMS für zelluläre WST-1 Reduktion weiter zu bewerten, wir untersucht Reduktion in das Vorhandensein oder Fehlen von PMS und WST-1, und festgestellt, dass PMS für zelluläre WST-1 Reduzierung erforderlich ist. Wenn Zellen in Assay Reagenz mit PMS (in Abwesenheit von WST-1) allein ausgebrütet werden, gibt es eine Zunahme der Extinktion bei 438 nm. Dies ist wahrscheinlich eine Ansammlung von Semiquinone Form von PMS (PMS-SQ), die eine Spitze Absorption bei 440 nm28hat. Ansammlung von PMS-SQ legt nahe, dass PMS reduziert wird schneller Elektronen an O2 Superoxid produzieren übergeben werden können. So ist die Ansammlung von PMS-SQ konsistent mit der gemeldeten langsame Reduzierung der O2 von PMS-SQ-verglichen mit der Rate für vollständig reduziert PMS28.

Wir stellten auch ein Protokoll, um festzustellen, ob die Elektronen-Akzeptoren Substrate für die Enzyme, die genutzt werden können sind, um tPMET zu überwachen. Durch die Überwachung der Reduzierung der extrazellulären Elektronen-Akzeptoren in einem Spektrophotometer, gefolgt durch die Zugabe des Enzyms von Interesse, ist es möglich, festzustellen, ob die Elektronen-Akzeptor ein Substrat für diese Enzyme ist. Durch diese Methode haben wir gezeigt, dass reduzierte ‑Aufklärung ein Substrat für AO und SOD, die darauf hinweist ist, dass es keine geeignete Elektron Akzeptor für die Überwachung von Ascorbat Ausfluss und Superoxid Export.

Das Verfahren für die Prüfung, ob Assay Komponenten wie SOD oder AO Artefakte zu schaffen ist eine deutliche Verbesserung gegenüber bestehenden Methoden. Reduzierten ‑Aufklärung ist beispielsweise ein Substrat für SOD, was darauf hindeutet, dass veröffentlichten Daten bei Verwendung von ‑Aufklärung und SOD entsprechend auszulegen ist. Unsere Ergebnisse unterstützen frühere Untersuchungen unter der Leitung von Dayan und Dawson, in denen die Absorption von Leuco 2,6-Dichloroindophenol wurde nach der Zugabe von AO überwacht: ‑Aufklärung war oxidiert, darauf hinweist, dass es ein Substrat für AO29. Aber addieren unsere Ergebnisse Kontext für die Forschung von Tan und Berridge24sowie Bellavite Et Al. durchgeführt 30, verwendet, die SOD ‑Aufklärung Reduktion zu hemmen. In einer Studie unter der Leitung von Tan und Berridge, vergleicht man die Elektronen-Akzeptoren WST-1, ‑Aufklärung und FeCN in HeLa-Zellen sahen sie, dass die Reduzierung von einigen der Elektronen-Akzeptoren im Beisein von SOD unterdrückt wurde. Die Reduzierung der WST-1, in Verbindung mit Komponenten, war gehemmt ~ 80 % in Anwesenheit von SOD, während die Reduzierung des ‑Aufklärung um 40 % gehemmt wurde. Die Reduzierung der FeCN, in Verbindung mit einer alternative zwischen Elektron Akzeptor wurde im Beisein von SOD24nicht gehemmt. Beim Auswerten des Modus des Elektrons Austausch zwischen NADPH oxidasen und ‑Aufklärung oder Cytochrom c, Bellavite Et Al. fanden, dass ‑Aufklärung und Cytochrom c werden durch oxidasen NADPH reduziert und dass diese Reduktion von SOD30deutlich gehemmt wird. Berridge und Tan haben außerdem gezeigt, dass SOD WST-1 Reduzierung um 80 % Mauslinien Zellen J774, 32Dcl23 und WEHI3B, sowie humanen Zelllinien Jurkat, MALME3M und 143B6,31hemmen kann. Mit humanen primären Neutrophilen Zellen war WST-1 Reduktion gehemmt 95 % in Anwesenheit von SOD6,32.

Hier die Daten legen nahe, dass es ist wichtig, um sicherzustellen, dass Enzyme verwendet, um bestimmte Beiträge der exportierte Moleküle tPMET bewerten die reduzierte Form der extrazellulären Elektron Akzeptor wieder oxidieren können nicht. Wir fanden, dass Eisen chlorid (Daten nicht gezeigt) und Eisensulfat nicht löslich in PBS. HBS und Phenol rotfrei-DMEM wurden sie schnell oxidiert, Inkompatibilität mit HBS oder DMEM als Assay Medien demonstrieren. Im Gegensatz dazu verwenden AO SOD nicht und Kaliumferrocyanid als Substrat, darauf hindeutet, dass es eine geeignete extrazelluläre Elektronen-Akzeptor ist seine geringe Aussterben Koeffizient kein Problem.

Die wichtigsten Einschränkungen des Assays gehört, dass PMS/WST-1 und ‑Aufklärung reduziert werden, indem mehrere Elektron Spender, wie NAD (P) H, Ascorbat und Flavonoide wie Quercetin und Myricetin19,33,34. Dies kann jedoch überwunden werden, durch den Zusatz von Enzymen (z. B. SOD, AO) oder Inhibitoren zu bestimmte Beiträgen zu Verringerung der PMS/WST-1 oder ‑Aufklärung zu bestimmen. Eine weitere Einschränkung ist, dass ‑Aufklärung als Substrat für AO und SOD handeln kann. So sollte diese Enzyme nicht in Verbindung mit ‑Aufklärung zur tPMET Überwachung genutzt werden. Eine weitere wichtige Einschränkung dieser Studie ist die Fähigkeit von PMS und anderen Redox-Cycler, Superoxid26,35,36zu produzieren. Dies ist in Abbildung 6dargestellt. Auf der anderen Seite, PMS selbst hat angeblich keinen direkten Einfluss auf tPMET32. Darüber hinaus haben Tan und Berridge32 gezeigt, dass der NADPH-Oxidase (NOX)-Inhibitor, Diphenyleneiodinium Chlorid (DPI), unterdrücken, kann die Mehrheit der WST-1 Reduzierung darauf hindeutet, dass DPI-Sensitive tPMET eine spezifische Aktion der NOX-Beitrag sein kann zu tPMET. Eine weitere Einschränkung ist, dass wir kleine Änderungen in der Extinktion bei der Verwendung von WST-1. Wir haben festgestellt, dass wenn WST-1 frisch zubereitet ist und Zellen konfluierende sind, die größte Änderung der Extinktion gesehen wird. Frühere Studien, die in P388-Zell-Linien haben gezeigt, dass die Menge an Formazan produziert positiv mit Zelle Nummer21 korreliert. Deshalb, je mehr konfluierende sind die Zellen dann umso größer der Rückgang der WST-1. Dies kann für durch die Normalisierung auf Mikrogramm Protein für jedes gut korrigiert werden.

Eine Einschränkung hinsichtlich dieser Assay ist, dass es in erster zur globalen tPMET zu beurteilen Linie. Obwohl es bearbeitet werden kann, um mehrere Formen der tPMET, wie das Beispiel von Ascorbat Efflux überwachen könnten spezifischere Tests besser geeignet, wenn das Ziel keine Messungen im Rahmen des tPMET erforderlich ist. Fuchs Beispiel, wenn Superoxid das Hauptinteresse ist, gibt es eine Reihe von anderen Möglichkeiten, Superoxid, wie z. B. Verwendung von fluoreszierenden undurchlässig Sonden, Aconitase, einschl. Nitroblue tetrazoliumsalz37-Sonden zu überwachen.

Bestehende Sonden, tPMET wie ‑Aufklärung, FeCN und Ferricytochrome c, gegenwärtige Nachteile zu überwachen. Zum Beispiel reduzierte ‑Aufklärung ist ein Substrat für AO und SOD, FeCN hat einen niedrige molare Aussterben-Koeffizienten, der ihre Nützlichkeit in Echtzeit-Assays begrenzt und Cytochrom c ist teuer. Darüber hinaus können einige dieser Sonden hohen Hintergrund was zu geringe Empfindlichkeit, wenn eine Änderung der Extinktion32Messen produzieren. WST-1 hat sich gezeigt, um kein Substrat für Enzyme wie AO und SOD. Darüber hinaus hat WST-1 eine hohe molare Aussterben Koeffizienten und eine niedrige Hintergrund Reaktion, erstellen einen empfindlicheren tPMET Assay. Nach vorne verschieben, kann dieser Assay genutzt werden, mit einer breiten Palette von Inhibitoren, besser verstehen den Prozess der tPMET, den Weg der Elektronentransport in einer bestimmten Zelle Linie zuordnen und führen zu einem besseren Verständnis der wie eine Zelle Redox-Umgebung aufrechterhalten wird.

Wichtige Schritte dieses Protokolls gehören feststellend, dass die Zellen bereit für Experimente (~ 70 % Zusammenfluss sind) sowie Assay Reagenzien, speziell WST-1 und PMS, frisch für jeden Test zu machen. Es ist auch wichtig, die Zellen vor der Zugabe von Assay Reagenzien zu waschen. Die DMEM genutzt in diesem Protokoll enthält keine Ascorbat, obwohl wir Differenzierung Medium mit Ascorbat ergänzen. Eine Reihe von verfügbaren Medien enthalten Ascorbat. Jedoch werden die Zellen vor der Zugabe der Reagenzien Assay, gewaschen, die Ascorbat-kostenlos, um alle verbleibenden Ascorbat vom Medium zu entfernen sind. Da ein Teil des tPMET auf molekularer Efflux (z. B. Ascorbat Export) zurückzuführen ist, ist es wichtig, Photometrische Messungen unmittelbar nach der Zugabe von Assay Reagenz nicht zu verpassen die ersten Momente der Fluth beginnen. Darüber hinaus ist es wichtig, Hintergrund Brunnen für jedes einzelne Reagenz in einem Experiment gehören. Der Assay-Bestandteile, die in diesem Dokument beschriebenen verursacht vernachlässigbar Hintergrundänderung in Absorption. Jedoch können einige Zusätze (z. B. Phloretin) eine substanzielle Hintergrund Reaktion fördern. Daher ist es wichtig, dass Hintergrund heraus subtrahiert wird, wenn die Daten analysiert werden, um keine verwirrende Effekte zu beseitigen, die die Reagenzien selbst produzieren können.

Zusammenfassend lässt sich sagen das Protokoll hier vorgestellten bietet ein Mittel zur Bewertung der tPMET und schlägt eine Reihe von Einschränkungen und Aspekte des Protokolls, die berücksichtigt werden sollten, bei der Anwendung des Tests auf verschiedenen Zelllinien und/oder Bewertung von bestimmten Autoren ( Ascorbat und Superoxid hier verwendet), tPMET.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Wir möchten Neej Patel, Thomas Bell, Lyn Mattathil und Mark Mannino für ihre technische Unterstützung zu danken. Diese Arbeit wurde von United States Public Health Service Award R15DK102122 vom National Institute of Diabetes und Magen-Darm und Niere-Krankheiten (NIDDK), Jonathan Fisher unterstützt. Der Manuskript-Inhalt ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung der NIDDK oder die National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C2C12 myoblasts American Type Culture Collection  CRL-1772
Dulbecco's modified eagle's medium - low glucose Sigma D6046
Fetal Plex animal serum complex Gemini Bio-Products  100-602
penicillin-streptomycin Sigma 516106
horse serum Gibco Technologies 16050-130
Dulbecco's phosphate buffered saline Sigma D8537
trypsin-EDTA Sigma T4049
15 cm culture dishes TPP 93150
96 well culture plates TPP 92096
2-(4-Iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium Sodium Salt (WST-1) Accela ChemBio  Inc SY016315
phenazine methosulfate  Sigma P9625
L-ascorbic acid Sigma A5960
ascorbate oxidase  Sigma A0157
superoxide dismutase  Sigma S5395
2,6-dichloroindophenol sodium salt  ICN Biomedicals 215011825
D-(+)-glucose Sigma G7528
HEPES sodium salt Sigma H3784
sodium chloride Sigma S7653
potassium chloride Fisher Scientific  BP366
magnesium sulfate heptahydrate Sigma M5921
calcium chloride dihydrate Sigma C7902
potassium phosphate Fisher Scientific  BP363
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific 23225
Powerwave X-I spectrophotometer Biotek Insturments discontinued 
Spectronic Genesys 5 Spectrophotometer Thermo Scientific 336001
PureGrade 96-well microplate, F-bottom, clear, untreated, non-sterile MidSci 781602
Iron (II) chloride tetrahydrate Sigma 220299
Iron (II) sulfate heptahydrate Sigma 215422
hypoxanthine Sigma H9636
xanthine oxidase Sigma X4500
Excel Microsoft
R Studio Rstudio https://www.rstudio.com/products/rstudio/
KC4 Biotek Insturments discontinued 

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Biochemie Ausgabe 135 tPMET WST-1 ‑Aufklärung Ascorbat Superoxid C2C12 Myotubes spektralfotometrische Assay
Messung der Trans-Plasma Membran Elektronentransport durch C2C12 Myotubes
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Kelly, S. C., Eccardt, A. M.,… More

Kelly, S. C., Eccardt, A. M., Fisher, J. S. Measuring Trans-Plasma Membrane Electron Transport by C2C12 Myotubes. J. Vis. Exp. (135), e57565, doi:10.3791/57565 (2018).

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