Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

מדידת הטרנס-פלזמה ממברנה אלקטרון תעבורה על-ידי C2C12 Myotubes

Published: May 4, 2018 doi: 10.3791/57565
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Biology, Saint Louis University
* These authors contributed equally

Summary

המטרה של פרוטוקול זה היא לפקח spectrophotometrically טרנס-פלזמה ממברנה אלקטרון תחבורה ניצול אלקטרון חוץ-תאית acceptors לנתח אנזימטי אינטראקציות העלולות להתעורר עם אלה acceptors אלקטרון חוץ-תאית.

Abstract

טרנס-פלזמה ממברנה אלקטרון תחבורה (tPMET) ממלא תפקיד הגנה על תאים מלחץ חותכות תאיים, כמו גם הגנה מפני נזק על ידי חמצון חוץ-תאית. תהליך זה של העברת אלקטרונים תאיים reductants כדי חמצון חוץ-תאית אינה מוגדרת היטב. כאן אנו מציגים מבחני spectrophotometric על ידי C2C12 myotubes לעקוב אחר tPMET ניצול acceptors את האלקטרונים חוץ-תאית: tetrazolium מסיסים במים מלח-1 (WST-1) ו- 2, 6-דיכלורופנול אינדופנול (DPIP או DCIP). באמצעות הפחתה של acceptors אלקטרונים אלה, אנו מסוגלים לעקוב אחר התהליך בניתוח בזמן אמת. עם התוספת של אנזימים כגון ascorbate אוקסידאז (AO), סופראוקסיד דיסמוטאז (SOD) מבחני, אנחנו ניתן לקבוע איזה חלק של tPMET עקב ייצור ייצוא או סופראוקסיד ascorbate, בהתאמה. בעוד WST-1 הוצגה כדי להפיק תוצאות יציב עם רקע נמוך, DPIP היה יכול להיות מחומצן מחדש לאחר התוספת של אאו, עשב, אשר הודגם עם ניתוח spectrophotometric. שיטה זו ממחישה assay spectrophotometric בזמן אמת, רב טוב, מהיר, עם יתרונות על פני שיטות אחרות ששימשו לעקוב אחר tPMET, כגון ferricyanide (FeCN) וצמצום c ferricytochrome.

Introduction

היכולת של ממברנות פלזמה מטוהרים להפחית אלקטרון acceptors הוביל התצוגה כי קרום פלזמה יש קיבולת של חמצון-חיזור הגלום1. ראיתי בעבר פטריות, צמחים, בעלי חיים, tPMET הוא תהליך משותף ל4,3,2,אורגניזמים מספר5. באופן ספציפי, תהליך זה הוכח שמר האפייה, בתאים הגזר, אריתרוציטים, לימפוציטים, אוסטאוסרקומה, מלנומה, מקרופאגים, שרירי השלד ו נויטרופילים2,3, 4 , 5 , 6 , 7. בתהליך כי המשלוחים אלקטרונים על פני קרום פלזמה כדי להפחית את חמצון חוץ-תאית, tPMET מעורב תאיים רבים, לרבות: תא-צמיחה-5,-8, תא הכדאיות9, ברזל חילוף החומרים10, התא איתות11,12,13, והגנה מפני14,12,מינים חמצן תגובתי15. בשל מעורבותו של tPMET תאיים רבים, חוסר איזון של tPMET יש כבר המשוערות לתרום להתפתחות של כמה מצבים בריאותיים חמורים, כולל סרטן16, מחלות לב וכלי דם17, וחילוף תסמונת18.

יש דרכים רבות כדי לפקח על העברת אלקטרונים על פני קרום פלזמה, אך הטכניקה הנפוצה ביותר היא להעריך את ההפחתה של אלקטרון חוץ-תאית acceptors באמצעות מבחני ערכי צבע מוחלטים. Acceptors אלקטרון חוץ-תאית נפוצים הם מלחי tetrazolium, DPIP, FeCN c19,ferricytochrome20. המלח tetrazolium הנפוץ ביותר הוא ידוע מלח הדור השני WST-119. תרכובת זו קל לנצל מבחני ערכי צבע מוחלטים לעומת הדור הראשון מלחי tetrazolium עקב שתי קבוצות סולפונאט, אשר מגבירים את מסיסות המים21. WST-1, בשילוב עם methosulfate 1-מתוקסי-phenazine מקבל אלקטרון ביניים (mPMS), מצטמצם העברת אלקטרונים יחיד שני אירועים. הפחתה זו משתנה מחמצנים את חלש בצבע של WST-1 ל-20,formazan יותר אינטנסיבי, צהוב22. WST-1 יש מקדם גבוה הכחדה טוחנת של 37 x 103 מ-1ס מ-1, שמוביל וזמינותו גבוהים רגישות21,22. DPIP הוא מנוצל גם כמאשר אלקטרון חוץ-תאית לעקוב אחר tPMET. הוכח, כי DPIP יכול להיות מופחת extracellularly על ידי tPMET בלי הסיוע של אלקטרון ביניים acceptors23,24. עקב חוסר acceptors אלקטרון ביניים, DPIP יכול ישירות איסוף אלקטרונים של קרום פלזמה, בניגוד WST-124. בדומה DPIP, FeCN הוכח להיות מופחת extracellularly כדי ferrocyanide על ידי tPMET בלי הסיוע של אלקטרון ביניים acceptors19,24. בניגוד WST-1 ו- DPIP, FeCN יש מקדם נמוך הכחדה טוחנת המוביל אל רגישות וזמינותו נמוכה9. מקבל אלקטרון חוץ-תאית נפוץ אחר לעקוב אחר tPMET הוא ferricytochrome ג בדומה WST-1, ferricytochrome מגביר הפחתת c עם השימוש של מקבל אלקטרון ביניים, mPMS22. אבל בניגוד WST-1 בשיטת c ferricytochrome הוא פחות רגיש בשל רקע גבוה ואת מקדם נמוך הכחדה טוחנת22.

כאן אנו מציגים שיטה לניתוח בזמן אמת של tPMET באמצעות מבחני spectrophotometric. השיטה ניצלה את acceptors חוץ-תאית אלקטרון WST-1 ו- DPIP, כפי לשניהם יש מקדם גבוה הכחדה טוחנת בזמן להיות פחות יקר בהשוואה למטבע האחר נפוץ בשימוש acceptors חוץ-תאית אלקטרונים כגון ferricytochrome c. אנחנו מנוצל phenazine methosulfate (PMS) במקום mPMS יש להם האיפור כימי דומה ו PMS הוא הרבה פחות יקר. mPMS הוא יציב photochemically שהוא מאפיין חשוב עבור ערכת מסחרי צריך חיי מדף ארוכים. עם זאת, אנו עושים PMS טריים עבור כל assay, כך יציבות לא צריך להיות בעיה. אנו מציגים גם שיטה להערכת אנזימטי האינטראקציות האפשריות (ראה איור 1) בין אלקטרון חוץ-תאית מקבל אנזימים היכולה לשמש לאפיין עוד יותר את התהליך של tPMET. באופן ספציפי, אנזימים AO ו- SOD יכול לשמש לקבוע איזה חלק של tPMET הוא ascorbate תחבורה או שחרור סופראוקסיד חוץ-תאית, שתי שיטות נפוצות האלקטרונים להיות מועבר על-פני קרום פלזמה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: ראה איור 1 סקירה סכמטי של השלבים החשובים.

1. WST-1 צמצום Assay

  1. לגדול, להבדיל C2C12 תאים חסיד באמצעות תא סטנדרטי לתרבות הליכים7 בצלחת 96-ובכן ניצול שורות A-F.
    1. השתמש מדיום בידול בהיקף בינוני (DMEM ששינה הנשר של Dulbecco) בתוספת 2% הסוס סרום, פניצילין U/mL 100 ו- 0.1 מ"ג/מ"ל סטרפטומיצין. דגירה התאים ב 37 ° C עם 5% CO2.
    2. בעת פיקוח על ascorbate מעורבות tPMET, תוספת בידול מדיה בחומצה אסקורבית 100 מיקרומטר. לאפשר לתאים דגירה בתקשורת בידול עבור ~ 24-48 שעות.
  2. להכין מלאי פתרונות WST-1 ו- PMS.
    1. כדי להפוך את מלאי 10 מ מ של WST-1, להמיס 0.033 גר' WST-1 (הנוסחה משקל (FW): g 651.34/mol) ב 5 מ של פוספט buffered תמיסת מלח (PBS). חנות ב 4 º C.
    2. כדי להפוך את מלאי 5 מ מ של PMS, להמיס 0.0023 גר' PMS (FW: g 306.34/mol) ב- 1.5 מ"ל של יונים H2O (לשכפל2O). לאחסן ב-20 ° C, להגן מפני אור.
  3. להוסיף 0.0108 גר' גלוקוזה עבור ריכוז הסופי של 5 מ מ ל 11.4 של PBS או HEPES buffered תמיסת מלח (HBS; 20 מ מ HEPES נתרן מלח, 140 מ מ NaCl, 5 מ מ אשלגן כלורי, 2.5 מ מ MgSO4, 1 מ"מ CaCl2). הוסף µL 480 10 מ מ WST-1 עבור ריכוז סופי של מיקרומטר 400 ו- 48 µL של 5 מ מ PMS עבור ריכוז סופי של 20 מיקרומטר.
  4. בעת פיקוח על ascorbate מעורבות tPMET, לחלק את הפתרון aliquots 6 מ ל שני. Aliquot אחד, להוסיף 6 µL של לשכפל2O ולחצו aliquot אחרים להוסיף 6 µL של 2 kU/mL אאו עבור ריכוז סופי של 2 U/mL.
  5. בעת פיקוח על מעורבות סופראוקסיד tPMET, לחלק את הפתרון aliquots 6 מ ל שני. כדי aliquot אחד, להוסיף µL 55 0.1 M KPO4 מאגר ולהוסיף את aliquot אחרים µL 55 של 6.5 kU/mL SOD עבור ריכוז סופי של 60 U/mL.
  6. לשטוף את התאים עם PBS. האחות התקשורת ולהוסיף 150 µL PBS. ואז מחוק לגמרי מגניב.
    הערה: הבדיקה מתבצעת באמצעות תאים מצופים, מצורף. לפיכך, אין שום צנטריפוגה או השימוש של טריפסין בתהליך הכביסה.
  7. להוסיף 100 µL של פתרון WST-1 (-) השתילות או (-) אאו לעמודות 1-6 ולהוסיף 100 µL של פתרון WST-1 (+) השתילות או (+) או על עמודות 7-12 בצלחת 96-ובכן. השתמש שורות G ו- H כפקדי רקע (קרי, לעקוב אחר שינוי בספיגת ב הכימית לבד בבארות ללא תאים).
  8. למדוד את הערכים ספיגת באמצעות ספקטרופוטומטרים את כל 10 דקות לשעה-438 ננומטר.
  9. אחרי הקריאה, תשאף בתקשורת ושוטפים כל טוב עם µL 150 ל- PBS. ואז מחוק לגמרי מגניב.
  10. לחשב את השינוי שחל ספיגת במשך כל על-ידי חיסור את ספיגת הראשוני עבור באר מ ספיגת בכל נקודת זמן על כך. תקן שינוי זה עבור שינוי ספיגת (אם בכלל) שנצפתה הבארות רקע (קרי, וולס עם פתרון assay אך לא תאים).
  11. לניתוח, לנרמל את הנתונים ספיגת למדידה שליטה 60 דקות או לשטוף וולס עם PBS או HBS ולאחר מכן לבצע bicinchoninic חומצה (BCA) חלבון וזמינותו.
  12. להוסיף 2 מ"ג/מ"ל אלבומין שור (BSA) תקן (נע בין 0.5-2 µL על העקומה רגיל, תלוי בדרגת זרימה של התאים) לבארות ריקות (שורות G ו- H), לאחר מכן להוסיף הכימית BCA כל בארות.
  13. לכמת את הנתונים באמצעות nmol של הפחתת WST-1 לכל µg של חלבון. שימוש 37 מ מ-1 ס מ-1 22 המקדם הכחדה עבור מופחתת WST-1-438 ננומטר.

2. DPIP הפחתת Assay

  1. לגדול, להבדיל C2C12 תאים חסיד עם ההליך אותו כשלב 1.1.
  2. להכין מלאי 10 מ מ DPIP פתרון כדלקמן. להמיס 0.029 גר' DPIP (FW: g 290.08/mol) ב- 10 מ"ל של לשכפל2O. אשר הריכוז של DPIP על ידי מדידת ספיגת על 600 nm עם ספקטרופוטומטרים. שימוש 1 מ-1 ס מ-1 23 המקדם הכחדה עבור DPIP מופחת ב 600 ננומטר. חנות ב 4 º C.
  3. להוסיף 0.0108 גר' גלוקוז 11.880 מ של PBS עבור ריכוז הסופי של 5 מ מ. להוסיף 120 µL 10 מ מ DPIP עבור ריכוז סופי של 100 מיקרומטר.
  4. בעת פיקוח על ascorbate מעורבות tPMET, לחלק את הפתרון aliquots 6 מ ל שני. Aliquot אחד, להוסיף 6 µL של לשכפל2O ולחצו aliquot אחרים להוסיף 6 µL של 2 kU/mL אאו עבור ריכוז סופי של 2 U/mL.
  5. בעת פיקוח על מעורבות סופראוקסיד tPMET, לחלק את הפתרון aliquots 6 מ ל שני. כדי aliquot אחד, להוסיף µL 55 0.1 M KPO4 מאגר ולהוסיף את aliquot אחרים µL 55 של 6.5 kU/mL SOD עבור ריכוז סופי של 60 U/mL.
  6. האחות התקשורת ולשטוף בתאים µL 150 ל- PBS. האחות של PBS ולהוסיף µL 100 DPIP פתרון (-) השתילות או (-) אאו לעמודות 1-6 ולהוסיף 100 µL DPIP פתרון (+) השתילות או (+) או על עמודות 7-12 בצלחת 96-ובכן. השתמש שורות G ו- H וויל כפקדי רקע (קרי, לעקוב אחר שינוי בספיגת ב הכימית לבד בבארות ללא תאים).
  7. למדוד את ספיגת ב 600 nm באמצעות ספקטרופוטומטרים כל 10 דקות עבור ה 1 לכמת את השינוי שחל ספיגת ביחס הפקד בחלק הדומה צעדים 1.9-1.13 60 דקות.

3. קביעת האלקטרון מופחת Acceptors סובסטרטים אאו או עשב

  1. 5.436 מ של PBS או HBS, להוסיף 240 µL 10 מ מ WST-1 עבור ריכוז סופי של מיקרומטר 400 ו- µL 24 של 5 מ מ PMS עבור ריכוז סופי של 20 מיקרומטר.
    1. עבור DPIP, להוסיף µL 60 10 מ מ DPIP, עבור ריכוז סופי של 100 מיקרומטר, 5.940 מ של PBS או HBS.
  2. להוסיף 100 µL של פתרון אחד טוב בצלחת 96-ובכן שטוח התחתונה בהיעדרו של תאים ולמדוד את ספיגת בספקטרופוטומטר-438 nm, עבור WST-1, או 600 nm, עבור DPIP.
  3. להוסיף חצי מן הבארות עבור ריכוז סופי של 100 μM µL 1 של 10 מ מ ascorbate. נטר את ספיגת עד זה מייצבת.
  4. על ייצוב, להוסיף 1 µL של 200 U/mL אאו עבור ריכוז סופי של 2 U/mL מכל קידוח או להוסיף 1 µL של קו 6/השתילות mL עבור ריכוז סופי של U/mL 60 לכל טוב ולנטר את ספיגת לשעה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

סטטיסטיקה בוצעו עם ANOVA באמצעים חוזרות באמצעות תוכנה סטטיסטית RStudio25. גודל מדגם הם הצביעו על האגדות איור.

כדי לפקח על tPMET, C2C12 myotubes נוצלו יחד עם acceptors אלקטרון חוץ-תאית, WST-1 ו- DPIP. אאו שימש כדי לקבוע איזה חלק של WST-1 ו DPIP הפחתת נבע ascorbate בזרימת SOD שימש כדי לקבוע איזה חלק של הפחתת WST-1 היה עקב שחרור סופראוקסיד חוץ-תאית. כפי שמוצג באיור2, C2C12 myotubes מסוגלים tPMET כפי שנראה על ידי צמצום WST-1. עם התוספת של אאו, הפחתת WST-1 דוכאה על ידי ~ 30% המציין כי ~ 30% של tPMET היה בשל הייצוא של ascorbate (איור 2 א). עם התוספת של SOD, הפחתת WST-1 דוכאה על ידי ~ 70%, המציין כי ~ 70% tPMET היה בשל שחרור סופראוקסיד חוץ-תאית (איור 2B). כאשר DPIP היה מנוצל כמאשר חוץ-תאית אלקטרון עם התוספת של אאו, הפחתת DPIP דוכאה מעל 100% (איור 3). זה העלה שאלות לגבי תוקפן של שימוש DPIP עם אאו כדי להעריך את התרומה של ascorbate.

לבדוק WST מופחתת-1 הוא מצע אאו או עשב, צומצם WST-1 עם חומצה אסקורבית. אאו או עשב נוספה ולאחר ספיגת היה במעקב. אחרי ה' 1, היה שינוי. ספיגת בין בצורת WST-1 ללא אאו או עשב מופחתת מופחתת בצורת WST-1 עם אאו או עשב (איור 4A, ב'). לכן, מופחתת WST-1 הוא לא מצע של אנזימים אלה, השימוש של אאו או עשב בשיתוף עם WST-1 הוא המתאים עבור הערכה של תפקידים של ascorbate או סופראוקסיד, בהתאמה.

כדי לקבוע אם DPIP מופחת מצע אאו או עשב, DPIP צומצם עם חומצה אסקורבית. לאחר 20 דקות, אאו נוספה ולאחר ספיגת היה במעקב. DPIP מופחת הוצגה להיות מצע של אאו, כפי שניתן לראות באיור 5A, איפה DPIP מחזירה לתבנית מחמצנים שלו בתוך 40 דקות. כאשר נוספה SOD, DPIP היה גם מחדש מחמצנים (איור 5B). לכן, DPIP מופחת הוא מצע אנזימים אלה, לא של מקבל אלקטרון חוץ-תאית המתאים כדי להיות מנוצל עם אנזימים אלה.

Figure 1
איור 1: ייצוג סכמטי של השלבים המפתח של מבחני אלקטרון תחבורה והנחישות של אינטראקציות אנזימטי עם acceptors אלקטרון חוץ-תאית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: התוספת של AO ו- SOD מדכאת את הפחתת WST-1 על-ידי C2C12 myotubes. (א) tPMET נותחו עבור 60 דקות באמצעות 400 מיקרומטר WST-1 ו- 20 מיקרומטר PMS עם התוספת של 2 U/mL אאו או לשכפל2O (N = 18/קבוצה). (B) tPMET נותחו עבור 60 דקות עם התוספת של 60 U/mL השתילות או 0.1 M KPO4 מאגר (N = 36/קבוצה). p≥ 0.05 בנקודת הזמן שצוין. קווי שגיאה מייצג את שגיאת התקן של הממוצע, וייתכן שהוא קטן מדי כדי להמחיש. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: התוספת של אאו מדכאת את הפחתת DPIP על ידי C2C12 myotubes. tPMET נותחו עבור 60 דקות באמצעות מיקרומטר 100 DPIP עם או בלי התוספת של 2 U/mL אאו (N = 36/קבוצה). p≥ 0.05 בנקודת הזמן שצוין. קווי שגיאה מייצג את שגיאת התקן של הממוצע, וייתכן שהוא קטן מדי כדי להמחיש. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: WST מופחתת-1 הוא לא מצע אאו או עשב. (א) WST-1 צומצם עם ascorbate. אחרי 45 דקות, אאו נוספה ולאחר ספיגת נוטרו לשעה. אין שינוי ספיגת נצפתה. (B) ההליך הוא בדיוק כמו לעיל, מלבד עשב נוספה לאחר 45 דקות. אין שינוי ספיגת נצפתה (N = 24/קבוצה). קווי שגיאה מייצג את שגיאת התקן של הממוצע, וייתכן שהוא קטן מדי כדי להמחיש. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5: DPIP מופחת הוא מצע עבור AO ו- SOD. (א) DPIP צומצם עם ascorbate. לאחר 20 דקות, אאו נוספה ולאחר ספיגת היה במעקב. בתוך 40 דקות, הדגימות חזרה ספיגת המקורי שלהם, המציינת כי מצע של אאו DPIP מופחת. DPIP (B) צומצם עם ascorbate. לאחר 20 דקות, SOD נוספה ולאחר ספיגת היה במעקב. במשך הזמן, DPIP מופחת היה מחדש מחמצנים, המציין כי מופחת DPIP הוא מצע של SOD (N = 24/קבוצה). קווי שגיאה מייצג את שגיאת התקן של הממוצע, וייתכן שהוא קטן מדי כדי להמחיש. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 6
איור 6: סכמטי המתאר tPMET. במודל זה של tPMET, ascorbate (או מטוס אלקטרון אחר) שיוצאו על ידי התא יכול להפחית PMS חוץ-תאית. בנוסף, ליצור nadph ל oxidases סופראוקסיד חוץ-תאית, אשר יכול להפחית WST-1 ישירות או להפחית אותה באופן עקיף באמצעות הפחתה של תסמונת קדם וסתית. אלקטרונים מתורמים אחרים קרום פלזמה ניתן גם להפחית PMS, אשר יכול לתרום אלקטרונים WST-1 או O2 עם הפחתת WST-1 עוקבות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הוצגו שתי שיטות ניצול אלקטרון חוץ-תאית acceptors, WST-1 ו- DPIP, במבחני spectrophotometric לעקוב אחר tPMET, C2C12 myotubes. עם הצמיחה של שורות תאים בהליכים תרבות רגיל, קורא צלחת ספקטרופוטומטרים, אפשרי לעקוב אחר tPMET עם אלה acceptors אלקטרונים ב וזמינותו microplate פשוט. צמצום WST-1 הוא לשחזור מכל טוב-כדי-טוב בתוך וזמינותו, אבל יש השתנות היומיומית. המקדם היומיומית של וריאציה (CV) ניצול PBS כמו המאגר הוא 0.18 את קורות חיים ניצול HBS כמו המאגר הוא 0.23.

מן הספרות הקודם mPMS וחומר WST-1, אנחנו ששינית פרוטוקול זה, במיוחד, לשימוש של תסמונת קדם וסתית. לכן, פתרון כולל לקביעת הריכוזים המתאים של PMS ותיאר WST-1 לשימוש עם myotubes. אנחנו נקבע גם כי הטמפרטורה (בטווח 23-37 מעלות צלזיוס) אינה מרכיב קריטי עבור וזמינותו, בזמן טלטול את הצלחת לפני כל הקריאה ספיגת חשוב. עם זאת, שיש לחקור נושאים אלה עבור שורות אחרות התא שעליו הוחל וזמינותו. הממצאים לגבי היכולת של SOD, אאו ישירות נישחק WST מופחתת-1 מראים כי ההקרנה של רכיבים חדשים assay עבור מאפיין זה הוא היבט מרכזי של פתרון בעיות.

הנתונים שלנו מצביע על תסמונת קדם וסתית כדאי להיות מנוצל בשיתוף עם WST-1 כדי להפיק אופטימלית הפחתת WST-1. מצאנו כי באמצעי אחסון 1 מ"ל, 100 מיקרומטר ascorbate מפחית nmol 322 WST-1 בדקה בנוכחות PMS, אשר נדרש עבור הפחתה ישירה של WST-1 מאת ascorbate. באמצעי אחסון 1 מ"ל, 2 U/mL של אאו מתחמצן ascorbate בקצב של 4,400 nmol/s או 800 פעמים מהר יותר מאשר צמצום WST-1 מאת ascorbate. . בבירור, פעילות אנזימטי של אאו היא הרבה יותר מהר מאשר הפחתה ישירה של PMS/WST-1 על ידי ascorbate. אנו מצפים כי הדבר יעקבו סופראוקסיד, מפגר, אבל אין לנו מערכת למדידת קצב מוחלטת של הפחתת WST-1 מאת סופראוקסיד.

כדי לקבוע אם הכללת PMS משפיעה על הוזלת WST-1 מאת סופראוקסיד, היינו xanthine אוקסידאז (4.5 מו/mL) / סופראוקסיד hypoxanthine (0.1 מ מ) יצירת מערכת כאמור תיאר26,27. ההכללה של PMS מכפילה כ קצב הפחתת WST-1 על ידי מערכת זו. לפיכך, נראה כי תסמונת קדם וסתית שמתווכת העברת אלקטרונים מן סופראוקסיד WST-1.

להעריך עוד יותר את הדרישה של PMS להפחתת WST-1 הסלולר, אנחנו לבדיקה הפחתה ב נוכחות או היעדרות של PMS, WST-1, ומצא כי תסמונת קדם וסתית נדרש להפחתת WST-1 הסלולר. כאשר תאים מודגרת ב ריאגנט assay המכיל PMS לבד (בהיעדר WST-1), יש עלייה ספיגת-438 ננומטר. זה משקף ככל הנראה להצטברות של הצורה semiquinone של תסמונת קדם וסתית (PMS-SQ) שיש לו על ספיגת שיא-440 ננומטר28. הצטברות של PMS-ר עולה כי תסמונת קדם וסתית להיות מופחתת מהר יותר זה יכול לעבור אלקטרונים O2 כדי לייצר סופראוקסיד. לכן, ההצטברות של PMS-קמ ר הוא עקבי עם ההפחתה איטי המדווחת של O2 מאת PMS-SQ לעומת התעריף עבור מופחת במלואם PMS28.

הוצגו גם פרוטוקול כדי לקבוע אם acceptors אלקטרון מצעים עבור אנזימים היכולה לשמש לעקוב אחר tPMET. על-ידי ניטור הפחתת acceptors חוץ-תאית אלקטרון בספקטרופוטומטר ואחריו התוספת של האנזים עניין, זה אפשרי לקבוע אם מקבל אלקטרונים מצע של אנזימים אלה. באמצעות שיטה זו, אנחנו הראו כי DPIP מופחת הוא מצע אאו, SOD המציינת שאין זה מקבל אלקטרונים מתאים לפיקוח הייצוא בזרימת ו סופראוקסיד ascorbate.

הנוהל לבדיקה אם לאו assay רכיבים כגון השתילות או אאו ליצור חפצים הוא שיפור משמעותי על פני שיטות קיימות. לדוגמה, DPIP מופחת הוא מצע של SOD, רומז כי נתונים שפורסמו שהושג עם השימוש DPIP SOD לפרש בהתאם. הממצאים שלנו תומך מחקר קודם שנערך על ידי דיין ודוסון שבו ספיגת של לוקו 2, 6-dichloroindophenol היה במעקב לאחר התוספת של אאו: DPIP היה מחומצן המציינות שזהו מצע של אאו29. עם זאת, הממצאים שלנו להוסיף בהקשר מחקר שנערך על ידי טאן, Berridge24, וכן Bellavite. et al. 30, זה מנוצל SOD לעכב הפחתת DPIP. במחקר שנערך על ידי טאן, Berridge משווה את acceptors אלקטרון WST-1, DPIP ו FeCN בתאים הלה, הם ראו כי ההפחתה של חלק acceptors אלקטרון דוכאה בנוכחות SOD. צמצום WST-1, בשיתוף עם mPMS, היה מאופק ~ 80% בנוכחות SOD, ואילו ההפחתה של DPIP היה מעוכב 40%. צמצום FeCN, בשיתוף מקבל אלקטרון ביניים חלופיים, היה לא עכבות בנוכחות SOD24. כאשר הערכת המצב של אלקטרון להחליף בין oxidases nadph ל DPIP או ציטוכרום c, Bellavite. et al. נמצא כי DPIP, ציטוכרום c מופחתים על ידי nadph ל oxidases, כי הפחתה זו מעוכבת באופן משמעותי על ידי SOD30. Berridge וטאן הראו גם כי עשב יכול לעכב WST-1 צמצום ב-80% העכבר שורות תאים של 32Dcl23, WEHI3B, J774, כמו גם שורות תאים אנושיים של6,Jurkat, MALME3M ו- 143B31. עם תאים אנושיים נויטרופילים העיקרי, הפחתת WST-1 היה מאופק 95% בנוכחות SOD6,32.

הנתונים מראים כי חשוב לוודא כי אנזימים להערכת תרומות ספציפיות של מולקולות המיוצא כדי tPMET מתחמצן מחדש בצורת מופחתת מקבל אלקטרון חוץ-תאית. מצאנו כי גופריתי הכלוריד ברזלי (נתונים לא מוצג) היו לא מסיס ב- PBS. ב- HBS ו נטול פנול אדום DMEM, הם היו במהירות מחומצן, הוכחת אי-תאימות עם HBS או DMEM כמו assay מדיה. לעומת זאת, AO ו- SOD אל תשתמש ferrocyanide אשלגן כמו מצע, רומז שזה מקבל אלקטרון חוץ-תאית מתאימה אם מקדם נמוך הכחדה שלה הוא לא בעיה.

אחת המגבלות העיקריות של זה וזמינותו הזה-PMS/WST-1, DPIP יכול להיות מופחת על ידי הרבה תורמים אלקטרונים, כגון NAD (P) H, ascorbate פלבנואידים כגון קוורצטין אלרג'י ו- myricetin19,33,34. עם זאת, זה ניתן להתגבר על ידי התוספת של אנזימים (למשל, מפגר, אאו) או מעכבי כדי לקבוע ספציפי כתורמים הפחתת תסמונת קדם וסתית/WST-1 או DPIP. מגבלה נוספת היא כי DPIP יכולים לשמש מצע עבור AO ו- SOD. לפיכך, אנזימים אלה צריך לא להיות מנוצל בשיתוף עם DPIP כדי לעקוב אחר tPMET. הגבלה חשוב נוסף של מחקר זה הוא היכולת של PMS רוכבי חמצון-חיזור אחרים כדי לייצר סופראוקסיד26,35,36. זה מודגם באיור6. לעומת זאת, תסמונת קדם וסתית עצמו על פי הדיווחים יש השפעה ישירה על tPMET32. בנוסף, Berridge וחום32 הראו nadph ל (NOX) אוקסידאז, diphenyleneiodinium כלוריד (DPI), יכול לדכא את הרוב המכריע של הפחתת WST-1, טוען כי tPMET DPI רגיש יכול להיות מידה מסוימת של התרומה NOX כדי tPMET. מגבלה נוספת היא כי אנו רואים שינויים קטנים בספיגת כאשר ניצול WST-1. מצאנו כי כאשר מתבצע WST-1 טריים תאים הם confluent, השינוי הגדול ביותר בספיגת נתפסת. מחקרים קודמים שנערכו שורות תאים P388 הראו כי הסכום של formazan מיוצר באופן חיובי להרכב תא מספר21. לכן, יותר confluent התאים ואז ככל ההפחתה בבית-WST-1. ניתן לתקן על ידי נרמול כדי מיקרוגרם של חלבון עבור כל טוב.

קודם לגבי assay זו היא כי זה נועד בעיקר כדי להעריך tPMET הכללית. למרות זאת ניתן לטפל לעקוב אחר טפסים מרובים של tPMET, כמו הדוגמה של ascorbate בזרימת, מבחני יותר ספציפי יהיה. מתאים יותר כאשר המטרה אינה דורשת מדידות בהקשר של tPMET. פוקס דוגמה, אם סופראוקסיד הענין המרכזי, יש מספר כיוונים נוספים שצריך לפקח סופראוקסיד, כגון שימוש של הגששים כולל פלורסנט הגששים אטום, aconitase ו nitroblue tetrazolium37.

הגששים הקיים לעקוב אחר tPMET כגון DPIP, FeCN ו- ferricytochrome c, חסרונות הנוכחי. לדוגמה, DPIP מופחת הוא מצע אאו, עשב, FeCN יש מקדם נמוך הכחדה טוחנת המגביל את השירות שלה במבחני בזמן אמת, ציטוכרום c הוא יקר. בנוסף, חלק רגשים אלו יכול לייצר רקע המוביל רגישות נמוכה כאשר מדידת שינוי ספיגת32. WST-1 שזוגות לא להיות מצע של אנזימים כגון AO ו- SOD. בנוסף, WST-1 יש מקדם גבוה הכחדה טוחנת, ריאקציה רקע נמוך, יצירה של assay tPMET רגישים יותר. . להתקדם, וזמינותו הזה יכול להיות מנוצל עם מגוון רחב של מעכבי כדאי להבין את התהליך של tPMET, למפות את הנתיב של אלקטרון תחבורה קו תא נתון של להוביל להבנה טובה יותר של כיצד נשמרת סביבת חמצון-חיזור של התא.

השלבים הקריטיים של פרוטוקול זה כוללים הקובע כי התאים מוכנים לניסויים (~ 70% confluent), כמו גם קבלת ריאגנטים assay, במיוחד WST-1 ו- PMS, טריים עבור כל וזמינותו. חשוב גם לנקות את התאים לפני התוספת של ריאגנטים וזמינותו. DMEM מנוצל פרוטוקול זה אינו מכיל ascorbate, למרות תוספת לנו בידול בינוני עם ascorbate. מספר מדיה זמינה מכילים ascorbate. עם זאת, התאים נשטפים לפני התוספת של ריאגנטים assay, אשר ascorbate-חינם, כדי להסיר כל ascorbate שיורית של המדיום. כמו חלק tPMET המיוחס בזרימת מולקולרית (למשל, ייצוא ascorbate), חשוב להתחיל הקריאות spectrophotometric מיד לאחר הוספת ריאגנט assay כדי לא לפספס את הרגעים הראשונים של בזרימת. כמו כן, חיוני לכלול רקע בארות ריאגנט בודדים בכל ניסוי. המרכיבים assay המתוארים במאמר זה גרם לשינוי רקע זניח ספיגת. עם זאת, תוספים מסוימים (למשל, phloretin) יכול לקדם לתגובה רקע משמעותי. לכן, חשוב כי הרקע יופחת החוצה כאשר הנתונים מנותחים לחסל את כל תופעות מבלבלים ריאגנטים עצמם העשויות להניב.

לסיכום, פרוטוקול המובאת כאן מספק אמצעים הערכת tPMET, מציע מספר אזהרות והיבטים של פרוטוקול זה צריך להילקח בחשבון בעת החלת וזמינותו שורות תאים שונים ו/או הערכת תורמים ספציפיים ( ascorbate ו סופראוקסיד המשמש כאן) כדי tPMET.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

ברצוננו להודות תומס בל, לין Mattathil, מארק Mannino, Neej פאטל לתמיכה טכנית שלהם. עבודה זו נתמכה על ידי שירות בריאות הציבור של ארצות הברית פרס R15DK102122 במכון הלאומי של סוכרת, העיכול, מחלות כליה (NIDDK) ג'ונתן פישר. תוכן כתב היד הוא אך ורק באחריות המחברים, ואינם מייצגים בהכרח את נופי הרשמי של NIDDK או מכוני הבריאות הלאומיים.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C2C12 myoblasts American Type Culture Collection  CRL-1772
Dulbecco's modified eagle's medium - low glucose Sigma D6046
Fetal Plex animal serum complex Gemini Bio-Products  100-602
penicillin-streptomycin Sigma 516106
horse serum Gibco Technologies 16050-130
Dulbecco's phosphate buffered saline Sigma D8537
trypsin-EDTA Sigma T4049
15 cm culture dishes TPP 93150
96 well culture plates TPP 92096
2-(4-Iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium Sodium Salt (WST-1) Accela ChemBio  Inc SY016315
phenazine methosulfate  Sigma P9625
L-ascorbic acid Sigma A5960
ascorbate oxidase  Sigma A0157
superoxide dismutase  Sigma S5395
2,6-dichloroindophenol sodium salt  ICN Biomedicals 215011825
D-(+)-glucose Sigma G7528
HEPES sodium salt Sigma H3784
sodium chloride Sigma S7653
potassium chloride Fisher Scientific  BP366
magnesium sulfate heptahydrate Sigma M5921
calcium chloride dihydrate Sigma C7902
potassium phosphate Fisher Scientific  BP363
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific 23225
Powerwave X-I spectrophotometer Biotek Insturments discontinued 
Spectronic Genesys 5 Spectrophotometer Thermo Scientific 336001
PureGrade 96-well microplate, F-bottom, clear, untreated, non-sterile MidSci 781602
Iron (II) chloride tetrahydrate Sigma 220299
Iron (II) sulfate heptahydrate Sigma 215422
hypoxanthine Sigma H9636
xanthine oxidase Sigma X4500
Excel Microsoft
R Studio Rstudio https://www.rstudio.com/products/rstudio/
KC4 Biotek Insturments discontinued 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kilberg, M. S., Christensen, H. N. Electron-transferring enzymes in the plasma membrane of the Ehrlich ascites tumor cell. Biochemistry. 18 (8), 1525-1530 (1979).
  2. Crane, F. L., Roberts, H., Linnane, A. W., Low, H. Transmembrane ferricyanide reduction by cells of the yeast Saccharomyces cerevisiae. J Bioenerg Biomembr. 14 (3), 191-205 (1982).
  3. Craig, T. A., Crane, F. L. Evidence for trans-plasma membrane electron transport system in plact cells. Proc. Indiana Acad. Sci. 90, 150-155 (1981).
  4. Mishra, R. K., Passow, H. Induction of intracellular ATP synthesis by extracellular ferricyanide in human red blood cells. J Membr Biol. 1 (1), 214-224 (1969).
  5. Crane, F. L., Sun, I. L., Clark, M. G., Grenbing, C., Low, H. Transplasma-membrane redox systems in growth and development. Biochim Biophys Acta. 811, 233-264 (1985).
  6. Berridge, M. V., Tan, A. S. Trans-plasma membrane electron transport: a cellular assay for NADH- and NADPH-oxidase based on extracellular, superoxide-mediated reduction of the sulfonated tetrazolium salt WST-1. Protoplasma. 205 (1-4), 74-82 (1998).
  7. Eccardt, A. M., et al. Trans-plasma membrane electron transport and ascorbate efflux by skeletal muscle. Antioxidants. 6 (4), 89 (2017).
  8. Sun, I. L., Navas, P., Crane, F. L., Morre, D. J., Low, H. NADH diferric transferrin reductase in liver plasma membrane. J Biol Chem. 262 (33), 15915-15921 (1987).
  9. Larm, J. A., Vaillant, F., Linnane, A. W., Lawen, A. Up-regulation of the plasma membrane oxidoreductase as a prerequisite for the viability of human Namalwa rho 0 cells. J Biol Chem. 269 (48), 30097-30100 (1994).
  10. Inman, R. S., Coughlan, M. M., Wessling-Resnik, M. Extracellular ferrireductase activity of K562 cells is coupled to transferrin-independent iron transport. Biochemistry. 33, 11850-11857 (1994).
  11. Castillo-Olivares, A., Esteban del Valle, A., Marquez, J., Nunez de Castro, I., Medina, M. A. Ehrlich cell plasma membrane redox system is modulated through signal transduction pathways involving cGMP and Ca2+ as second messengers. J Bioenerg Biomembr. 27 (6), 605-611 (1995).
  12. Medina, M. A., del Castillo-Olivares, A., Nunez de Castro, I. Multifunctional plasma membrane redox systems. Bioessays. 19 (11), 977-984 (1997).
  13. Medina, M. A., del Castillo-Olivares, A., Schweigerer, L. Plasma membrane redox activity correlates with N-myc expression in neuroblastoma cells. FEBS Lett. 311 (2), 99-101 (1992).
  14. Diaz-Gomez, C., Villalba, J. M., Perez-Vicente, R., Crane, F. Ascorbate Stabilization Is Stimulated in rho(0)HL-60 Cells by CoQ10 Increase at the Plasma Membrane. Biochem Biophys Res Commun. 234 (0), 79-81 (1997).
  15. Navarro, F., et al. Protective role of ubiquinone in vitamin E and selenium-deficient plasma membranes. Biofactors. 9 (2-4), 163-170 (1999).
  16. Herst, P. M., Berridge, M. V. Cell surface oxygen consumption: a major contributor to cellular oxygen consumption in glycolytic cancer cell lines. Biochim Biophys Acta. 1767 (2), 170-177 (2007).
  17. Baoutina, A., Dean, R. T., Jessup, W. Trans-plasma membrane electron transport induces macrophage-mediated low density lipoprotein oxidation. FASEB J. 15 (9), 1580-1582 (2001).
  18. Furukawa, S., et al. Increased oxidative stress in obesity and its impact on metabolic syndrome. J Clin Invest. 114 (12), 1752-1761 (2004).
  19. Del Principe, D., Avigliano, L., Savini, I., Catani, M. V. Trans-plasma membrane electron transport in mammals: functional significance in health and disease. Antioxid Redox Signal. 14 (11), 2289-2318 (2011).
  20. Berridge, M. V., Tan, A. S. High-Capacity Redox Control at the Plasma Membrane of Mammalian Cells Trans-Membrane, Cell Surface, and Serum NADH-Oxidases. Antioxidants & Redox Signaling. 2 (2), 231-242 (2000).
  21. Ishiyama, M., Shiga, M., Sasamoto, K., Mizoguchi, M., He, P. G. A New Sulfonated Tetrazolium Salt That Produces a Highly Water-Soluble Formazan Dye. Chemical & Pharmaceutical Bulletin. 41 (6), 1118-1122 (1993).
  22. Berridge, M. V., Herst, P. M., Tan, A. S. Tetrazolium dyes as tools in cell biology: New insights into their cellular reduction. Biotechnology Annual Review. 11, 127-152 (2005).
  23. Gurtoo, H. L., Johns, D. G. On the interaction of the electron acceptor 2,6-dichlorophenolindophenol with bovine milk xanthine oxidase. J Biol Chem. 246 (2), 286-293 (1971).
  24. Tan, A. S., Berridge, M. V. Distinct trans-plasma membrane redox pathways reduce cell-impermeable dyes in HeLa cells. Redox Rep. 9 (6), 302-306 (2004).
  25. R: A language and environment for statistical computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. (2013).
  26. Peskin, A. V., Winterbourn, C. C. A microtiter plate assay for superoxide dismutase using a water-soluble tetrazolium salt (WST-1). Clinica Chimica Acta. 293 (1-2), 157-166 (2000).
  27. Higaki, Y., et al. Oxidative stress stimulates skeletal muscle glucose uptake through a phosphatidylinositol 3-kinase-dependent pathway. Am J Physiol Endocrinol Metab. 294 (E889-E897), (2008).
  28. Zuagg, W. Spectroscopic characteristics and some chemical propertiesof N-methylphenazinium methyl sulfate (phenazine methosulfate) and pyocyanine at the oxidation level. J Biol Chem. 239 (11), 3964-3970 (1964).
  29. Dayan, J., Dawson, C. R. Substrate specificity of ascorbate oxidase. Biochem Biophys Res Commun. 73 (2), 451-458 (1976).
  30. Bellavite, P., della Bianca, V., Serra, M. C., Papini, E., Rossi, F. NADPH oxidase of neurtrophils forms superoxide anion but does not reduce cytochrome c and dichlorophenolindophenol. FEBS. 170 (1), 157-161 (1984).
  31. Berridge, M. V., Tan, A. S., McCoy, K. D., Wang, R. The biochemical and cellular basis of cell proliferation assays that use tetrazolium salts. Biochemica. 4, 15-20 (1996).
  32. Tan, A. S., Berridge, M. V. Superoxide produced by activated neutrophils efficiently reduces the tetrazolium salt, WST-1 to produce a soluble formazan: a simple colorimetric assay for measuring respiratory burst activation and for screening anti-inflammatory agents. J Immunol Methods. 238 (1-2), 59-68 (2000).
  33. Phillips, P. A., et al. Myricetin induces pancreatic cancer cell death via the induction of apoptosis and inhibition of the phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) signaling pathway. Cancer Letters. 308 (2), 181-188 (2011).
  34. Altundag, E., et al. Quercetin-induced cell death in human papillary thyroid cancer (B-CPAP) cells. Journal of thyroid research. 2016 (8), (2015).
  35. Ukeda, H., Kawana, D., Maeda, S., Sawamura, M. Spectrophotometric Assay for Superoxide Dismutase Based on the Reduction of Highly Water-soluble Tetrazolium Salts by Xanthine-Xanthine Oxidase. Biosci Biotechnol Biochem. 63 (3), 485-488 (1999).
  36. Halaka, F. G., Babcock, G. T., Dye, J. L. Properties of 5-methylphenazinium methyl sulfate. Reaction of the oxidized form with NADH and of the reduced form with oxygen. J Biol Chem. 257 (3), 1458-1461 (1982).
  37. Maghzal, G. J., Krause, K. H., Stocker, R., Jaquet, V. Detection of reactive oxygen species derived from the family of NOX NADPH oxidases. Free Radic Biol Med. 53 (10), 1903-1918 (2012).

Tags

ביוכימיה גיליון 135 tPMET WST-1 DPIP ascorbate סופראוקסיד C2C12 myotubes spectrophotometric assay
מדידת הטרנס-פלזמה ממברנה אלקטרון תעבורה על-ידי C2C12 Myotubes
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kelly, S. C., Eccardt, A. M.,… More

Kelly, S. C., Eccardt, A. M., Fisher, J. S. Measuring Trans-Plasma Membrane Electron Transport by C2C12 Myotubes. J. Vis. Exp. (135), e57565, doi:10.3791/57565 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter