Summary
このプロトコルの目標はオンカラム細胞外の電子受容体を用いたトランス プラズマ膜電子輸送を監視し、これらの細胞外の電子アクセプターに発生する酵素の相互作用を解析します。
Abstract
トランス プラズマ膜電子輸送 (tPMET) は、細胞の酸化剤によって損傷からの保護と同様に、細胞内還元ストレスからの細胞の保護の役割を果たします。細胞の酸化細胞内還元剤から電子を輸送のこのプロセスはよく定義されません。細胞外の電子受容体を用いた tPMET を監視する C2C12 細胞によって吸光光度アッセイを紹介: 水溶性テトラゾリウム塩 1 (WST-1) と 2, 6 ‐ ジクロルフェノールインドフェノール (プラズマまたはなった)。これらの電子アクセプターの削減、リアルタイム解析で、このプロセスを監視することがおります。アスコルビン酸オキシダーゼ (AO) やスーパーオキシドディスムターゼ (SOD) アッセイなどの酵素のほか、tPMET のどの部分がアスコルビン酸のエクスポートまたはスーパーオキシド生産、それぞれを判断できます。WST 1 は、低バック グラウンドで安定した結果を生成する示されていたプラズマ AO と吸光光度分析と実証された SOD の付加の後で再酸化することができた。このメソッドは、吸光光度法がリアルタイム、マルチも、クイック フェリシアン (FeCN) フェリチト クロム c 削減などの tPMET を監視するために使用他の方法上の利点を示します。
Introduction
精製膜の電子受容体を減らす機能は、ビュー固有の酸化還元能力1は、細胞膜につながっています。動物、植物、菌類に見られる以前、tPMET、複数生物2,3,4,5一般的なプロセスです。具体的には、このプロセスは、酵母、ニンジン培養細胞、赤血球、リンパ球、骨肉腫、悪性黒色腫、大食細胞、骨格筋、好中球2,3、で実証されています。4,5,6,7. 細胞酸化を減らすために原形質膜の間で電子を輸送するプロセスで tPMET を含む多くの細胞機能に関与している: セル成長5,8, 細胞生存率9, 鉄代謝10、セルシグナ リング11,12,13、および活性酸素種12,14,15からの保護。TPMET の不均衡ががん16, 心血管疾患17を含むいくつかの深刻な健康状態の発展に貢献するという仮説が tPMET のおかげで多くの細胞機能と代謝症候群18。
血しょう膜の間で電子の移動を監視する複数の方法がありますが、最も広く使用されている手法は、比色試金を介して細胞外の電子アクセプターの削減を評価します。一般的に使用される細胞外電子アクセプターはテトラゾリウム塩、プラズマ、FeCN、フェリチト クロム c19,20。最も一般的に使用されるテトラゾリウム塩は、WST 119の第二世代塩知られています。この化合物は 2 つスルホン酸のグループがあり、その水への溶解度21になるため最初の世代テトラゾリウム塩と比較して比色試金で使用する簡単です。WST-1 中間電子アクセプター 1-メトキシ-フェナチン methosulfate (Mpm) と組み合わせて、2 つの単電子転送イベントに削減されます。この減少は、WST 一色弱酸化型をより強烈な黄色の塩20,22に変更します。WST 1 が 37 × 103 M-1cm-1、高モル吸光係数高い測定感度21,22に 。プラズマはまた tPMET を監視するため細胞外の電子受容体として利用されています。これは、プラズマが tPMET 中間電子アクセプター23,24の援助なしで細胞外に減らすことが示されています。中間電子アクセプターの不足、プラズマは直接ピックアップ WST 124とは異なり、細胞膜から電子ことができます。プラズマと同様に、FeCN は細胞外 tPMET 中間電子アクセプター19,24の助けを借りずにフェロシアン化する縮小する示されています。WST 1 やプラズマと違って FeCN が低いアッセイ感度9につながる低分子吸光係数です。TPMET を監視するもう一つの一般的に使用される細胞外電子アクセプターは、フェリチト クロム c 中間電子アクセプター、Mpm22使ってフェリチト クロム c 削減増加、WST 1 と同様です。WST 1 とは異なり、フェリチト クロム科学的方法は高いバック グラウンド化低分子吸光係数22敏感。
吸光光度法による tPMET のリアルタイム解析法をご紹介します。メソッドは、使用されますが一般的、他と比較されて安価フェリチト クロム c など細胞外の電子アクセプター、両者は高分子吸光係数を持っている WST 1、プラズマ、細胞外の電子受容体を利用しました。フェナジン methosulfate (PMS) 利用 Mpm の代わりに類似した化学構造、PMS ははるかに高価です。Mpm は光化学安定した長い貯蔵寿命を必要があります市販キットの重要な特徴であります。しかし、我々 PMS 新鮮なを確認各試金のための安定性の問題をすべきではないです。酵素間の相互作用 (図 1を参照) さらに tPMET のプロセスを特徴付けるために利用されるかもしれない酵素と細胞外の電子受容体を評価する方法を提案する.具体的には、AO と SOD を使用ことができます酵素アスコルビン酸輸送や細胞のスーパーオキシド リリースでは、膜の間で運ばれる電子の 2 つの一般的な方法は、tPMET のどの部分を決定します。
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Protocol
注: は、主な手順の概要を図 1を参照してください。
1. WST 1 還元能の測定
- 成長し、C2C12 行 A ~ F を利用した 96 ウェル プレートで標準的な細胞培養手順7を使用して付着性のセルを区別します。
- 構成のダルベッコ変更されたワシの媒体 (DMEM) 2% 馬血清、100 U/mL ペニシリン、ストレプトマイシン 0.1 mg/mL と分化培地を使用します。5% CO2と 37 ° C でセルを孵化させなさい。
- アスコルビン酸 tPMET 関与を監視する場合は、100 μ M アスコルビン酸による分化メディアを補足します。24 ~ 48 の分化メディアでインキュベートする h。
- WST 1 と PMS の貯蔵液を準備します。
- WST 1 の 10 の mM の在庫をするためには、WST 1 の 0.033 g を溶解 (式重量 (FW): 651.34 g/mol) を 5 mL のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS)。4 ° C でのストア
- PMS の 5 mM の在庫をするためには、PMS の 0.0023 g を溶解 (FW: 306.34 g/mol) 1.5 ml の脱イオン H2O (式行先方向2O)。-20 ° C で保存し、光から保護します。
- 11.4 mL の PBS か HEPES に 5 mM の最終濃度緩衝生理食塩水 0.0108 g のブドウ糖を追加 (HBS; 20 mM HEPES ナトリウム塩、140 mM の NaCl、KCl、2.5 mM MgSO4、5 mM 1 mM CaCl2)。5 mM 20 μ M の最終的な集中のための PMS の 48 μ L ・ 400 μ M の最終濃度 10 mm WST 1 480 μ L を追加します。
- アスコルビン酸 tPMET 関与を監視する場合は、ソリューションを 2 つ 6 mL 因数に分割します。1 つの因数に式行先方向2O の 6 μ L を追加し、他の因数 2 区/mL AO 2 U/mL の最終的な集中のための 6 μ L を追加します。
- TPMET 活性酸素関与を監視する場合は、ソリューションを 2 つ 6 mL 因数に分割します。1 つの因数を 0.1 M KPO4バッファーの 55 μ l 添加し他の因数に 6.5 区/mL SOD 60 U/mL の最終的な集中のための 55 μ L を追加します。
- PBS のセルを洗浄します。メディアを吸引し、150 μ L の PBS を追加します。その後、PBS を吸い出しなさい。
注: アッセイは、メッキ、添付の細胞で行われます。したがって、遠心分離または洗浄工程におけるトリプシンの使用はありません。 - WST 1 ソリューション (-) を 100 μ l 添加 SOD または (-) AO 列 1-6 にし 100 μ L WST 1 ソリューション (+) SOD のや (+) AO 96 ウェル プレートの 7-12 列に追加します。G と H の行を使用して、バック グラウンド コントロールとして (すなわち変化を監視するセルのない井戸で試薬のみで吸光度の)。
- 438 で 1 時間 10 分毎の分光光度計を使用して吸光度を測定 nm。
- 読んだ後、メディアを吸引し、それぞれを洗って、150 μ L の PBS。その後、PBS を吸い出しなさい。
- ためにも、その任意の時点での吸光度からも初期の吸光度を差し引くことによって各ウェルの吸光度の変化を計算します。吸光度 (もしあれば) バック グラウンド井戸 (すなわち、分析ソリューションと井戸がない細胞) にみられる変化のこの変更を修正します。
- 分析のため 60 分制御測定吸光度データを正規化または PBS または HBS と井戸を洗浄し、ビシンコニン酸 (BCA) タンパク質アッセイを行います。
- 2 Mg/ml とウシ血清アルブミン (BSA) 標準を追加 (0.5 ~ 2 範囲セルの合流点の程度に応じて、標準曲線の μ L) 空井戸 (G と H の行) に、すべての井戸に BCA 試薬を追加。
- WST 1 排出削減量 μ g 蛋白の nmol を介してデータを定量化します。438 で減らされた WST 1 の消散係数として 37 mM-1 cm-1 22を使用 nm。
2. プラズマ還元能の測定
- 成長し、1.1 の手順と同じ手順で C2C12 付着性のセルを区別するため。
- とおり株式 10 mM プラズマ ソリューションを準備します。プラズマの 0.029 g を溶解 (FW: 290.08 g/mol) 式行先方向2O. 確認 600 で吸光度を測定することによってプラズマの濃度の 10 mL の分光光度計との nm。600 で減らされたプラズマの消散係数として 1 mM-1 cm-1 23を使用 nm。4 ° C でのストア
- 0.0108 g のグルコースを最終濃度 5 mM の 11.880 mL の PBS に追加します。10 mm プラズマ最終濃度 100 μ M 120 μ L を追加します。
- アスコルビン酸 tPMET 関与を監視する場合は、ソリューションを 2 つ 6 mL 因数に分割します。1 つの因数に式行先方向2O の 6 μ L を追加し、他の因数 2 区/mL AO 2 U/mL の最終的な集中のための 6 μ L を追加します。
- TPMET 活性酸素関与を監視する場合は、ソリューションを 2 つ 6 mL 因数に分割します。1 つの因数を 0.1 M KPO4バッファーの 55 μ l 添加し他の因数に 6.5 区/mL SOD 60 U/mL の最終的な集中のための 55 μ L を追加します。
- メディアを吸引し、150 μ L の PBS のセルを洗ってください。PBS を吸引し、プラズマ ソリューション (-) を 100 μ l 添加 SOD または (-) AO 列 1-6 に 100 μ L プラズマ ソリューション (+) SOD のまたは 96 ウェル プレートの 7-12 列に (+) AO を追加。行 G と H はバック グラウンド コントロールとして使用 (つまり変化を監視するセルのない井戸で試薬のみで吸光度の)。
- 600 nm を使用して吸光度を測定分光光度計 10 分毎 1 時間の 60 分 1.9 1.13 の手順と同様にコントロールに対する相対吸光度の変化を定量化します。
3. 削減電子アクセプターが AO や SOD 用基板であるかどうかの決定
- 5.436 mL の PBS か HBS、400 μ M の最終的な集中と 5 mM 20 μ M の最終的な集中のための PMS の 24 μ L の 10 mm WST 1 240 μ L を追加します。
- プラズマ、PBS または HBS 5.940 mL に 10 mM プラズマ、最終濃度 100 μ M の 60 μ L を追加します。
- 細胞の不在中のフラット底 96 ウェル プレートによく各 438 で分光光度計で吸光度を測定しソリューションを 100 μ l 添加プラズマの WST-1、または 600 nm の nm。
- 最終濃度 100 μ M の井戸の半分に 10 mM のアスコルビン酸の 1 μ L を追加します。それが安定するまでは、吸光度を監視します。
- 安定化時に各ウェルに 2 U/mL の最終濃度 200 U/mL AO の 1 μ L を追加または各 60 U/mL の最終濃度も、1 h の吸光度を監視、6 区/mL SOD の 1 μ L を追加します。
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Representative Results
統計は、RStudio 統計ソフトウェア25を使用して反復測定分散分析で行った。サンプル サイズは、図の凡例に示されます。
TPMET を監視するには、C2C12 細胞が細胞外の電子アクセプター、WST 1 とプラズマと共に利用されます。AO は WST 1 のどの部分を決定するために使用されたプラズマ還元されたアスコルビン酸の排出が原因と SOD は、WST 1 削減の部分は細胞のスーパーオキシドのリリースのための決定に使用されました。図 2に示すとおり、C2C12 細胞は WST 1 の減少によって見られるように tPMET が可能です。AO の追加により、WST 1 削減は tPMET の ~ 30% がアスコルビン酸 (図 2 a) の輸出が原因だったことを示す ~ 30% によって抑制されました。SOD の追加により、WST 1 削減は ~ 70%、tPMET の ~ 70% が細胞のスーパーオキシド リリース (図 2 b) によることを示すによって抑制されました。プラズマの減少が抑制されたプラズマは、AO の添加による細胞外の電子受容体として利用されていた、時 100% (図 3)。これは、アスコルビン酸の寄与を評価する AO をプラズマを使用しての有効性に関する問題を提起しました。
減らされた WST 1 が AO や SOD の基板であるかどうかを検討するには、WST 1 はアスコルビン酸で還元しました。AO や SOD を追加し、吸光度をモニターしていた。1 時間後、AO や SOD なし WST 1 の還元型と WST-1 AO や SOD (図 4 a, B) と還元型の吸光度の変化はないです。したがって、減らされた WST 1 はこれらの酵素のための基板ではない、AO や SOD の WST 1 と組み合わせての使用はそれぞれアスコルビン酸や活性酸素の役割の評価のために適切。
減らされたプラズマが AO や SOD の基質であるかどうかにプラズマはアスコルビン酸を減少しました。20 分後に AO を追加し、吸光度をモニターしていた。図 5 aプラズマが 40 分以内酸化フォームに戻りますに見られるように、減らされたプラズマはアオのための基板を示した。SOD が追加されたとき、また、再酸化処理 (図 5 b) はプラズマだった。したがって、削減のプラズマはないこれらの酵素で利用されるように適切な細胞外電子受容体とこれらの酵素のための基板です。
図 1: 電子輸送アッセイの重要な手順と細胞外の電子受容体と酵素の相互作用の測定の模式。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: AO と SOD の添加は、C2C12 細胞によって WST 1 低下を抑える。(A) tPMET 60 分 2 U/mL AO または式行先方向2O の追加 400 μ M WST 1 と 20 μ PMS を使用して分析した (N = 18/グループ)。(B) tPMET 60 U/mL SOD または 0.1 M KPO4バッファーの追加と 60 分のため行った (N = 36/グループ)。指定された時点でp≥ 0.05。誤差範囲は、平均値の標準誤差を表すし、視覚化には小さすぎる場合があります。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: AO 添加が C2C12 細胞によってプラズマの低下を抑える。60 分 2 U/mL の AO の添加の有無、100 μ M のプラズマを使用して tPMET を行った (N = 36/グループ)。指定された時点でp≥ 0.05。誤差範囲は、平均値の標準誤差を表すし、視覚化には小さすぎる場合があります。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 減らされた WST 1 は AO や SOD の基板ではない。(A) WST 1 はアスコルビン酸で還元しました。45 分後に AO を追加し、吸光度が 1 h で計測しました。吸光度の変化は認められなかった。(B) の手順は、45 分後に SOD が追加された以外、上記と同じです。吸光度の変化が認められなかった (N = 24/グループ)。誤差範囲は、平均値の標準誤差を表すし、視覚化には小さすぎる場合があります。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: 減らされたプラズマはアオと芝用基板。(A) プラズマはアスコルビン酸で還元しました。20 分後に AO を追加し、吸光度をモニターしていた。40 分以内のサンプルは減らされたプラズマが AO の基質であることを示す彼らの元吸光度に返されます。(B) プラズマはアスコルビン酸で還元しました。20 分後に SOD を追加し、吸光度をモニターしていた。時間をかけて、減らされたプラズマだった再酸化、SOD の基板は、それはプラズマが減少を示す (N = 24/グループ)。誤差範囲は、平均値の標準誤差を表すし、視覚化には小さすぎる場合があります。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6: tPMET を描いた模式。TPMET のこのモデルでセルによってエクスポートされたアスコルビン酸 (または別の電子キャリア) は、細胞外の PM を減らすことができます。また、NADPH オキシダーゼは WST 1 を直接削減したりそれを削減しない直接 PMS の減少によって細胞の活性酸素を生成します。他のドナーの細胞膜から電子 WST 1 または O2 WST 1 に削減以降に電子を寄付することが、PMS を軽減できます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
我々 は、C2C12 細胞に tPMET を監視する吸光光度アッセイでの細胞外の電子アクセプター、WST 1、プラズマを利用するための 2 つの方法を提示しています。標準培養プロシージャのセルラインの成長と分光光度計プレート リーダー、単純なマイクロ プレート法でこれらの電子アクセプターと tPMET を監視することが可能です。WST 1 削減は、アッセイ内の井戸-井戸から再現が、日々 変動があります。変動 (CV) バッファーとして PBS を活用した日常的な係数は 0.18 と CV バッファーが 0.23 HBS を活用します。
Mpm と WST 1 を利用した先行文献、修正を加えて、このプロトコルでは、具体的には、月経前緊張症の使用のため。したがって、PMS の適切な濃度を決定する含まれているトラブルシューティング、WST-1 であるとの使用のために記載されています。各吸読書の前に板を振動することは重要である、(23-37 ° C の範囲) 内の温度はない、試金のための重要なコンポーネントでことも決定。ただし、アッセイを適用する他の細胞のこれらの問題を調査する必要があります。減らされた WST 1 を直接酸化する SOD と AO の能力についてこのプロパティの新しいアッセイ コンポーネントのスクリーニングがトラブルシューティングの重要な側面であることが示唆します。
我々 のデータでは、PMS が適切に WST 1 削減を引き出すために WST 1 と組み合わせて活用すべき示唆しています。1 mL ボリュームで 100 μ M アスコルビン酸がアスコルビン酸によって WST 1 の還元に必要な PMS の存在下で毎分 WST 1 322 nmol を減少させることがわかった。1 mL ボリュームで AO の 2 U/mL 4,400 nmol/秒、または WST 1 の削減の 800 倍のレートでアスコルビン酸、アスコルビン酸を酸化させます。明らかに、AO の酵素活性は、アスコルビン酸 PMS/WST-1 の直接還元よりもはるかに高速です。我々 はスーパーオキシドによって WST 1 削減の絶対速度を測定するためのシステムを持っていないのに同じに活性酸素と SOD の従うことを見込んでいます。
ヒポキサンチン (0.1 mM) スーパーオキシド生成システム前述説明26,27/PMS の包含スーパーオキシドによる WST 1 の低減に影響を与えるかどうかを決定する我々 はキサンチン酸化酵素 (4.5 mU/mL) を使用します。PMS の包含は、このシステムによって WST 1 削減率を約 2 倍します。したがって、PMS が WST 1 活性酸素から電子の転送を仲介するようであります。
細胞の WST 1 低減のための PMS の要件をさらに評価する PMS の存在の有無で削減をアッセイと WST-1、PMS は細胞の WST 1 削減に必要なことがわかったと。438 で吸光度の増加があるとき細胞試金の試薬 (WST 1 の不在) で単独で PMS を含む, が、nm。これはおそらくされるセミキノン型ピーク吸光度は、440 nm28PMS (月経前緊張症 SQ) 状の蓄積を反映しています。PMS SQ の蓄積では、PMS は O2活性酸素を生成するために電子を渡すことができますよりも速く削減されていることを示唆しています。したがって、PMS SQ の蓄積は PMS 平方28PMS を完全に削減率と比較して O2の報告が遅い減少と一貫性のあります。
我々 はまた電子アクセプターが tPMET を監視するために利用されるかもしれない酵素のための基板を確認するためのプロトコルを提案しました。興味の酵素を添加した分光光度計での細胞の電子アクセプター分子の減少を監視することによって電子受容体がこれらの酵素のための基板を確認することが可能です。このメソッドを通じて私たちは削減プラズマが AO と SOD のアスコルビン酸の放出とスーパーオキシドの輸出を監視するための適切な電子受容体ではないことを示すための基板であることを示しています。
SOD や AO などの分析コンポーネントは、成果物を作成するかどうかをテストする手順は既存の方法と比べて大幅に改善です。たとえば、減らされたプラズマ、公開データ プラズマと SOD の使用で得られたがそれに応じて解釈すべきことを示唆している SOD の基板です。我々 の調査結果はダヤンとドーソン ロイコ 2, 6-ジクロロインドフェノールの吸光度が AO の付加の後で入院前の調査をサポート: プラズマは AO29の基質であることを示す酸化されました。しかし、我々 の調査結果を追加 Bellaviteらと同様に、タン ・ ベリッジ24, が実施した研究にコンテキスト30プラズマ化を抑制する SOD を活用しました。タンとベリッジ WST 1、プラズマ、FeCN HeLa 細胞での電子アクセプターの比較調査では、彼らはいくつか電子受容体の還元が SOD の存在下で抑制されたことを見た。と共に、議事要旨、WST 1 の削減は SOD の存在下で抑制 〜 80% 40% によってプラズマ化が抑制されました。代替の中間電子アクセプターと組み合わせて省 FeCN、SOD24存在下で抑制されなかった.NADPH オキシダーゼ プラズマとシトクロム c が減少することと、この減少は著しく抑制され, SOD30を見つけたとき NADPH オキシダーゼとプラズマやシトクロム c、Bellaviteらの間交換電子モードを評価します。・ ベリッジとタンもを SOD が Jurkat、MALME3M、および 143B6,31のひと培養細胞と同様に、32Dcl23、WEHI3B、および J774 のマウス細胞ラインの 80% の WST 1 減少を抑制することが実証します。ひと好中球細胞と WST 1 削減 SOD6,32の存在下で抑制の 95% であった。
ここのデータは、tPMET にエクスポートされた分子の特定の貢献を評価するために使用される酵素できない細胞の電子受容体の還元型を酸化して再検証することが重要である提案します。(データは示されていない) 塩化第一鉄、硫酸第一鉄に PBS で置いたことがわかった。HBS、フェノールレッド フリー DMEM に急速に酸化された、アッセイ メディアとして HBS または DMEM に非互換性を示します。対照的に、AO と SOD として使用しないフェロシアン化カリウム基板、その低消散係数は問題ではない場合適切な細胞外電子アクセプターであることを示唆します。
このアッセイの主な制限の 1 つは、PMS/WST-1、NAD (P) H、アスコルビン酸、ケルセチン、ミリセチン19,33,34などのフラボノイドなどの複数の電子ドナーはプラズマを減らすことができます。しかし、これは (例えばSOD、AO) 酵素の添加により克服できるまたは PMS/WST-1 またはプラズマ縮小する特定の要因を決定する阻害剤。別の制限は、プラズマが AO と SOD の基板として機能できることです。したがって、これらの酵素は、tPMET を監視するプラズマと組み合わせて使用しないでください。今回の追加の重要な制限は PMS の能力と他の酸化還元サイクラー スーパーオキシド26,35,36を生成します。これを図 6に示します。その一方で、PMS 自体は伝え tPMET32に直接影響を持ってないです。さらに、タンとベリッジ32 NADPH オキシダーゼ (NOX) 阻害剤、塩化 diphenyleneiodinium (DPI)、ことができます DPI に敏感な tPMET が NOX 貢献の特定の測定をすることができますを示唆している WST 1 削減の大半を抑制することを示しています。tPMET。別の制限は、WST 1 を利用する場合吸光度の小さな変化を我々 参照してくださいです。WST 1 新鮮なと細胞が合流、吸光度の最大の変化が見られることがわかりました。P388 細胞において以前の研究では、セル番号21を積極的に生成される塩の量に関連付けられているを示しています。したがってより合流セルは、WST 1 のより大きい減少です。これは、各井戸のための蛋白質のマイクログラムを正規化することで修正できます。
この試金についての注意点は、グローバル tPMET を評価するために主に設計されていることです。TPMET、アスコルビン酸の排出の例などの複数のフォームをモニターに操作できるより特定のアッセイことがありますより適切な目標は tPMET のコンテキストでの測定を必要としないとき。例のフォックス、スーパーオキシド、ニトロブルーテトラゾリウム テトラゾリウム37アコニターゼ、不浸透性蛍光プローブなどのプローブの使用などを監視する他の手段の数がある活性酸素が主な関心の場合。
既存のプラズマ、FeCN フェリチト クロムc、存在のデメリットなど tPMET を監視するプローブします。たとえば、減らされたプラズマは AO と SOD の基板、FeCN はリアルタイムの試金でその有用性を制限する低分子吸光係数、シトクロムcは高価です。さらに、これらのプローブのいくつかは32吸光度の変化を測定する際に低感度につながる高いバック グラウンドを生成できます。WST 1 は、AO や SOD などの酵素のための基板のないように示されています。さらに、WST 1 は高分子吸光係数と低バック グラウンド反応敏感 tPMET アッセイを作成します。前進して、この試金がより良い tPMET のプロセスを理解する道筋を与えられた細胞ラインでの電子輸送、細胞の酸化還元環境の維持方法のよりよい理解につながる阻害剤の広い範囲で利用できます。
このプロトコルの重要な手順には、アッセイ用試薬、具体的、WST 1 および各試金のため新鮮な PM を作ると同様にセルが実験 (〜 70% 合流) のため準備ができていることを確認が含まれます。また、アッセイ用試薬添加前に血球を洗浄するが重要です。我々 は分化培地とアスコルビン酸を補うが、このプロトコルで利用した DMEM はアスコルビン酸を含んでいません。利用可能なメディアの数には、アスコルビン酸は含まれています。ただし、セルは、アスコルビン酸フリー、メディアから任意の残留のアスコルビン酸を削除する試金の試薬の付加の前に洗っています。TPMET の部分は、分子流出 (アスコルビン酸エクスポートなど) に起因するが、流出の最初の瞬間に乗り遅れないように試金の試薬の付加の後ですぐに吸光光度測定を開始することが重要です。また、実験ではそれぞれ個々 の試薬の背景井戸を含めることが重要です。本稿で説明している分析成分は、吸光度で無視できる背景の変更を引き起こした。ただし、いくつかの添加物 (例えばフロレチン) は実質的な背景反応を昇格できます。したがって、自分自身試薬を生成可能性があります任意の交絡因子を排除するために、データを分析するとき、うち背景を減算することが重要です。
要約すると、ここで提示されたプロトコル tPMET を評価する手段を提供し、多数の注意事項と異なる細胞株および/または特定の要因 (の評価にアッセイを適用するときに考慮されるべきプロトコルの側面を示唆しています。アスコルビン酸およびここで使用されるスーパーオキシド) tPMET します。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
彼らのテクニカル サポートのトーマス ・ ベル、リン Mattathil、マーク Mannino、Neej patel さんに感謝したいと思います。この作品は、米国公衆衛生サービス賞 R15DK102122 国立糖尿病・消化器・腎臓病 (NIDDK) からジョナサンフィッシャーによって支えられました。原稿内容は著者の責任し、もの、NIDDK または健康の国民の協会の公式見解ではありません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C2C12 myoblasts | American Type Culture Collection | CRL-1772 | |
| Dulbecco's modified eagle's medium - low glucose | Sigma | D6046 | |
| Fetal Plex animal serum complex | Gemini Bio-Products | 100-602 | |
| penicillin-streptomycin | Sigma | 516106 | |
| horse serum | Gibco Technologies | 16050-130 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline | Sigma | D8537 | |
| trypsin-EDTA | Sigma | T4049 | |
| 15 cm culture dishes | TPP | 93150 | |
| 96 well culture plates | TPP | 92096 | |
| 2-(4-Iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium Sodium Salt (WST-1) | Accela ChemBio Inc | SY016315 | |
| phenazine methosulfate | Sigma | P9625 | |
| L-ascorbic acid | Sigma | A5960 | |
| ascorbate oxidase | Sigma | A0157 | |
| superoxide dismutase | Sigma | S5395 | |
| 2,6-dichloroindophenol sodium salt | ICN Biomedicals | 215011825 | |
| D-(+)-glucose | Sigma | G7528 | |
| HEPES sodium salt | Sigma | H3784 | |
| sodium chloride | Sigma | S7653 | |
| potassium chloride | Fisher Scientific | BP366 | |
| magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | M5921 | |
| calcium chloride dihydrate | Sigma | C7902 | |
| potassium phosphate | Fisher Scientific | BP363 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Powerwave X-I spectrophotometer | Biotek Insturments | discontinued | |
| Spectronic Genesys 5 Spectrophotometer | Thermo Scientific | 336001 | |
| PureGrade 96-well microplate, F-bottom, clear, untreated, non-sterile | MidSci | 781602 | |
| Iron (II) chloride tetrahydrate | Sigma | 220299 | |
| Iron (II) sulfate heptahydrate | Sigma | 215422 | |
| hypoxanthine | Sigma | H9636 | |
| xanthine oxidase | Sigma | X4500 | |
| Excel | Microsoft | ||
| R Studio | Rstudio | https://www.rstudio.com/products/rstudio/ | |
| KC4 | Biotek Insturments | discontinued |
References
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