Summary
이 프로토콜의 목표 spectrophotometrically 트랜스-플라즈마 막 전자 전송 extracellular 전자 수락자를 활용 하 여 모니터링 하 고 이러한 세포 외 전자 수락자로 발생할 수 있는 효소의 상호 작용을 분석 하는입니다.
Abstract
Trans 플라스마 막 전자 전송 (tPMET) extracellular oxidants에 의해 세포내 감소 스트레스 로부터 세포의 보호 뿐만 아니라 손상 으로부터 보호 역할을 하고있다. Extracellular oxidants 세포내 reductants에서 전자 수송의이 과정은 잘 정의 된. 여기 우리 C2C12 myotubes tPMET 세포 외 전자 수락자를 활용 하 여 모니터링 하 여 spectrophotometric 분석 실험을 제시: 수용 성 tetrazolium 소금-1 (서 부 표준시-1)과 2, 6-dichlorophenolindophenol DPIP (DCIP). 이러한 전자 수락자의 감소, 통해 우리는 실시간 분석에이 과정을 모니터 할 수 있습니다. 효소 superoxide dismutase (SOD)는 분석 실험을 하는데 산화 효소 (AO) 등의 추가 함께 우리 tPMET의 부분 각각 하는데 수출 또는 초과 생산 때문입니다 확인할 수 있습니다. 서 부 표준시-1 낮은 배경 가진 안정적인 결과를 표시 했다, 그러나 DPIP AO와 spectrophotometric 분석 시연 했다 잔디의 추가 후 다시 산화 될 수 있었다. 이 메서드는 실시간, 빠른 멀티 잘 spectrophotometric 분석 결과 tPMET, ferricyanide (FeCN) ferricytochrome c 감소 등을 모니터링 하는 데 사용 하는 다른 방법을 통해 장점 보여 줍니다.
Introduction
전자 수락자를 줄이기 위해 순화 된 플라즈마 막 수 플라즈마 멤브레인 고유의 redox 용량1는 보기를 주도하 고 있다. 이전에 곰 팡이, 식물, 그리고 동물에서 본, tPMET는 여러 생물2,3,,45에 공통 프로세스입니다. 특히,이 과정은 Saccharomyces cerevisiae, 당근 세포, 적혈구, 림프 톨, 다리, 흑색 종, 대 식 세포, 골격 근육, 및 호 중구2,3, 에서 입증 되었습니다. 4 , 5 , 6 , 7. extracellular oxidants를 줄이기 위해 플라즈마 막에 걸쳐 전자를 수송 하는 과정에서 tPMET는 포함 하는 많은 세포 기능에 관여: 세포 성장5,8, 세포 생존 능력9, 철 대사10,11,,1213, 반응성 산소 종12,,1415보호를 신호 하는 세포입니다. 많은 세포질 기능에 tPMET의 개입으로 인해 tPMET의 불균형은 암16,17, 심혈 관 질환 포함 한 몇 가지 심각한 건강 상태의 발전에 기여할 가설 되었습니다 및 대사 증후군18.
원형질 막의 전자 전송을 모니터링 하는 여러 가지 하지만 가장 널리 사용 되는 기술 색도계 분석 실험을 통해 세포 외 전자 수락자의 감소를 평가 하는 것입니다. 일반적으로 사용 되는 세포 외 전자 수락자 tetrazolium 소금, DPIP, FeCN, 그리고 ferricytochrome c19,20있습니다. 가장 일반적으로 사용 되는 tetrazolium 소금은 2 세대 소금 알려진 서 부 표준시-119. 이 화합물은 1 세대 tetrazolium 소금 두 된 그룹,21의 물 가용성 증가 하는 때문에 비해 색도계 분석 실험에 활용 하기가 쉽습니다. 중간 전자 수락자 1-methoxy-phenazine methosulfate (Mpm)와 함께에서 서 부 표준시-1, 2 단 전자 전송 이벤트에서 감소 된다. 이 감소는 더 강렬한, 노란색 formazan20,22에 약하게 색 산화 형태의 서 부 표준시-1을 변경합니다. 서 부 표준시-1 높은 분석 결과 감도21,22로 이어지는 37 x 103 M-1c m-1의 높은 어 금 니 소 광 계수가 있다. DPIP는 또한 tPMET를 모니터링 하는 extracellular 전자 수락자로 이용 된다. 그것은 그 DPIP 감소 될 수 있다 extracellularly 중간 전자 수락자23,24의 도움 없이 tPMET에 의해 표시 되었습니다. 중간 전자 수락자의 부족, DPIP 픽업 전자를 서 부 표준시-124달리 플라즈마 막에서 직접 수 있습니다. DPIP와 마찬가지로 FeCN 줄어들 extracellularly ferrocyanide 중간 전자 수락자19,24의 도움 없이 tPMET에 의해에 표시 되었습니다. 서 부 표준시-1, DPIP와 달리 FeCN 낮은 분석 결과 감도9로 이어지는 낮은 어 금 니 소멸 계수가 있다. TPMET 모니터를 또 다른 일반적으로 사용 되는 세포 외 전자 수락자는 ferricytochrome c. 서 부 표준시-1, ferricytochrome c 감소 증가 중간 전자 수락자, Mpm22의 사용과 비슷합니다. 서 부 표준시-1과는 달리, ferricytochrome c 방법은 높은 배경 및 낮은 분자량 소멸 계수22덜 민감한.
여기 우리 spectrophotometric 분석 실험을 통해 tPMET의 실시간 분석을 위한 방법 제시. 메서드 활용 서 부 표준시-1 및 DPIP, extracellular 전자 수락자로 그들은 둘 다 높은 어 금 니 소멸 계수 되 고 일반적으로 다른에 비해 덜 비싼 사용 ferricytochrome c 등 세포 외 전자 수락자. 우리는 phenazine methosulfate (PMS) 활용 Mpm 대신 그들은 유사한 화학 메이크업 및 PMS 있다 훨씬 덜 비싼. Mpm은 photochemically 안정 긴 수명이 필요로 하는 상용 키트에 대 한 중요 한 특성입니다. 그러나, 우리가 있도록 PMS 신선한 각 분석 결과 대 한 안정성 문제 해서는 안됩니다. 우리는 또한 가능한 효소 사이 상호 작용 ( 그림 1참조) extracellular 전자 수락자와 더 tPMET의 과정을 특성화 하기 위해 활용 될 수 있습니다 효소를 평가 하는 방법을 제시. 특히, 효소 AO와 잔디를 사용할 수 있습니다 어떤의 tPMET 부분은 하는데 전송 또는 extracellular superoxide 릴리스, 원형질 막에 걸쳐 수송 될 전자에 대 한 두 가지 일반적인 방법 결정 합니다.
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Protocol
참고:에 대 한 주요 단계 도식 개요 그림 1 을 참조 하십시오.
1. 서 부 표준시-1 감소 분석 결과
- 성장 하 고 96 잘 접시 행 A-f.를 활용 하 여 표준 셀 문화 절차7 을 사용 하 여 C2C12 부착 세포 분화
- 구성 된 Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM)의 하 2% 말 혈 청, 100 U/mL 페니실린과 0.1 mg/mL 스 보충 차별화 매체를 사용 합니다. 5% CO2와 37 ° C에서 세포를 품 어.
- TPMET에서 하는데 참여 모니터링, 100 µ M ascorbic 산 차별화 미디어 보충. 셀 ~ 24-48 대 한 차별화 미디어에는 알을 품을 수 h.
- 재고 서 부 표준시-1 및 PMS 솔루션을 준비 합니다.
- 서 부 표준시-1의 10 밀리미터 주식을 하려면 분해 서 부 표준시-1의 0.033 g (수식 무게 (FW): 651.34 g/mol) 5 ml의 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS). 4 ° c.에 게
- PMS의 5 밀리미터 주식을 하려면 0.0023 g PMS의 분해 (FW: 306.34 g/mol) 이온된 H2O의 1.5 ml (diH2O). -20 ° C에서 저장 하 고 빛 으로부터 보호 합니다.
- 11.4 ml PBS 또는 HEPES 5mm의 최종 농도 식 염 수 버퍼 0.0108 g 포도 당의 추가 (HBS; 20 mM HEPES 나트륨 소금, 140 m NaCl, KCl, 2.5 m m MgSO4, 5mm 1 m CaCl2m m). 10 m m 400 µ M의 최종 농도를 48 µ L 5mm 20 µ M의 최종 농도 대 한 PMS의 서 부 표준시-1의 480 µ L를 추가 합니다.
- TPMET에서 하는데 참여, 모니터링 솔루션 두 6 mL aliquots 나눕니다. 한 약 수에 diH2O 6 µ L을 추가 하 고 다른 약 수 2 구/mL AO 2 U/mL의 최종 농도 6 µ L 추가 합니다.
- TPMET에 superoxide 참여 모니터링 솔루션 두 6 mL aliquots 나눕니다. 한 약 수를 0.1 M KPO4 버퍼의 55 µ L을 추가 하 고 다른 약 수를 60 U/mL의 최종 농도 대 한 6.5 구/mL 잔디의 55 µ L을 추가 합니다.
- PBS로 세포 세척. 미디어를 발음 하 고 150 µ L PBS를 추가 합니다. 다음에 PBS 발음.
참고: 분석 결과 도금, 연결 된 셀과 함께 이루어집니다. 따라서, 원심 분리 또는 세척 과정에서 trypsin의 사용 이다. - 서 부 표준시-1 솔루션 (-)의 100 µ L를 추가 잔디 또는 (-) 아오 열 1-6를 100 µ L의 서 부 표준시-1 솔루션 (+) 잔디 또는 (+) 아오 열 7-12 96 잘 접시에 추가. 배경 컨트롤 행 G와 H를 사용 하 여 (즉, 변화를 모니터링 하는 데 셀 없이 웰 스에서 혼자 시 흡 광도에).
- 438에서 1 시간 마다 10 분 분 광 광도 계를 사용 하 여 흡 광도 값 nm.
- 읽기 후에, 미디어를 발음 하 고 각각을 씻어 PBS의 150 µ L로 잘. 다음에 PBS 발음.
- 그 잘 시간 언제 든 지 흡 광도에서 잘에 대 한 초기 흡 광도 빼서 각 잘 흡 광도 변화를 계산 합니다. 흡 광도 (있을 경우) 배경 웰 스 (즉, 분석 결과 솔루션 우물만 셀)에서 관찰 된 변화에 대 한이 변경 수정.
- 분석을 위해 60 분 제어 측정에 흡 광도 데이터 정상화 또는 PBS와 HBS 웰 스를 세척 하 고 bicinchoninic 산 (BCA) 단백질 분석을 수행.
- 2 mg/mL 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 기준 추가 (0.5-2에서 셀의 합류의 정도 따라 표준 곡선 µ L) 빈 우물 (행 G 및 H), 다음 추가 BCA 시 모든 우물에.
- 단백질의 µ g 당 서 부 표준시-1 감소의 nmol 통해 데이터를 계량. 멸종 계수로 37 m m-1 c m-1 22 를 사용 하 여 감소 된 서 부 표준시-438에서 1 nm.
2. DPIP 감소 분석 결과
- 성장 하 고 C2C12 단계 1.1 동일한 절차와 부착 세포를 차별화 합니다.
- 다음과 같이 재고 10 m m DPIP 솔루션을 준비 합니다. 분해 DPIP의 0.029 g (FW: 290.08 g/mol) diH2O. 확인 600에서 흡 광도 측정 하 여 DPIP의 농도의 10 mL에 nm는 분 광 광도 계. 소 광 계수로 1 m m-1 c m-1 23 을 사용 하 여 감소 DPIP 600에 대 한 nm. 4 ° c.에 게
- 5mm의 최종 농도 대 한 PBS의 11.880 ml 0.0108 g의 포도 당을 추가 합니다. 100 µ M의 최종 농도 대 한 10 m m DPIP의 120 µ L를 추가 합니다.
- TPMET에서 하는데 참여, 모니터링 솔루션 두 6 mL aliquots 나눕니다. 한 약 수에 diH2O 6 µ L을 추가 하 고 다른 약 수 2 구/mL AO 2 U/mL의 최종 농도 6 µ L 추가 합니다.
- TPMET에 superoxide 참여 모니터링 솔루션 두 6 mL aliquots 나눕니다. 한 약 수를 0.1 M KPO4 버퍼의 55 µ L을 추가 하 고 다른 약 수를 60 U/mL의 최종 농도 대 한 6.5 구/mL 잔디의 55 µ L을 추가 합니다.
- 미디어를 발음 하 고 PBS의 150 µ L에서 세포를 씻어. PBS를 발음 하 고 100 µ L DPIP 솔루션 (-)의 추가 잔디 또는 (-) 아오 열 1-6를 100 µ L DPIP 솔루션 (+) 잔디의 또는 (+) 아오 열 7-12 96 잘 접시에 추가. 배경 컨트롤 행 G와 H 사용 (즉, 변화를 모니터링 하는 데 셀 없이 웰 스에서 혼자 시 흡 광도에).
- 사용 하 여 600 nm에서 흡 광도 측정 분 광 광도 계 10 분 마다 1 헤에 대 한 계량 60 분 단계 1.9 1.13 비슷한 컨트롤에 상대적인 흡 광도 있는 변화.
3. 결정 여부 감소 전자 수락자는 AO 또는 잔디에 대 한 기판의
- PBS의 HBS 5.436 ml, 10 m m 400 µ M의 최종 농도 5mm 20 µ M의 최종 농도 대 한 PMS의 24 µ L에 대 한 서 부 표준시-1 240 µ L를 추가 합니다.
- DPIP, PBS의 HBS 5.940 mL를 100 µ M의 최종 농도 10 m m, DPIP의 60 µ L를 추가 합니다.
- 각 셀의 부재에서 평면 아래 96 잘 접시에 잘 438에서 분 광 광도 계에서 흡 광도 측정 하는 솔루션의 100 µ L를 추가 nm, DPIP에 대 한 서 부 표준시-1, 또는 600 nm에 대 한.
- 100 μ M의 최종 농도 대 한 웰 스의 절반의 10mm 하는데 1 µ L를 추가 합니다. 안정화 될 때까지 흡수도 모니터링 합니다.
- 안정화, 시 각 음을 2 U/mL의 최종 농도 대 한 200 U/mL AO의 1 µ L를 추가 하거나 각 60 U/mL의 최종 농도 잘 하 고 1 시간에 대 한 흡 광도 모니터 6 구/mL 잔디의 1 µ L를 추가 합니다.
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Representative Results
통계는 RStudio 통계 소프트웨어25를 사용 하 여 반복된 측정 ANOVA와 수행 했다. 샘플 크기는 그림 범례에 표시 됩니다.
모니터 tPMET, C2C12 myotubes extracellular 전자 수락자, 서 부 표준시-1 및 DPIP 함께 활용 했다. AO는 서 부 표준시-1의 부분을 결정 하는 데 사용 되었다, DPIP 감소 하는데 경과 예정 이었습니다 그리고 잔디 extracellular superoxide 출시로 인해 서 부 표준시-1 감소의 부분을 결정 하 사용 되었다. 그림 2에서 같이, C2C12 myotubes tPMET 서 부 표준시-1의 감소에 의해 볼 수 있다. AO의 추가 함께 서 부 표준시-1 감소 하는데 (그림 2A)의 수출으로 인해 tPMET의 ~ 30%가 나타내는 ~ 30%에 의해 억압 되었다. 잔디의 추가 함께 서 부 표준시-1 감소 ~ 70 %tPMET 세포 외 초과 릴리스 (그림 2B) 인해 되었다 나타내는 ~ 70%에 의해 억압 되었다. DPIP 감소 억압 되었다 DPIP AO의 추가 함께 세포 외 전자 수락자로 이용 되었다 때 이상 100% (그림 3). 이 사용 하 여 DPIP AO 하 하는데의 기여를 평가의 타당성에 관한 질문을 제기.
축소 서 부 표준시-1 AO 또는 잔디에 대 한 기판 인지 보길, 서 부 표준시-1 의약품으로 감소 되었다. AO 또는 잔디 추가 되었습니다, 그리고 흡수도 모니터링 했습니다. 1 시간 후 서 부 표준시-1 AO 또는 잔디의 감소 된 형태와 AO 또는 잔디 (그림 4A, B)와 서 부 표준시-1 감소 형태 사이의 흡 광도에 아무런 변화가 없었다. 따라서, 감소 된 서 부 표준시-1이이 효소에 대 한 기판 이며 서 부 표준시-1와 함께에서 AO 또는 잔디의 사용은 하는데 또는 초과의 역할의 평가 대 한 적절 한 각각.
감소 DPIP AO 또는 잔디에 대 한 기판 확인, DPIP ascorbic 산으로 감소 되었다. 20 분 후 아오 추가 되었습니다, 그리고 흡수도 모니터링 했습니다. 그림 5A, DPIP 40 분 이내 산화 형태로 반환에서 보듯이 감소 DPIP AO, 기판 수를 표시 했다. 잔디는 추가 될 때 DPIP는 또한 다시 산화 (그림 5B). 따라서, 감소 DPIP 이러한 효소와 이러한 효소 활용 하지 적절 한 세포 외 전자 수락자에 대 한 기판 이다.
그림 1: 전자 교통 분석의 주요 단계 및 세포 외 전자 수락자와 효소의 상호 작용의 결정의 도식 대표. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: AO와 잔디의 또한 C2C12 myotubes에 의해 서 부 표준시-1 감소를 표시 하지 않습니다. 2 U/mL AO 또는 diH2O의 추가 함께 400 µ M 서 부 표준시-1 및 20 µ M PMS를 사용 하 여 60 분에 대 한 분석 (A) tPMET (N = 18/그룹). (B) tPMET 60 U/mL 잔디 또는 0.1 M KPO4 버퍼의 추가 함께 60 분에 대 한 분석 (N = 36/그룹). 표시 된 시간 시점에서p≥ 0.05 오차 막대는 뜻의 표준 오류 나타내고 시각화 너무 작을 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: AO의 추가 C2C12 myotubes에 의해 DPIP 감소 하지 않습니다. tPMET 또는 2 U/mL AO의 추가 없이 100 µ M DPIP를 사용 하 여 60 분에 대 한 분석 (N = 36/그룹). 표시 된 시간 시점에서p≥ 0.05 오차 막대는 뜻의 표준 오류 나타내고 시각화 너무 작을 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 감소 된 서 부 표준시-1 AO 또는 잔디에 대 한 기판 아니다. (A) 서 부 표준시-1 하는데로 감소 되었다. 45 분 후 아오 추가 되었습니다, 그리고 흡수도 1 시간에 대 한 모니터링 했습니다. 흡 광도에 변화가 관찰 되었다. (B) 절차는 위의 동일 제외 하 고 잔디는 45 분 후에 추가 되었습니다. 흡 광도에 변화가 관찰 되었다 (N = 24/그룹). 오차 막대는 뜻의 표준 오류 나타내고 시각화 너무 작을 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 감소 DPIP AO와 잔디에 대 한 기판 이다. (A) DPIP 하는데로 감소 되었다. 20 분 후 아오 추가 되었습니다, 그리고 흡수도 모니터링 했습니다. 40 분 이내 샘플 감소 DPIP AO에 대 한 기질을 나타내는 그들의 원래 흡 광도를 반환. (B) DPIP 하는데로 감소 되었다. 20 분 후 잔디 추가 되었습니다, 그리고 흡수도 모니터링 했습니다. 시간이 지나면서 감소 DPIP 다시 산화, DPIP를 감소 하는 것은 잔디에 대 한 기판 (N = 24/그룹). 오차 막대는 뜻의 표준 오류 나타내고 시각화 너무 작을 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6: 도식 묘사 tPMET. TPMET의이 모델에서 셀 여 하는데 (또는 다른 전자 캐리어) extracellular PMS를 줄일 수 있습니다. 또한, NADPH oxidases 서 부 표준시-1을 직접 감소 또는 직접 PMS의 감소를 통해 하지 그것을 줄일 수 있는 세포 외 초과 생성. 다른 원형질 막 기증자 로부터 전자 전자 서 부 표준시-1 또는 이후의 서 부 표준시-1 감소와 O2 을 기부할 수 있습니다 PMS를 줄일 수도 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
우리는 세포 외 전자 수락자, DPIP, 및 서 부 표준시-1 tPMET C2C12 myotubes에서 모니터링 하는 spectrophotometric 분석 실험에 활용 하는 두 가지 방법 제시. 표준 문화 절차에 셀 라인의 성장과 플레이트 리더를 분 광 광도 계 분석 결과 간단한 microplate에에서 이러한 전자 수락자와 tPMET 모니터링 가능 하다. 서 부 표준시-1 감소는 잘-투-잘 분석 결과, 내에서 재현할 수 이지만 일상적인 변화. PBS는 버퍼를 활용 하 여 편차 (CV)의 일상적인 계수는 0.18 및 버퍼는 0.23 HBS를 활용 하 여 이력서.
이전 문학 Mpm과 서 부 표준시-1을 활용 하 여에서 우리는 수정이 프로토콜 특히, PMS의 사용에 대 한. 따라서, PMS의 적절 한 농도 결정 하는 포함 된 문제 해결 및 설명 하는 서 부 표준시-1는 myotubes와 함께 사용 하기 위해. 우리 또한 (23-37 ° C의 범위)에 있는 온도 결정 하지는 분석 결과 대 한 중요 한 구성 요소 동안 각 흡수도 읽기 전에 접시를 떨고 하는 것이 중요 합니다. 그러나, 분석 결과 적용 되는 다른 셀 라인에 대 한 이러한 문제를 조사 한다. 직접 산화 감소 서 부 표준시-1 잔디와 AO의 능력에 관한 결과이 속성에 대 한 새로운 분석 결과 구성의 문제 해결의 핵심 측면은 좋습니다.
우리의 데이터 나왔다 PMS 최적의 서 부 표준시-1 감소를 유도 하기 위해 서 부 표준시-1와 함께에서 활용 되어야 합니다. 우리는 1 mL 볼륨에서 100 µ M 하는데 감소 하는데 서 부 표준시-1의 직접적인 감소를 위한 요구는 PMS의 분당 서 부 표준시-1 322 nmol 발견. 1 mL 볼륨에서 AO의 2 U/mL 하는데에 의해 4400 nmol/s, 또는 800 배 서 부 표준시-1의 감소 보다 빠른 속도로 하는데 산화 한다. 명확 하 게, AO의 효소 활동은 하는데에 의해 PMS/서 부 표준시-1의 직접적인 감소 보다 훨씬 빠릅니다. 비록 우리가 초과 여 서 부 표준시-1 감소의 절대 속도 측정 하기 위한 시스템 하지 우리 같은 superoxide 및 잔디, 따를 것 이라고 기대 합니다.
PMS의 포함 superoxide에 의해 서 부 표준시-1의 감소 영향을 있는지 여부를 확인 하려면 사용 하는 세 산화 효소 (4.5 mU/mL) /26,27을 설명 하는 이전 시스템 생성 hypoxanthine (0.1 m m) 초과 합니다. PMS의 포함은 약이 시스템에 의해 서 부 표준시-1 감소의 속도 두 배로. 따라서, 그것은 PMS 서 부 표준시-1 초과에서 전자 전송 중재 나타납니다.
휴대 전화 서 부 표준시-1 감소 PMS의 요구를 더 평가 하려면 우리는 PMS의 유무에 감소를 분석 및 서 부 표준시-1, PMS 세포 서 부 표준시-1 감소를 위해 필요 하다는 것을 발견 하 고. 438에서 흡 광도 증가 세포는 PMS (서 부 표준시-1의 부재)에 혼자를 포함 분석 결과 시 약에 알을 품는 때 nm. 이 가능성이 semiquinone 형태의 PMS (PMS-SQ) 440 nm28에서 최대 흡 광도의 축적을 반영 합니다. PMS SQ의 축적 PMS는 O2 를 초과 생산 전자에 전달할 수 있습니다 것 보다 더 빨리 감소 되 고는 나왔다. 따라서, PMS SQ의 축적은 PMS 평방 완전히 감소 PMS28속도에 비해 O2 의 보고 느린 감소는 일치 합니다.
우리는 또한 전자 수락자 tPMET 모니터링에 활용 될 수 있습니다 효소에 대 한 기판 결정 하는 프로토콜을 제시. 관심의 효소의 추가 의해 다음 분 광 광도 계에 extracellular 전자 수락자의 감소를 모니터링 함으로써 전자 수락자가이 효소에 대 한 기판 인지 확인 가능 하다. 이 방법을 통해, 우리는 감소 DPIP AO 및 잔디 하는데 경과 및 초과 수출을 모니터링 하기 위한 적합 한 전자 수락자 아니다 나타내는 기판은 나타났습니다.
여부 또는 잔디 또는 AO 등 분석 결과 구성 요소 만드는 아티팩트를 테스트 하기 위한 절차는 기존 방법에 비해 상당한 개선 이다. 예를 들어 감소 DPIP 잔디, DPIP와 잔디의 사용으로 얻은 게시 된 데이터에 따라 해석 되어야 제안에 대 한 기판 이다. 우리의 연구 결과 원하는 Dayan 및 도슨 leuco 2, 6-dichloroindophenol의 흡 광도 AO의 추가 후 모니터링은 이전 연구: DPIP AO29기판 나타내는 산화 했다. 그러나, 우리의 연구 결과 탄 및 Berridge24, Bellavite 그 외 여러분 에 의해 실시 하는 연구를 컨텍스트 추가 30, DPIP 감소를 억제 하기 위해 잔디를 활용. 연구 탄 및 Berridge 비교 하는 서 부 표준시-1, DPIP, 및 FeCN HeLa 세포에서의 전자 수락자에 의해, 그들은 전자 수락자의 일부 감소 잔디의 억압 되었다 보았다. Mpm와 함께에서 서 부 표준시-1의 감소 DPIP의 감소는 40%에 의해 저해 되었다 동안 잔디 존재 저해 ~ 80%를 했다. 대체 중간 전자 수락자와 함께에서 FeCN, 감소 하지 떼24존재 저해 했다. NADPH oxidases와 DPIP 또는 시 토 크롬 c, Bellavite 그 외 여러분 사이 교환 전자의 모드 평가 때 발견 DPIP와 시 토 크롬 c NADPH oxidases에 의해 감소 된다이 감소 잔디30에 의해 크게 저해입니다. Berridge 및 Tan는 또한 잔디 Jurkat, MALME3M, 및 143B6,31의 인간 세포 선으로 32Dcl23, WEHI3B, 및 J774 마우스 셀 라인에서 80%로 서 부 표준시-1 감소를 억제할 수 있는 시연 했다. 인간의 기본 호 중구 세포로, 서 부 표준시-1 감소 잔디6,32존재 저해 95% 이었다.
데이터는 tPMET 내보낸된 분자의 구체적인 기여를 평가 하는 데 사용 하는 효소 세포 외 전자 수락자 감소 형태의 산화 다시 수 없습니다 확인 하는 것이 중요 것이 좋습니다. 우리는 (데이터 표시 되지 않음) 철 염화 물 및 황산 철 PBS에 용 해 되지 않은 것을 발견. HBS, 페 놀 레드 무료 DMEM 그들은 했다 급속 하 게 산화, 분석 결과 미디어 HBS 또는 DMEM 호환성을 보여주는. 반면, AO 및 잔디 사용 하지 마십시오 칼륨 ferrocyanide는 기판으로 제안 하는 그것의 낮은 소멸 계수 문제가 경우 그것이 적당 한 세포 외 전자 수락자.
이 분석 결과의 주요 한계 중 하나는 PMS/서 부 표준시-1 이며 DPIP NAD (P) H, 하는데, quercetin 및 myricetin19,,3334등 플 라 보노 이드 등 여러 전자 기증자에 의해 감소 될 수 있다. 그러나,이 효소 (예를 들어, 잔디, AO)의 추가 의해 극복 될 수 있다 또는 PMS/서 부 표준시-1 또는 DPIP 감소 특정 참여자를 결정 하는 억제제. 또 다른 한계는 DPIP AO와 잔디에 대 한 기판으로 작동할 수 있습니다. 따라서, 이러한 효소 하지 tPMET 모니터 DPIP와 함께에서 활용 합니다. 이 연구의 추가적인 중요 한 한계는 PMS의 능력 및 다른 산화 cyclers 초과26,,3536을 생산. 이것은 그림 6에 나와 있습니다. 반면에, PMS 자체 있다 tPMET32에 직접적인 영향을 주지 않습니다. 또한, 탄 및 Berridge32 으로 나타났습니다 NADPH 산화 (NOX) 효소 억제 물, diphenyleneiodinium 염화 (DPI) DPI 민감한 tPMET NOX 기여의 특정 측정 될 수 있다 제안 서 부 표준시-1 감소의 대부분을 억제 하실 수 있습니다. tPMET 하. 또 다른 한계는 서 부 표준시-1을 활용 하면 우리가 흡 광도에 작은 변화를 볼. 우리는 그 때 서 부 표준시-1 신선한 이루어집니다 셀 confluent, 흡 광도에 가장 큰 변화는 볼을 발견 했다. P388 셀 라인에서 실시 하는 이전 연구 formazan 긍정적으로 생산의 양을 셀 번호21와 상관 관계가 나타났습니다. 따라서, 더 confluent 셀 다음 서 부 표준시-1에서 더 큰 감소. 이 각 음에 대 한 단백질의 그램을 정상화 하 여에 대 한 수정 될 수 있습니다.
이 분석 결과 대 한 하나의 경고는 그것 주로 글로벌 tPMET를 평가 하기 위해 설계 되었습니다. 모니터링 하는데 경과의 예제와 같은 tPMET의 여러 형태를 조작할 수 있지만 목표 tPMET의 맥락에서 측정을 필요로 하지 않습니다 더 구체적인 분석 더 적절 한 있을 수도 있습니다. 폭스 예를 들어, superoxide 주요 관심사 인 경우에, 초과, 프로브 스며들 지 않는 형광 프로브, nitroblue tetrazolium37, aconitase, 등의 사용 등을 모니터링 하는 다른도 수 있습니다.
TPMET FeCN DPIP와 ferricytochrome c, 현재 단점 등을 모니터링 하는 기존 조사 합니다. 예를 들어 감소 DPIP AO와 잔디에 대 한 기판, FeCN는 실시간 분석 실험에 그것의 유틸리티를 제한 하는 낮은 분자량 멸종 계수 이며 시 토 크롬 c 는 비용이 많이 드는. 또한, 일부 이러한 프로브32흡 광도에서 변화를 측정 하는 경우 낮은 감도를 선도 하는 높은 백그라운드를 생성할 수 있습니다. 서 부 표준시-1 AO, SOD 등의 효소에 대 한 기판 되지 표시 되었습니다. 또한, 서 부 표준시-1는 높은 어 금 니 소멸 계수와 낮은 배경 반응, 더 과민 한 tPMET 분석 결과 만드는 있습니다. 앞으로 이동,이 분석 결과 더 나은 tPMET의 과정을 이해, 주어진된 셀 라인, 전자 전송 경로 지도와 세포의 산화 환 원 환경 유지 방법의 더 나은 이해로 이어질 억제제로 활용할 수 있습니다.
이 프로토콜의 중요 한 단계 세포 실험 (합칠 ~ 70%)에 대 한 준비가 결정으로 분석 시 약, 특히 서 부 표준시-1 및 PMS, 각 분석 결과 대 한 신선한 만들기를 포함 합니다. 그것은 또한 중요 한 분석 실험 시 약의 추가 하기 전에 셀을 씻어입니다. 이 프로토콜에서 DMEM 비록 우리가 하는데로 차별화 매체를 보충 하는데를 포함 하지 않습니다. 사용 가능한 미디어 수가 하는데를 포함지 않습니다. 그러나, 세포는 하는데-무료, 어떤 잔류 하는데 매체에서 제거 하는 분석 실험 시 약의 추가 하기 전에 세척 된다. 분자 경과 (예: 하는데 수출)에 기인 tPMET의 한 부분으로, 그것은 바로 경과의 첫 순간을 놓칠 수 없습니다 분석 실험 시 약의 추가 다음 spectrophotometric 읽기를 시작 하는 것이 중요. 또한, 실험에서 각 개별 시 약에 대 한 배경 웰 스를 포함 하도록 중요 하다. 이 문서에서 설명 하는 분석 결과 성분 흡 광도에 무시할 수 배경 변경을 발생 합니다. 그러나, 일부 첨가제 (예: phloretin)는 상당한 배경 반응을 홍보할 수 있습니다. 따라서, 그것은 중요 한 시 약 스스로 생성 될 수 있습니다 어떤 혼란 효과 제거 하는 데이터 분석 때 배경 밖으로 뺍니다.
요약, 여기에 제시 된 프로토콜 tPMET를 평가 하는 수단을 제공 하 고 주의 수와 다른 세포 또는 특정 참여자 (평가 분석 결과 적용할 때 고려해 야 하는 프로토콜의 제안 하는데, 여기에서 사용 하는 superoxide) tPMET를.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리는 그들의 기술 지원에 대 한 토마스 벨, 린 Mattathil, 마크 Mannino, 및 Neej 파 텔에 게 감사 하 고 싶습니다. 이 작품은 조나단 피셔 국립 연구소의 당뇨병과 소화기 및 신장 질환 (NIDDK)에서 미국 공중 보건 봉사 상 R15DK102122에 의해 지원 되었다. 원고 내용은 전적으로 저자의 책임 이며 반드시는 NIDDK 또는 국립 보건원의 공식 의견을 대표 하지 않는다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C2C12 myoblasts | American Type Culture Collection | CRL-1772 | |
| Dulbecco's modified eagle's medium - low glucose | Sigma | D6046 | |
| Fetal Plex animal serum complex | Gemini Bio-Products | 100-602 | |
| penicillin-streptomycin | Sigma | 516106 | |
| horse serum | Gibco Technologies | 16050-130 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline | Sigma | D8537 | |
| trypsin-EDTA | Sigma | T4049 | |
| 15 cm culture dishes | TPP | 93150 | |
| 96 well culture plates | TPP | 92096 | |
| 2-(4-Iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium Sodium Salt (WST-1) | Accela ChemBio Inc | SY016315 | |
| phenazine methosulfate | Sigma | P9625 | |
| L-ascorbic acid | Sigma | A5960 | |
| ascorbate oxidase | Sigma | A0157 | |
| superoxide dismutase | Sigma | S5395 | |
| 2,6-dichloroindophenol sodium salt | ICN Biomedicals | 215011825 | |
| D-(+)-glucose | Sigma | G7528 | |
| HEPES sodium salt | Sigma | H3784 | |
| sodium chloride | Sigma | S7653 | |
| potassium chloride | Fisher Scientific | BP366 | |
| magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | M5921 | |
| calcium chloride dihydrate | Sigma | C7902 | |
| potassium phosphate | Fisher Scientific | BP363 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Powerwave X-I spectrophotometer | Biotek Insturments | discontinued | |
| Spectronic Genesys 5 Spectrophotometer | Thermo Scientific | 336001 | |
| PureGrade 96-well microplate, F-bottom, clear, untreated, non-sterile | MidSci | 781602 | |
| Iron (II) chloride tetrahydrate | Sigma | 220299 | |
| Iron (II) sulfate heptahydrate | Sigma | 215422 | |
| hypoxanthine | Sigma | H9636 | |
| xanthine oxidase | Sigma | X4500 | |
| Excel | Microsoft | ||
| R Studio | Rstudio | https://www.rstudio.com/products/rstudio/ | |
| KC4 | Biotek Insturments | discontinued |
References
- Kilberg, M. S., Christensen, H. N. Electron-transferring enzymes in the plasma membrane of the Ehrlich ascites tumor cell. Biochemistry. 18 (8), 1525-1530 (1979).
- Crane, F. L., Roberts, H., Linnane, A. W., Low, H. Transmembrane ferricyanide reduction by cells of the yeast Saccharomyces cerevisiae. J Bioenerg Biomembr. 14 (3), 191-205 (1982).
- Craig, T. A., Crane, F. L. Evidence for trans-plasma membrane electron transport system in plact cells. Proc. Indiana Acad. Sci. 90, 150-155 (1981).
- Mishra, R. K., Passow, H. Induction of intracellular ATP synthesis by extracellular ferricyanide in human red blood cells. J Membr Biol. 1 (1), 214-224 (1969).
- Crane, F. L., Sun, I. L., Clark, M. G., Grenbing, C., Low, H. Transplasma-membrane redox systems in growth and development. Biochim Biophys Acta. 811, 233-264 (1985).
- Berridge, M. V., Tan, A. S. Trans-plasma membrane electron transport: a cellular assay for NADH- and NADPH-oxidase based on extracellular, superoxide-mediated reduction of the sulfonated tetrazolium salt WST-1. Protoplasma. 205 (1-4), 74-82 (1998).
- Eccardt, A. M., et al. Trans-plasma membrane electron transport and ascorbate efflux by skeletal muscle. Antioxidants. 6 (4), 89 (2017).
- Sun, I. L., Navas, P., Crane, F. L., Morre, D. J., Low, H. NADH diferric transferrin reductase in liver plasma membrane. J Biol Chem. 262 (33), 15915-15921 (1987).
- Larm, J. A., Vaillant, F., Linnane, A. W., Lawen, A. Up-regulation of the plasma membrane oxidoreductase as a prerequisite for the viability of human Namalwa rho 0 cells. J Biol Chem. 269 (48), 30097-30100 (1994).
- Inman, R. S., Coughlan, M. M., Wessling-Resnik, M. Extracellular ferrireductase activity of K562 cells is coupled to transferrin-independent iron transport. Biochemistry. 33, 11850-11857 (1994).
- Castillo-Olivares, A., Esteban del Valle, A., Marquez, J., Nunez de Castro, I., Medina, M. A. Ehrlich cell plasma membrane redox system is modulated through signal transduction pathways involving cGMP and Ca2+ as second messengers. J Bioenerg Biomembr. 27 (6), 605-611 (1995).
- Medina, M. A., del Castillo-Olivares, A., Nunez de Castro, I. Multifunctional plasma membrane redox systems. Bioessays. 19 (11), 977-984 (1997).
- Medina, M. A., del Castillo-Olivares, A., Schweigerer, L. Plasma membrane redox activity correlates with N-myc expression in neuroblastoma cells. FEBS Lett. 311 (2), 99-101 (1992).
- Diaz-Gomez, C., Villalba, J. M., Perez-Vicente, R., Crane, F. Ascorbate Stabilization Is Stimulated in rho(0)HL-60 Cells by CoQ10 Increase at the Plasma Membrane. Biochem Biophys Res Commun. 234 (0), 79-81 (1997).
- Navarro, F., et al. Protective role of ubiquinone in vitamin E and selenium-deficient plasma membranes. Biofactors. 9 (2-4), 163-170 (1999).
- Herst, P. M., Berridge, M. V. Cell surface oxygen consumption: a major contributor to cellular oxygen consumption in glycolytic cancer cell lines. Biochim Biophys Acta. 1767 (2), 170-177 (2007).
- Baoutina, A., Dean, R. T., Jessup, W. Trans-plasma membrane electron transport induces macrophage-mediated low density lipoprotein oxidation. FASEB J. 15 (9), 1580-1582 (2001).
- Furukawa, S., et al. Increased oxidative stress in obesity and its impact on metabolic syndrome. J Clin Invest. 114 (12), 1752-1761 (2004).
- Del Principe, D., Avigliano, L., Savini, I., Catani, M. V. Trans-plasma membrane electron transport in mammals: functional significance in health and disease. Antioxid Redox Signal. 14 (11), 2289-2318 (2011).
- Berridge, M. V., Tan, A. S. High-Capacity Redox Control at the Plasma Membrane of Mammalian Cells Trans-Membrane, Cell Surface, and Serum NADH-Oxidases. Antioxidants & Redox Signaling. 2 (2), 231-242 (2000).
- Ishiyama, M., Shiga, M., Sasamoto, K., Mizoguchi, M., He, P. G. A New Sulfonated Tetrazolium Salt That Produces a Highly Water-Soluble Formazan Dye. Chemical & Pharmaceutical Bulletin. 41 (6), 1118-1122 (1993).
- Berridge, M. V., Herst, P. M., Tan, A. S. Tetrazolium dyes as tools in cell biology: New insights into their cellular reduction. Biotechnology Annual Review. 11, 127-152 (2005).
- Gurtoo, H. L., Johns, D. G. On the interaction of the electron acceptor 2,6-dichlorophenolindophenol with bovine milk xanthine oxidase. J Biol Chem. 246 (2), 286-293 (1971).
- Tan, A. S., Berridge, M. V. Distinct trans-plasma membrane redox pathways reduce cell-impermeable dyes in HeLa cells. Redox Rep. 9 (6), 302-306 (2004).
- R: A language and environment for statistical computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. (2013).
- Peskin, A. V., Winterbourn, C. C. A microtiter plate assay for superoxide dismutase using a water-soluble tetrazolium salt (WST-1). Clinica Chimica Acta. 293 (1-2), 157-166 (2000).
- Higaki, Y., et al. Oxidative stress stimulates skeletal muscle glucose uptake through a phosphatidylinositol 3-kinase-dependent pathway. Am J Physiol Endocrinol Metab. 294 (E889-E897), (2008).
- Zuagg, W. Spectroscopic characteristics and some chemical propertiesof N-methylphenazinium methyl sulfate (phenazine methosulfate) and pyocyanine at the oxidation level. J Biol Chem. 239 (11), 3964-3970 (1964).
- Dayan, J., Dawson, C. R.
- Bellavite, P., della Bianca, V., Serra, M. C., Papini, E., Rossi, F. NADPH oxidase of neurtrophils forms superoxide anion but does not reduce cytochrome c and dichlorophenolindophenol. FEBS. 170 (1), 157-161 (1984).
- Berridge, M. V., Tan, A. S., McCoy, K. D., Wang, R. The biochemical and cellular basis of cell proliferation assays that use tetrazolium salts. Biochemica. 4, 15-20 (1996).
- Tan, A. S., Berridge, M. V. Superoxide produced by activated neutrophils efficiently reduces the tetrazolium salt, WST-1 to produce a soluble formazan: a simple colorimetric assay for measuring respiratory burst activation and for screening anti-inflammatory agents. J Immunol Methods. 238 (1-2), 59-68 (2000).
- Phillips, P. A., et al. Myricetin induces pancreatic cancer cell death via the induction of apoptosis and inhibition of the phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) signaling pathway. Cancer Letters. 308 (2), 181-188 (2011).
- Altundag, E., et al. Quercetin-induced cell death in human papillary thyroid cancer (B-CPAP) cells. Journal of thyroid research. 2016 (8), (2015).
- Ukeda, H., Kawana, D., Maeda, S., Sawamura, M. Spectrophotometric Assay for Superoxide Dismutase Based on the Reduction of Highly Water-soluble Tetrazolium Salts by Xanthine-Xanthine Oxidase. Biosci Biotechnol Biochem. 63 (3), 485-488 (1999).
- Halaka, F. G., Babcock, G. T., Dye, J. L. Properties of 5-methylphenazinium methyl sulfate. Reaction of the oxidized form with NADH and of the reduced form with oxygen. J Biol Chem. 257 (3), 1458-1461 (1982).
- Maghzal, G. J., Krause, K. H., Stocker, R., Jaquet, V. Detection of reactive oxygen species derived from the family of NOX NADPH oxidases. Free Radic Biol Med. 53 (10), 1903-1918 (2012).
