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JoVE Journal Biochemistry
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Biochemistry

Trans-Plasma da membrana, transporte de elétrons por Myotubes de C2C12 de medição

Published: May 4, 2018 doi: 10.3791/57565
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Biology, Saint Louis University
* These authors contributed equally

Summary

O objetivo do presente protocolo é espectrofotometricamente monitorar o transporte de elétrons da membrana trans-plasma utilizando aceitadores de electrões extracelular e analisar interações enzimáticas que podem ocorrer com estes aceitadores de electrões extracelular.

Abstract

Transporte de elétrons da membrana trans-plasma (tPMET) desempenha um papel na proteção das células do stress redutivo intracelular, bem como a proteção contra danos por oxidantes extracelulares. Este processo de transporte de elétrons do redutores intracelulares para o extracelulares oxidantes não é bem definido. Aqui apresentamos os ensaios espectrofotométricos por C2C12 myotubes para monitorar tPMET utilizando os aceitadores de electrões extracelular: sal de tetrazólio solúvel em água-1 (WST-1) e 2,6-dichlorophenolindophenol (DPIP ou DCIP). Através da redução destes aceitadores de electrões, somos capazes de monitorar este processo em uma análise em tempo real. Com a adição de enzimas como ascorbato oxidase (AO) e superóxido dismutase (SOD) para os ensaios, podemos determinar qual parte do tPMET é devido à produção de exportação ou superóxido de ascorbato, respectivamente. Enquanto WST-1 foi mostrado para produzir resultados estáveis com baixo fundo, DPIP era capaz de ser re-oxidado após a adição do AO e SOD, que foi demonstrado com análise espectrofotométrica. Este método demonstra um ensaio espectrofotométrico em tempo real, multi bem, rápido, com vantagens sobre outros métodos usados para monitorar tPMET, tais como o ferricianeto (BECN) e redução de c ferricytochrome.

Introduction

A visão de que a membrana plasmática tem uma capacidade inerente redox1levou a capacidade das membranas de plasma purificadas de reduzir aceitadores de electrões. Visto anteriormente em fungos, plantas e animais, o tPMET é um processo comum a vários organismos2,3,4,5. Especificamente, este processo tem sido demonstrado em Saccharomyces cerevisiae, cenoura células, hemácias, linfócitos, osteossarcoma, melanoma, macrófagos, músculo esquelético e neutrófilos2,3, 4 , 5 , 6 , 7. em um processo que transporta elétrons através da membrana de plasma para reduzir oxidantes extracelulares, tPMET está envolvido em muitas funções celulares, incluindo: célula crescimento5,8, de viabilidade celular9, ferro metabolismo10, sinalização11,12,13e proteção de1514,12,do espécies reactivas de oxigénio celular. Devido ao envolvimento do tPMET em muitas funções celulares, um desequilíbrio de tPMET tem sido hypothesized para contribuir para o desenvolvimento de algumas condições graves de saúde, incluindo câncer16, doença cardiovascular,17e metabólica Síndrome de18.

Existem várias maneiras de monitorar a transferência de electrões através da membrana de plasma, mas a técnica mais utilizada é avaliar a redução de aceitadores de electrões extracelular através de ensaios colorimétricos. Aceitadores de electrões extracelular comumente usados são sais de tetrazólio, DPIP, BECN e ferricytochrome c19,20. O sal de tetrazólio mais comumente usado é um conhecido sal da segunda geração como WST-119. Este composto é mais fácil de utilizar em ensaios colorimétricos comparados com sais de tetrazólio primeira geração devido a dois grupos sulfonato, que aumentam sua solubilidade de água21. WST-1, em conjunto com o methosulfate de 1-metoxi-Fenazina aceitador elétrons intermediários (mPMS), é reduzido em eventos de transferência de elétron dois. Esta redução altera a forma oxidada fraca-colorido do WST-1 para um mais intenso, amarelo formazan20,22. WST-1 possui um coeficiente de extinção molar elevada de 37 x 103 M-1cm-1, levando a um ensaio de alta sensibilidade21,22. DPIP é também utilizado como um aceitador do elétron extracelular para monitorar tPMET. Tem sido demonstrado que DPIP pode ser diminuído extracelularmente tPMET sem o auxílio de aceitadores de electrões intermediário23,24. Devido à falta de aceitadores de electrões intermediário, DPIP pode diretamente a pick-up os elétrons da membrana plasmática, ao contrário do WST-124. Semelhante a DPIP, BECN foi mostrado para ser diminuído extracelularmente para ferrocianeto de tPMET sem o auxílio de aceitadores de electrões intermediário19,24. Ao contrário do WST-1 e DPIP, BECN tem um coeficiente de extinção molar baixa, levando a uma baixa de sensibilidade de ensaio9. Outra aceitador de electrões extracelular comumente usados para monitorar tPMET é c ferricytochrome semelhante a WST-1, ferricytochrome c redução aumenta com o uso do aceptor de elétrons intermediários, mPMS22. Ao contrário do WST-1, o método de ferricytochrome c é menos sensível devido a um fundo elevado e um coeficiente de extinção molar baixa22.

Aqui nós apresentamos um método de análise em tempo real de tPMET através de ensaios espectrofotométricos. O método utilizado os aceitadores de electrões extracelular WST-1 e DPIP, que tenham um coeficiente de extinção molar alta enquanto ser menos caro em comparação com o outro comumente usado aceitadores de electrões extracelular como ferricytochrome c. Utilizamos o methosulfate Fenazina (PMS) em vez de mPMS têm uma composição química semelhante e PMS é muito menos dispendioso. mPMS fotoquimicamente estável que é uma característica importante para um kit comercial que tem uma vida útil longa. No entanto, fazemos PMS fresco para cada ensaio, por estabilidade não deve ser um problema. Também apresentamos um método para avaliar possíveis interações enzimáticas (ver Figura 1) entre o aceitador de electrões extracelular e enzimas que podem ser utilizadas para caracterizar ainda mais o processo de tPMET. Especificamente, as enzimas AO e SOD podem ser usado determinam qual parte do tPMET é devido ao transporte de ascorbato ou liberação de superóxido extracelular, dois métodos comuns para elétrons ser transportado através da membrana plasmática.

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Protocol

Nota: Consulte a Figura 1 para uma visão esquemática das principais etapas.

1. ensaio de redução WST-1

  1. Crescem e se diferenciam células aderentes C2C12, usando de procedimentos de cultura de célula padrão7 em uma placa de 96 poços utilizando linhas A-F.
    1. Use um meio de diferenciação consistindo de modificado águia de Dulbecco médio (DMEM) suplementado com 2% de soro de cavalo, 100 U/mL penicilina e estreptomicina 0,1 mg/mL. Incube a 37 ° C com 5% CO2células.
    2. Ao monitorar o envolvimento de ascorbato em tPMET, suplemento meios de diferenciação com o ácido ascórbico 100 µM. Permitir que as células incubar em meios de diferenciação para ~ 24-48 h.
  2. Prepare as soluções WST-1 e PMS.
    1. Para fazer um estoque de 10 mM do WST-1, dissolver 0,033 g do WST-1 (fórmula peso (FW): 651.34 g/mol) em 5 mL de fosfato, tampão salino (PBS). Loja a 4 ° C.
    2. Para fazer um estoque de 5 mM do PMS, dissolver 0,0023 g de PMS (FW: 306.34 g/mol) em 1,5 mL de deionizada H2O (diH2O). Armazenar a-20 ° C e proteger da luz.
  3. Adicionar 0,0108 g de glicose para uma concentração final de 5 mM a 11,4 mL de PBS ou HEPES tampão salino (HBS; sal de sódio HEPES 20 mM, 140 mM de NaCl, 5 mM KCl, 2.5 mM de MgSO4, 1mm CaCl2). Adicione 480 µ l de 10mm WST-1 para uma concentração final de 400 µM e 48 µ l de 5mm PMS para uma concentração final de 20 µM.
  4. Ao monitorar o envolvimento de ascorbato em tPMET, divida a solução em duas alíquotas de 6 mL. Para uma alíquota, adicione 6 µ l de diH2O e para outra alíquota adicionar 6 µ l de 2 kU/mL para uma concentração final de 2 U/mL.
  5. Ao monitorar o envolvimento de superóxido em tPMET, divida a solução em duas alíquotas de 6 mL. Para uma alíquota, adicionar 55 µ l de tampão de4 de KPO 0,1 M e para a outra alíquota adicionar µ l 55 de 6,5 kU/mL SOD para uma concentração final de 60 U/mL.
  6. Lave as células com PBS. Aspirar a mídia e adicionar 150 µ l PBS. Em seguida, Aspire a PBS.
    Nota: O ensaio é feito com células chapeadas, anexadas. Assim, não há nenhum centrifugação ou o uso de tripsina no processo de lavagem.
  7. Adicione 100 µ l de solução WST-1 (-) SOD ou (-) de colunas 1-6 e adicionar 100 µ l de solução WST-1 (+) SOD ou (+) de colunas 7-12 na placa de 96 poços. Usar linhas G e H, como controles de fundo (ou seja, para monitorar a mudança em absorvância no reagente sozinho em poços sem células).
  8. Medir os valores de absorvância utilizando o espectrofotômetro cada 10min por 1h em 438 nm.
  9. Após a leitura, aspirar a mídia e lave cada uma com 150 µ l de PBS. Em seguida, Aspire a PBS.
  10. Calcule a variação de absorvância para cada poço subtraindo-se a absorbância inicial para um poco de absorvância em qualquer ponto do tempo para aquele poço. Corrigi essa alteração para a mudança de absorbância (se houver) observada em poços de fundo (ou seja, poços com solução de ensaio, mas sem células).
  11. Para análise, normalizar os dados de absorbância para a medição de controle de 60 min ou lavar os poços com PBS ou HBS e então executar um ensaio de proteína bicinchoninic ácido (BCA).
  12. Adicionar o padrão de albumina de soro bovino (BSA) 2 mg/mL (variam de 0,5-2 µ l para a curva padrão, dependendo do grau de confluência das células) aos poços vazios (linhas G e H), em seguida, adicionar o reagente BCA a todos os poços.
  13. Quantificar os dados via nmol de redução WST-1 por µ g de proteína. Use 37 mM-1 cm-1 22 como o coeficiente de extinção para WST-1 reduzido a 438 nm.

2. ensaio de redução DPIP

  1. Crescem e se diferenciam células aderentes de C2C12 com o mesmo procedimento como passo 1.1.
  2. Prepare a solução DPIP de 10mm estoque como segue. Dissolver 0,029 g de DPIP (FW: 290.08 g/mol) em 10 mL de diH2Confirm O. a concentração de DPIP medindo a absorbância em 600 nm com um espectrofotômetro. Use 1 mM-1 cm-1 23 como o coeficiente de extinção para DPIP reduzido em 600 nm. Loja a 4 ° C.
  3. Adicione 0,0108 g de glicose a 11,880 mL de PBS para uma concentração final de 5 mM. Adicione 120 µ l de 10mm DPIP para uma concentração final de 100 µM.
  4. Ao monitorar o envolvimento de ascorbato em tPMET, divida a solução em duas alíquotas de 6 mL. Para uma alíquota, adicione 6 µ l de diH2O e para outra alíquota adicionar 6 µ l de 2 kU/mL para uma concentração final de 2 U/mL.
  5. Ao monitorar o envolvimento de superóxido em tPMET, divida a solução em duas alíquotas de 6 mL. Para uma alíquota, adicionar 55 µ l de tampão de4 de KPO 0,1 M e para a outra alíquota adicionar µ l 55 de 6,5 kU/mL SOD para uma concentração final de 60 U/mL.
  6. Aspirar a mídia e lavar as células em 150 µ l de PBS. Aspire a PBS e adicionar 100 µ l de solução DPIP (-) SOD ou (-) de colunas 1-6 e adicionar 100 µ l de solução DPIP (+) SOD ou (+) de colunas 7-12 na placa de 96 poços. Usar linhas G e H vontade como controles de fundo (ou seja, para monitorar a mudança em absorvância no reagente sozinho em poços sem células).
  7. Medir a absorvância a 600 nm utilizando espectrofotômetro cada 10 min para 1 h. quantificar a mudança de absorvância em relação ao controle em semelhante etapas 1.9-1.13 60 min.

3. a determinação se os aceitadores de electrões reduzida são substratos para AO ou SOD

  1. A 5,436 mL de PBS ou HBS, adicione 240 µ l de 10mm WST-1 para uma concentração final de 400 µM e 24 µ l de 5mm PMS para uma concentração final de 20 µM.
    1. Para DPIP, adicione 60 µ l de 10mm DPIP, para uma concentração final de 100 µM, a 5,940 mL de PBS ou HBS.
  2. Adicione 100 µ l de solução para cada um bem em uma placa de 96 poços de fundo plano na ausência de células e medir a absorvância em espectrofotómetro a 438 nm, para WST-1, ou 600 nm, para DPIP.
  3. Adicione 1 µ l de ascorbato de 10mm a metade dos poços para uma concentração final de 100 μM. Monitore a absorvância até estabiliza.
  4. Após estabilização, adicionar 1 µ l de 200 U/mL para uma concentração final de 2 U/mL para cada poço ou adicionar 1 µ l de kU/6ml SOD para uma concentração final de 60 U/mL para cada bem e monitorar a absorvância por 1h.

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Representative Results

As estatísticas foram realizadas com ANOVA com medidas repetidas utilizando RStudio software estatístico25. Tamanhos de amostra são indicados nas lendas figura.

Para monitorar tPMET, C2C12 myotubes foram utilizados juntamente com aceitadores de electrões extracelular, WST-1 e DPIP. AO foi usado para determinar qual parte do WST-1 e redução de DPIP foi devido ao efluxo de ascorbato e SOD foi usada para determinar qual parte do WST-1 redução foi devido a liberação de superóxido extracelular. Como mostrado na Figura 2, myotubes de C2C12 são capazes de tPMET como visto pela redução do WST-1. Com a adição de AO, WST-1 redução foi suprimida em ~ 30%, indicando que ~ 30% de tPMET deveu-se a exportação de ascorbato (Figura 2A). Com a adição de SOD, WST-1 redução foi suprimida pelo ~ 70%, indicando que ~ 70% de tPMET foi devido a liberação de superóxido extracelular (Figura 2B). Quando DPIP foi utilizado como um aceptor de elétrons extracelular com a adição de AO, redução de DPIP foi suprimida mais de 100% (Figura 3). Isso levantou dúvidas sobre a validade do uso de DPIP com AO avaliar a contribuição de ascorbato.

Para investigar se a reduzida WST-1 é um substrato para AO ou SOD, WST-1 foi reduzido com ácido ascórbico. AO ou SOD foi adicionado, e a absorbância foi monitorizada. Depois de 1 h, não houve alteração na absorbância entre a forma reduzida do WST-1 sem AO ou SOD e a forma reduzida do WST-1 com AO ou SOD (Figura 4A, B). Portanto, o reduzido WST-1 não é um substrato para estas enzimas e o uso de AO ou SOD em conjunto com WST-1 é adequado para a avaliação de funções de ascorbato ou superóxido, respectivamente.

Para determinar se a DPIP reduzida é um substrato para AO ou SOD, DPIP foi reduzido com ácido ascórbico. Depois de 20 min, AO foi adicionado, e a absorbância foi monitorizada. DPIP reduzida foi mostrada para ser um substrato para AO, como visto na Figura 5A, onde DPIP retorna à sua forma oxidada dentro de 40 min. Quando SOD foi adicionado, DPIP foi também re-oxidado (Figura 5B). Portanto, DPIP reduzida é um substrato para estas enzimas e não um aceitador de elétrons extracelular apropriado para ser utilizado com estas enzimas.

Figure 1
Figura 1: uma representação esquemática das principais etapas dos ensaios transporte de elétrons e determinação enzimática interações com os aceitadores de electrões extracelular. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: A adição de AO e SOD suprime WST-1 redução por C2C12 myotubes. TPMET (A) foi analisada por 60 min usando 400 µM WST-1 e 20 µM PMS com a adição de 2 U/mL AO ou diH2O (N = 18/grupo). TPMET (B) foi analisada por 60 min com a adição de 60 U/mL SOD ou buffer de4 KPO 0,1 M (N = 36/grupo). p≥ 0,05 em ponto do tempo indicado. Barras de erro representam o erro padrão da média e podem ser demasiado pequenas para visualizar. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: A adição de AO suprime redução DPIP por C2C12 myotubes. tPMET foi analisada por 60 min com 100 µM DPIP, com ou sem a adição de 2 U/mL AO (N = 36/grupo). p≥ 0,05 em ponto do tempo indicado. Barras de erro representam o erro padrão da média e podem ser demasiado pequenas para visualizar. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: reduzida WST-1 não é um substrato para AO ou SOD. (A) WST-1 foi reduzida com o ascorbato. Depois de 45 min, AO foi adicionado, e a absorbância foi monitorada por 1h. Não observou-se nenhuma alteração na absorbância. (B), o procedimento é o mesmo que acima, exceto SOD foi adicionado depois de 45 min. Não observou-se nenhuma alteração na absorbância (N = 24/grupo). Barras de erro representam o erro padrão da média e podem ser demasiado pequenas para visualizar. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: DPIP reduzida é um substrato para AO e SOD. (A) DPIP foi reduzida com o ascorbato. Depois de 20 min, AO foi adicionado, e a absorbância foi monitorizada. Dentro de 40 min, as amostras retornou à sua absorvância original, indicando que a reduzida DPIP é um substrato para AO. (B) DPIP foi reduzida com o ascorbato. Depois de 20 min, SOD foi adicionado, e a absorbância foi monitorizada. Ao longo do tempo, a DPIP reduzida foi re-oxidado, indicando que reduziu DPIP é um substrato para SOD (N = 24/grupo). Barras de erro representam o erro padrão da média e podem ser demasiado pequenas para visualizar. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: esquemático representando tPMET. Neste modelo de tPMET, ascorbato (ou outra transportadora de electrões) exportadas pela célula pode reduzir PMS extracelular. Além disso, oxidases NADPH geram superóxido extracelular, que pode reduzir WST-1 diretamente ou reduzi-lo indiretamente, através de redução de PMS. Elétrons de outros doadores de membrana plasmática também podem reduzir a PMS, que pode doar elétrons para WST-1 ou O2 , com consequente redução do WST-1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Apresentamos dois métodos para a utilização de aceitadores de electrões extracelular, WST-1 e DPIP, em ensaios espectrofotométricos para monitorar tPMET em C2C12 myotubes. Com o crescimento de linhagens celulares em procedimentos padrão de cultura e um leitor de placa de espectrofotômetro, é possível monitorar tPMET com estes aceitadores de electrões em um ensaio de microplacas simples. WST-1 redução é reprodutível de para-bem dentro de um ensaio, mas não há variabilidade do dia a dia. O dia-a-coeficiente de variação (CV) utilizando PBS como o buffer é 0,18 e o CV utilizando HBS como o buffer é 0.23.

Da literatura anterior utilizando mPMS e WST-1, modificamos este protocolo, especificamente, para o uso do PMS. Assim, resolução de problemas incluídas determinar as concentrações adequadas de PMS e WST-1 para uso com o myotubes descrito. Nós também determinou que a temperatura (em uma escala de 23-37 ° C) não é um componente crítico para o ensaio, enquanto a placa antes de cada leitura de absorvância a tremer é importante. No entanto, estas questões devem ser investigadas para outras linhas de células ao qual é aplicado o ensaio. As conclusões sobre a capacidade da SOD e de oxidar diretamente reduzida WST-1 sugerem que o rastreio de novos componentes de ensaio para essa propriedade é um aspecto-chave da solução de problemas.

Nossos dados sugerem que PMS deve ser utilizado em conjunto com WST-1 para eliciar ideal WST-1 redução. Nós achamos que em um volume de 1 mL, ascorbato de 100 µM reduz 322 nmol de WST-1 por minuto na presença de PMS, que é necessário para redução direta do WST-1 por ascorbato. Em um volume de 1 mL, 2 U/mL de AO oxida o ascorbato em uma taxa de 4.400 nmol/s, ou 800 vezes mais rápido do que a redução do WST-1 por ascorbato. Claramente, a atividade enzimática de AO é muito mais rápida do que a redução direta de PMS/WST-1 por ascorbato. Esperamos que o mesmo iria seguir para superóxido e SOD, embora não temos um sistema para medir a taxa absoluta de WST-1 redução por superóxido.

Para determinar se a inclusão da TPM afeta a redução do WST-1 por superóxido, usamos uma xantina oxidase (4,5 mU/mL) / superóxido de hipoxantina (0,1 mM) que gera o sistema como anteriormente descrito,26,,27. Inclusão de PMS aproximadamente dobra a taxa de redução WST-1 por este sistema. Assim, parece que PMS Medeia a transferência de elétrons do superóxido WST-1.

Para avaliar mais a exigência de PMS para celular WST-1 redução, nós analisada redução na presença ou ausência de PMS e WST-1 e encontrado que PMS são necessários para redução de WST-1 celular. Quando as células são incubadas no reagente de ensaio contendo PMS sozinho (na ausência de WST-1), há um aumento de absorvância a 438 nm. Isto provavelmente reflete uma acumulação de forma semiquinona de PMS (PMS-SQ) que possui uma absorvância máxima a 440 nm28. Acumulação de PMS-SQ sugere que PMS está sendo reduzido mais rápido do que ele pode passar os elétrons para O2 para produzir superóxido. Assim, o acúmulo de PMS-SQ é consistente com a relatado redução lenta de O2 por PMS-SQ em comparação com a taxa reduzida totalmente PMS28.

Também apresentamos um protocolo para determinar se os aceitadores de electrões são substratos para as enzimas que podem ser utilizados para monitorar o tPMET. Ao monitorar a redução dos aceitadores de electrões extracelular em um espectrofotômetro, seguido pela adição da enzima de interesse, é possível determinar se o aceitador do elétron é um substrato para estas enzimas. Por meio desse método, mostramos que reduzida DPIP é um substrato para AO e SOD, indicando que não é um aceitador de electrões adequado para exportação de efluxo e superóxido de ascorbato de monitoramento.

O procedimento de ensaio ou não componentes de ensaio como SOD ou AO criar artefatos é uma melhoria significativa sobre os métodos existentes. Por exemplo, reduzida DPIP é um substrato para a SOD, sugerindo que os dados publicados obtidos com o uso de DPIP e SOD devem ser interpretados em conformidade. Nossos resultados suportam pesquisas anteriores realizadas pelo Dayan e Dawson, em que a absorvância de leuco 2,6-dichloroindophenol foi monitorada após a adição de AO: DPIP foi oxidado indicando que é um substrato para AO29. No entanto, nossas descobertas adicionar contexto pesquisa conduzida por Tan e Berridge24, bem como Bellavite et al 30, que utilizou o SOD para inibir a redução de DPIP. Em um estudo conduzido por Tan e Berridge comparando os aceitadores de electrões do WST-1, DPIP e BECN em células HeLa, eles viram que a redução de alguns dos aceitadores de electrões foi suprimida na presença de SOD. A redução do WST-1, em conjunto com mPMS, foi inibida ~ 80%, na presença de SOD, enquanto a redução de DPIP foi inibida por 40%. A redução de BECN, em conjunto com um aceptor de elétrons intermediários alternativos, não foi inibida em presença de SOD24. Quando avaliar o modo de elétron troca entre NADPH oxidases e DPIP ou citocromo c, et al . Bellavite encontrado que DPIP e citocromo c são reduzidos por oxidases NADPH e que esta redução é significativamente inibida pela SOD30. Berridge e Tan também têm demonstrado que a SOD pode inibir WST-1 redução de 80% em linhas de células de rato de 32Dcl23, WEHI3B e J774, bem como linhas de células humanas de Jurkat, MALME3M e 1436,31. Com células humanas de neutrófilos primárias, WST-1 redução foi inibida 95%, na presença de SOD6,32.

Os dados aqui sugerem que é importante verificar que as enzimas usadas para avaliar as contribuições específicas de moléculas exportadas para tPMET re-não podem oxidar a forma reduzida do aceitador de electrões extracelular. Nós achamos que o cloreto ferroso (dados não mostrados) e sulfato ferroso não eram solúveis em PBS. Na HBS e livre de vermelho de fenol DMEM, eles foram rapidamente oxidados, demonstrando a incompatibilidade com HBS ou DMEM como meios de ensaio. Em contraste, AO e SOD não usam ferrocianeto de potássio como substrato, sugerindo que é um aceptor de elétrons extracelular apropriado se seu coeficiente de extinção baixa não é um problema.

Uma das principais limitações deste teste é que PMS/WST-1 e DPIP pode ser reduzida por vários doadores de elétrons, tais como o NAD (P) H, ascorbato e flavonoides como a quercetina e miricetina19,33,34. No entanto, isto pode ser superado pela adição de enzimas (por exemplo, SOD, AO) ou inibidores para determinar a contribuintes específicos para redução de PMS/WST-1 ou DPIP. Outra limitação é que DPIP pode atuar como um substrato para AO e SOD. Assim, estas enzimas não devem ser utilizadas em conjunto com DPIP para monitorar tPMET. Uma limitação adicional importante deste estudo é a capacidade de PMS e outras ciclistas redox para produzir superóxido26,35,36. Isso é ilustrado na Figura 6. Por outro lado, PMS se declaradamente não tem nenhum efeito direto na tPMET32. Além disso, Tan e Berridge32 mostraram que o inibidor de NADPH oxidase (NOX), cloreto de diphenyleneiodinium (DPI), pode suprimir a maioria de redução WST-1, sugerindo que tPMET DPI-sensível pode ser uma medida específica da contribuição de NOX para tPMET. Outra limitação é que vemos as pequenas alterações na absorção quando utilizando WST-1. Achamos que quando WST-1 é feito fresco e as células são confluentes, a maior mudança em absorvância é vista. Estudos anteriores realizados em linhas de células P388 mostraram que a quantidade de formazan produzido positivamente se correlaciona com a célula de número21. Portanto, quanto mais confluente as células são então quanto maior a redução no WST-1. Isso pode ser corrigido por normalizando para microgramas de proteína para cada poço.

Uma ressalva sobre este ensaio é que é projetado principalmente para avaliar tPMET global. Embora ele pode ser manipulado para monitorar várias formas de tPMET, como o exemplo do efluxo de ascorbato, ensaios mais específicos podem ser mais apropriados quando o objetivo não requer medidas no contexto da tPMET. Fox exemplo, se o superóxido é o interesse principal, há uma série de outras vias para monitorar superóxido, tais como uso de sondas, incluindo sondas impermeable fluorescentes e aconitase Tetrazolium tetrazólio37.

Sondas existentes para monitorar tPMET como DPIP, BECN e ferricytochrome c, desvantagens presentes. Por exemplo, reduzida DPIP é um substrato para AO e SOD, BECN tem um coeficiente de extinção molar baixa que limita sua utilidade em ensaios em tempo real e citocromo c é caro. Além disso, algumas destas sondas podem produzir fundo elevado, levando a baixa sensibilidade quando uma alteração na absorbância32de medição. WST-1 tem demonstrado não ser um substrato para as enzimas como AO e SOD. Além disso, WST-1 tem um coeficiente de extinção molar elevada e uma reação de baixo fundo, criando um ensaio de tPMET a mais sensível. Em frente, este ensaio pode ser utilizado com uma ampla gama de inibidores para melhor entender o processo de tPMET, mapear o caminho do transporte de elétrons em uma linha de determinada célula e levar à melhor compreensão de como o ambiente de redox da célula é mantida.

Passos críticos do presente protocolo incluem determinar que as células estão prontas para a experimentação (~ 70% confluente), bem como tornando os reagentes do ensaio, especificamente WST-1 e PMS, fresco para cada ensaio. Também é essencial para lavar as células antes da adição de reagentes de ensaio. O DMEM utilizado neste protocolo não contiver ascorbato, embora complementamos o meio de diferenciação com o ascorbato. Um número de meios de comunicação disponíveis contêm ascorbato. No entanto, as células são lavadas antes da adição dos reagentes do ensaio, que são livres de ascorbato, para remover qualquer ascorbato residual do meio. Como uma parte do tPMET é atribuível a efluxo molecular (por exemplo, exportação de ascorbato), é importante começar as leituras espectrofotométricas imediatamente após a adição do reagente de ensaio para não perder os primeiros momentos do efluxo. Além disso, é fundamental incluir poços de fundo para cada reagente individual em um experimento. Os constituintes de ensaio descritos neste artigo causaram mudança de fundo negligenciável em absorvância. No entanto, alguns aditivos (e.g., phloretin) podem promover uma reação de fundo substancial. Assim, é importante que o fundo é subtraído para fora quando os dados são analisados para eliminar qualquer confusão efeitos que os reagentes se podem produzir.

Em resumo, o protocolo aqui apresentado fornece um meio de avaliação tPMET e sugere um número de advertências e aspectos do protocolo que devem ser tomadas em consideração, ao aplicar o ensaio de linhagens celulares diferentes e/ou avaliar a contribuintes específicos ( ascorbato e superóxido usado aqui) para tPMET.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Gostaríamos de agradecer seu apoio técnico Thomas Bell, Lyn Mattathil, Mark Mannino e Neej Patel. Este trabalho foi financiado pelo prêmio de serviço de saúde pública dos Estados Unidos R15DK102122 do Instituto Nacional de Diabetes e doenças do rim (NIDDK) e digestivo para Jonathan Fisher. O conteúdo do manuscrito é exclusivamente da responsabilidade dos autores e não representa necessariamente a opinião oficial do NIDDK ou o National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C2C12 myoblasts American Type Culture Collection  CRL-1772
Dulbecco's modified eagle's medium - low glucose Sigma D6046
Fetal Plex animal serum complex Gemini Bio-Products  100-602
penicillin-streptomycin Sigma 516106
horse serum Gibco Technologies 16050-130
Dulbecco's phosphate buffered saline Sigma D8537
trypsin-EDTA Sigma T4049
15 cm culture dishes TPP 93150
96 well culture plates TPP 92096
2-(4-Iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium Sodium Salt (WST-1) Accela ChemBio  Inc SY016315
phenazine methosulfate  Sigma P9625
L-ascorbic acid Sigma A5960
ascorbate oxidase  Sigma A0157
superoxide dismutase  Sigma S5395
2,6-dichloroindophenol sodium salt  ICN Biomedicals 215011825
D-(+)-glucose Sigma G7528
HEPES sodium salt Sigma H3784
sodium chloride Sigma S7653
potassium chloride Fisher Scientific  BP366
magnesium sulfate heptahydrate Sigma M5921
calcium chloride dihydrate Sigma C7902
potassium phosphate Fisher Scientific  BP363
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific 23225
Powerwave X-I spectrophotometer Biotek Insturments discontinued 
Spectronic Genesys 5 Spectrophotometer Thermo Scientific 336001
PureGrade 96-well microplate, F-bottom, clear, untreated, non-sterile MidSci 781602
Iron (II) chloride tetrahydrate Sigma 220299
Iron (II) sulfate heptahydrate Sigma 215422
hypoxanthine Sigma H9636
xanthine oxidase Sigma X4500
Excel Microsoft
R Studio Rstudio https://www.rstudio.com/products/rstudio/
KC4 Biotek Insturments discontinued 

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References

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Trans-Plasma da membrana, transporte de elétrons por Myotubes de C2C12 de medição
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Kelly, S. C., Eccardt, A. M., Fisher, J. S. Measuring Trans-Plasma Membrane Electron Transport by C2C12 Myotubes. J. Vis. Exp. (135), e57565, doi:10.3791/57565 (2018).

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