Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Измерения транс плазмы мембраны переноса электронов, C2C12 Myotubes

Published: May 4, 2018 doi: 10.3791/57565
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Biology, Saint Louis University
* These authors contributed equally

Summary

Цель настоящего Протокола заключается в спектрофотометрически контролировать транс плазмы мембраны электронного транспорта используя внеклеточного электрон акцепторов и проанализировать ферментативные взаимодействия, которые могут произойти с эти внеклеточные электрона акцепторами.

Abstract

Транс плазмы мембраны переноса электронов (tPMET) играет роль в защите клеток от внутриклеточного редуктивной стресса, а также защиту от повреждений, внеклеточная окислителей. Этот процесс транспортировки электроны от внутриклеточного восстановителях внеклеточного окислителей не является правильно определенным. Здесь мы представляем спектрофотометрические анализы по C2C12 myotubes следить за tPMET, используя внеклеточного электрон акцепторов: водорастворимые tetrazolium соль-1 (WST-1) и 2,6-dichlorophenolindophenol (DPIP или DCIP). Путем сокращения этих акцепторов электронов мы в состоянии контролировать этот процесс в режиме реального времени анализа. С добавлением ферментов, таких как аскорбат оксидазы (AO) и супероксиддисмутазы (СОД) для анализов мы можем определить, какая часть tPMET объясняется аскорбат экспорта или супероксид производства, соответственно. В то время как WST-1 было показано производить стабильные результаты с низким фоном, DPIP был в состоянии быть повторно окисленные после добавления AO и SOD, которая была продемонстрирована с спектрофотометрический анализ. Этот метод демонстрируется в реальном времени, несколько хорошо, быстро спектрофотометрические пробирного с преимущества по сравнению с другими методами, используемыми для наблюдения за tPMET, как Гексацианоферрат (FeCN) и c сокращение ferricytochrome.

Introduction

Очищенная плазменных мембран возможность уменьшения акцепторов электронов привело к считает, что плазматической мембраны имеет присущие окислительно-восстановительного потенциала1. Ранее видели в грибов, растений и животных, tPMET представляет собой процесс, общие для нескольких организмов2,3,4,5. В частности этот процесс был продемонстрирован в Saccharomyces cerevisiae, морковь клеток, эритроцитов, лимфоцитов, остеосаркома, меланома, макрофаги, скелетных мышц и нейтрофилов2,3, 4 , 5 , 6 , 7. в процессе, который перевозит электронов через плазматической мембраны для уменьшения внеклеточного окислителей, tPMET участвует в многих клеточных функций, в том числе: рост клеток5,8, жизнеспособность клеток9, железо метаболизм10, сигнализации11,12,13и защита от реактивнооксигенных видов12,,1415клеток. Из-за tPMET в причастности многих клеточных функций, дисбаланс tPMET был предположил вносить вклад в развитие некоторых серьезных заболеваний, включая рак16,17сердечно-сосудистых заболеваний и метаболических синдром18.

Существует несколько способов для отслеживания передачи электронов через плазматическую мембрану, но наиболее широко используемый метод заключается в оценке сокращения акцепторов внеклеточного электронов через колориметрические анализов. Часто используемые внеклеточного электрона акцепторов являются соли tetrazolium, DPIP, FeCN и ferricytochrome c19,20. Наиболее часто используемым tetrazolium соль является второго поколения соли известный как19WST-1. Это соединение проще использовать в колориметрические анализов по сравнению с первого поколения tetrazolium соли из-за две группы сульфонат, которые увеличивают его растворимость воды21. WST-1, в сочетании с промежуточных электрон акцептора 1-метокси мембранотропного порфириновых (МПМ), уменьшается в два одного электрона передачи событий. Это сокращение меняется слабо цвета окисленной формы WST-1 к более интенсивным, желтые Формазаны20,22. WST-1 имеет коэффициент Высокая молярная вымирания 37 x 103 M-1см-1, приводит к высокой пробирного чувствительность21,22. DPIP также используется в качестве акцептора внеклеточного электронов для мониторинга tPMET. Было показано, что DPIP может быть внеклеточно уменьшен tPMET без помощи промежуточных электронных акцепторов23,24. Из-за отсутствия промежуточных электронных акцепторов DPIP может непосредственно пикап электроны от плазматической мембраны, в отличие от WST-124. Подобно DPIP, FeCN было показано, быть уменьшена внеклеточно для Ферроцианид tPMET без помощи промежуточных электронных акцепторов19,24. В отличие от WST-1 и DPIP FeCN имеет коэффициент низкий Молярная вымирания приводит к нижней пробирного чувствительность9. Другой часто используемые внеклеточного электрон акцептора следить за tPMET-ferricytochrome c. аналогичен WST-1, ferricytochrome c сокращение увеличивается с использованием промежуточных электрон акцептора, МПМ22. Хотя, в отличие от WST-1 c метод ferricytochrome менее чувствительным из-за высокой фон и коэффициент низкий Молярная исчезновения22.

Здесь мы представляем метод для в реальном времени анализ tPMET через спектрофотометрические анализов. Метод используется внеклеточного электрона акцепторов WST-1 и DPIP, как они оба имеют коэффициентом Высокая молярная вымирания, в то время как существо менее дорогостоящим по сравнению с другими широко используется акцепторов внеклеточного электронов как ferricytochrome c. Мы использовали мембранотропного порфириновых (PMS) вместо МП они имеют аналогичного химического состава и PMS гораздо дешевле. МПМ воздухе стабилен, которая является важной характеристикой для коммерческих комплект, который нуждается в длительный срок. Однако мы делаем PMS свежие для калибровочных, поэтому стабильность не должно быть проблемой. Мы также представляем метод для оценки возможных ферментативные взаимодействий (см. Рисунок 1) между внеклеточным электрон акцептора и ферменты, которые могут быть использованы для дальнейшей характеризации процесс tPMET. В частности ферменты, которые AO и SOD могут использоваться определить какая часть tPMET благодаря аскорбат транспорта или внеклеточная супероксид релиз, два общих метода для электронов перевозиться через плазматическую мембрану.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Примечание: Смотрите Рисунок 1 Схематический обзор ключевых шагов.

1. WST-1 сокращения Assay

  1. Расти и дифференцировать C2C12 адэрентных клеток с использованием стандартной ячейки культуры процедуры7 в 96-луночных пластину, используя строки A-F.
    1. Воспользуйтесь средством дифференциации, состоящий из Дульбекко изменение орла среднего (DMEM) с 2% лошадь сыворотки, 100 ед/мл пенициллина и стрептомицина 0,1 мг/мл. Инкубируйте клетки при 37 ° C с 5% CO2.
    2. При мониторинге аскорбат участие в tPMET, дополнение дифференциация СМИ с аскорбиновой кислотой 100 мкм. Позволяют клеткам инкубировать в дифференциации СМИ для ~ 24-48 ч.
  2. Подготовка запасов WST-1 и PMS решения.
    1. Чтобы сделать 10 мм запас WST-1, распустить 0,033 г WST-1 (формула веса (FW): 651.34 г/моль) в 5 мл фосфата буфер солевой раствор (PBS). Хранить при 4 ° C.
    2. Чтобы сделать 5 мм запас PMS, распустить 0.0023 g PMS (FW: 306.34 г/моль) в 1,5 мл дейонизированной H2O (diH2O). Хранить при температуре-20 ° C и защищать от света.
  3. Добавить 0,0108 г глюкозы для конечной концентрации 5 мм до 11,4 мл PBS или HEPES буфер солевой раствор (HBS; 20 мм HEPES натриевая соль, 140 мм NaCl, 5 мм KCl, 2,5 мм MgSO4, 1 мм CaCl2). 480 мкл 10 мм WST-1 для конечной концентрации 400 мкм и 48 мкл 5 мм PMS для конечной концентрации 20 мкм.
  4. При мониторинге аскорбат участие в tPMET, решение разделите два 6 мл аликвоты. Один Алиготе 6 мкл diH2O и для других Алиготе мкл 6 ку/2мл AO для конечной концентрации 2 ед/мл.
  5. При мониторинге супероксид участие в tPMET, решение разделите два 6 мл аликвоты. Один Алиготе 55 мкл буфера4 КПО 0,1 М и для других Алиготе мкл 55 6,5 ку/мл SOD для конечной концентрации 60 ед/мл.
  6. Вымойте клетки с PBS. Аспирационная средства массовой информации и добавить 150 мкл PBS. Затем, аспирационная PBS.
    Примечание: Assay делается с покрытием, прилагаемый клетки. Таким образом нет центрифугирования или использование трипсина в процессе стирки.
  7. 100 мкл раствора WST-1 (-) SOD или (-) АО столбцы 1-6 и добавить 100 мкл раствора WST-1 (+) SOD или (+) AO столбцы 7-12 в 96-луночных пластины. Использовать строки, G и H в качестве фона элементов управления (например, для мониторинга изменений в поглощения в одиночку реагента в скважинах без клетки).
  8. Измерение оптической плотности значений, с помощью спектрофотометра каждые 10 мин на 1 ч в 438 Нм.
  9. После прочтения, аспирационная СМИ и мыть каждый хорошо с 150 мкл PBS. Затем, аспирационная PBS.
  10. Расчет изменения в поглощения для каждой скважины путем вычитания начального поглощения для колодца от поглощения в любой точке времени для этого хорошо. Исправьте это изменение для изменения поглощения (если таковые имеются), наблюдается на фоне скважинах (т.е., скважин с Пробирной решения, но не клетки).
  11. Для анализа нормализовать оптической плотности данных измерения управления 60 мин или промыть скважин с PBS или HBS и затем выполнить bicinchoninic кислоты assay протеина (BCA).
  12. Добавить 2 мг/мл бычьим сывороточным альбумином (БСА) стандарт (диапазон от 0,5-2 мкл для стандартной кривой, в зависимости от степени слияния клеток) для пустой скважин (строк G и H), затем добавьте BCA реагент для всех скважин.
  13. Количественную оценку данных через нмоль WST-1 сокращения за мкг белка. Используйте 37 мм-1 см-1 22 как коэффициент вымирания для снижения WST-1 438 Нм.

2. DPIP сокращения Assay

  1. Расти и дифференцировать C2C12 адэрентных клеток с той же процедурой, шаг 1.1.
  2. Запасов 10 мм DPIP раствор готовят следующим образом. Распустить 0,029 g DPIP (FW: 290.08 г/моль) в 10 мл diH2O. Confirm концентрация DPIP путем измерения оптической плотности на 600 нм с спектрофотометром. Использовать 1 мм-1 см-1 23 как коэффициент вымирания для снижения DPIP 600 Нм. Хранить при 4 ° C.
  3. Добавьте 0,0108 г глюкозы в 11.880 мл PBS для конечной концентрации 5 мм. 120 мкл 10 мм DPIP для окончательного концентрации 100 мкм.
  4. При мониторинге аскорбат участие в tPMET, решение разделите два 6 мл аликвоты. Один Алиготе 6 мкл diH2O и для других Алиготе мкл 6 ку/2мл AO для конечной концентрации 2 ед/мл.
  5. При мониторинге супероксид участие в tPMET, решение разделите два 6 мл аликвоты. Один Алиготе 55 мкл буфера4 КПО 0,1 М и для других Алиготе мкл 55 6,5 ку/мл SOD для конечной концентрации 60 ед/мл.
  6. Аспирационная СМИ и вымыть клетки в 150 мкл PBS. Аспирационная PBS и 100 мкл раствора (-) DPIP SOD или (-) АО столбцы 1-6 и добавить 100 мкл раствора (+) SOD DPIP или (+) AO столбцы 7-12 в 96-луночных пластины. Использовать строки G и H будет в качестве фона элементов управления (например, для мониторинга изменений в поглощения в одиночку реагента в скважинах без клетки).
  7. Измерение оптической плотности на 600 нм с помощью спектрофотометра каждые 10 мин на 1 ч. количественно изменения поглощения относительно управления на 60 мин аналогичные шаги 1.9-1,13.

3. определение того, являются ли снижение электрона акцепторов субстратов АО или SOD

  1. 5.436 мл PBS или HBS 240 мкл 10 мм WST-1 для конечной концентрации 400 мкм и 24 мкл 5 мм PMS для конечной концентрации 20 мкм.
    1. Для DPIP добавьте 60 мкл 10 мм DPIP, для окончательного концентрации 100 мкм, 5.940 mL HBS или PBS.
  2. 100 мкл раствора для каждой хорошо в квартиру-96-луночных днище в отсутствие клеток и измерения поглощения в спектрофотометром в 438 Нм, для WST-1, или 600 Нм, для DPIP.
  3. 1 мкл 10 мм аскорбат, половина из скважин для конечной концентрации 100 мкм. Следить за поглощения, до тех пор, пока она стабилизируется.
  4. После стабилизации мкл 1 200 ед/мл AO для конечной концентрации 2 ед/мл для каждой скважины или 1 мкл 6 ку/мл SOD конечная концентрация 60 ед/мл для каждого Ну и контролировать поглощения за 1 час.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Статистические данные были выполнены с ANOVA неоднократные меры с использованием статистического программного обеспечения RStudio25. Размеры выборки, указаны в рисунке легенды.

Для контроля за tPMET, C2C12 myotubes были использованы наряду с внеклеточного электрона акцепторов, WST-1 и DPIP. AO была использована для определения какая часть WST-1 и DPIP сокращение было вызвано измеряем аскорбат и SOD была использована для определения, какая часть WST-1 сокращение было вызвано внеклеточного супероксид выпуска. Как показано на рисунке 2, C2C12 myotubes способны tPMET как видно сокращение WST-1. С добавлением AO сокращение WST-1 было подавлено ~ 30%, указав, что ~ 30% tPMET за счет экспорта аскорбата (рисунок 2A). С добавлением SOD сокращение WST-1 было подавлено ~ 70%, указав, что ~ 70% tPMET из-за выпуска внеклеточного супероксида (рис. 2B). Когда DPIP был использован в качестве акцептора внеклеточного электрона с добавлением AO, было подавлено DPIP сокращение более чем на 100% (рис. 3). Это вызывает вопросы относительно допустимости использования DPIP с АО, чтобы оценить вклад аскорбат.

Разобраться в том, является ли снижение WST-1 субстрата для АО или SOD, WST-1 был сокращен с аскорбиновой кислотой. AO или SOD был добавлен, и контролируется поглощения. После 1 h было без изменений в оптической плотности между сокращенной форме WST-1 без AO или SOD и сокращенной форме WST-1 с АО или SOD (рис. 4A, B). Таким образом снижение WST-1 не является субстратом для этих ферментов, и АО или SOD в сочетании с WST-1 используется для оценки роли аскорбат или супероксиддисмутаза, соответственно.

Чтобы определить, является ли снижение DPIP субстрата для АО или SOD, DPIP была сокращена с аскорбиновой кислотой. После 20 минут AO был добавлен, и контролируется поглощения. Снижение DPIP было показано, что субстрат для АО, как показано на рисунке 5А, где DPIP возвращает его окисленной формы в течение 40 мин. Когда был добавлен SOD, DPIP был также вновь окисляется (Рисунок 5B). Таким образом снижение DPIP является субстратом для этих ферментов и не соответствующие внеклеточного электрон акцептора использоваться с этих ферментов.

Figure 1
Рисунок 1: Схематическое представление ключевых этапов переноса электронов анализов и определение ферментативные взаимодействий с внеклеточного электрона акцепторами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: Добавление AO и SOD подавляет сокращение WST-1, C2C12 myotubes. (A) tPMET был проанализирован на 60 мин с использованием 400 мкм WST-1 и 20 мкм PMS с добавлением 2 ед/мл AO или diH2O (N = 18/группа). (B) tPMET был проанализирован на 60 мин с добавлением 60 ед/мл SOD или 0,1 М КПО4 буфера (N = 36/Группа). p≥ 0,05 в точке указанное время. Планки погрешностей представляют Среднеквадратичная ошибка среднего значения и может быть слишком мал, чтобы визуализировать. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: Добавление AO подавляет DPIP сокращения, C2C12 myotubes. tPMET был проанализирован на 60 мин, с использованием 100 мкм DPIP с или без добавления 2 ед/мл AO (N = 36/Группа). p≥ 0,05 в точке указанное время. Планки погрешностей представляют Среднеквадратичная ошибка среднего значения и может быть слишком мал, чтобы визуализировать. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: снижение WST-1 не является субстратом для АО или SOD. (A) WST-1 был сокращен с аскорбиновая кислота. После 45 минут AO был добавлен, и поглощения следили за 1 ч. Было отмечено никаких изменений в оптической плотности. (B) процедура является то же самое, что и выше, за исключением SOD был добавлен после 45 мин. Было отмечено никаких изменений в оптической плотности (N = 24/группа). Планки погрешностей представляют Среднеквадратичная ошибка среднего значения и может быть слишком мал, чтобы визуализировать. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5: снижение DPIP является субстратом для АО и SOD. (A) DPIP был сокращен с аскорбиновая кислота. После 20 минут AO был добавлен, и контролируется поглощения. В течение 40 мин образцы вернулся в их оригинальной поглощения, указывающее, что снижение DPIP субстрата для АО. (B) DPIP была сокращена с аскорбиновая кислота. После 20 минут SOD был добавлен, и контролируется поглощения. Со временем, снижение DPIP был повторно окисляется, указав, что снижение DPIP субстрата для SOD (N = 24/группа). Планки погрешностей представляют Среднеквадратичная ошибка среднего значения и может быть слишком мал, чтобы визуализировать. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 6
Рисунок 6: схематические изображающий tPMET. В этой модели tPMET аскорбат (или другой перевозчик электрона), экспортируемых в ячейке может уменьшить внеклеточного PMS. Кроме того NADPH оксидазы генерировать внеклеточного супероксиддисмутаза, которые могут уменьшить WST-1 непосредственно или косвенно уменьшить его через сокращение PMS. Электроны от других доноров плазматической мембраны может также уменьшить PMS, который может пожертвовать электроны WST-1 или2 O с последующим сокращением WST-1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Мы представили два метода для использования внеклеточного электрон акцепторов, WST-1 и DPIP, в спектрофотометрические анализов для мониторинга tPMET в C2C12 myotubes. С ростом клеточных линий в стандартных культуры процедурах и читатель спектрофотометр пластины можно контролировать tPMET с этих акцепторов электронов в assay простой микроплиты. WST-1 сокращение воспроизводима от скважины в assay, но есть повседневное изменчивости. Изо дня в день коэффициент вариации (кв) используя PBS как буфер-0,18 и резюме, используя HBS, как буфер 0.23.

От предыдущих литературы, использование МПМ и WST-1 мы изменили этот протокол, в частности, для использования ПМС. Таким образом устранение неполадок включены определения соответствующих концентраций PMS и описал WST-1 для использования с myotubes. Мы также установили, что температура (в диапазоне 23-37 ° C) не является критическим компонентом для assay, пожимая пластины до каждого чтения поглощения имеет важное значение. Однако эти вопросы должны быть исследованы для других клеточных линий, к которым применяется assay. Согласно выводам относительно способности ДЕРНА и AO непосредственно окисления снижение WST-1 что скрининга новых пробирного компонентов для этого свойства является ключевым аспектом устранения неполадок.

Наши данные свидетельствуют о том, что ПМС должны использоваться в сочетании с WST-1 для того, чтобы добиться оптимального сокращения WST-1. Мы обнаружили, что в томе 1 мл, 100 мкм аскорбиновая кислота уменьшает 322 нмоль WST-1 минуту при наличии PMS, который требуется для прямого сокращения WST-1, аскорбиновая кислота. В томе 1 мл 2 ед/мл АО окисляет аскорбината в размере 4 400 нмоль/s, или 800 раз быстрее, чем сокращение WST-1, аскорбиновая кислота. Ферментативная активность AO очевидно, гораздо быстрее, чем прямое сокращение PMS/WST-1, аскорбиновая кислота. Мы ожидаем, что то же самое будет следовать супероксиддисмутаза и SOD, хотя у нас нет системы для измерения абсолютного темпы сокращения WST-1 супероксида.

Чтобы определить, влияет ли включение PMS сокращение WST-1 супероксиддисмутаза, мы использовали ксантиноксидаза (4.5 му/мл) / гипоксантин (0,1 мм) супероксид генерации системы ранее описанных26,27. Включение PMS приблизительно удваивает темпы сокращения WST-1 по этой системе. Таким образом представляется, что PMS опосредует передачи электронов от супероксид WST-1.

Для дальнейшей оценки требование PMS для сотовых WST-1 сокращение, мы assayed сокращения в наличие или отсутствие PMS и WST-1 и обнаружил, что ПМС является обязательным для сотовых WST-1 сокращения. Когда клетки инкубируют в Пробирной реагента, содержащие PMS самостоятельно (при отсутствии WST-1), есть увеличение поглощения на 438 Нм. Вероятно, это отражает накопление полухинон формы PMS (PMS-кв), который имеет пик поглощения при 440 Нм28. Накопление PMS-SQ предполагает, что PMS снижается быстрее, чем электроны можно передать2 O производить супероксида. Таким образом накопление PMS-SQ согласуется с сообщил медленное сокращение O2 PMS-площадь по сравнению с полностью снижение PMS28.

Мы также представили протокол для определения если акцепторов электронов субстраты для ферментов, которые могут быть использованы для мониторинга tPMET. Путем наблюдения за сокращение внеклеточного электрона акцепторов в спектрофотометр с последующим добавлением энзима интерес, можно определить, если электрон акцептора является субстратом для этих ферментов. С помощью этого метода мы показывают, что снижение DPIP субстрата для АО и SOD, указывающий, что это не подходящий электрон акцептора для контроля за экспортом аскорбат измеряем и супероксиддисмутаза.

Процедура тестирования ли пробирного компонентов, таких как SOD или AO создают артефакты является существенное улучшение над существующими методами. Например снижение DPIP является субстратом для SOD, предполагая, что опубликованные данные, полученные с использованием DPIP и SOD следует толковать соответствующим образом. Наши выводы подкрепляют предыдущие исследования Даян и Доусон, в котором поглощения leuco 2,6-dichloroindophenol наблюдали после добавления AO: DPIP был окисляется, указывающий, что это субстрат для АО29. Однако наши выводы добавить контекст для исследования проведенного Тан и Берридж24, а также Bellavite и др. 30, используемой SOD ингибировать DPIP сокращения. В исследовании, проведенном Тан и Берридж, сравнивая акцепторов электронов WST-1, DPIP и FeCN в клетки HeLa они увидели, что сокращение некоторых из акцепторов электронов было подавлено в присутствии SOD. Сокращение WST-1, совместно с МП, было тормозится ~ 80% присутствии SOD, в то время как сокращение DPIP была тормозится на 40%. Снижение FeCN, в сочетании с альтернативной промежуточных электрон акцептора, был не препятствуют присутствии SOD24. При оценке режима электрона обмен между NADPH оксидазы и DPIP или цитохром с, Bellavite et al. нашли что DPIP и цитохром c снижены NADPH оксидазы и что это сокращение существенно тормозится SOD30. Берридж и Тан также продемонстрировал, что SOD может препятствовать WST-1 сокращение на 80% в линии клетки мыши, 32Dcl23, WEHI3B, и J774, а также линий клеток человека6,Jurkat, MALME3M и 143B31. С первичной нейтрофилов клетки человека сокращение WST-1 был тормозится 95% присутствии SOD6,32.

Данные показывают, что важно, чтобы убедиться, что ферментов, используемых для оценки конкретных взносов экспортированных молекул tPMET повторно не окисляется на уменьшенную форму внеклеточных электрон акцептора. Мы обнаружили, что черных хлорид (данные не отображаются) и Железный купорос не растворим в PBS. В ОБД и свободного фенола Красного DMEM они были быстро окисляется, демонстрируя несовместимости с ОБД или DMEM как assay СМИ. В отличие от AO и ДЕРНА не использовать Ферроцианид калия как субстрат, предполагая, что это подходящий внеклеточного электрон акцептора, если его коэффициент низкий вымирания является не вопросом.

Одним из основных ограничений этот assay что PMS/WST-1 и DPIP может быть уменьшен несколькими электрона донорами, такими как NAD (P) H, аскорбат и флавоноиды как кверцетин и мирицетин19,,33-34. Однако, это может быть преодолено путем добавления ферментов (например, SOD, AO) или ингибиторов, чтобы определить конкретный вклад PMS/WST-1 или DPIP сокращения. Еще одним ограничением является, что DPIP может выступать в качестве субстрата для АО и SOD. Таким образом эти ферменты не должны использоваться в сочетании с DPIP для мониторинга tPMET. Дополнительное важное ограничение данного исследования является способность PMS и других велосипедистов редокс производить супероксид26,35,36. Это показано на рисунке 6. С другой стороны, PMS сам якобы не напрямую влияет на tPMET32. Кроме того Тан и Берридж32 показали, что ингибитор NADPH оксидаза (NOX), diphenyleneiodinium хлорид (DPI), можно подавить большинство WST-1 сокращения, предполагая, что ДОИ чувствительных tPMET может быть конкретной мерой NOX вклада к tPMET. Другое ограничение состоит в том, что мы видим небольшие изменения в оптической плотности при использовании WST-1. Мы обнаружили, что когда WST-1 свежий и клетки вырожденная, величайший изменения оптической плотности видно. Предыдущие исследования, проведенные в P388 клеточных линий показали, что количество Формазаны производства положительно коррелирует с ячейки номер21. Поэтому, чем больше вырожденная клетки затем большее сокращение WST-1. Это могут быть исправлены для путем нормализации мкг белка для каждой скважины.

Одно предостережение относительно этот assay является, что он предназначен прежде всего для оценки глобальных tPMET. Хотя это можно манипулировать для отслеживания множественных форм tPMET, например, измеряем аскорбат, более конкретных анализов может быть более подходящим, когда цель не требует измерения в контексте tPMET. Фокс пример, если супероксид основной интерес, есть целый ряд других возможностей для мониторинга супероксиддисмутаза, например использование датчиков, включая флуоресцентных зондов непроницаемой, aconitase и nitroblue tetrazolium37.

Существующих датчиков для мониторинга tPMET как DPIP, FeCN и ferricytochrome c, нынешних недостатков. Например снижение DPIP является субстратом для АО и SOD, FeCN имеет низкий Молярная вымирания коэффициент, который ограничивает его полезность в реальном времени анализов, и c тситохрома является дорогостоящим. Кроме того некоторые из этих датчиков может производить высокий фон, приводит к низкой чувствительности при измерении изменения поглощения32. WST-1 было показано, чтобы не быть субстрата для ферментов, таких как АО и SOD. Кроме того WST-1 имеет коэффициентом Высокая молярная вымирания и низких фоновых реакции, создавая более чувствительных tPMET assay. Продвигаясь вперед, этот assay может использоваться с широким спектром ингибиторов, чтобы лучше понять процесс tPMET, карта пути переноса электронов в строку данной ячейки и привести к лучшему пониманию как клетки окислительно-восстановительной среде поддерживается.

Важнейшие шаги настоящего Протокола включают в себя определение, что клетки готовы для экспериментов (~ 70% притока), а также делает пробирного реагентов, специально WST-1 и PMS, свежие для каждого assay. Важно также, чтобы вымыть клетки перед добавлением пробирного реагентов. DMEM, используемые в настоящем Протоколе не содержат аскорбиновая кислота, хотя мы дополняем дифференциации среднего с аскорбиновая кислота. Количество имеющихся средств массовой информации содержат аскорбиновая кислота. Однако клетки помыты перед добавлением пробирного реагентов, которые аскорбат бесплатно, чтобы удалить любые остаточные аскорбат с носителя. Как часть tPMET объясняется молекулярной измеряем (например, экспорт аскорбата), важно начать сразу же после добавления реагента assay так, чтобы не пропустить первые моменты измеряем спектрофотометрические чтений. Кроме того важно включить фон скважин для каждого индивидуального реагента в эксперименте. Пробирного компонентов, описанных в данном документе вызвало изменения незначительным фона в поглощения. Однако некоторые добавки (например, Флоретин) могут способствовать существенной фон реакции. Таким образом важно, что фон вычитается из, когда данные анализируются, чтобы устранить любые смешанные эффекты, которые сами реагентов может привести.

Таким образом протокол, представленные здесь предоставляет средства оценки tPMET и предлагает ряд предостережений и аспекты протокола, который следует учитывать при применении assay различных клеточных линий и/или оценке конкретных авторов ( аскорбат и супероксиддисмутаза, используемый здесь) на tPMET.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Мы хотели бы поблагодарить Томас Белл, Lyn Mattathil, Марк Манино и Neej Patel за их техническую поддержку. Эта работа была поддержана Служба общественного здравоохранения США награду R15DK102122 из Национального института диабета и пищеварения и заболевания почек (NIDDK) Джонатан Fisher. Рукопись содержание является исключительно ответственности авторов и не обязательно отражают официальную точку зрения NIDDK или национальных институтов здравоохранения.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C2C12 myoblasts American Type Culture Collection  CRL-1772
Dulbecco's modified eagle's medium - low glucose Sigma D6046
Fetal Plex animal serum complex Gemini Bio-Products  100-602
penicillin-streptomycin Sigma 516106
horse serum Gibco Technologies 16050-130
Dulbecco's phosphate buffered saline Sigma D8537
trypsin-EDTA Sigma T4049
15 cm culture dishes TPP 93150
96 well culture plates TPP 92096
2-(4-Iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium Sodium Salt (WST-1) Accela ChemBio  Inc SY016315
phenazine methosulfate  Sigma P9625
L-ascorbic acid Sigma A5960
ascorbate oxidase  Sigma A0157
superoxide dismutase  Sigma S5395
2,6-dichloroindophenol sodium salt  ICN Biomedicals 215011825
D-(+)-glucose Sigma G7528
HEPES sodium salt Sigma H3784
sodium chloride Sigma S7653
potassium chloride Fisher Scientific  BP366
magnesium sulfate heptahydrate Sigma M5921
calcium chloride dihydrate Sigma C7902
potassium phosphate Fisher Scientific  BP363
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific 23225
Powerwave X-I spectrophotometer Biotek Insturments discontinued 
Spectronic Genesys 5 Spectrophotometer Thermo Scientific 336001
PureGrade 96-well microplate, F-bottom, clear, untreated, non-sterile MidSci 781602
Iron (II) chloride tetrahydrate Sigma 220299
Iron (II) sulfate heptahydrate Sigma 215422
hypoxanthine Sigma H9636
xanthine oxidase Sigma X4500
Excel Microsoft
R Studio Rstudio https://www.rstudio.com/products/rstudio/
KC4 Biotek Insturments discontinued 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kilberg, M. S., Christensen, H. N. Electron-transferring enzymes in the plasma membrane of the Ehrlich ascites tumor cell. Biochemistry. 18 (8), 1525-1530 (1979).
  2. Crane, F. L., Roberts, H., Linnane, A. W., Low, H. Transmembrane ferricyanide reduction by cells of the yeast Saccharomyces cerevisiae. J Bioenerg Biomembr. 14 (3), 191-205 (1982).
  3. Craig, T. A., Crane, F. L. Evidence for trans-plasma membrane electron transport system in plact cells. Proc. Indiana Acad. Sci. 90, 150-155 (1981).
  4. Mishra, R. K., Passow, H. Induction of intracellular ATP synthesis by extracellular ferricyanide in human red blood cells. J Membr Biol. 1 (1), 214-224 (1969).
  5. Crane, F. L., Sun, I. L., Clark, M. G., Grenbing, C., Low, H. Transplasma-membrane redox systems in growth and development. Biochim Biophys Acta. 811, 233-264 (1985).
  6. Berridge, M. V., Tan, A. S. Trans-plasma membrane electron transport: a cellular assay for NADH- and NADPH-oxidase based on extracellular, superoxide-mediated reduction of the sulfonated tetrazolium salt WST-1. Protoplasma. 205 (1-4), 74-82 (1998).
  7. Eccardt, A. M., et al. Trans-plasma membrane electron transport and ascorbate efflux by skeletal muscle. Antioxidants. 6 (4), 89 (2017).
  8. Sun, I. L., Navas, P., Crane, F. L., Morre, D. J., Low, H. NADH diferric transferrin reductase in liver plasma membrane. J Biol Chem. 262 (33), 15915-15921 (1987).
  9. Larm, J. A., Vaillant, F., Linnane, A. W., Lawen, A. Up-regulation of the plasma membrane oxidoreductase as a prerequisite for the viability of human Namalwa rho 0 cells. J Biol Chem. 269 (48), 30097-30100 (1994).
  10. Inman, R. S., Coughlan, M. M., Wessling-Resnik, M. Extracellular ferrireductase activity of K562 cells is coupled to transferrin-independent iron transport. Biochemistry. 33, 11850-11857 (1994).
  11. Castillo-Olivares, A., Esteban del Valle, A., Marquez, J., Nunez de Castro, I., Medina, M. A. Ehrlich cell plasma membrane redox system is modulated through signal transduction pathways involving cGMP and Ca2+ as second messengers. J Bioenerg Biomembr. 27 (6), 605-611 (1995).
  12. Medina, M. A., del Castillo-Olivares, A., Nunez de Castro, I. Multifunctional plasma membrane redox systems. Bioessays. 19 (11), 977-984 (1997).
  13. Medina, M. A., del Castillo-Olivares, A., Schweigerer, L. Plasma membrane redox activity correlates with N-myc expression in neuroblastoma cells. FEBS Lett. 311 (2), 99-101 (1992).
  14. Diaz-Gomez, C., Villalba, J. M., Perez-Vicente, R., Crane, F. Ascorbate Stabilization Is Stimulated in rho(0)HL-60 Cells by CoQ10 Increase at the Plasma Membrane. Biochem Biophys Res Commun. 234 (0), 79-81 (1997).
  15. Navarro, F., et al. Protective role of ubiquinone in vitamin E and selenium-deficient plasma membranes. Biofactors. 9 (2-4), 163-170 (1999).
  16. Herst, P. M., Berridge, M. V. Cell surface oxygen consumption: a major contributor to cellular oxygen consumption in glycolytic cancer cell lines. Biochim Biophys Acta. 1767 (2), 170-177 (2007).
  17. Baoutina, A., Dean, R. T., Jessup, W. Trans-plasma membrane electron transport induces macrophage-mediated low density lipoprotein oxidation. FASEB J. 15 (9), 1580-1582 (2001).
  18. Furukawa, S., et al. Increased oxidative stress in obesity and its impact on metabolic syndrome. J Clin Invest. 114 (12), 1752-1761 (2004).
  19. Del Principe, D., Avigliano, L., Savini, I., Catani, M. V. Trans-plasma membrane electron transport in mammals: functional significance in health and disease. Antioxid Redox Signal. 14 (11), 2289-2318 (2011).
  20. Berridge, M. V., Tan, A. S. High-Capacity Redox Control at the Plasma Membrane of Mammalian Cells Trans-Membrane, Cell Surface, and Serum NADH-Oxidases. Antioxidants & Redox Signaling. 2 (2), 231-242 (2000).
  21. Ishiyama, M., Shiga, M., Sasamoto, K., Mizoguchi, M., He, P. G. A New Sulfonated Tetrazolium Salt That Produces a Highly Water-Soluble Formazan Dye. Chemical & Pharmaceutical Bulletin. 41 (6), 1118-1122 (1993).
  22. Berridge, M. V., Herst, P. M., Tan, A. S. Tetrazolium dyes as tools in cell biology: New insights into their cellular reduction. Biotechnology Annual Review. 11, 127-152 (2005).
  23. Gurtoo, H. L., Johns, D. G. On the interaction of the electron acceptor 2,6-dichlorophenolindophenol with bovine milk xanthine oxidase. J Biol Chem. 246 (2), 286-293 (1971).
  24. Tan, A. S., Berridge, M. V. Distinct trans-plasma membrane redox pathways reduce cell-impermeable dyes in HeLa cells. Redox Rep. 9 (6), 302-306 (2004).
  25. R: A language and environment for statistical computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. (2013).
  26. Peskin, A. V., Winterbourn, C. C. A microtiter plate assay for superoxide dismutase using a water-soluble tetrazolium salt (WST-1). Clinica Chimica Acta. 293 (1-2), 157-166 (2000).
  27. Higaki, Y., et al. Oxidative stress stimulates skeletal muscle glucose uptake through a phosphatidylinositol 3-kinase-dependent pathway. Am J Physiol Endocrinol Metab. 294 (E889-E897), (2008).
  28. Zuagg, W. Spectroscopic characteristics and some chemical propertiesof N-methylphenazinium methyl sulfate (phenazine methosulfate) and pyocyanine at the oxidation level. J Biol Chem. 239 (11), 3964-3970 (1964).
  29. Dayan, J., Dawson, C. R. Substrate specificity of ascorbate oxidase. Biochem Biophys Res Commun. 73 (2), 451-458 (1976).
  30. Bellavite, P., della Bianca, V., Serra, M. C., Papini, E., Rossi, F. NADPH oxidase of neurtrophils forms superoxide anion but does not reduce cytochrome c and dichlorophenolindophenol. FEBS. 170 (1), 157-161 (1984).
  31. Berridge, M. V., Tan, A. S., McCoy, K. D., Wang, R. The biochemical and cellular basis of cell proliferation assays that use tetrazolium salts. Biochemica. 4, 15-20 (1996).
  32. Tan, A. S., Berridge, M. V. Superoxide produced by activated neutrophils efficiently reduces the tetrazolium salt, WST-1 to produce a soluble formazan: a simple colorimetric assay for measuring respiratory burst activation and for screening anti-inflammatory agents. J Immunol Methods. 238 (1-2), 59-68 (2000).
  33. Phillips, P. A., et al. Myricetin induces pancreatic cancer cell death via the induction of apoptosis and inhibition of the phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) signaling pathway. Cancer Letters. 308 (2), 181-188 (2011).
  34. Altundag, E., et al. Quercetin-induced cell death in human papillary thyroid cancer (B-CPAP) cells. Journal of thyroid research. 2016 (8), (2015).
  35. Ukeda, H., Kawana, D., Maeda, S., Sawamura, M. Spectrophotometric Assay for Superoxide Dismutase Based on the Reduction of Highly Water-soluble Tetrazolium Salts by Xanthine-Xanthine Oxidase. Biosci Biotechnol Biochem. 63 (3), 485-488 (1999).
  36. Halaka, F. G., Babcock, G. T., Dye, J. L. Properties of 5-methylphenazinium methyl sulfate. Reaction of the oxidized form with NADH and of the reduced form with oxygen. J Biol Chem. 257 (3), 1458-1461 (1982).
  37. Maghzal, G. J., Krause, K. H., Stocker, R., Jaquet, V. Detection of reactive oxygen species derived from the family of NOX NADPH oxidases. Free Radic Biol Med. 53 (10), 1903-1918 (2012).

Tags

Биохимия выпуск 135 tPMET WST-1 DPIP аскорбиновая кислота супероксиддисмутаза C2C12 myotubes спектрофотометрические пробирного
Измерения транс плазмы мембраны переноса электронов, C2C12 Myotubes
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kelly, S. C., Eccardt, A. M.,… More

Kelly, S. C., Eccardt, A. M., Fisher, J. S. Measuring Trans-Plasma Membrane Electron Transport by C2C12 Myotubes. J. Vis. Exp. (135), e57565, doi:10.3791/57565 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter