Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Mäta Trans-Plasma membran elektrontransport av C2C12 Myotubes

Published: May 4, 2018 doi: 10.3791/57565
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Biology, Saint Louis University
* These authors contributed equally

Summary

Målet med detta protokoll är att spektrofotometriskt övervaka trans-plasma membran elektrontransport utnyttja extracellulära Elektronacceptorer och analysera enzymatisk samspel som kan uppstå med dessa extracellulära Elektronacceptorer.

Abstract

Trans-plasma membran elektrontransport (tPMET) spelar en roll i skyddet av celler från intracellulära reduktiv stress samt skydd mot skador av extracellulära oxidanter. Denna process för transport av elektroner från intracellulära reduktionsmedel till extracellulära oxidanter är inte väldefinierade. Här presenterar vi spektrofotometrisk analyser av C2C12 myotubes att övervaka tPMET utnyttja de extracellulära Elektronacceptorer: vattenlösliga tetrazolium salt-1 (WST-1) och 2,6-dichlorophenolindophenol (DPIP eller DCIP). Genom minskning av dessa Elektronacceptorer har vi möjlighet att övervaka denna process i en realtidsanalys. Med tillägg av enzymer såsom askorbinsyra oxidas (AO) och superoxiddismutas (SOD) att analyserna, kan vi avgöra vilken del av tPMET beror askorbat produktion för export eller superoxid, respektive. Medan WST-1 visades att producera stabila resultat med låg bakgrund, kunde DPIP vara åter oxiderat efter tillsats av AO och SOD, vilket visades med spektrofotometrisk analys. Denna metod visar en realtid, flera, snabb spektrofotometrisk analysen med fördelar jämfört med andra metoder som används för att övervaka tPMET, såsom Kaliumferricyanid (FeCN) och ferricytochrome c minskning.

Introduction

Renat plasma membran förmåga att minska Elektronacceptorer har lett till att plasmamembranet har en inneboende redox kapacitet1. TPMET tidigare sett i svampar, växter och djur, och är en process som är gemensamma för flera organismer2,3,4,5. Specifikt, har denna process visats i Saccharomyces cerevisiae, morot celler, erytrocyter, lymfocyter, osteosarkom, melanom, makrofager, skelettmuskel och neutrofiler2,3, 4 , 5 , 6 , 7. en process som transporterar elektroner över plasmamembranet att minska extracellulära oxidanter, tPMET är involverad i många cellulära funktioner inklusive: cell tillväxt5,8, cell livskraft9, järn ämnesomsättningen10, cell signalering11,12,13och skydd från reaktivt syre arter12,14,15. På grund av Tpmet's medverkan i många cellulära funktioner, har en obalans i tPMET antagit hypotesen för att bidra till utvecklingen av vissa allvarliga hälsotillstånd, inklusive cancer16, hjärt-kärlsjukdom17, och metaboliska syndrom18.

Det finns flera sätt att övervaka överföring av elektroner över plasmamembranet, men den mest använda tekniken är att bedöma minskningen av extracellulära Elektronacceptorer genom kolorimetrisk analyser. Vanligen används extracellulära Elektronacceptorer är tetrazolium salter, DPIP, FeCN och ferricytochrome c19,20. Det vanligaste tetrazolium saltet är en andra generationens salt känd som WST-119. Denna förening är lättare att utnyttja kolorimetriska analyser jämfört med första generationens tetrazolium salter på grund av två sulfonat grupper, som ökar dess vatten löslighet21. WST-1, reduceras jämförd med den mellanliggande elektron acceptorn 1-metoxi-phenazine metosulfat (mPMS), i två single-elektronöverföring händelser. Denna minskning ändrar svagt färgade oxiderade form av WST-1 till en mer intensiv, gul formazan20,22. WST-1 har en hög molar extinktionskoefficient 37 x 103 M-1cm-1, vilket leder till en hög assay känslighet21,22. DPIP utnyttjas också som en extracellulär Elektronacceptor att övervaka tPMET. Det har visat att DPIP kan minskas extracellularly genom tPMET utan hjälp av mellanliggande elektron acceptorer23,24. På grund av mellanliggande Elektronacceptorer, DPIP direkt kan pickupen elektroner från plasmamembranet, till skillnad från WST-124. Liknar DPIP, FeCN har visat att minskas extracellularly till kaliumferrocyanid genom tPMET utan hjälp av mellanliggande elektron acceptorer19,24. Till skillnad från WST-1 och DPIP har FeCN en låg molar extinktionskoefficient leder till en lägre analysens känslighet9. En annan vanligt förekommande extracellulära Elektronacceptor att övervaka tPMET är ferricytochrome c. liknar WST-1, ferricytochrome c minskning ökar med användning av mellanliggande Elektronacceptor, mPMS22. Till skillnad från WST-1 dock är ferricytochrome c metoden mindre känslig på grund av en hög bakgrund och en låg molar absorption koefficient22.

Här presenterar vi en metod för realtidsanalys av tPMET genom spektrofotometrisk analyser. Metoden utnyttjas de extracellulära Elektronacceptorer WST-1 och DPIP, som de båda har en hög molar extinktionskoefficient medan att vara mindre dyr jämfört med andra ofta används extracellulära Elektronacceptorer såsom ferricytochrome c. Vi utnyttjade phenazine metosulfat (PMS) i stället för mPMS de har en liknande kemisk makeup och PMS är betydligt billigare. mPMS är photochemically stabila vilket ett viktigt kännetecken för en kommersiell kit som behöver en lång hållbarhet. Men gör vi PMS färska för varje analys, så stabilitet inte bör vara ett problem. Vi presenterar också en metod för att utvärdera möjliga enzymatisk interaktioner (se figur 1) mellan extracellulära Elektronacceptor och enzymer som kan utnyttjas för att ytterligare karakterisera processen för tPMET. Specifikt, avgöra de enzymer som AO och SOD kan användas som del av tPMET beror på askorbat transport eller extracellulära superoxid release, två vanliga metoder för elektronerna transporteras över plasmamembranet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Obs: Se figur 1 för en schematisk översikt av viktiga steg.

1. WST-1 minskning Assay

  1. Växa och differentiera C2C12 vidhäftande celler använder standard cell kultur förfaranden7 i en plattan med 96 brunnar utnyttja rader A-F.
    1. Använd en differentiering medel bestående av Dulbeccos modifierade örnens Medium (DMEM) kompletteras med 2% häst serum, 100 U/mL penicillin och 0,1 mg/mL streptomycin. Inkubera cellerna vid 37 ° C med 5% CO2.
    2. När övervakning askorbat inblandning i tPMET, komplettera differentiering media med 100 µM askorbinsyra. Tillåta celler att ruva i differentiering media för ~ 24-48 h.
  2. Förbereda stamlösningar WST-1 och PMS.
    1. För att göra en 10 mM lager av WST-1, Lös 0.033 g WST-1 (formeln vikt (FW): 651.34 g/mol) i 5 mL av fosfat buffrad saltlösning (PBS). Förvaras vid 4 ° C.
    2. För att göra en 5 mM lager av PMS, Lös 0.0023 g PMS (FW: 306.34 g/mol) i 1,5 mL avjoniserat H2O (Dihs2O). Förvaras vid-20 ° C och skyddas från ljus.
  3. Lägga till 0.0108 g glukos till en slutkoncentration på 5 mM till 11,4 mL PBS eller HEPES buffrad koksaltlösning (HBS; 20 mM HEPES natrium salt, 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2,5 mM MgSO4, 1 mM CaCl2). Tillsätt 480 µL 10 mm WST-1 för en slutlig koncentration på 400 µM och 48 µL av 5 mM PMS för en slutlig koncentration på 20 µM.
  4. När övervakning askorbat inblandning i tPMET, dela upp lösningen i två 6 mL portioner. Till en alikvot, tillsätt 6 µL Dihs2O och den andra alikvoten lägga till 6 µL av 2 kU/mL AO för en slutlig koncentration på 2 U/mL.
  5. När övervakning superoxid inblandning i tPMET, dela upp lösningen i två 6 mL portioner. En alikvot, tillsätt 55 µL 0,1 M KPO4 buffert och att den andra alikvoten lägga till 55 µL av 6,5 kU/mL SOD för en slutlig koncentration på 60 U/mL.
  6. Tvätta cellerna med PBS. Aspirera media och tillsätt 150 µL PBS. Sedan aspirera PBS.
    Obs: Analysen görs med guldpläterade, bifogade celler. Det finns således ingen centrifugering eller användning av trypsin i tvättprocessen.
  7. Tillsätt 100 µL av WST-1-lösning (-) SOD eller (-) AO till kolumner 1-6 och tillsätt 100 µL WST-1 lösning (+) SOD eller (+) AO till kolumner 7-12 i plattan med 96 brunnar. Använda rader G och H som bakgrund kontroller (dvs.att övervaka förändringar i absorbansen i reagensen ensam i brunnar utan celler).
  8. Mät absorbansvärdena med spektrofotometern varje 10 min för 1 h på 438 nm.
  9. Efter behandlingen aspirera media och tvätta vart bra med 150 µL av PBS. Sedan aspirera PBS.
  10. Beräkna förändringen i absorbansen för varje brunn genom att subtrahera inledande absorbansen för en brunn från absorbansen vid någon tidpunkt för det brunnen. Korrigera denna förändring för förändringen i absorbans (om någon) som observerats i bakgrunden brunnarna (dvs, brunnar med analyslösningen men inga celler).
  11. För analys, normalisera absorbansen data till 60 min kontrollmätning eller Tvätta brunnarna med PBS eller HBS och sedan utföra en bicinchoninic syra (BCA) protein assay.
  12. Lägg till 2 mg/mL bovint serumalbumin (BSA) standard (varierar från 0,5-2 µL för standardkurvan, beroende på graden av sammanflödet av cellerna) till de tomma brunnarna (rader G och H), sedan lägga till BCA reagenset i alla brunnar.
  13. Kvantifiera data via nmol WST-1 minskning per µg av protein. Använda 37 mM-1 cm-1 22 som extinktionskoefficient för minskad WST-1 på 438 nm.

2. DPIP minskning Assay

  1. Växa och differentiera C2C12 vidhäftande celler med samma förfarande som steg 1,1.
  2. Bered lager 10 mM DPIP enligt följande. Lös 0,029 g DPIP (FW: 290.08 g/mol) i 10 mL Dihs2O. bekräfta koncentrationen av DPIP genom att mäta absorbansen vid 600 nm med en spektrofotometer. Använda 1 mM-1 cm-1 23 som utrotning koefficienten för minskad DPIP på 600 nm. Förvaras vid 4 ° C.
  3. Lägga till 0.0108 g glukos 11.880 mL PBS för en slutlig koncentration på 5 mM. Tillsätt 120 µL 10 mM DPIP för en slutlig koncentration på 100 µM.
  4. När övervakning askorbat inblandning i tPMET, dela upp lösningen i två 6 mL portioner. Till en alikvot, tillsätt 6 µL Dihs2O och den andra alikvoten lägga till 6 µL av 2 kU/mL AO för en slutlig koncentration på 2 U/mL.
  5. När övervakning superoxid inblandning i tPMET, dela upp lösningen i två 6 mL portioner. En alikvot, tillsätt 55 µL 0,1 M KPO4 buffert och att den andra alikvoten lägga till 55 µL av 6,5 kU/mL SOD för en slutlig koncentration på 60 U/mL.
  6. Aspirera media och tvätta cellerna i 150 µL av PBS. Aspirera PBS och tillsätt 100 µL av DPIP lösning (-) SOD eller (-) AO till kolumner 1-6 och tillsätt 100 µL DPIP lösning (+) SOD eller (+) AO till kolumner 7-12 i plattan med 96 brunnar. Använda rader G och H kommer som bakgrund kontroller (dvs.att övervaka förändringar i absorbansen i reagensen ensam i brunnar utan celler).
  7. Mät absorbansen vid 600 nm med spektrofotometer varje 10 min för 1 h. kvantifiera förändringen i absorbansen i förhållande till kontrollen vid 60 min liknar steg 1,9-1.13.

3. bestämning av om minskad Elektronacceptorer är substrat för AO eller SOD

  1. 5.436 mL PBS eller HBS, tillsätt 240 µL 10 mm WST-1 för en slutlig koncentration på 400 µM och 24 µL av 5 mM PMS för en slutlig koncentration på 20 µM.
    1. För DPIP, tillsätt 60 µL 10 mM DPIP, för en slutlig koncentration på 100 µM, i 5.940 mL PBS eller HBS.
  2. Tillsätt 100 µL av lösning till varje brunn i en platt botten plattan med 96 brunnar i avsaknad av celler och Mät absorbansen i en spektrofotometer vid 438 nm, för WST-1 eller 600 nm, för DPIP.
  3. Tillsätt 1 µL 10 mM askorbat till hälften av brunnarna för en slutlig koncentration på 100 μM. Övervaka absorbansen tills det stabiliserar.
  4. Vid stabilisering, tillsätt 1 µL 200 U/mL AO för en slutlig koncentration på 2 U/mL till varje brunn eller tillsätt 1 µL av 6 kU/mL SOD för en slutlig koncentration på 60 U/mL till varje brunn och övervaka absorbansen för 1 h.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Statistiken utfördes med ANOVA med upprepad åtgärder använder RStudio statistisk programvara25. Urvalsstorlekar indikeras i figur legender.

För att övervaka tPMET, utnyttjades C2C12 myotubes tillsammans med extracellulära Elektronacceptorer, WST-1 och DPIP. AO användes för att avgöra vilken del av WST-1 och DPIP minskningen hade askorbat efflux och SOD användes för att avgöra vilken del av WST-1 minskning berodde på extracellulära superoxid release. Som visas i figur 2, klarar C2C12 myotubes av tPMET som ses av en minskning av WST-1. Med tillägg av AO, var WST-1 minskning undertryckt av ~ 30% vilket indikerar att ~ 30% av tPMET berodde på export av askorbat (figur 2A). Med tillägg av SOD, var WST-1 minskning undertryckt av ~ 70%, vilket indikerar att ~ 70% av tPMET förföll till extracellulära superoxid release (figur 2B). När DPIP utnyttjades som en extracellulär Elektronacceptor med tillägg av AO, DPIP minskning var undertryckt över 100% (figur 3). Detta väckte frågor om giltigheten av använder DPIP med AO för att bedöma bidrag av askorbat.

För att undersöka om minskad WST-1 är ett substrat för AO eller SOD, reducerades WST-1 med askorbinsyra. AO eller SOD lades och absorbansen övervakades. Efter 1 h fanns det ingen förändring i absorbansen mellan reducerad form av WST-1 utan AO eller SOD och reducerad form av WST-1 med AO eller SOD (figur 4A, B). Därför, den reducera WST-1 är inte ett substrat för dessa enzymer och användning av AO eller SOD i samband med WST-1 är lämpliga för bedömning av roller av askorbat eller superoxid, respektive.

För att avgöra om minskad DPIP är ett substrat för AO eller SOD, reducerades DPIP med askorbinsyra. Efter 20 min, AO lades och absorbansen övervakades. Reducerad DPIP visade sig vara ett substrat för AO, som kan ses i figur 5A, där DPIP återgår till sin oxiderade form inom 40 min. När SOD lades, var DPIP också åter oxiderat (figur 5B). Reducerad DPIP är därför ett substrat för dessa enzymer och inte en lämplig extracellulära Elektronacceptor utnyttjas med dessa enzymer.

Figure 1
Figur 1: en schematisk representation av de viktigaste stegen för elektrontransport analyserna och bestämning av enzymatisk interaktioner med de extracellulära Elektronacceptorer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: tillägg av AO och SOD undertrycker WST-1 minskning av C2C12 myotubes. (A) tPMET analyserades för 60 min med 400 µM WST-1 och 20 µM PMS med tillägg av 2 U/mL AO eller Dihs2O (N = 18/grupp). (B) tPMET analyserades för 60 min med tillsats 60 U/mL SOD eller 0,1 M KPO4 buffert (N = 36/grupp). p≥ 0,05 vid den angivna tidpunkten. Felstaplar representera standardavvikelsen för medelvärdet och kan vara för liten för att visualisera. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: tillägg av AO dämpar DPIP minskning av C2C12 myotubes. tPMET analyserades för 60 min med 100 µM DPIP med eller utan tillsats av 2 U/mL AO (N = 36/grupp). p≥ 0,05 vid den angivna tidpunkten. Felstaplar representera standardavvikelsen för medelvärdet och kan vara för liten för att visualisera. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: minskad WST-1 inte är ett substrat för AO eller SOD. (A) WST-1 reducerades med askorbat. Efter 45 min, AO lades och absorbansen övervakades för 1 h. Ingen förändring i absorbans observerades. (B) förfarandet är samma som ovan, utom SOD lades efter 45 min. Ingen förändring i absorbans observerades (N = 24/grupp). Felstaplar representera standardavvikelsen för medelvärdet och kan vara för liten för att visualisera. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: minskad DPIP är ett substrat för AO och SOD. (A) DPIP minskades med askorbat. Efter 20 min, AO lades och absorbansen övervakades. Inom 40 min, proverna återvände till sin ursprungliga absorbans, vilket indikerar att minskad DPIP är ett substrat för AO. (B) DPIP reducerades med askorbat. Efter 20 min, SOD lades och absorbansen övervakades. Över tiden, den reducerade DPIP var åter oxiderat, som visar att minskad DPIP är ett substrat för SOD (N = 24/grupp). Felstaplar representera standardavvikelsen för medelvärdet och kan vara för liten för att visualisera. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: Schematisk föreställande tPMET. I denna modell av tPMET, kan askorbat (eller en annan elektron bärare) exporteras av cellen minska extracellulära PMS. Dessutom genererar NADPH oxidases extracellulära superoxid, vilket kan minska WST-1 direkt eller minska det indirekt via reduktion av PMS. Elektroner från andra plasmamembranet givare kan också minska PMS, som kan donera elektroner till WST-1 eller O2 med efterföljande WST-1 minskning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi har lagt fram två metoder för att utnyttja extracellulära Elektronacceptorer, WST-1 och DPIP, spektrofotometrisk analyser att övervaka tPMET i C2C12 myotubes. Med tillväxten av cellinjer i standard kultur förfaranden och en spektrofotometer Plattläsare är det möjligt att övervaka tPMET med dessa Elektronacceptorer i en enkel mikroplattan-analys. WST-1 minskning är reproducerbara från väl-att-väl inom ett test, men det finns variation. Dagliga variationskoefficienten (CV) utnyttja PBS som bufferten är 0,18 och CV utnyttja HBS eftersom bufferten är 0,23.

Från tidigare litteratur utnyttja mPMS och WST-1, har vi ändrat detta protokoll, särskilt för användning av PMS. Således, felsökning ingår att fastställa de lämpliga koncentrationerna av PMS och WST-1 för användning med myotubes beskrivs. Vi har också konstaterat att temperaturen (i en rad 23-37 ° C) inte är en kritisk komponent för analysen, medan skaka plattan innan varje absorbansen läsning är viktigt. Dessa frågor bör dock utredas för andra cellinjer som analysen tillämpas. Resultaten avseende SOD och AO förmåga att direkt oxidera reducerade WST-1 tyder på att screening av nya assay komponenter för den här egenskapen är en viktig aspekt av felsökning.

Våra data tyder på att PMS bör utnyttjas i samband med WST-1 för att framkalla optimal WST-1 minskning. Vi hittade att i en 1 mL volym, 100 µM askorbat minskar 322 nmol WST-1 per minut i närvaro av PMS, som är nödvändiga för direkt reduktion av WST-1 askorbat. I en 1 mL volym oxiderar 2 U/mL AO askorbat uppgå till 4 400 nmol/s, eller 800 gånger snabbare än en minskning av WST-1 genom askorbat. Tydligt, enzymatisk aktivitet för AO är mycket snabbare än direkt reduktion av PMS/WST-1 genom askorbat. Vi förväntar oss att detsamma skulle följa för superoxid och SOD, även om vi inte har ett system för att mäta andelen absolut WST-1 minskning av superoxid.

För att avgöra huruvida införandet av PMS påverkar minskning av WST-1 genom superoxid, vi använde en xantin oxidas (4,5 mU/mL) / hypoxantin (0.1 mM) superoxid genererar systemet som tidigare beskrivs26,27. Införandet av PMS ungefär fördubblas andelen WST-1 minskning av detta system. Således förefaller det att PMS förmedlar överföring av elektroner från superoxid till WST-1.

För att ytterligare utvärdera kravet på PMS för cellulära WST-1 minskning, vi analyseras minskning i närvaro eller frånvaro av PMS och WST-1, och fann att PMS krävs för cellulära WST-1 minskning. När cellerna inkuberas i assay reagens som innehåller PMS ensam (i frånvaro av WST-1), finns det en ökning av absorbansen vid 438 nm. Detta återspeglar troligen en ansamling av semiquinone form av PMS (PMS-SQ) som har en topp absorbansen vid 440 nm28. Ansamling av PMS-SQ antyder att PMS minskar snabbare än det kan passera elektroner till O2 att producera superoxid. Ansamling av PMS-SQ är således förenligt med rapporterade långsam minskning av O2 av PMS-SQ jämfört med priset för fullt-minskad PMS28.

Vi har också lagt fram ett protokoll för att fastställa om Elektronacceptorer substrat för de enzymer som kan användas för att övervaka tPMET. Genom övervakning av minskningen av de extracellulära Elektronacceptorer i en spektrofotometer följt av tillägg av enzymet av intresse, är det möjligt att avgöra om Elektronacceptor är ett substrat för dessa enzymer. Genom denna metod, har vi visat att minskad DPIP är ett substrat för AO och SOD som anger att det inte är en lämplig Elektronacceptor för övervakning askorbat efflux och superoxid export.

Förfarandet för att testa huruvida assay komponenter såsom SOD eller AO skapa artefakter är en betydande förbättring jämfört med befintliga metoder. Exempelvis är minskad DPIP ett substrat för SOD, vilket tyder på att publicerade uppgifter som erhålls med användning av DPIP och SOD bör tolkas. Våra resultat stödjer tidigare forskning utförd av Dayan och Dawson som övervakades absorbans leuco 2,6-dichloroindophenol efter tillsats av AO: DPIP var oxiderat vilket indikerar att det är ett substrat för AO29. Men våra fynd lägga till sammanhang att forskning utförs av Tan och Berridge24, liksom Bellavite o.a. 30, som utnyttjas SOD hämma DPIP minskning. I en studie utförd av Tan och Berridge jämföra Elektronacceptorer WST-1, DPIP och FeCN i HeLa celler, såg de att minskningen av några av Elektronacceptorer var undertryckt i närvaro av SOD. Minskning av WST-1, i samband med mPMS, var hämmad ~ 80% i närvaro av SOD medan minskningen av DPIP hämmades av 40%. Minskning av FeCN, tillsammans med en alternativ mellanliggande Elektronacceptor, hämmades inte i närvaro av SOD24. När utvärdering av funktionsläget av elektron utbyte mellan NADPH oxidases och DPIP eller cytokrom c, Bellavite et al. fann att DPIP och cytokrom c minskas av NADPH oxidases och att denna minskning är betydligt hämmad av SOD30. Berridge och Tan har också visat att SOD kan hämma WST-1 minskning med 80% i mus celler linjer av 32Dcl23, WEHI3B, och J774 samt mänskliga cellinjer av Jurkat, MALME3M och 143B6,31. Med humana primära neutrofila celler minskningen WST-1 hämmade 95% i närvaro av SOD6,32.

Uppgifterna här tyder på att det är viktigt att kontrollera att enzymer som används för att bedöma specifika bidrag exporterade molekyler till tPMET åter inte kan oxidera reducerade form av den extracellulära Elektronacceptor. Vi hittade att (inga data anges) järnhaltiga klorid och järnsulfat inte var lösligt i PBS. I HBS och fenolrött-fri DMEM, var de snabbt oxideras, visar oförenlighet med HBS eller DMEM som assay media. Däremot AO och SOD använder inte kaliumferrocyanid som substrat, vilket tyder på att det är en lämplig extracellulära Elektronacceptor om dess låga extinktionskoefficient inte är en fråga.

En av de viktigaste begränsningarna av denna analys är att PMS/WST-1 och DPIP kan minskas genom flera Elektronoljedoseringar, såsom NAD (P) H, askorbat och flavonoider såsom quercetin och myricetin19,33,34. Men detta kan lösas genom tillsats av enzymer (t ex SOD, AO) eller hämmare att bestämma specifika bidragsgivare till minskning av PMS/WST-1 eller DPIP. En annan begränsning är att DPIP kan fungera som ett substrat för AO och SOD. Dessa enzymer bör således inte utnyttjas i samband med DPIP att övervaka tPMET. En ytterligare viktig begränsning av denna studie är andra redox cyclers och PMS förmåga att producera superoxid26,35,36. Detta illustreras i figur 6. Å andra sidan, PMS sig enligt uppgift har ingen direkt effekt på tPMET32. Tan och Berridge32 har dessutom visat att NADPH-oxidas (NOX) hämmare, diphenyleneiodinium klorid (DPI), kan undertrycka de flesta WST-1 minskning, vilket tyder på att en särskild åtgärd i NOX bidrag kan DPI-känsliga tPMET till tPMET. En annan begränsning är att vi ser små förändringar i absorbans när utnyttja WST-1. Vi har funnit att när WST-1 görs färsk och cellerna är konfluenta, ses den största förändringen i absorbans. Tidigare studier som utförts i P388 cellinjer har visat att mängden formazan produceras positivt korrelerat med cell nummer21. Därför, ju mer konfluenta cellerna är sedan desto större minskningen WST-1. Detta kan korrigeras för av normalisera till mikrogram av protein för varje brunn.

En varning angående denna analys är att det är främst avsett att bedöma globala tPMET. Även om det kan manipuleras för att övervaka flera former av tPMET, såsom exemplet med askorbat efflux, kan mer specifika analyser vara lämpligare när målet inte kräver mätningar inom ramen av tPMET. Fox exempel, om superoxid är Huvudintresset, finns det ett antal andra vägar att övervaka superoxid, såsom användning av sonder inklusive fluorescerande ogenomtränglig sonder, aconitase och nitroblue tetrazolium37.

Befintliga sonder för att övervaka tPMET såsom DPIP, FeCN och ferricytochrome c, nuvarande nackdelar. Exempelvis minskad DPIP är ett substrat för AO och SOD, FeCN har en låg molar extinktionskoefficient som begränsar dess användbarhet i realtid analyser och cytokrom c är kostsamt. Några av dessa sonder Dessutom kan producera hög bakgrund leder till låg känslighet vid mätning av en förändring i absorbans32. WST-1 har visat sig inte vara ett substrat för enzymer såsom AO och SOD. Dessutom har WST-1 en hög molar extinktionskoefficient och en låg bakgrund reaktion, att skapa en mer känslig tPMET analys. Denna analys går framåt, och kan utnyttjas med ett brett utbud av hämmare att bättre förstå processen för tPMET, karta sökvägen till elektrontransport i en viss cell linje och leda till bättre förståelse för hur en cell redox miljö upprätthålls.

Kritiska steg i detta protokoll omfattar fastställandet att cellerna är redo för experimenterande (~ 70% konfluenta) samt att göra analysreagenser, specifikt WST-1 och PMS, färska för varje analys. Det är också viktigt att tvätta cellerna före tillsats av analysreagenser. Den DMEM utnyttjas i detta protokoll innehåller inte askorbat, även om vi komplettera differentiering medium med askorbat. Ett antal tillgängliga media innehåller askorbat. Men tvättas cellerna innan de analysreagenser, som är fria från askorbat, ta bort eventuella kvarvarande ascorbate från mediet. Som en del av tPMET kan hänföras till molekylär efflux (t.ex. askorbat export), är det viktigt att starta spektrofotometrisk avläsningar omedelbart efter tillsats av assay reagens för att inte missa de första ögonblicken av efflux. Det är också viktigt att inkludera bakgrunden brunnar för varje enskild reagens i ett experiment. Assay beståndsdelar beskrivs i denna uppsats orsakade försumbar bakgrund förändring i absorbans. Dock kan vissa tillsatser (t.ex. phloretin) främja en betydande bakgrund reaktion. Det är därför viktigt att bakgrunden dras ut när data analyseras för att eliminera eventuella störande effekter som reagenserna som själva kan producera.

I sammanfattning, protokollet presenteras här tillhandahåller ett sätt att bedöma tPMET och föreslår ett antal varningar och aspekter av protokollet som bör beaktas vid tillämpningen av analysens olika cellinjer eller bedömning av specifika bidragsgivare ( ascorbaten och superoxid används här) till tPMET.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Vi skulle vilja tacka Thomas Bell, Lyn Mattathil, Mark Mannino och Neej Patel för deras tekniska support. Detta arbete stöds av United States Public Health Service award R15DK102122 från nationella institutet för Diabetes och mag- och njur sjukdomar (NIDDK) till Jonathan Fisher. Manuskriptet innehållet ansvarar enbart för författarna och representerar inte nödvändigtvis officiella åsikter NIDDK eller National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C2C12 myoblasts American Type Culture Collection  CRL-1772
Dulbecco's modified eagle's medium - low glucose Sigma D6046
Fetal Plex animal serum complex Gemini Bio-Products  100-602
penicillin-streptomycin Sigma 516106
horse serum Gibco Technologies 16050-130
Dulbecco's phosphate buffered saline Sigma D8537
trypsin-EDTA Sigma T4049
15 cm culture dishes TPP 93150
96 well culture plates TPP 92096
2-(4-Iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium Sodium Salt (WST-1) Accela ChemBio  Inc SY016315
phenazine methosulfate  Sigma P9625
L-ascorbic acid Sigma A5960
ascorbate oxidase  Sigma A0157
superoxide dismutase  Sigma S5395
2,6-dichloroindophenol sodium salt  ICN Biomedicals 215011825
D-(+)-glucose Sigma G7528
HEPES sodium salt Sigma H3784
sodium chloride Sigma S7653
potassium chloride Fisher Scientific  BP366
magnesium sulfate heptahydrate Sigma M5921
calcium chloride dihydrate Sigma C7902
potassium phosphate Fisher Scientific  BP363
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific 23225
Powerwave X-I spectrophotometer Biotek Insturments discontinued 
Spectronic Genesys 5 Spectrophotometer Thermo Scientific 336001
PureGrade 96-well microplate, F-bottom, clear, untreated, non-sterile MidSci 781602
Iron (II) chloride tetrahydrate Sigma 220299
Iron (II) sulfate heptahydrate Sigma 215422
hypoxanthine Sigma H9636
xanthine oxidase Sigma X4500
Excel Microsoft
R Studio Rstudio https://www.rstudio.com/products/rstudio/
KC4 Biotek Insturments discontinued 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kilberg, M. S., Christensen, H. N. Electron-transferring enzymes in the plasma membrane of the Ehrlich ascites tumor cell. Biochemistry. 18 (8), 1525-1530 (1979).
  2. Crane, F. L., Roberts, H., Linnane, A. W., Low, H. Transmembrane ferricyanide reduction by cells of the yeast Saccharomyces cerevisiae. J Bioenerg Biomembr. 14 (3), 191-205 (1982).
  3. Craig, T. A., Crane, F. L. Evidence for trans-plasma membrane electron transport system in plact cells. Proc. Indiana Acad. Sci. 90, 150-155 (1981).
  4. Mishra, R. K., Passow, H. Induction of intracellular ATP synthesis by extracellular ferricyanide in human red blood cells. J Membr Biol. 1 (1), 214-224 (1969).
  5. Crane, F. L., Sun, I. L., Clark, M. G., Grenbing, C., Low, H. Transplasma-membrane redox systems in growth and development. Biochim Biophys Acta. 811, 233-264 (1985).
  6. Berridge, M. V., Tan, A. S. Trans-plasma membrane electron transport: a cellular assay for NADH- and NADPH-oxidase based on extracellular, superoxide-mediated reduction of the sulfonated tetrazolium salt WST-1. Protoplasma. 205 (1-4), 74-82 (1998).
  7. Eccardt, A. M., et al. Trans-plasma membrane electron transport and ascorbate efflux by skeletal muscle. Antioxidants. 6 (4), 89 (2017).
  8. Sun, I. L., Navas, P., Crane, F. L., Morre, D. J., Low, H. NADH diferric transferrin reductase in liver plasma membrane. J Biol Chem. 262 (33), 15915-15921 (1987).
  9. Larm, J. A., Vaillant, F., Linnane, A. W., Lawen, A. Up-regulation of the plasma membrane oxidoreductase as a prerequisite for the viability of human Namalwa rho 0 cells. J Biol Chem. 269 (48), 30097-30100 (1994).
  10. Inman, R. S., Coughlan, M. M., Wessling-Resnik, M. Extracellular ferrireductase activity of K562 cells is coupled to transferrin-independent iron transport. Biochemistry. 33, 11850-11857 (1994).
  11. Castillo-Olivares, A., Esteban del Valle, A., Marquez, J., Nunez de Castro, I., Medina, M. A. Ehrlich cell plasma membrane redox system is modulated through signal transduction pathways involving cGMP and Ca2+ as second messengers. J Bioenerg Biomembr. 27 (6), 605-611 (1995).
  12. Medina, M. A., del Castillo-Olivares, A., Nunez de Castro, I. Multifunctional plasma membrane redox systems. Bioessays. 19 (11), 977-984 (1997).
  13. Medina, M. A., del Castillo-Olivares, A., Schweigerer, L. Plasma membrane redox activity correlates with N-myc expression in neuroblastoma cells. FEBS Lett. 311 (2), 99-101 (1992).
  14. Diaz-Gomez, C., Villalba, J. M., Perez-Vicente, R., Crane, F. Ascorbate Stabilization Is Stimulated in rho(0)HL-60 Cells by CoQ10 Increase at the Plasma Membrane. Biochem Biophys Res Commun. 234 (0), 79-81 (1997).
  15. Navarro, F., et al. Protective role of ubiquinone in vitamin E and selenium-deficient plasma membranes. Biofactors. 9 (2-4), 163-170 (1999).
  16. Herst, P. M., Berridge, M. V. Cell surface oxygen consumption: a major contributor to cellular oxygen consumption in glycolytic cancer cell lines. Biochim Biophys Acta. 1767 (2), 170-177 (2007).
  17. Baoutina, A., Dean, R. T., Jessup, W. Trans-plasma membrane electron transport induces macrophage-mediated low density lipoprotein oxidation. FASEB J. 15 (9), 1580-1582 (2001).
  18. Furukawa, S., et al. Increased oxidative stress in obesity and its impact on metabolic syndrome. J Clin Invest. 114 (12), 1752-1761 (2004).
  19. Del Principe, D., Avigliano, L., Savini, I., Catani, M. V. Trans-plasma membrane electron transport in mammals: functional significance in health and disease. Antioxid Redox Signal. 14 (11), 2289-2318 (2011).
  20. Berridge, M. V., Tan, A. S. High-Capacity Redox Control at the Plasma Membrane of Mammalian Cells Trans-Membrane, Cell Surface, and Serum NADH-Oxidases. Antioxidants & Redox Signaling. 2 (2), 231-242 (2000).
  21. Ishiyama, M., Shiga, M., Sasamoto, K., Mizoguchi, M., He, P. G. A New Sulfonated Tetrazolium Salt That Produces a Highly Water-Soluble Formazan Dye. Chemical & Pharmaceutical Bulletin. 41 (6), 1118-1122 (1993).
  22. Berridge, M. V., Herst, P. M., Tan, A. S. Tetrazolium dyes as tools in cell biology: New insights into their cellular reduction. Biotechnology Annual Review. 11, 127-152 (2005).
  23. Gurtoo, H. L., Johns, D. G. On the interaction of the electron acceptor 2,6-dichlorophenolindophenol with bovine milk xanthine oxidase. J Biol Chem. 246 (2), 286-293 (1971).
  24. Tan, A. S., Berridge, M. V. Distinct trans-plasma membrane redox pathways reduce cell-impermeable dyes in HeLa cells. Redox Rep. 9 (6), 302-306 (2004).
  25. R: A language and environment for statistical computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. (2013).
  26. Peskin, A. V., Winterbourn, C. C. A microtiter plate assay for superoxide dismutase using a water-soluble tetrazolium salt (WST-1). Clinica Chimica Acta. 293 (1-2), 157-166 (2000).
  27. Higaki, Y., et al. Oxidative stress stimulates skeletal muscle glucose uptake through a phosphatidylinositol 3-kinase-dependent pathway. Am J Physiol Endocrinol Metab. 294 (E889-E897), (2008).
  28. Zuagg, W. Spectroscopic characteristics and some chemical propertiesof N-methylphenazinium methyl sulfate (phenazine methosulfate) and pyocyanine at the oxidation level. J Biol Chem. 239 (11), 3964-3970 (1964).
  29. Dayan, J., Dawson, C. R. Substrate specificity of ascorbate oxidase. Biochem Biophys Res Commun. 73 (2), 451-458 (1976).
  30. Bellavite, P., della Bianca, V., Serra, M. C., Papini, E., Rossi, F. NADPH oxidase of neurtrophils forms superoxide anion but does not reduce cytochrome c and dichlorophenolindophenol. FEBS. 170 (1), 157-161 (1984).
  31. Berridge, M. V., Tan, A. S., McCoy, K. D., Wang, R. The biochemical and cellular basis of cell proliferation assays that use tetrazolium salts. Biochemica. 4, 15-20 (1996).
  32. Tan, A. S., Berridge, M. V. Superoxide produced by activated neutrophils efficiently reduces the tetrazolium salt, WST-1 to produce a soluble formazan: a simple colorimetric assay for measuring respiratory burst activation and for screening anti-inflammatory agents. J Immunol Methods. 238 (1-2), 59-68 (2000).
  33. Phillips, P. A., et al. Myricetin induces pancreatic cancer cell death via the induction of apoptosis and inhibition of the phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) signaling pathway. Cancer Letters. 308 (2), 181-188 (2011).
  34. Altundag, E., et al. Quercetin-induced cell death in human papillary thyroid cancer (B-CPAP) cells. Journal of thyroid research. 2016 (8), (2015).
  35. Ukeda, H., Kawana, D., Maeda, S., Sawamura, M. Spectrophotometric Assay for Superoxide Dismutase Based on the Reduction of Highly Water-soluble Tetrazolium Salts by Xanthine-Xanthine Oxidase. Biosci Biotechnol Biochem. 63 (3), 485-488 (1999).
  36. Halaka, F. G., Babcock, G. T., Dye, J. L. Properties of 5-methylphenazinium methyl sulfate. Reaction of the oxidized form with NADH and of the reduced form with oxygen. J Biol Chem. 257 (3), 1458-1461 (1982).
  37. Maghzal, G. J., Krause, K. H., Stocker, R., Jaquet, V. Detection of reactive oxygen species derived from the family of NOX NADPH oxidases. Free Radic Biol Med. 53 (10), 1903-1918 (2012).

Tags

Biokemi fråga 135 tPMET WST-1 DPIP askorbat superoxid C2C12 myotubes spektrofotometrisk assay
Mäta Trans-Plasma membran elektrontransport av C2C12 Myotubes
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kelly, S. C., Eccardt, A. M.,… More

Kelly, S. C., Eccardt, A. M., Fisher, J. S. Measuring Trans-Plasma Membrane Electron Transport by C2C12 Myotubes. J. Vis. Exp. (135), e57565, doi:10.3791/57565 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter