Summary
Bu iletişim kuralı spectrophotometrically trans-plazma membran elektron taşıma ekstraselüler elektron alıcısı kullanan izlemek ve bu hücre dışı elektron alıcısı ile oluşabilir enzimatik etkileşimleri analiz için hedeftir.
Abstract
Trans-plazma membran elektron taşıma (tPMET) hücre dışı oksidanlar ile hücre içi indirgeyici stres hücrelerden korunması hem de hasar koruma bir rol oynar. Bu işlem için hücre dışı oksidanlar hücre içi reductants elektron taşıma iyi tanımlanmış değildir. Burada hücre dışı elektron alıcısı kullanan tPMET izlemek için C2C12 myotubes tarafından spektrofotometrik deneyleri mevcut: suda çözünen tetrazolium tuz-1 (WST-1) ve 2,6-dichlorophenolindophenol (DPIP veya DCIP). Bu elektron alıcısı azaltılması, biz gerçek zamanlı analiz bu süreçte izlemek edebiliyoruz. Enzimler askorbat oksidaz (AO) ve süperoksit dismutaz (SOD) deneyleri için gibi eklenmesiyle, biz tPMET kısmını askorbat verme ya da süperoksit üretimi nedeniyle sırasıyla belirleyebilirsiniz. WST-1 düşük arka plan ile istikrarlı sonuçlar üretmek için gösterildi iken, DPIP AO ve spektrofotometrik analiz ile gösterilmiştir SOD eklenmesi sonra yeniden oksitlenmiş olmayı başardı. Bu yöntem bir gerçek zamanlı, çok iyi, hızlı spektrofotometrik tahlil tPMET, ferricyanide (FeCN) ve ferricytochrome c azaltma gibi izlemek için kullanılan diğer yöntemler üzerinde avantajları ile gösterilmektedir.
Introduction
Saf plazma membran elektron alıcısı azaltma becerisini plazma zarı doğasında Redoks kapasitesi1sahip görünümüne yol açmıştır. Daha önce görüldü mantar, bitki ve hayvan, tPMET bir işlemi birden çok organizmalar2,3,4,5' e ortak var. Saccharomyces cerevisiae, havuç hücreleri, eritrositler, lenfositler, osteosarkom, Melanom, makrofajlar, iskelet kası ve nötrofil2,3, bu işlem özellikle gösterilmiştir 4 , 5 , 6 , 7. hücre dışı oksidanlar azaltmak için plazma zarı arasında elektron taşıma bir süreç içinde tPMET de dahil olmak üzere birçok hücresel işlevler ilgilenmektedir: hücre büyüme5,8, hücre canlılığı9, demir metabolizma10,11,12,13ve Reaktif oksijen türleri12,14,15koruma sinyalizasyon hücre. Pek çok hücresel fonksiyon tPMET'ın katılımı nedeniyle, tPMET bir dengesizlik kanser16, kardiyovasküler hastalık17, dahil olmak üzere bazı ciddi sağlık koşulları, gelişimine katkıda bulunmak olan ve metabolik Sendromu18.
Plazma zarı arasında elektron transferi izlemek için birden çok yolu vardır, ancak en çok kullanılan teknik ekstraselüler elektron alıcısı Renkölçer deneyleri ile azalma değerlendirmek için. Yaygın olarak kullanılan hücre dışı elektron alıcısı tetrazolium tuzları, DPIP, FeCN ve ferricytochrome c19,20dir. En sık kullanılan tetrazolium WST-119bilinen ikinci nesil bir tuz tuzudur. Bu bileşik Renkölçer deneyleri ilk nesil tetrazolium tuzlar, su çözünürlük21artırmak iki Sülfonat grup nedeniyle göre kullanmak kolaydır. WST-1, iki tek-elektron transferi olaylar ara elektron alıcısı 1-metoksi-phenazine methosulfate (MPM), ile birlikte azalır. Bu azalma WST-1 zayıf renkli oksitlenmiş şeklinde bir daha yoğun, sarı formazan20,22' ye değişir. WST-1 37 x 103 M-1cm-1, yüksek molar tükenme katsayısı bir yüksek tahlil duyarlılık21,22' ye lider vardır. DPIP da tPMET izlemek için bir hücre dışı elektron alıcısı olarak kullanılmaktadır. Bu DPIP extracellularly tPMET ara elektron alıcısı23,24yardımı olmadan tarafından azaltılabilir gösterilmiştir. Ara elektron alıcısı olmaması nedeniyle DPIP doğrudan WST-124aksine plazma zarı pick-up elektron olabilir. Benzer şekilde DPIP, extracellularly ferrocyanide için tPMET ara elektron alıcısı19,24yardımı olmadan düşülmesi için FeCN gösterilmiştir. WST-1 ve DPIP, FeCN bir alt tahlil duyarlılık9için önde gelen bir düşük molar tükenme katsayısı vardır. TPMET izlemek için başka bir sık kullanılan hücre dışı elektron alıcısı ferricytochrome c. WST-1, ferricytochrome c azaltma artar ara elektron alıcısı, MPM22kullanımı ile benzer olduğunu. WST-1 olsa da, ferricytochrome c yöntemi yüksek bir arka plan ve düşük molar tükenme katsayısı22nedeniyle daha az duyarlıdır.
Burada tPMET spektrofotometrik deneyleri aracılığıyla gerçek zamanlı analiz için bir yöntem mevcut. Ekstraselüler elektron alıcısı ferricytochrome c gibi diğer yaygın olarak karşılaştırıldığında olmak daha ucuz kullanılan iken her ikisi de yüksek molar tükenme katsayısı gibi WST-1 ve DPIP, hücre dışı elektron alıcısı yöntemi kullanılmıştır. Biz phenazine methosulfate (PMS) kullanılan MPM'ler yerine onlar-si olmak benzer kimyasal makyaj ve PMS çok daha az pahalı. MPM'ler uzun bir raf ömrü ihtiyacı bir ticari kiti için önemli bir özelliği olan photochemically stabil. İstikrar sorunu olmamalı böylece Ancak, biz PMS her tahlil için taze olun. Biz de hücre dışı elektron alıcısı ve daha fazla tPMET süreci karakterize için kullanılması gereken enzimler arasındaki olası enzimatik etkileşimler (bkz. şekil 1) değerlendirmek için bir yöntem mevcut. Özellikle, AO ve SOD kullanılan enzimler tPMET kısmını askorbat taşıma veya hücre dışı süperoksit açıklaması, plazma zarı arasında taşınması elektron için iki yaygın yöntem nedeniyle belirlemek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Not: Resim 1 anahtar adımlar şematik bir bakış için bkz:.
1. WST-1 azaltma tahlil
- Standart hücre kültür yordamlar7 satır A-f kullanan bir 96-şey tabak içinde kullanarak C2C12 yapışık hücreleri ayırt etmek ve büyümek
- İn Dulbecco'nın modifiye kartal orta (%2 at serum, 100 U/mL penisilin ve 0.1 mg/mL streptomisin ile desteklenmiş DMEM) oluşan bir farklılaşma aracı kullanın. %5 CO237 ° C'de hücreler kuluçkaya.
- TPMET askorbat katılımı izlerken, farklılaşma medya 100 µM askorbik asit ile ek. Hücre farklılaşması medya ~ 24-48 için kuluçkaya izin h.
- Hisse senedi WST-1 ve PMS çözümleri hazırlayın.
- Bir 10 mM hisse senedi WST-1 yapmak için WST-1 0,033 g dağıtılması (formül ağırlık (FW): 651.34 g/mol) 5 mL fosfat tamponlu tuz (PBS). 4 ° C'de mağaza
- PMS 5 mM stokunun yapmak, PMS 0.0023 g dağıtılması (FW: 306.34 g/mol) 1,5 ml deiyonize H2O (diH2O). -20 ° C'de depolayın ve ışıktan korumak.
- İçin PBS veya HEPES 11,4 ml 5 mM son bir konsantrasyon arabelleğe alınmış serum glikoz 0.0108 g ekleyin (HBS; 20 mM HEPES sodyum tuz, 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2.5 mM MgSO4, 1 mM CaCl2). 10 mm WST-1 400 µM son bir konsantrasyon ve 5 mm PMS 20 µM son bir konsantrasyon için 48 µL için 480 µL ekleyin.
- TPMET askorbat katılımı izlerken, çözüm iki 6 mL aliquots bölün. Bir aliquot için Ekle diH2O 6 µL ve diğer aliquot olarak 2 kU/mL AO 2 U/mL nihai bir konsantrasyon için 6 µL ekleyin.
- TPMET katılımı süperoksit izlerken, çözüm iki 6 mL aliquots bölün. Bir aliquot için 0,1 M KPO4 arabelleği 55 µL ekleyin ve diğer aliquot 6.5 kU/ml SOD 60 U/mL nihai bir konsantrasyon için 55 µL ekleyin.
- PBS hücrelerle yıkayın. Medya Aspire edin ve 150 µL PBS ekleyin. O zaman PBS Aspire edin.
Not: Kaplama, ekli hücrelerle tahlil yapılır. Böylece, hiçbir aralıklarla veya tripsin yıkama işleminin kullanımı olduğunu. - WST-1 çözüm (-) 100 µL eklemek SOD veya (-) AO sütunlara 1-6 ve 100 µL WST-1 çözüm (+) SOD veya (+) AO 96-şey plaka 7-12 sütuna ekleyin. G ve H satır arka plan denetimleri kullanın (değişikliği izlemek içinYani, Wells hücreleri olmadan tek başına reaktif Absorbans içinde).
- 438, 1 h için her 10 min Spektrofotometre kullanarak Absorbans değerleri ölçmek nm.
- Okuma sonra medya Aspire edin ve her yıkama PBS 150 µL ile iyi. O zaman PBS Aspire edin.
- Her şey için Absorbans değişimi Absorbans için o kadar iyi herhangi bir zamanda noktada bir kuyudan için ilk Absorbans çıkararak hesaplar. Bu değişiklik arka plan wells (Yani, wells ile tahlil çözüm ama hiçbir hücre) gözlenen Absorbans (varsa) yapılan değişikliğin düzeltin.
- Analiz için 60 dk kontrol ölçüm Absorbans verileri normalleştirmek veya wells PBS veya HBS ile yıkayın ve bir bicinchoninic asit (BCA) protein tahlil gerçekleştirin.
- 2 mg/mL sığır serum albumin (BSA) standart Ekle (aralığı 0.5-2 hücreleri izdiham derecesine bağlı olarak standart Curve µL) boş wells için (satır G ve H), sonra BCA reaktif için bütün wells ekleyin..
- Nmol protein µg başına WST-1 azaltılması yoluyla veri ölçmek. 37 mM-1 cm-1 22 tükenme katsayısı azaltılmış WST-1'de 438 kullanmak nm.
2. DPIP azaltma tahlil
- Büyümek ve C2C12 yapışık hücreleri ile aynı prosedürü adım 1.1 olarak ayırt etmek.
- Hisse senedi 10 mM DPIP çözüm aşağıdaki gibi hazırlayın. DPIP 0,029 g dağıtılması (FW: 290.08 g/mol) diH2O. Onayla 600 Absorbans ölçme tarafından DPIP konsantrasyonu 10 ml nm bir Spektrofotometre ile. 1 mM-1 cm-1 23 tükenme katsayısı azaltılmış DPIP 600 kullanmak nm. 4 ° C'de mağaza
- 0.0108 g glikoz PBS 11.880 mL 5 mM son bir konsantrasyon için ekleyin. 10 mm DPIP 100 µM son bir konsantrasyon için 120 µL ekleyin.
- TPMET askorbat katılımı izlerken, çözüm iki 6 mL aliquots bölün. Bir aliquot için Ekle diH2O 6 µL ve diğer aliquot olarak 2 kU/mL AO 2 U/mL nihai bir konsantrasyon için 6 µL ekleyin.
- TPMET katılımı süperoksit izlerken, çözüm iki 6 mL aliquots bölün. Bir aliquot için 0,1 M KPO4 arabelleği 55 µL ekleyin ve diğer aliquot 6.5 kU/ml SOD 60 U/mL nihai bir konsantrasyon için 55 µL ekleyin.
- Medya Aspire edin ve PBS 150 µL hücrelerde yıkayın. PBS Aspire edin ve DPIP çözüm (-) 100 µL eklemek SOD veya (-) AO sütunlara 1-6 ve 100 µL DPIP çözüm (+) SOD veya (+) AO 96-şey plaka 7-12 sütuna ekleyin. Arka plan denetimleri satır G ve H kullanarak (değişikliği izlemek içinYani, Wells hücreleri olmadan tek başına reaktif Absorbans içinde).
- 600 nm kullanarak Absorbans ölçmek Spektrofotometre her 10 min için 1 h Absorbans 60 dk adımlara 1.9-1,13 benzer denetime göre değişiklik ölçmek.
3. düşük elektron alıcısı yüzeylerde AO veya SOD için olup belirlenmesi
- PBS veya HBS 5.436 mL için 10 mm WST-1 400 µM son bir konsantrasyon ve 5 mm PMS 20 µM son bir konsantrasyon için 24 µL için 240 µL ekleyin.
- DPIP için 10 mm DPIP, 100 µM, son bir konsantrasyon için 60 µL PBS veya HBS için 5.940 mL ekleyin.
- Her bir düz-alt 96-şey plaka yokluğunda hücreleri, iyi ve 438, Spektrofotometre Absorbans ölçmek için çözüm 100 µL eklemek için DPIP için WST-1 veya 600 nm nm.
- 10 mM askorbat 1 µL kuyular için 100 mikron son bir konsantrasyon yarısını ekleyin. Onu stabilize kadar Absorbans izlemek.
- İstikrar, üzerine 200 U/mL AO 1 µL 2 U/mL nihai bir konsantrasyon için her şey için veya 60 U/mL her son bir konsantrasyon iyi ve 1 h Absorbans izlemek için 6 kU/ml SOD 1 µL ekleyebilirsiniz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
İstatistik ANOVA ile RStudio istatistiksel yazılım25kullanarak yinelenen ölçüleri ile gerçekleştirilmiştir. Örneklerin boyutu şekil efsanelerde gösterilir.
TPMET izlemek için C2C12 myotubes hücre dışı elektron alıcısı, WST-1 ve DPIP ile birlikte kullanılmıştır. AO WST-1 kısmını belirlemek için kullanılan ve DPIP azalma nedeniyle askorbat sızma ve SOD WST-1 azaltma kısmını ekstraselüler süperoksit yayın nedeniyle olduğunu belirlemek için kullanılmıştır. Şekil 2' de gösterildiði gibi C2C12 myotubes WST-1 azaltma tarafından görüldüğü gibi tPMET yeteneğine sahiptirler. AO eklenmesiyle, WST-1 azaltma ~ %30 tPMET % ~ 30 askorbat (şekil 2A) ihracat nedeniyle olduğunu belirten tarafından bastırıldı. SOD eklenmesiyle, WST-1 azaltma ~ %70, tPMET % ~ 70 ekstraselüler süperoksit yayın (şekil 2B) olduğunu belirten tarafından bastırıldı. Ne zaman DPIP AO ilavesi ile bir hücre dışı elektron alıcısı olarak kullanılmıştır, DPIP azaltma bastırıldı üzerinde %100 (şekil 3). Bu DPIP askorbat katkısını değerlendirmek için AO ile kullanarak geçerlilik ile ilgili soru kaldırdı.
Azaltılmış WST-1 AO veya SOD için bir yüzey olup içine bakmak için WST-1 askorbik asit ile düşürülmüştür. AO veya SOD eklendi ve Absorbans izlenir. 1 saat sonra Absorbans azaltılmış WST-1 AO veya SOD ve azaltılmış formunda WST-1 AO veya SOD (şekil 4A, B) ile arasında herhangi bir değişiklik yapıldı. Bu nedenle, azaltılmış WST-1 bir substrat Bu enzimler için değildir ve AO veya SOD WST-1 ile birlikte sırasıyla rolleri askorbat veya süperoksit, değerlendirilmesi için uygun kullanmaktır.
İndirimli DPIP bir substrat AO veya SOD için olup olmadığını belirlemek için DPIP askorbik asit ile düşürülmüştür. 20 dakika sonra AO eklendi ve Absorbans izlenir. İndirimli DPIP bir substrat AO için için DPIP 40 dk içinde oksitlenmiş formuna döndüğü şekil 5A, görüldüğü gibi gösterildi. SOD eklendiğinde, DPIP da yeniden oksitlenmiş (şekil 5B) oldu. Bu nedenle, düşük DPIP bir substrat Bu enzimler ve bu enzimler ile kullanılmak üzere değil bir ilgili ekstraselüler elektron alıcısı için.
Şekil 1: Elektron taşıma deneyleri önemli adımlar ve ekstraselüler elektron alıcısı ile enzimatik etkileşimlerin belirlenmesi şematik gösterimi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: AO ve SOD eklenmesi WST-1 azaltma C2C12 myotubes tarafından bastırır. (A)tPMET 60 dk 400 µM WST-1 ve 20 µM PMS 2 U/mL AO veya diH2O eklenmesiyle kullanarak analiz (N = 18/grup). (B) tPMET 60 U/mL SOD veya 0.1 M KPO4 arabellek eklenmesi için 60 dk analiz (N = 36/grup). p≥ 0,05 belirtilen zamanda noktada. Hata çubukları ve standart hata ortalamaya temsil görselleştirmek için çok küçük olabilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: AO ilavesi DPIP azalma C2C12 myotubes tarafından bastırır. tPMET 60 dk 100 µM DPIP veya 2 U/mL AO ilavesi olmadan kullanarak analiz (N = 36/grup). p≥ 0,05 belirtilen zamanda noktada. Hata çubukları ve standart hata ortalamaya temsil görselleştirmek için çok küçük olabilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: azaltılmış WST-1 bir substrat AO veya SOD için değil. (A)WST-1 ile askorbat düşürüldü. 45 dakika sonra AO eklendi ve 1 h Absorbans takip. Herhangi bir değişiklik Absorbans gözlendi. SOD 45 dakika sonra eklendi dışında (B) yordamı yukarıdaki, aynıdır. Herhangi bir değişiklik Absorbans gözlenmiştir (N = 24/grup). Hata çubukları ve standart hata ortalamaya temsil görselleştirmek için çok küçük olabilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: azaltılmış DPIP olduğunu bir substrat AO ve SOD için. (A)DPIP askorbat ile düşürüldü. 20 dakika sonra AO eklendi ve Absorbans izlenir. 40 dk içinde onların orijinal Absorbans, düşük DPIP bir substrat için AO olduğunu belirten örnekleri döndü. (B) DPIP askorbat ile düşürülmüştür. 20 dakika sonra SOD eklendi ve Absorbans izlenir. Zaman içinde düşük DPIP yeniden oksitlenmiş, DPIP azalma gösteren bir substrat SOD için (N = 24/grup). Hata çubukları ve standart hata ortalamaya temsil görselleştirmek için çok küçük olabilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6: şematik tPMET resmeden. TPMET bu modelde, askorbat (veya başka bir elektron taşıyıcı) hücre tarafından verilen hücre dışı PMS azaltır. Buna ek olarak, NADPH oxidases hangi azaltabilir WST-1 doğrudan veya dolaylı olarak PMS azaltılması azaltmak ekstraselüler süperoksit üretir. Diğer plazma zarı bağışçılardan elektronlar da elektron WST-1 veya O2 sonraki WST-1 azaltma ile bağış yapabilirsiniz PMS azaltabilirsiniz. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biz hücre dışı elektron alıcısı, WST-1 ve DPIP, C2C12 myotubes tPMET izlemek için spektrofotometrik deneyleri içinde kullanmak için iki yöntem sundu. Spektrofotometre plaka okuyucu ve hücre hatlarında standart kültür yordamlar büyüme ile tPMET bu elektron alıcısı basit Mikroplaka tahlil ile izlemek mümkündür. İyi iyi bir tahlil içinde WST-1 azaltma tekrarlanabilir değil ama gün-gün değişkenlik var. PBS arabellek olarak kullanan varyasyon (CV) günlük fark 0.18 ve arabellek 0,23 olduğu gibi HBS kullanan CV katsayısıdır.
MPM'ler ve WST-1 kullanan önceki edebiyat, biz bu iletişim kuralı, özellikle, PMS kullanım için değiştirdiniz. Bu nedenle, sorun giderme PMS uygun konsantrasyonlarda belirlenmesi dahil ve WST-1 myotubes ile kullanmak için açıklanan. Biz de her Absorbans okuma önce plaka sallayarak önemli olsa sıcaklık (23-37 ° C aralığında) tahlil için kritik bir bileşeni değildir belirledi. Ancak, bu sorunları tahlil uygulandığı diğer hücre satırlarını araştırılmalıdır. Bulgular SOD ve AO doğrudan azaltılmış WST-1 okside yeteneklerini ilgili tarama bu özellik için yeni tahlil bileşenlerinin sorun giderme önemli bir yönü olduğunu göstermektedir.
Bizim veri PMS WST-1 ile birlikte en iyi WST-1 azaltma temin için var olmak kullanmak olduğunu göstermektedir. 1 mL hacminde WST-1 322 nmol / dakika WST-1 doğrudan azaltma için askorbat tarafından gerekli olan PMS, huzurunda 100 µM askorbat azalttığı tespit. 1 mL hacminde AO 2 U/mL 4.400 nmol/s veya 800 kat WST-1 azaltma hızlı bir hızda askorbat askorbat tarafından oksitlenir. Açıkça, AO, enzimatik aktivite askorbat tarafından doğrudan PMS/WST-1 azalma hızlıdır. Biz tarafından süperoksit WST-1 azaltma mutlak oranını ölçmek için bir sistem yok rağmen aynı süperoksit ve SOD, takip edecek bekliyoruz.
26,27hypoxanthine (0,1 mM) süperoksit sistem daha önce üreten açıklanan / PMS eklenmesi WST-1 azaltma tarafından süperoksit etkileyip etkilemediğini belirlemek için biz bir ksantin oksidaz (4,5 mU/mL) kullanılır. PMS dahil yaklaşık WST-1 azaltma oranı bu sistem ile iki katına çıkar. Böylece, bu PMS süperoksit WST-1 elektron transfer aracılık eder görünür.
Daha fazla PMS hücresel WST-1 azaltılması için gerekliliğini değerlendirmek için biz azaltma PMS içinde denetlesinler ve WST-1 ve PMS hücresel WST-1 azaltılması için gerekli olduğunu buldum. Hücreleri içeren PMS (WST-1'in yokluğunda) yalnız tahlil reaktif içinde inkübe zaman 438 Absorbans artış yoktur nm. Bu büyük olasılıkla bir tepe Absorbans 440 nm28, olan PMS (PMS-SQ) semiquinone şeklinde bir birikimi yansıtır. PMS-SQ birikimi PMS süperoksit üretmek için O2 için elektron verir misin daha hızlı azalma olduğunu göstermektedir. Böylece, PMS-SQ birikimi O2 PMS-SQ oranı tam olarak azaltılmış PMS28karşılaştırıldığında tarafından bildirilen yavaş azalma ile tutarlıdır.
Biz de elektron alıcısı yüzeylerde tPMET izlemek için kullanılması gereken enzimler için olup olmadığını belirlemek için bir protokol sundu. Buna ek olarak faiz enzim tarafından takip Spektrofotometre ekstraselüler elektron alıcısı azalma izleyerek, elektron alıcısı bir substrat Bu enzimler için olup olmadığını belirlemek mümkündür. Bu yöntemle, düşük DPIP bir substrat AO ve askorbat sızma ve süperoksit ihracat izlenmesi için uygun elektron alıcısı olmadığını belirten SOD için olduğunu göstermiştir.
Tahlil bileşenleri SOD veya AO gibi eserler oluşturmak olup olmadığını sınama yordamı mevcut yöntemler üzerinde önemli bir gelişmedir. Örneğin, düşük DPIP bir substrat SOD, yayımlanmış veri DPIP ve SOD kullanılarak elde edilen buna göre yorumlanması gerektiğini ima için olur. Bizim bulgular önceki araştırma Dayan ve hangi leuco 2,6-dichloroindophenol Absorbans AO eklenmesinden sonra izlenen Dawson tarafından yürütülen destek: DPIP okside bir substrat AO29olduğunu belirten. Ancak, bizim bulgular araştırma için bağlam Tan ve Contanze24, hem de Bellavite vd tarafından yürütülen Ekle SOD DPIP azaltma etkisizleştirmek için kullanılan 30. Tan ve elektron alıcısı WST-1, DPIP ve FeCN HeLa hücreleri içinde karşılaştırma Contanze tarafından yürütülen bir çalışmada, gördüler elektron alıcısı bazıları azalma SOD huzurunda bastırıldı. DPIP azalma % 40 oranında inhibe ederken WST-1, azaltma MPM ile birlikte Inhibe ~ %80 SOD huzurunda yapıldı. FeCN, azaltma bir alternatif ara elektron alıcısı ile birlikte SOD24huzurunda inhibe değil. Ne zaman elektron modu değerlendirmek döviz NADPH oxidases ve DPIP veya sitokrom c, Bellavite ve ark. arasında DPIP ve sitokrom c NADPH oxidases tarafından azaltılmış ve bu azalma önemli ölçüde SOD30tarafından inhibe buldum. Contanze ve Tan de SOD WST-1 azaltma fare hücre hatları, 32Dcl23, WEHI3B ve J774 yanı sıra insan hücre hatları Jurkat, MALME3M ve 143B6,%3180'i tarafından inhibe olabilir göstermiştir. İnsan birincil nötrofil hücrelerle WST-1 azaltma Inhibe %95 SOD6,32huzurunda yapıldı.
Burada veri tPMET için verilen moleküllerin belirli katkıları değerlendirmek için kullanılan enzimler hücre dışı elektron alıcısı azaltılmış şeklinde yeniden okside değil doğrulamak önemli olduğunu göstermektedir. Biz (veri gösterilmez) demir klorür ve demir çelik sülfat PBS içinde çözünür değildir bulundu. HBS ve fenol red-Alerjik DMEM, onlar hızla, tahlil medya olarak HBS veya DMEM ile uyumsuzluk gösteren okside. Buna ek olarak, AO ve SOD potasyum ferrocyanide bir substrat aldığı düşük yok olma notun katsayısının bir sorun değilse uygun hücre dışı elektron alıcısı olduğunu düşündüren kullanmayın.
Bu testin ana sınırlamaları biri bu PMS/WST-1 ve DPIP NAD (P) H, askorbat ve flavonoidler quercetin ve myricetin19,33,34gibi gibi birden çok elektron bağışçılar tarafından azaltılabilir. Ancak, bu enzimler (Örneğin, SOD, AO) eklenmesi tarafından üstesinden gelebilir veya belirli katkıda bulunan PMS/WST-1 veya DPIP azaltma belirlemek için inhibitörleri. AO ve SOD için DPIP bir substrat hareket edebilir başka bir kısıtlamadır. Böylece, bu enzimler tPMET izlemek için DPIP ile birlikte olmak kullanmak değil. Bir ek önemli bu çalışmanın PMS özelliği ve diğer Redoks cycler cihazları süperoksit26,35,36üretmek için kısıtlamadır. Bu şekil 6' da gösterilmiştir. Diğer taraftan, PMS kendisi bildirildi tPMET32üzerinde doğrudan bir etkisi yoktur. Ayrıca, Tan ve Contanze32 NADPH oksidaz (NOX) inhibitörü diphenyleneiodinium klorür (DPI), DPI duyarlı tPMET belirli bir ölçü NOX katkılarının olabileceğini düşündüren WST-1 azaltma, çoğunluğu önleyebilirsiniz göstermiştir tPMET için. Biz ne zaman WST-1 kullanan Absorbans küçük değişiklikleri görmek başka bir kısıtlamadır. Bulduğumuz zaman WST-1 taze yapılır ve hücreleri Konfluent, Absorbans en büyük değişiklik görülür. Önceki çalışmalar P388 hücre hatlarında yapılan olumlu üretilen formazan miktarda hücre sayı21ile karşılıklı olarak ilişkilendirir göstermiştir. Bu nedenle, daha fazla Konfluent hücreleri sonra WST-1 büyük azalma vardır. Bunun için her şey için protein mikrogram normalleştirme tarafından düzeltilebilir.
Bu öncelikle küresel tPMET değerlendirmek için tasarlanmıştır bu tahlil ile ilgili bir uyarı olduğunu. TPMET askorbat sızma, örneği gibi birden fazla form izlemek için kullanılabilirler, ancak amaç tPMET bağlamında ölçümleri gerektirmiyorsa daha belirgin deneyleri daha uygun olabilir. Örnek fox, süperoksit ana ilgi ise, bir dizi süperoksit, floresan geçirimsiz probları, aconitase ve nitroblue tetrazolium37gibi sonda kullanımı gibi izlemek için başka yollar vardır.
TPMET DPIP, FeCN ve ferricytochrome c, mevcut dezavantajları gibi izlemek için varolan sondalar. Örneğin, sınırlı DPIP AO ve SOD için bir substrat, FeCN yararını gerçek zamanlı deneyleri içinde sınırlar bir düşük molar tükenme katsayısı vardır ise sitokrom c pahalı. Ayrıca, bazı bu probları yüksek arka plan için düşük duyarlılık Absorbans32bir değişiklik ölçerken önde gelen üretebilir. WST-1 bir substrat AO ve SOD gibi enzimler için olmak gösterilmiştir. Ayrıca, yüksek molar tükenme katsayısı ve düşük arka plan tepki WST-1 olan bir daha duyarlı tPMET tahlil oluşturma. İleride, bu tahlil daha iyi tPMET süreci anlamak, elektron taşıma belli bir hücre doğrultusunda yol göster ve nasıl bir hücrenin Redoks ortamı korunur daha iyi anlamak için kurşun inhibitörleri geniş bir yelpazesi ile yararlı olabilir.
Bu protokol kritik adımlar hücreleri deneme (~ %70 birleşmesi) için hazır olduğunu belirlemenin yanı sıra tahlil reaktifler, özellikle WST-1 ve PMS, her tahlil için taze yapım içerir. Önce tahlil reaktifler ek hücreleri yıkamak için önemlidir. Her ne kadar biz farklılaşma orta askorbat ile ek Bu protokol için kullanılan DMEM askorbat, içermiyor. Kullanılabilir ortam bir dizi askorbat içermektedirler. Ancak, hücreleri askorbat-herhangi bir kalıntı askorbat ortamından kaldırmak için ücretsiz, tahlil reaktifleri eklenmesi önce yıkanır. TPMET bir kısmını (Örneğin, askorbat verme) moleküler sızma atfedilebilecek olduğu gibi spektrofotometrik ölçümler hemen sızma ilk anları kaçırmayın için tahlil reaktif eklenmesinden sonra başlatmak önemlidir. Ayrıca, arka plan kuyular için tek tek her reaktif bir denemeye dahil için önemlidir. Bu raporda açıklanan tahlil bileşenlerinin Absorbans içinde ihmal edilebilir arka plan değişikliği neden oldu. Ancak, bazı katkı maddeleri (Örneğin, phloretin) önemli arka plan reaksiyon teşvik edebilirsiniz. Böylece, verileri reaktifler kendilerini neden olabilir herhangi bir karıştırıcı etkisi ortadan kaldırmak için analiz edilir zaman arka plan dışarı çıkarılır önemlidir.
Özetle, burada sunulan Protokolü tPMET değerlendirmek için bir yol sağlar ve uyarılar çok sayıda ve farklı hücre satırları ve/veya değerlendirme belirli katılımcılar () için tahlil başvurusu sırasında dikkate alınması gereken protokol yönlerini öneriyor askorbat ve burada kullanılan süperoksit) tPMET için.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Thomas Bell, Lyn Mattathil, Mark Mannino ve Neej Patel ve teknik destek için teşekkür etmek istiyorum. Bu eser Jonathan Fisher için Amerika Birleşik Devletleri halk sağlığı hizmet Ödülü R15DK102122 diyabet Ulusal Enstitüsü ve sindirim ve böbrek hastalıkları (NIDDK) tarafından desteklenmiştir. El yazması içerik sadece yazarlar sorumludur ve mutlaka NIDDK veya Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmiyor.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C2C12 myoblasts | American Type Culture Collection | CRL-1772 | |
| Dulbecco's modified eagle's medium - low glucose | Sigma | D6046 | |
| Fetal Plex animal serum complex | Gemini Bio-Products | 100-602 | |
| penicillin-streptomycin | Sigma | 516106 | |
| horse serum | Gibco Technologies | 16050-130 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline | Sigma | D8537 | |
| trypsin-EDTA | Sigma | T4049 | |
| 15 cm culture dishes | TPP | 93150 | |
| 96 well culture plates | TPP | 92096 | |
| 2-(4-Iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium Sodium Salt (WST-1) | Accela ChemBio Inc | SY016315 | |
| phenazine methosulfate | Sigma | P9625 | |
| L-ascorbic acid | Sigma | A5960 | |
| ascorbate oxidase | Sigma | A0157 | |
| superoxide dismutase | Sigma | S5395 | |
| 2,6-dichloroindophenol sodium salt | ICN Biomedicals | 215011825 | |
| D-(+)-glucose | Sigma | G7528 | |
| HEPES sodium salt | Sigma | H3784 | |
| sodium chloride | Sigma | S7653 | |
| potassium chloride | Fisher Scientific | BP366 | |
| magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | M5921 | |
| calcium chloride dihydrate | Sigma | C7902 | |
| potassium phosphate | Fisher Scientific | BP363 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Powerwave X-I spectrophotometer | Biotek Insturments | discontinued | |
| Spectronic Genesys 5 Spectrophotometer | Thermo Scientific | 336001 | |
| PureGrade 96-well microplate, F-bottom, clear, untreated, non-sterile | MidSci | 781602 | |
| Iron (II) chloride tetrahydrate | Sigma | 220299 | |
| Iron (II) sulfate heptahydrate | Sigma | 215422 | |
| hypoxanthine | Sigma | H9636 | |
| xanthine oxidase | Sigma | X4500 | |
| Excel | Microsoft | ||
| R Studio | Rstudio | https://www.rstudio.com/products/rstudio/ | |
| KC4 | Biotek Insturments | discontinued |
References
- Kilberg, M. S., Christensen, H. N. Electron-transferring enzymes in the plasma membrane of the Ehrlich ascites tumor cell. Biochemistry. 18 (8), 1525-1530 (1979).
- Crane, F. L., Roberts, H., Linnane, A. W., Low, H. Transmembrane ferricyanide reduction by cells of the yeast Saccharomyces cerevisiae. J Bioenerg Biomembr. 14 (3), 191-205 (1982).
- Craig, T. A., Crane, F. L. Evidence for trans-plasma membrane electron transport system in plact cells. Proc. Indiana Acad. Sci. 90, 150-155 (1981).
- Mishra, R. K., Passow, H. Induction of intracellular ATP synthesis by extracellular ferricyanide in human red blood cells. J Membr Biol. 1 (1), 214-224 (1969).
- Crane, F. L., Sun, I. L., Clark, M. G., Grenbing, C., Low, H. Transplasma-membrane redox systems in growth and development. Biochim Biophys Acta. 811, 233-264 (1985).
- Berridge, M. V., Tan, A. S. Trans-plasma membrane electron transport: a cellular assay for NADH- and NADPH-oxidase based on extracellular, superoxide-mediated reduction of the sulfonated tetrazolium salt WST-1. Protoplasma. 205 (1-4), 74-82 (1998).
- Eccardt, A. M., et al. Trans-plasma membrane electron transport and ascorbate efflux by skeletal muscle. Antioxidants. 6 (4), 89 (2017).
- Sun, I. L., Navas, P., Crane, F. L., Morre, D. J., Low, H. NADH diferric transferrin reductase in liver plasma membrane. J Biol Chem. 262 (33), 15915-15921 (1987).
- Larm, J. A., Vaillant, F., Linnane, A. W., Lawen, A. Up-regulation of the plasma membrane oxidoreductase as a prerequisite for the viability of human Namalwa rho 0 cells. J Biol Chem. 269 (48), 30097-30100 (1994).
- Inman, R. S., Coughlan, M. M., Wessling-Resnik, M. Extracellular ferrireductase activity of K562 cells is coupled to transferrin-independent iron transport. Biochemistry. 33, 11850-11857 (1994).
- Castillo-Olivares, A., Esteban del Valle, A., Marquez, J., Nunez de Castro, I., Medina, M. A. Ehrlich cell plasma membrane redox system is modulated through signal transduction pathways involving cGMP and Ca2+ as second messengers. J Bioenerg Biomembr. 27 (6), 605-611 (1995).
- Medina, M. A., del Castillo-Olivares, A., Nunez de Castro, I. Multifunctional plasma membrane redox systems. Bioessays. 19 (11), 977-984 (1997).
- Medina, M. A., del Castillo-Olivares, A., Schweigerer, L. Plasma membrane redox activity correlates with N-myc expression in neuroblastoma cells. FEBS Lett. 311 (2), 99-101 (1992).
- Diaz-Gomez, C., Villalba, J. M., Perez-Vicente, R., Crane, F. Ascorbate Stabilization Is Stimulated in rho(0)HL-60 Cells by CoQ10 Increase at the Plasma Membrane. Biochem Biophys Res Commun. 234 (0), 79-81 (1997).
- Navarro, F., et al. Protective role of ubiquinone in vitamin E and selenium-deficient plasma membranes. Biofactors. 9 (2-4), 163-170 (1999).
- Herst, P. M., Berridge, M. V. Cell surface oxygen consumption: a major contributor to cellular oxygen consumption in glycolytic cancer cell lines. Biochim Biophys Acta. 1767 (2), 170-177 (2007).
- Baoutina, A., Dean, R. T., Jessup, W. Trans-plasma membrane electron transport induces macrophage-mediated low density lipoprotein oxidation. FASEB J. 15 (9), 1580-1582 (2001).
- Furukawa, S., et al. Increased oxidative stress in obesity and its impact on metabolic syndrome. J Clin Invest. 114 (12), 1752-1761 (2004).
- Del Principe, D., Avigliano, L., Savini, I., Catani, M. V. Trans-plasma membrane electron transport in mammals: functional significance in health and disease. Antioxid Redox Signal. 14 (11), 2289-2318 (2011).
- Berridge, M. V., Tan, A. S. High-Capacity Redox Control at the Plasma Membrane of Mammalian Cells Trans-Membrane, Cell Surface, and Serum NADH-Oxidases. Antioxidants & Redox Signaling. 2 (2), 231-242 (2000).
- Ishiyama, M., Shiga, M., Sasamoto, K., Mizoguchi, M., He, P. G. A New Sulfonated Tetrazolium Salt That Produces a Highly Water-Soluble Formazan Dye. Chemical & Pharmaceutical Bulletin. 41 (6), 1118-1122 (1993).
- Berridge, M. V., Herst, P. M., Tan, A. S. Tetrazolium dyes as tools in cell biology: New insights into their cellular reduction. Biotechnology Annual Review. 11, 127-152 (2005).
- Gurtoo, H. L., Johns, D. G. On the interaction of the electron acceptor 2,6-dichlorophenolindophenol with bovine milk xanthine oxidase. J Biol Chem. 246 (2), 286-293 (1971).
- Tan, A. S., Berridge, M. V. Distinct trans-plasma membrane redox pathways reduce cell-impermeable dyes in HeLa cells. Redox Rep. 9 (6), 302-306 (2004).
- R: A language and environment for statistical computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. (2013).
- Peskin, A. V., Winterbourn, C. C. A microtiter plate assay for superoxide dismutase using a water-soluble tetrazolium salt (WST-1). Clinica Chimica Acta. 293 (1-2), 157-166 (2000).
- Higaki, Y., et al. Oxidative stress stimulates skeletal muscle glucose uptake through a phosphatidylinositol 3-kinase-dependent pathway. Am J Physiol Endocrinol Metab. 294 (E889-E897), (2008).
- Zuagg, W. Spectroscopic characteristics and some chemical propertiesof N-methylphenazinium methyl sulfate (phenazine methosulfate) and pyocyanine at the oxidation level. J Biol Chem. 239 (11), 3964-3970 (1964).
- Dayan, J., Dawson, C. R.
- Bellavite, P., della Bianca, V., Serra, M. C., Papini, E., Rossi, F. NADPH oxidase of neurtrophils forms superoxide anion but does not reduce cytochrome c and dichlorophenolindophenol. FEBS. 170 (1), 157-161 (1984).
- Berridge, M. V., Tan, A. S., McCoy, K. D., Wang, R. The biochemical and cellular basis of cell proliferation assays that use tetrazolium salts. Biochemica. 4, 15-20 (1996).
- Tan, A. S., Berridge, M. V. Superoxide produced by activated neutrophils efficiently reduces the tetrazolium salt, WST-1 to produce a soluble formazan: a simple colorimetric assay for measuring respiratory burst activation and for screening anti-inflammatory agents. J Immunol Methods. 238 (1-2), 59-68 (2000).
- Phillips, P. A., et al. Myricetin induces pancreatic cancer cell death via the induction of apoptosis and inhibition of the phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) signaling pathway. Cancer Letters. 308 (2), 181-188 (2011).
- Altundag, E., et al. Quercetin-induced cell death in human papillary thyroid cancer (B-CPAP) cells. Journal of thyroid research. 2016 (8), (2015).
- Ukeda, H., Kawana, D., Maeda, S., Sawamura, M. Spectrophotometric Assay for Superoxide Dismutase Based on the Reduction of Highly Water-soluble Tetrazolium Salts by Xanthine-Xanthine Oxidase. Biosci Biotechnol Biochem. 63 (3), 485-488 (1999).
- Halaka, F. G., Babcock, G. T., Dye, J. L. Properties of 5-methylphenazinium methyl sulfate. Reaction of the oxidized form with NADH and of the reduced form with oxygen. J Biol Chem. 257 (3), 1458-1461 (1982).
- Maghzal, G. J., Krause, K. H., Stocker, R., Jaquet, V. Detection of reactive oxygen species derived from the family of NOX NADPH oxidases. Free Radic Biol Med. 53 (10), 1903-1918 (2012).
