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Biochemistry

Trans-Plasma Membrane Transport des électrons par les Myotubes C2C12 de mesure

Published: May 4, 2018 doi: 10.3791/57565
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Biology, Saint Louis University
* These authors contributed equally

Summary

Ce protocole vise à surveiller par spectrophotométrie trans-plasma membrane transport d’électrons utilisant les accepteurs d’électrons extracellulaire et d’analyser les interactions enzymatiques qui peuvent survenir avec ces accepteurs d’électrons extracellulaire.

Abstract

TRANS-plasma membrane transport d’électrons (tPMET) joue un rôle dans la protection des cellules du stress réductrice intracellulaire ainsi que la protection contre les dommages causés par les oxydants extracellulaires. Ce processus de transport des électrons de réducteurs intracellulaires extracellulaire oxydants n’est pas bien défini. Nous présentons des analyses spectrophotométriques de myotubes C2C12 pour surveiller tPMET utilisant les accepteurs d’électrons extracellulaire : tétrazolium soluble dans l’eau sel-1 WST-1 et 2, 6-dichlorophénolindophénol (DPIP ou DCIP). Grâce à la réduction de ces accepteurs d’électrons, nous sommes en mesure de contrôler ce processus dans une analyse en temps réel. Avec l’ajout d’enzymes telles que l’ascorbate oxydase (AO) et de la superoxyde dismutase (SOD) pour les essais, nous pouvons déterminer quelle partie du tPMET est due à la production de superoxyde ou de l’exportation d’ascorbate, respectivement. WST-1 a montré des résultats stables avec faible bruit de fond, DPIP a pu être ré-oxydé après l’ajout des AO et des mottes de terre, qui a été démontrée avec l’analyse spectrophotométrique. Cette méthode montre un dosage spectrophotométrique multipuit, rapide, en temps réel avec les avantages par rapport aux autres méthodes utilisées pour surveiller les tPMET, tels que ferricyanure (FeCN) et ferricytochrome c réduction.

Introduction

La capacité des membranes de plasma épurés de réduire les accepteurs d’électrons a conduit à l’idée que la membrane plasmique a une capacité inhérente redox1. Vu précédemment dans les champignons, les plantes et animaux, tPMET est un processus commun à plusieurs organismes2,3,4,5. Plus précisément, ce processus a été démontré chez Saccharomyces cerevisiae, cellules de carotte, érythrocytes, lymphocytes, ostéosarcome, mélanome, macrophages, le muscle squelettique et neutrophiles2,3, 4 , 5 , 6 , 7. dans un processus qui transporte les électrons à travers la membrane de plasma pour réduire les oxydants extracellulaires, tPMET est impliqué dans nombreuses fonctions cellulaires, y compris : cellule croissance5,8, de la viabilité cellulaire9, fer métabolisme des10,11,12,13et protection contre l’oxygène réactif espèces12,14,15de signalisation cellulaire. En raison de l’implication de tPMET dans de nombreuses fonctions cellulaires, un déséquilibre de tPMET a émis l’hypothèse pour contribuer au développement de certains troubles de santé graves, y compris le cancer16,17de maladies cardiovasculaires, métaboliques et le syndrome18.

Il y a plusieurs façons de contrôler le transfert des électrons à travers la membrane de plasma, mais la technique la plus largement utilisée est d’évaluer la réduction des accepteurs d’électrons extracellulaire par dosages colorimétriques. Accepteurs d’électrons extracellulaire couramment utilisés sont les sels de tétrazolium, DPIP, FeCN et ferricytochrome c19,20. Le sel de tetrazolium plus couramment utilisé est un deuxième génération connu sel comme WST-119. Ce composé est plus facile à utiliser dans les essais colorimétriques par rapport aux sels de tétrazolium de première génération en raison de deux groupes de sulfonate de perfluorooctane, qui augmentent sa solubilité de l’eau21. WST-1, en liaison avec l’intermédiaire électron accepteur 1-méthoxy-phénazine méthosulfate (mPMS), est réduite dans les événements de transfert d’électron deux. Cette réduction change la forme oxydée de faiblement couleur du WST-1 à une plus intense, jaune de formazan20,22. WST-1 a un coefficient d’extinction molaire élevée de 37 x 103 M-1cm-1, conduisant à un dosage haute sensibilité21,22. DPIP est également utilisé comme un accepteur d’électrons extracellulaire pour surveiller tPMET. Il a été démontré que DPIP peut être réduit extracellulaire par tPMET sans l’aide d’intermédiaires électrons accepteurs23,24. En raison de l’absence d’accepteurs d’électrons intermédiaire, DPIP peut directement électrons pick-up de la membrane plasmique, contrairement à WST-124. Semblable à DPIP, FeCN s’est avéré extracellulaire réduit à ferrocyanure de tPMET sans l’aide d’intermédiaires électrons accepteurs19,24. Contrairement à WST-1 et DPIP, FeCN a un coefficient d’extinction molaire bas menant à un plus faible dosage sensibilité9. Un autre accepteur d’électron d’extracellulaire couramment utilisés pour surveiller les tPMET est ferricytochrome c. semblable à WST-1, ferricytochrome c réduction augmente avec l’utilisation d’accepteur d’électrons intermédiaire, mPMS22. Contrairement à WST-1, la méthode de ferricytochrome c est moins sensible en raison d’un haut fond et une extinction molaire faible coefficient22.

Nous présentons ici une méthode d’analyse en temps réel de tPMET par le biais de dosages par spectrophotométrie. La méthode utilisée les accepteurs d’électrons extracellulaire WST-1 et DPIP, car ils ont un coefficient d’extinction molaire élevée tout en étant moins cher par rapport à l’autre couramment utilisé accepteurs d’électrons extracellulaire comme ferricytochrome c. Nous avons utilisé la phénazine méthosulfate (PMS) au lieu de MPM, ils ont une composition chimique similaire et PMS est beaucoup moins cher. mPMS photochimiquement stable qui est une caractéristique importante pour une trousse commerciale qui a besoin d’une longue durée de vie. Toutefois, nous faisons PMS frais pour chaque dosage, donc stabilité ne devrait pas être un problème. Nous présentons aussi une méthode pour évaluer les possibles interactions enzymatiques (voir Figure 1) entre l’accepteur d’électron extracellulaire et des enzymes qui peuvent être utilisés afin de caractériser le processus de tPMET. Plus précisément, les enzymes AO et SOD peuvent servir déterminent quelle partie du tPMET est due à transport ascorbate ou communiqué de superoxyde extracellulaire, deux méthodes courantes pour les électrons d’être transporté à travers la membrane plasmique.

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Protocol

Remarque : Voir la Figure 1 pour un aperçu schématique des étapes clés.

1. WST-1 réduction dosage

  1. Croître et se différencier C2C12 cellules adhérentes à l’aide de procédures standard cell culture7 dans une plaque à 96 puits utilisant des lignes A-F.
    1. Utiliser un moyen de différenciation composé de l’aigle de la modification de Dulbecco Medium (DMEM) additionné de 2 % de sérum de cheval, 100 U/mL de pénicilline et 0,1 mg/mL de streptomycine. Incuber les cellules à 37 ° C, avec 5 % de CO2.
    2. Participation d’ascorbate dans tPMET de l’analyse, Supplément médias de différenciation avec l’acide ascorbique 100 µM. Permettre aux cellules d’incuber dans des milieux de différenciation pour ~ 24-48 h.
  2. Préparer les solutions WST-1 et PMS.
    1. Pour faire un stock de 10 mM de WST-1, dissoudre 0,033 g de WST-1 (formule poids (FW) : 651.34 g/mol) dans 5 mL de phosphate buffered saline (PBS). Conserver à 4 ° C.
    2. Pour faire un stock de 5 mM du syndrome prémenstruel, dissoudre 0,0023 g du syndrome prémenstruel (FW : 306.34 g/mol) dans 1,5 mL désionisée H2O (diH2O). Conserver à-20 ° C et protéger de la lumière.
  3. Ajouter 0,0108 g de glucose à une concentration finale de 5 mM à 11,4 mL de PBS ou HEPES solution saline tamponnée (HBS ; sel de sodium HEPES 20 mM, 140 mM NaCl, KCl, 2,5 mM MgSO4, 5 mM 1 mM CaCl2). Ajouter 480 µL de 10 mM WST-1 pour une concentration finale de 400 µM et 48 µL de 5 mM PMS pour une concentration finale de 20 µM.
  4. Participation d’ascorbate dans tPMET de l’analyse, diviser la solution en deux parties aliquotes de 6 mL. Une partie aliquote, ajouter 6 µL de diH2O et dans l’autre partie aliquote ajouter 6 µL de 2 kU/mL AO pour une concentration finale de 2 U/mL.
  5. Participation de superoxyde dans tPMET de l’analyse, diviser la solution en deux parties aliquotes de 6 mL. Une partie aliquote, ajouter 55 µL de tampon de4 KPO 0,1 M et l’autre partie aliquote Ajouter 55 µL de 6,5 kU/mL SOD pour une concentration finale de 60 U/mL.
  6. Laver les cellules avec du PBS. Aspirer les médias et ajouter 150 µL PBS. Puis aspirer le PBS.
    Remarque : Le test se fait avec cellules plaqués, ci-joint. Il n’y a donc pas de centrifugation ou utilisation de trypsine dans le processus de lavage.
  7. Ajouter 100 µL de solution WST-1 (-) SOD ou (-) AO aux colonnes 1 à 6 et ajouter 100 µL de solution de WST-1 (+) SOD ou (+) AO aux colonnes 7-12 dans la plaque à 96 puits. Utiliser des lignes G et H sous forme de contrôles de fond (par exemple, pour surveiller le changement d’absorbance dans le réactif seul dans les puits sans cellules).
  8. Mesurer les valeurs d’absorption à l’aide du spectrophotomètre toutes les 10 min pendant 1 h à 438 nm.
  9. Après lecture, aspirer les médias et laver chaque fois avec 150 µL de PBS. Puis aspirer le PBS.
  10. Calculer la différence d’absorbance pour chaque puits en soustrayant l’absorbance initiale pour un puits de l’absorbance à n’importe quel point de temps pour ce puits. Corriger ce changement pour le changement d’absorbance (le cas échéant) observé dans les puits de fond (c.-à-d., puits avec solution de dosage mais aucune cellule).
  11. Pour l’analyse, normaliser les données de l’absorbance à la mesure de contrôle de 60 min ou laver les puits avec PBS ou HBS et puis effectuer une analyse de protéine (BCA) acide bicinchoninic.
  12. Ajouter étalon d’albumine sérique bovine (BSA) 2 mg/mL (allant de 0,5 à 2 µL de la courbe d’étalonnage, selon le degré de confluence des cellules) dans les puits vides (lignes G et H), puis ajouter le réactif BCA dans chaque puits.
  13. Quantifier les données via nmol de WST-1 réduction par µg de protéines. Utiliser des 37 mM-1 cm-1 22 comme le coefficient d’extinction pour réduite WST-1 438 nm.

2. test de réduction DPIP

  1. Croître et se différencier des cellules adhérentes C2C12 avec la même procédure que l’étape 1.1.
  2. Préparer la solution DPIP stock 10 mM comme suit. Dissoudre 0,029 g des DPIP (FW : 290.08 g/mol) dans 10 mL de diH2O. confirmer la concentration des DPIP en mesurant l’absorbance à 600 nm avec un spectrophotomètre. Utiliser 1 mM-1 cm-1 23 comme le coefficient d’extinction pour DPIP réduite à 600 nm. Conserver à 4 ° C.
  3. Ajouter 0,0108 g de glucose à 11,880 mL de PBS pour une concentration finale de 5 mM. Ajouter 120 µL de 10 mM DPIP pour une concentration finale de 100 µM.
  4. Participation d’ascorbate dans tPMET de l’analyse, diviser la solution en deux parties aliquotes de 6 mL. Une partie aliquote, ajouter 6 µL de diH2O et dans l’autre partie aliquote ajouter 6 µL de 2 kU/mL AO pour une concentration finale de 2 U/mL.
  5. Participation de superoxyde dans tPMET de l’analyse, diviser la solution en deux parties aliquotes de 6 mL. Une partie aliquote, ajouter 55 µL de tampon de4 KPO 0,1 M et l’autre partie aliquote Ajouter 55 µL de 6,5 kU/mL SOD pour une concentration finale de 60 U/mL.
  6. Aspirer les médias et laver les cellules en 150 µL de PBS. Aspirer le PBS et ajouter 100 µL de solution DPIP (-) SOD ou (-) AO aux colonnes 1 à 6 et ajouter 100 µL de solution DPIP (+) SOD ou (+) AO aux colonnes 7-12 dans la plaque à 96 puits. Utiliser des lignes G et volonté de H comme contrôles de fond (par exemple, pour surveiller le changement d’absorbance dans le réactif seul dans les puits sans cellules).
  7. Mesurer l’absorbance à 600 nm en spectrophotomètre toutes les 10 min pendant 1 h. quantifier la différence d’absorption par rapport au contrôle après 60 min similaire aux étapes 1,9-1.13.

3. déterminer si les accepteurs d’électrons réduits sont des substrats pour AO ou GAZONNIÈRE

  1. Dans 5,436 mL de PBS ou HBS, ajouter 240 µL de 10 mM WST-1 pour une concentration finale de 400 µM et 24 µL de 5 mM PMS pour une concentration finale de 20 µM.
    1. Pour DPIP, ajouter 60 µL de 10 mM DPIP, pour une concentration finale de 100 µM, à 5,940 mL de PBS ou HBS.
  2. Ajouter 100 µL de solution pour chaque bien dans une plaque à 96 puits à fond plat en l’absence de cellules et de mesurer l’absorbance dans un spectrophotomètre à 438 nm, pour le WST-1, ou 600 nm, pour DPIP.
  3. Ajouter 1 µL d’ascorbate de 10 mM à la moitié des puits pour une concentration finale de 100 μM. Surveiller l’absorption jusqu'à ce qu’il se stabilise.
  4. Après stabilisation, ajouter 1 µL de 200 U/mL AO pour une concentration finale de 2 U/mL dans chaque cupule ou ajouter 1 µL de 6 kU/mL SOD pour une concentration finale de 60 U/mL à chaque bien et surveiller l’absorbance pendant 1 h.

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Representative Results

Statistiques ont été réalisées avec ANOVA à mesures répétées à l’aide de logiciels statistiques RStudio25. Tailles d’échantillon sont indiqués dans les légendes de la figure.

Pour surveiller les tPMET, les myotubes C2C12 étaient utilisés parallèlement accepteurs d’électrons extracellulaire, WST-1 et DPIP. AO a été utilisée pour déterminer quelle partie du WST-1 réduction DPIP résultait de l’efflux ascorbate et SOD a été utilisée pour déterminer quelle partie du WST-1 réduction a été en raison de la libération de superoxyde extracellulaire. Comme illustré à la Figure 2, les myotubes C2C12 sont capables de tPMET comme on le voit par la réduction de WST-1. Avec l’ajout de AO, réduction WST-1 a été supprimée d’environ 30 %, ce qui indique qu’environ 30 % de tPMET a été en raison de l’exportation d’ascorbate (Figure 2 a). Avec l’ajout de SOD, WST-1 réduction fut supprimée par environ 70 %, ce qui indique qu’environ 70 % de tPMET a été dûment communiqué de superoxyde extracellulaire (Figure 2 b). Lorsque DPIP fut utilisée comme un accepteur d’électrons extracellulaire avec l’ajout de AO, réduction DPIP réprimée plus de 100 % (Figure 3). Cela a soulevé des questions au sujet de la validité de l’utilisation des DPIP avec AO pour évaluer la contribution de l’ascorbate.

Pour examiner si réduite WST-1 est un substrat pour AO ou GAZONNIÈRE, WST-1 a été réduite avec l’acide ascorbique. AO ou SOD a été ajouté, et l’absorbance a été suivie. Après 1 h, il n’y avait aucune différence d’absorption entre la forme réduite du WST-1 sans AO ou SOD et de la forme réduite du WST-1 avec AO ou GAZONNIÈRE (Figure 4 a, B). Par conséquent, la réduction WST-1 n’est pas un substrat de ces enzymes, et l’utilisation de AO ou GAZONNIÈRE conjointement avec WST-1 est appropriée pour l’évaluation des rôles d’ascorbate ou superoxyde, respectivement.

Pour déterminer si DPIP réduite est un substrat pour AO ou GAZONNIÈRE, DPIP a été réduite avec l’acide ascorbique. Après 20 min, AO a été ajouté, et l’absorbance a été suivie. DPIP réduite s’est avéré être un substrat pour AO, comme on le voit dans la Figure 5 a, où DPIP retourne à sa forme oxydée dans 40 min. Lorsque le gazon a été ajouté, DPIP était également ré-oxydé (Figure 5 b). Par conséquent, réduit DPIP est un substrat de ces enzymes et pas un accepteur d’électrons extracellulaire approprié pour être utilisé avec ces enzymes.

Figure 1
Figure 1 : représentation schématique des étapes clés de l’essais de transport d’électrons et de détermination des interactions enzymatiques avec les accepteurs d’électrons extracellulaire. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : l’ajout de AO et SOD supprime WST-1 réduction de myotubes C2C12. TPMET (A) a été analysé pendant 60 min à l’aide de 400 µM WST-1 et 20 µM PMS avec l’ajout de 2 U/mL AO ou diH2O (N = 18/groupe). TPMET (B) a été analysé pendant 60 min avec l’ajout de 60 U/mL SOD ou un tampon4 KPO 0,1 M (N = 36/groupe). p≥ 0,05 à l’instant indiqué. Barres d’erreur représentent l’écart-type de la moyenne et peuvent être trop petites pour la visualiser. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : l’ajout de AO supprime la réduction DPIP en myotubes C2C12. tPMET a été analysé pendant 60 min à l’aide de 100µm DPIP avec ou sans l’ajout de 2 U/mL AO (N = 36/groupe). p≥ 0,05 à l’instant indiqué. Barres d’erreur représentent l’écart-type de la moyenne et peuvent être trop petites pour la visualiser. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : réduction WST-1 n’est pas un substrat pour AO ou GAZONNIÈRE. (A) WST-1 a été réduite avec ascorbate. Après 45 min, AO a été ajouté, et l’absorbance a été suivie pendant 1 h. Aucune différence d’absorption a été observée. (B) la procédure est la même que ci-dessus, sauf SOD a été ajouté après 45 min. Aucune différence d’absorption a été observée (N = 24/groupe). Barres d’erreur représentent l’écart-type de la moyenne et peuvent être trop petites pour la visualiser. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : DPIP réduite est un substrat pour AO et SOD. DPIP (A) a été réduite avec ascorbate. Après 20 min, AO a été ajouté, et l’absorbance a été suivie. Moins de 40 min, les échantillons retournés à leur origine absorbance, indiquant que DPIP réduite est un substrat pour AO. (B) DPIP a été réduite avec ascorbate. Après 20 min, SOD a été ajouté, et l’absorbance a été suivie. Au fil du temps, le DPIP réduite a été ré-oxydé, indiquant que réduit DPIP est un substrat de tourbe (N = 24/groupe). Barres d’erreur représentent l’écart-type de la moyenne et peuvent être trop petites pour la visualiser. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : schéma illustrant tPMET. Dans ce modèle de tPMET, ascorbate (ou un autre transporteur d’électrons) exportés par la cellule peut réduire PMS extracellulaire. En outre, oxydases NADPH produisent superoxyde extracellulaire, ce qui peut réduire WST-1 directement ou indirectement le réduire par la réduction du syndrome prémenstruel. Électrons par d’autres donateurs de la membrane plasmique peuvent également réduire les PMS, ce qui peut donner des électrons au WST-1 ou O2 avec réduction subséquente de WST-1. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Nous avons présenté deux méthodes d’utilisation d’accepteurs d’électrons extracellulaire, WST-1 et DPIP, dans des dosages spectrophotométriques pour surveiller les tPMET dans les myotubes C2C12. Avec la croissance de lignées cellulaires dans les méthodes de culture standard et d’un lecteur de spectrophotomètre, il est possible de surveiller tPMET avec ces accepteurs d’électrons dans un essai simple microplaque. WST-1 réduction est reproductible de puits à puits dans un essai, mais il existe une variabilité au jour le jour. Le quotidien coefficient de variation (CV) utilisant des PBS comme le tampon est de 0,18 et le CV utilisant HBS que le tampon est de 0,23.

Dans la littérature antérieure utilisant mPMS et WST-1, nous avons modifié ce protocole, en particulier, pour l’utilisation du syndrome prémenstruel. Ainsi, dépannage compris déterminer les concentrations appropriées du syndrome prémenstruel et WST-1 pour une utilisation avec les myotubes décrit. Nous avons également déterminé que la température (dans une fourchette de 23 à 37 ° C) n’est pas un élément essentiel pour le dosage, tout en secouant la plaque avant chaque lecture de l’absorbance est important. Toutefois, ces questions doivent être examinées pour d’autres lignées cellulaires auquel est appliqué le test. Les résultats concernant la capacité des SOD et AO pour oxyder directement réduit WST-1 suggèrent que le dépistage des nouveaux éléments d’analyse pour cette propriété est un aspect clé de dépannage.

Nos données suggèrent que PMS devraient être utilisées en conjonction avec WST-1 pour obtenir la réduction optimale WST-1. Nous avons constaté que, dans un volume de 1 mL, ascorbate de µM 100 réduit 322 nmol de WST-1 par minute en présence de PMS, ce qui est nécessaire pour une réduction directe de WST-1 par l’ascorbate. Dans un volume de 1 mL, 2 U/mL de AO oxyde ascorbate à raison de 4 400 nmol/s ou 800 fois plus rapide que la réduction de WST-1 par l’ascorbate. Clairement, l’activité enzymatique de l’AO est beaucoup plus rapide que la réduction directe du PMS/WST-1 par l’ascorbate. Gageons que les mêmes suivrait de superoxyde et de mottes de terre, bien que nous n’avons pas un système pour mesurer le taux absolu de WST-1 réduction de superoxyde.

Pour déterminer si l’inclusion du syndrome prémenstruel influe sur la réduction de WST-1 par le superoxyde, nous avons utilisé une xanthine oxydase (4,5 mU/mL) / superoxyde hypoxanthine (0,1 mM) système de génération comme précédemment décrit26,27. Inclusion du syndrome prémenstruel double approximativement le taux de réduction WST-1 par ce système. Il semble donc que le PMS médie transfert des électrons de superoxyde à WST-1.

Pour continuer à évaluer l’exigence du syndrome prémenstruel pour cellulaire WST-1 réduction, nous dosés réduction en la présence ou l’absence du syndrome prémenstruel et WST-1 et constaté que le PMS est nécessaire pour cellulaire WST-1 réduction. Lorsque les cellules sont incubées en réactif d’analyse contenant PMS seul (en l’absence de WST-1), il y a une augmentation de l’absorbance à 438 nm. Cela reflète probablement une accumulation de la forme semiquinone du syndrome prémenstruel (PMS-SQ) possédant une absorbance de pic à 440 nm28. Accumulation de PMS-SQ suggère que PMS passe plus vite qu’il peut passer des électrons au O2 pour produire superoxyde. Ainsi, l’accumulation des PMS-SQ est conforme avec la lente diminution de O2 par PMS-SQ par rapport au taux réduit entièrement PMS28.

Nous avons également présenté un protocole pour déterminer si les accepteurs d’électrons sont des substrats d’enzymes qui peuvent être utilisés pour surveiller les tPMET. En surveillant la réduction des accepteurs d’électrons extracellulaire dans un spectrophotomètre, suivie par l’ajout de l’enzyme d’intérêt, il est possible de déterminer si l’accepteur d’électron est un substrat de ces enzymes. Grâce à cette méthode, nous avons montré que DPIP réduite est un substrat pour AO et SOD indiquant qu’il n’est pas un accepteur d’électrons appropriés pour surveiller l’ascorbate efflux et superoxyde exportation.

La méthode d’essai ou non des éléments d’analyse tels que SOD ou AO créent des artefacts est une amélioration significative par rapport aux méthodes existantes. Par exemple, DPIP réduite est un substrat pour la SOD, suggérant que les données publiées obtenues avec l’utilisation des DPIP et SOD doivent être interprétées en conséquence. Nos résultats confirment des recherches antérieures menées par Dayan et Dawson dans laquelle l’absorbance de leuco 2,6-dichloroindophenol a été suivie après l’ajout de AO : DPIP était oxydée, indiquant qu’il s’agit d’un substrat pour AO29. Cependant, nos résultats ajoutent contexte à la recherche menée par Tan et Berridge24, ainsi que Bellavite et al. 30, qui a utilisé SOD pour inhiber la réduction DPIP. Dans une étude menée par Tan et Berridge comparant les accepteurs d’électrons de WST-1 et DPIP FeCN dans les cellules HeLa, ils ont vu que la réduction de certains les accepteurs d’électrons a été supprimée en présence de SOD. La réduction de WST-1, en collaboration avec mPMS, était inhibée ~ 80 % en présence de SOD tandis que la réduction des DPIP était diminuée de 40 %. La réduction de FeCN, parallèlement à un accepteur d’électrons intermédiaire alternatif, n’est pas inhibée en présence de SOD24. Évaluer le mode d’électron lorsqu’exchange entre oxydases NADPH et DPIP ou cytochrome c, Bellavite al trouvé que DPIP et cytochrome c sont diminuées des oxydases NADPH et que cette réduction est significativement inhibée par SOD30. Berridge et Tan ont également démontré que SOD peut inhiber WST-1 réduction de 80 % dans les lignées de cellules de souris de 32Dcl23, WEHI3B et J774 ainsi que des lignées de cellules Jurkat, MALME3M et 143 ter6,31. Avec des cellules humaines primaires neutrophiles, réduction WST-1 a été inhibée à 95 % en présence de SOD6,32.

Ici, les données suggèrent qu’il est important de vérifier qu’enzymes utilisées pour évaluer les contributions spécifiques de molécules exportés à tPMET ne peut pas ré-oxyder la forme réduite de l’accepteur d’électron extracellulaire. Nous avons trouvé que le sulfate ferreux et chlorure ferreux (données non présentées) n’étaient pas solubles dans du PBS. HBS et exempt de rouge de phénol DMEM, ils ont été rapidement oxydés, démontrant l’incompatibilité avec HBS ou DMEM comme support de test. En revanche, AO et SOD n’utilisent pas le ferrocyanure de potassium comme substrat, ce qui suggère que c’est un accepteur d’électrons extracellulaire approprié si son coefficient d’extinction faible n’est pas un problème.

Une des limites principales de ce test est que PMS/WST-1 et DPIP peut être réduite de plusieurs donneurs d’électrons, tels que les flavonoïdes comme la quercétine et myricétine19,33,34, ascorbate et NAD (P) H. Toutefois, cela peut être surmonté par l’addition d’enzymes (p. ex., SOD, AO) ou inhibiteurs pour déterminer les contributeurs spécifiques à la réduction de PMS/WST-1 ou DPIP. Une autre limitation est que DPIP peut servir de substrat pour AO et SOD. Ainsi, ces enzymes ne devraient être utilisés qu’en conjonction avec DPIP pour surveiller tPMET. Une autre limite importante de cette étude est la capacité du syndrome prémenstruel et autres cyclistes d’oxydo-réduction pour produire superoxyde26,35,36. Ceci est illustré à la Figure 6. En revanche, PMS lui-même aurait n’a aucun effet direct sur tPMET32. En outre, Tan et Berridge32 ont montré que l’inhibiteur de la NADPH oxydase (NOX), le chlorure de diphenyleneiodinium (DPI), peut supprimer la majorité des WST-1 réduction, ce qui laisse supposer que tPMET DPI sensible peut être une mesure spécifique de NOX contribution à tPMET. Une autre limitation est que nous voyons des petits changements d’absorbance lors de l’utilisation de WST-1. Nous avons trouvé que lorsque WST-1 est fait frais et que les cellules sont confluentes, la plus grande différence d’absorption est perçue. Des études antérieures menées dans les lignées cellulaires P388 ont montré que la quantité de formazan produit positivement est corrélée avec la cellule numéro21. Par conséquent, plus anastomosé les cellules ne sont alors plus la réduction WST-1. Ceci peut être corrigé pour en normalisant à microgramme de protéine pour chaque puits.

Une mise en garde au sujet de ce test est qu’il est principalement conçu pour évaluer la tPMET mondiale. Même si elle peut être manipulée pour surveiller les multiples formes de tPMET, comme dans l’exemple de l’efflux de l’ascorbate, des tests plus spécifiques pourraient être plus appropriés lorsque l’objectif ne nécessite pas de mesures dans le cadre de tPMET. Exemple de Fox, si superoxyde est le principal intérêt, il y a un certain nombre d’autres avenues pour surveiller le superoxyde, telles que l’utilisation de sondes, ainsi que des sondes fluorescentes imperméables, aconitase nitrobleu de tétrazolium37.

Sondes existants pour surveiller tPMET comme DPIP, FeCN et ferricytochrome c, inconvénients présents. Par exemple, DPIP réduite est un substrat pour AO et SOD FeCN a un coefficient d’extinction molaire faible qui limite son utilité lors d’essais en temps réel et le cytochrome c est coûteux. En outre, certaines de ces sondes peuvent produire ambiants menant à faible sensibilité lors de la mesure d’un changement d’absorbance32. WST-1 s’est avéré ne pas être un substrat pour les enzymes telles que AO et SOD. En outre, WST-1 a un coefficient d’extinction molaire élevée et une réaction faible bruit de fond, créant un test plus sensible de la tPMET. Aller de l’avant, ce test peut être utilisé avec un large éventail d’inhibiteurs de mieux comprendre le processus de tPMET, carte de la voie de transport des électrons dans une lignée cellulaire donné et conduire à mieux comprendre comment l’environnement redox de la cellule est maintenue.

Les étapes critiques du présent protocole incluent déterminer que les cellules sont prêtes pour l’expérimentation (~ 70 % anastomosé) ainsi que les réactifs de dosage, spécifiquement WST-1 et PMS, frais pour chaque dosage. Il est également essentiel de laver les cellules avant l’ajout de réactifs de dosage. Le DMEM utilisé dans le présent protocole ne contient-elle pas d’ascorbate, bien que nous complétions moyen de différenciation avec ascorbate. Un certain nombre de médias disponibles contiennent-ils ascorbate. Cependant, les cellules sont lavées avant d’ajouter les réactifs de dosage, qui sont exempts d’ascorbate, pour enlever tout résidu ascorbate du milieu. Comme une partie du tPMET est attribuable à l’efflux moléculaire (par exemple, l’exportation ascorbate), il est important de commencer lectures spectrophotométriques immédiatement après l’ajout de manière à ne pas manquer les premiers instants de l’efflux de réactif d’analyse. Aussi, il est important d’inclure les puits de fond pour chaque réactif individuel dans une expérience. Les constituants de l’analyse décrites dans cet article a causé fond négligeable changement d’absorbance. Toutefois, certains additifs (par exemple, phlorétine) peuvent favoriser une réaction importante de fond. Ainsi, il est important que le fond est soustraite dehors lorsque les données sont analysées afin d’éliminer tout effet confusionnel qui peuvent produire des réactifs eux-mêmes.

En résumé, le protocole présenté ici constitue un moyen d’évaluer tPMET et suggère un certain nombre de mises en garde et les aspects du protocole qui devrait être tenu compte lors de l’application de l’essai de différentes lignées cellulaires et/ou évaluation des contributeurs ( ascorbate et superoxyde utilisé ici) à tPMET.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Nous tenons à remercier Thomas Bell, Lyn Mattathil, Mark Mannino et Neej Patel pour leur soutien technique. Ce travail a été soutenu par l’award de l’United States Public Health Service R15DK102122 de l’Institut National du diabète et l’appareil digestif et la Kidney Diseases (NIDDK) à Jonathan Fisher. Le contenu du manuscrit est la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les vues officielles de la NIDDK ou le National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C2C12 myoblasts American Type Culture Collection  CRL-1772
Dulbecco's modified eagle's medium - low glucose Sigma D6046
Fetal Plex animal serum complex Gemini Bio-Products  100-602
penicillin-streptomycin Sigma 516106
horse serum Gibco Technologies 16050-130
Dulbecco's phosphate buffered saline Sigma D8537
trypsin-EDTA Sigma T4049
15 cm culture dishes TPP 93150
96 well culture plates TPP 92096
2-(4-Iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium Sodium Salt (WST-1) Accela ChemBio  Inc SY016315
phenazine methosulfate  Sigma P9625
L-ascorbic acid Sigma A5960
ascorbate oxidase  Sigma A0157
superoxide dismutase  Sigma S5395
2,6-dichloroindophenol sodium salt  ICN Biomedicals 215011825
D-(+)-glucose Sigma G7528
HEPES sodium salt Sigma H3784
sodium chloride Sigma S7653
potassium chloride Fisher Scientific  BP366
magnesium sulfate heptahydrate Sigma M5921
calcium chloride dihydrate Sigma C7902
potassium phosphate Fisher Scientific  BP363
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific 23225
Powerwave X-I spectrophotometer Biotek Insturments discontinued 
Spectronic Genesys 5 Spectrophotometer Thermo Scientific 336001
PureGrade 96-well microplate, F-bottom, clear, untreated, non-sterile MidSci 781602
Iron (II) chloride tetrahydrate Sigma 220299
Iron (II) sulfate heptahydrate Sigma 215422
hypoxanthine Sigma H9636
xanthine oxidase Sigma X4500
Excel Microsoft
R Studio Rstudio https://www.rstudio.com/products/rstudio/
KC4 Biotek Insturments discontinued 

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Kelly, S. C., Eccardt, A. M., Fisher, J. S. Measuring Trans-Plasma Membrane Electron Transport by C2C12 Myotubes. J. Vis. Exp. (135), e57565, doi:10.3791/57565 (2018).

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