Summary
本协议的目标是通过细胞外电子受体 spectrophotometrically 监测反式等离子体膜电子传输, 并分析这些细胞外电子受体可能发生的酶相互作用。
Abstract
反式等离子体膜电子传输 (tPMET) 在细胞内的还原应力保护和保护免受细胞外氧化剂的破坏中起着重要作用。这种从胞内还原剂向细胞外氧化剂输送电子的过程没有很好的定义。在这里, 我们提出了 C2C12 myotubes 的分光光度检测, 以监测 tPMET 利用细胞外电子受体: 水溶性四氮唑 salt-1 (WST-1) 和 26-dichlorophenolindophenol (DPIP 或 DCIP)。通过减少这些电子受体, 我们能够在实时分析中监控这个过程。随着抗坏血酸氧化酶 (AO) 和超氧化物歧化酶 (SOD) 的加入, 我们可以确定 tPMET 的哪一部分是由抗坏血酸出口或超氧化物产生的。当 WST-1 在低背景下产生稳定结果的同时, 在添加 AO 和 SOD 后, DPIP 能够重新氧化, 并通过分光光度分析证明。该方法显示了一种实时、多井、快速分光光度法, 其优点优于其它用于监测 tPMET 的方法, 如氰化钾 (FeCN) 和 ferricytochrome c 还原法。
Introduction
纯化的等离子膜降低电子受体的能力使人认为等离子膜具有固有的氧化还原容量1。以前在真菌、植物和动物中看到过, tPMET 是多个有机体共有的过程2,3,4,5。具体地说, 这一过程已在酿酒酵母、胡萝卜细胞、红细胞、淋巴细胞、骨肉瘤、黑色素瘤、巨噬细胞、骨骼肌和中性粒细胞2、3、4,5,6,7. 在通过等离子膜传输电子以减少细胞外氧化剂的过程中, tPMET 涉及许多细胞功能, 包括: 细胞生长5,8, 细胞生存能力9, 铁新陈代谢10, 细胞信号11,12,13, 和保护从活性氧种类12,14,15。由于 tPMET 在许多细胞功能中的参与, tPMET 的失衡已经被推测为某些严重的健康状况的发展做出贡献, 包括癌症16、心血管疾病17和新陈代谢综合症18。
有多种方法来监测电子在等离子膜上的传输, 但最广泛使用的技术是通过比色测定来评估细胞外电子受体的减少。通常使用的细胞外电子受体是四氮唑盐、DPIP、FeCN 和 ferricytochromec19, 20.最常用的四氮唑盐是第二代盐, 称为WST-119。与第一代四氮唑盐相比, 这种化合物在比色测定中更容易使用, 因为两个磺酸基团增加了其水溶性21。WST-1 与中间电子受体 1-甲氧基吩 methosulfate (mPMS) 相结合, 在两个单电子转移事件中减少。此还原将 WST-1 的弱色氧化形式更改为更强烈的黄色 formazan20,22。WST-1 有一个高摩尔消光系数 37 x 103 M-1cm-1, 导致高检测灵敏度21,22。DPIP 也被用作细胞外电子受体来监测 tPMET。已表明, DPIP 可以减少 extracellularly 由 tPMET 不支持中间电子受体23,24。由于缺少中间电子受体, DPIP 可以直接从等离子膜中提取电子, 而不像 WST-124。类似于 DPIP, FeCN 已被证明是减少 extracellularly 盐 tPMET 不支持中间电子受体19,24。与 WST-1 和 DPIP 不同, FeCN 具有低摩尔消光系数, 导致检测灵敏度降低9。另一个常用的细胞外电子受体监测 tPMET 是 ferricytochrome c. 类似 WST-1, ferricytochrome c 减少增加使用中间电子受体, mPMS22。与 WST-1 不同的是, ferricytochrome c 方法由于高背景和低摩尔消光系数22而不太敏感。
本文提出了一种通过分光光度法进行 tPMET 的实时分析方法。该方法利用细胞外电子受体 WST-1 和 DPIP, 因为它们都具有较高的摩尔消光系数, 而与其他常用的细胞外电子受体如 ferricytochrome c 相比, 它们的成本更低。我们使用吩 methosulfate (pms), 而不是 mPMS 他们有类似的化学成分和 PMS 是远远低于昂贵。mPMS 是光化学法稳定, 这是一个重要的特点, 商业套件, 需要长期的货架期。然而, 我们使 PMS 新的每一个化验, 所以稳定性不应该是一个问题。我们还提出一种方法来评估可能的酶相互作用 (参见图 1) 之间的细胞外电子受体和酶, 可用于进一步表征的过程 tPMET。具体地说, 酶的 AO 和 SOD 可以用来确定哪一部分的 tPMET 是由于抗坏血酸转运或胞外超氧化物释放, 两种常用的方法, 电子运输横跨等离子膜。
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Protocol
注意: 有关关键步骤的示意图概述, 请参见图 1 。
1. WST-1 还原试验
- 使用标准的细胞培养过程在96井板中利用 a F 来生长和区分 C2C12 黏附细胞.7
- 使用由 Dulbecco 修饰鹰培养基 (DMEM) 组成的分化培养基, 辅以2% 匹马血清、100毫升青霉素和0.1 毫克/毫升链霉素。孵化细胞在37°c 与 5% CO2。
- 当监测抗坏血酸参与 tPMET, 补充分化培养基与100µM 抗坏血酸。允许细胞在分化培养基中孵育24-48 小时。
- 准备库存 WST-1 和 PMS 解决方案。
- 为了使10毫米的 WST-1, 溶解0.033 克 WST-1 (FW): 651.34 克/摩尔) 在5毫升磷酸盐缓冲盐水 (PBS)。存储在4摄氏度。
- 要制作5毫米的 pms 库存, 可将0.0023 克 pms (固件: 306.34 克/摩尔) 溶解在1.5 毫升的去离子 H2o (蝶和 2 o).储存在-20 摄氏度和保护免受光照。
- 添加0.0108 克葡萄糖的最终浓度为5毫米至11.4 毫升的 PBS 或 HEPES 缓冲生理盐水 (哈佛商学院; 20 毫米 HEPES 钠盐, 140 毫米氯化钠, 5 毫米氯化钾, 2.5 毫米 MgSO4, 1 毫米 CaCl2)。添加480µL 10 毫米 WST-1 为最终浓度为400µM 和48µL 5 毫米 PMS 的最后浓度20µM。
- 当监测抗坏血酸参与 tPMET, 把溶液分成两个6毫升整除数。对一个整除, 添加6µL 蝶和 2 O 和另一个整除添加6µL 2 kU/毫升 AO 为最终浓度 2 U/毫升.
- 当监测超氧化物参与 tPMET, 将解决方案分为两个6毫升整除数。对于一个整除, 添加55µL KPO4缓冲区和另一个整除添加55µL 6.5 kU/毫升 SOD, 以最终浓度为 60 U/毫升。
- 用 PBS 冲洗细胞。吸入介质并添加150µL PBS。然后吸入 PBS
注: 化验是用电镀的, 附着的细胞做的。因此, 在洗涤过程中没有离心或胰蛋白酶的使用。 - 添加100µL WST-1 溶液 (-) sod 或 (-) ao 到列 1-6, 并添加100µL WST-1 溶液 (+) SOD 或 (+) AO 到7-12 列在96井板块。使用行 G 和 H 作为背景控件 (即, 在没有单元格的井中单独监测试剂中吸光度的变化)。
- 用分光光度计每10分钟测量1小时的吸光度值 438 nm。
- 读完后, 用150µL 的 PBS 冲洗介质, 洗净每一个井。然后吸入 PBS
- 计算每个井吸光度的变化, 方法是从任何时间点的吸光度中减去井的初始吸光度。更正背景井 (即) 中观察到的吸光度变化 (如果有) 的变化, 而不使用检测溶液, 但没有细胞的油井。
- 为了进行分析, 将吸光度数据正常化为60分钟的控制测量或用 PBS 或哈佛商学院冲洗水井, 然后执行二辛可宁酸 (可评估) 蛋白质测定。
- 添加2毫克/毫升牛血清白蛋白 (BSA) 标准 (范围从 0.5-2 µL 为标准曲线, 取决于细胞的汇合程度) 到空井 (G 行和 H), 然后添加到所有水井的可测性试剂。
- 通过 nmol 每µg 蛋白质的 WST-1 减少来量化数据。使用37毫米-1 cm-1 22作为消光系数为减少的 WST-1 在438毫微米。
2. DPIP 还原试验
- 生长和区分 C2C12 黏附细胞与步骤1.1 相同的步骤。
- 准备库存10毫米 DPIP 溶液如下。溶出0.029 克 DPIP (FW: 290.08 克/摩尔) 在10毫升的蝶和 2 o. 通过用分光光度计测定 600 nm 中的吸光度, 确定 DPIP 的浓度.使用1毫米-1 cm-1 23作为消光系数为减少的 DPIP 在600毫微米。存储在4摄氏度。
- 添加0.0108 克葡萄糖到11.880 毫升的 PBS, 最终浓度为5毫米。添加120µL 10 毫米 DPIP 的最后浓度为100µM。
- 当监测抗坏血酸参与 tPMET, 把溶液分成两个6毫升整除数。对一个整除, 添加6µL 蝶和 2 O 和另一个整除添加6µL 2 kU/毫升 AO 为最终浓度 2 U/毫升.
- 当监测超氧化物参与 tPMET, 将解决方案分为两个6毫升整除数。对于一个整除, 添加55µL KPO4缓冲区和另一个整除添加55µL 6.5 kU/毫升 SOD, 以最终浓度为 60 U/毫升。
- 在150µL 的 PBS 中吸入培养基和洗涤细胞。吸入 PBS 并添加100µL DPIP 溶液 (-) sod 或 (-) ao 到1-6 列, 并添加100µL DPIP 溶液 (+) SOD 或 (+) AO 到7-12 列在96井板。使用 G 和 H 行作为后台控制 (即), 以监测在没有细胞的油井中单独的试剂中吸收的变化。
- 用分光光度计每10分钟测量 600 nm 的吸光度, 1 h. 将相对于该控件的吸光度的变化量化为60分钟, 类似于步骤 1.9-1.13。
3. 降低电子受体是否为 AO 或 SOD 基板的测定
- 到5.436 毫升的 PBS 或哈佛商学院, 添加240µL 10 毫米 WST-1 为最终浓度400µM 和24µL 5 毫米 PMS 的最后浓度20µM。
- 对于 DPIP, 添加60µL 10 毫米 DPIP, 最终集中100µM, 到5.940 毫升的 PBS 或哈佛商学院。
- 在没有细胞的情况下, 在一个平底96井板中添加100µL 溶液, 并测量分光光度计在 438 nm, WST-1, 或 600 nm, DPIP。
- 添加1µL 10 毫米抗坏血酸到一半的水井, 最后浓度为100微米。监测吸光度直到稳定。
- 稳定后, 添加1µL 200 u/毫升 AO 的最终浓度为 2 u/毫升的每一个井或添加1µL 6 kU/毫升 SOD 的最后浓度 60 U/毫升的最终集中到每一个井和监测吸光度为 1 h。
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Representative Results
使用 RStudio 统计软件25进行重复测量, 对方差分析进行了统计。示例大小在图图例中显示。
为了监测 tPMET, C2C12 myotubes 与细胞外电子受体、WST-1 和 DPIP 一起使用。AO 用于确定 WST-1 和 DPIP 减少的部分是由于抗坏血酸流出和 SOD 被用来确定 WST-1 减少的部分是由于胞外超氧化物释放。如图 2所示, C2C12 myotubes 可以 tPMET, 这是 WST-1 减少所看到的。随着 AO 的加入, WST-1 的减少被抑制了 30%, 表明30% 的 tPMET 是由于抗坏血酸的出口 (图 2A)。随着 SOD 的增加, WST-1 的减少被抑制了 70%, 表明70% 的 tPMET 是由于胞外超氧化物释放 (图 2B)。当 DPIP 被用来作为一个细胞外电子受体的添加 AO, DPIP 减少被抑制超过 100% (图 3)。这引起了关于使用 DPIP 与 AO 评估抗坏血酸贡献的有效性的问题。
为了研究 WST-1 是否为 AO 或 SOD 的基质, WST-1 随抗坏血酸的减少而降低。添加了 AO 或 SOD, 并监测了吸光度。1小时后, WST-1 的减少形式与 ao 或 sod 之间的吸光度变化不变, WST-1 的减少形式 (图 4A, B)。因此, 减少的 WST-1 不是这些酶的基质, 和使用 AO 或 SOD 结合 WST-1 是适当的评价抗坏血酸或超氧化物的作用, 分别。
为了确定还原 DPIP 是否为 AO 或 SOD 的基质, DPIP 随抗坏血酸降低。20分钟后, AO 增加, 并监测吸光度。减少的 DPIP 被证明是 AO 的基底, 如图 5A所示, 在那里 DPIP 返回到其氧化形式在40分钟内。添加 SOD 后, DPIP 也被重新氧化 (图 5B)。因此, 减少 DPIP 是这些酶的基质, 而不是一个适当的细胞外电子受体使用这些酶。
图 1: 电子传输检测的关键步骤的示意图表示和与胞外电子受体的酶相互作用的测定.请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 添加 AO 和 SOD 以抑制 C2C12 myotubes 的 WST-1 还原.(A) tPMET 分析了60分钟, 使用400µM WST-1 和20µM PMS, 增加了 2 U/毫升 AO 或蝶和 2 O (N = 18/组).(B) tPMET 分析了60分钟, 增加了60个 U/mL SOD 或 0.1 M KPO4缓冲区 (N = 36/组)。*p≥0.05 在指定的时间点。误差线表示平均值的标准误差, 可能太小, 无法可视化。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 添加 AO 抑制 C2C12 myotubes 的 DPIP 还原.tPMET 分析60分钟使用100µM DPIP 与或不添加 2 U/毫升 AO (N = 36/组)。*p≥0.05 在指定的时间点。误差线表示平均值的标准误差, 可能太小, 无法可视化。请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: 减少的 WST-1 不是 AO 或 SOD 的基板.(A) WST-1 随抗坏血酸减少。45分钟后, 添加了 AO, 并监测了1小时的吸光度。没有观察到吸收的变化。(B) 该过程与上述步骤相同, 但在45分钟后添加 SOD。没有观察到吸收的变化 (N = 24/组)。误差线表示平均值的标准误差, 可能太小, 无法可视化。请单击此处查看此图的较大版本.
图 5: 减少的 DPIP 是 AO 和 SOD 的基板.(A) DPIP 随抗坏血酸减少。20分钟后, AO 增加, 并监测吸光度。在40分钟内, 样品回到原来的吸光度, 表明减少 DPIP 是一个基板的 AO。(B) DPIP 随抗坏血酸减少。20分钟后, 添加 SOD, 并监测吸光度。随着时间的推移, 减少的 DPIP 被重新氧化, 表明减少 DPIP 是一个基片的 SOD (N = 24/组)。误差线表示平均值的标准误差, 可能太小, 无法可视化。请单击此处查看此图的较大版本.
图 6: 描述 tPMET 的示意图.在这种 tPMET 模型中, 由细胞输出的抗坏血酸 (或另一种电子载体) 可以减少细胞外经前综合征。此外, 氧化酶产生胞外超氧化物, 可以直接减少 WST-1 或通过降低 PMS 间接减少。其他等离子膜捐献者的电子也可以减少 PMS, 它可以将电子捐献给 WST-1 或 O2 , 随后 WST-1 减少。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
我们提出了两种方法, 利用细胞外电子受体, WST-1 和 DPIP, 分光光度法检测 tPMET C2C12 myotubes。随着标准培养过程中细胞系的生长和分光光度计板读取器的增加, 在简单的微板块实验中, 可以用这些电子受体监测 tPMET。WST-1 的还原是从良好到良好的在一个试验中重现, 但有日常的变化。以 PBS 为缓冲器的日日变化系数 (cv) 为 0.18, 以哈佛商学院为缓冲区的 cv 为0.23。
从以前的文献使用 mPMS 和 WST-1, 我们已经修改了这个协议, 特别是用于 PMS 的使用。因此, 故障排除包括确定适当浓度的 PMS 和 WST-1 用于 myotubes 描述。我们还确定温度 (在23-37 摄氏度范围内) 不是检测的关键成分, 而在每次吸光度读数之前摇动盘子是很重要的。然而, 这些问题应该被调查的其他细胞线, 该化验是适用的。关于 SOD 和 AO 直接氧化还原 WST-1 能力的研究表明, 筛选新的检测成分是诊断的关键。
我们的数据表明, 应与 WST-1 结合使用 PMS, 以获得最佳的 WST-1 减少。我们发现, 在1毫升体积, 100 µM 抗坏血酸减少 322 nmol WST-1 每分钟的存在的 PMS, 这是需要直接减少 WST-1 的抗坏血酸。在1毫升体积, AO 2 U/毫升氧化抗坏血酸的速率为 4400 nmol/秒, 或800倍的速度比还原 WST-1 的抗坏血酸。显然, AO 酶活性比抗坏血酸直接还原 PMS/WST-1 快得多。我们希望同样的情况下, 超氧化物和 SOD, 虽然我们没有一个系统, 以测量绝对率的 WST-1 还原的超氧化物。
为了确定 PMS 是否会影响超氧化物 WST-1 的还原, 我们使用了黄嘌呤氧化酶 (4.5 亩/毫升)/嘌呤 (0.1 毫米) 超氧化物生成系统, 如前所述26,27。该系统的 WST-1 减少率约加倍。因此, PMS 似乎将电子从超氧化物转移到 WST-1。
为了进一步评价 pms 对细胞 WST-1 减少的要求, 我们对 pms 和 WST-1 的存在或缺失进行了测定, 发现在细胞 WST-1 减少时需要 pms。当细胞在含有 PMS 的检测试剂中孵化时 (在没有 WST-1 的情况下), 吸光度增加 438 nm。这可能反映了 semiquinone 形式的 pms (pms) 的累积, 其峰值吸收率在 440 nm28。经前综合征的积累表明, pms 的降低速度比它可以通过电子到 O2产生超氧化物。因此, 经 pms (pms) 的积累与经前综合症报告的 O2的缓慢减少相比, 与完全减少的 PMS28的比率是一致的。
我们还提出了一个协议, 以确定是否电子受体是基质的酶, 可用于监测 tPMET。通过监测分光光度计中细胞外电子受体的减少, 然后再加入感兴趣的酶, 可以确定电子受体是否为这些酶的基底。通过这种方法, 我们已经表明, 减少 DPIP 是一个基的 AO 和 SOD 表明, 它不是一个合适的电子受体监测抗坏血酸流出和超氧化物出口。
测试诸如 SOD 或 AO 等检测组件是否会产生工件的过程是对现有方法的显著改进。例如, 减少 DPIP 是 SOD 的基板, 表明使用 DPIP 和 SOD 获得的公布数据应该相应地解释。我们的发现支持以前的研究, 大雁和道森, 其中无色 26-dichloroindophenol 的吸光度监测后添加 AO: DPIP 氧化表明它是一个基板为 AO29。但是, 我们的研究结果为 Tan 和 Berridge24以及 Bellavite et . 所进行的研究添加了上下文。30, 利用 SOD 抑制 DPIP 还原。在谭和 Berridge 进行的一项研究中, 比较 WST-1、DPIP 和 FeCN 在 HeLa 细胞中的电子受体, 他们发现某些电子受体的减少是在 SOD 存在的情况下被抑制的。WST-1 的减少与 mPMS 结合, 在 SOD 存在的情况下抑制了 80%, 而 DPIP 的还原抑制了40%。在 SOD24的存在下, FeCN 的还原与替代的中间电子受体不被抑制。在评价氧化酶与 DPIP 或细胞色素 c 之间的电子交换模式时, Bellavite et等) 发现 DPIP 和细胞色素 c 通过氧化酶减少, 而 SOD 30 明显抑制了这种还原.Berridge 和 Tan 还表明, SOD 可以抑制 WST-1 减少80% 的小鼠细胞线的 32Dcl23, WEHI3B, J774 以及人类细胞系 Jurkat, MALME3M, 和 143B6,31。与人原发性中性粒细胞, 在 SOD6,32的存在下, WST-1 还原抑制95%。
这里的数据表明, 重要的是要验证, 用于评估出口分子对 tPMET 的特定贡献的酶不能重新氧化的减少形式的细胞外电子受体。我们发现 (数据未显示) 氯化亚铁和硫酸亚铁不溶于 PBS。在哈佛商学院和苯酚无红 DMEM, 它们被迅速氧化, 表明与哈佛商学院或 DMEM 不相容作为化验媒介。相反, AO 和 SOD 不使用盐钾作为基质, 表明它是一个合适的细胞外电子受体, 如果它的低消光系数不是一个问题。
这种检测的主要限制之一是, PMS/WST-1 和 DPIP 可以减少多个电子捐助者, 如 NAD (P) H, 抗坏血酸和黄酮类化合物, 如槲皮素和杨梅素19,33,34。然而, 这可以通过添加酶 (例如, SOD, AO) 或抑制剂来解决, 以确定特定的贡献者 PMS/WST-1 或 DPIP 减少。另一个限制是 DPIP 可以充当 AO 和 SOD 的基底。因此, 这些酶不应与 DPIP 一起使用来监测 tPMET。这项研究的另一个重要限制是, PMS 和其他氧化还原循环产生超氧化物26,35,36的能力。这在图 6中进行了说明。另一方面, 据报道, PMS 本身对 tPMET32没有直接影响。此外, Tan 和 Berridge32已经表明, diphenyleneiodinium 氧化酶 (NOX) 抑制剂, 氯甲烷 (DPI), 可以抑制大多数 WST-1 减少, 表明 DPI 敏感 tPMET 可以是一个具体的措施 NOX 贡献tPMET。另一个限制是, 我们看到在使用 WST-1 时, 吸光度的变化很小。我们发现, 当 WST-1 是新鲜的, 细胞是汇合的, 吸收的最大变化是可见的。以前在 P388 细胞系进行的研究表明, formazan 产生的量与细胞数21呈正相关。因此, 细胞越汇合, WST-1 的减少越大。这可以通过规范化为每个井的蛋白质微克来纠正。
关于这一分析的一个告诫是, 它的主要目的是评估全球 tPMET。虽然它可以纵 , 以监测多种形式的 tPMET , 如抗坏血酸流出的例子 , 更具体的化验可能更适合当目标不需要测量的情况下 , tPMET 。福克斯举例来说, 如果超氧化物是主要的兴趣, 有许多其他途径来监测超氧化物, 如使用探针, 包括荧光不透水探针, 乌头和硝基四氮唑37。
现有的用于监视 tPMET 的探测器 (如 DPIP、FeCN 和 ferricytochrome c) 存在缺点。例如, 减少 DPIP 是 AO 和 SOD 的基板, FeCN 具有低摩尔消光系数, 限制其在实时检测中的效用, 而细胞色素c成本高昂。此外, 有些探头在测量吸光度32的变化时, 会产生高背景, 导致灵敏度低。WST-1 已被证明不是一个基质的酶, 如 AO 和 SOD。此外, WST-1 具有较高的摩尔消光系数和较低的背景反应, 产生了更灵敏的 tPMET 测定。向前迈进, 这种分析可以使用广泛的抑制剂, 以更好地了解 tPMET 的过程, 地图的电子传输路径在一个特定的细胞线, 并导致更好地了解如何保持细胞的氧化还原环境。
该协议的关键步骤包括确定细胞是否准备好进行实验 (70% 汇合) 以及使化验试剂, 特别是 WST-1 和 PMS, 为每种化验新鲜。在添加化验试剂之前, 对细胞进行洗涤也是非常重要的。在本议定书中使用的 DMEM 不含抗坏血酸, 虽然我们补充抗坏血酸的分化培养基。一些可用的媒体确实含有抗坏血酸。然而, 在添加无抗坏血酸的化验试剂之前, 细胞会被洗涤, 以除去培养基中的任何残留抗坏血酸。由于 tPMET 的一部分是分子外排 (例如,抗坏血酸出口), 所以在添加化验试剂后立即开始分光光度读数是很重要的, 以免错过第一次流出的瞬间。另外, 在实验中包括每个试剂的背景井也是至关重要的。本文所描述的检测成分在吸光度方面的背景变化微不足道。但是, 某些添加剂 (例如,根皮素) 可以促进大量的背景反应。因此, 在分析数据以消除试剂本身可能产生的混杂效应时, 必须将背景减去。
总之, 此处提出的议定书提供了一种评估 tPMET 的方法, 并建议在将分析应用于不同的细胞线和/或评估特定贡献者时, 应考虑到议定书的若干告诫和方面 (抗坏血酸和超氧化物在这里使用) tPMET。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们要感谢托马斯贝尔, 林恩 Mattathil, 马克 Mannino, 和 Neej 的技术支持。这项工作得到美国公共卫生服务奖 R15DK102122 从国家糖尿病和消化和肾脏疾病研究所 (NIDDK) 的支持乔纳森费舍尔。手稿内容完全是作者的责任, 不一定代表 NIDDK 或国立卫生研究院的官方意见。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C2C12 myoblasts | American Type Culture Collection | CRL-1772 | |
| Dulbecco's modified eagle's medium - low glucose | Sigma | D6046 | |
| Fetal Plex animal serum complex | Gemini Bio-Products | 100-602 | |
| penicillin-streptomycin | Sigma | 516106 | |
| horse serum | Gibco Technologies | 16050-130 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline | Sigma | D8537 | |
| trypsin-EDTA | Sigma | T4049 | |
| 15 cm culture dishes | TPP | 93150 | |
| 96 well culture plates | TPP | 92096 | |
| 2-(4-Iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium Sodium Salt (WST-1) | Accela ChemBio Inc | SY016315 | |
| phenazine methosulfate | Sigma | P9625 | |
| L-ascorbic acid | Sigma | A5960 | |
| ascorbate oxidase | Sigma | A0157 | |
| superoxide dismutase | Sigma | S5395 | |
| 2,6-dichloroindophenol sodium salt | ICN Biomedicals | 215011825 | |
| D-(+)-glucose | Sigma | G7528 | |
| HEPES sodium salt | Sigma | H3784 | |
| sodium chloride | Sigma | S7653 | |
| potassium chloride | Fisher Scientific | BP366 | |
| magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | M5921 | |
| calcium chloride dihydrate | Sigma | C7902 | |
| potassium phosphate | Fisher Scientific | BP363 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Powerwave X-I spectrophotometer | Biotek Insturments | discontinued | |
| Spectronic Genesys 5 Spectrophotometer | Thermo Scientific | 336001 | |
| PureGrade 96-well microplate, F-bottom, clear, untreated, non-sterile | MidSci | 781602 | |
| Iron (II) chloride tetrahydrate | Sigma | 220299 | |
| Iron (II) sulfate heptahydrate | Sigma | 215422 | |
| hypoxanthine | Sigma | H9636 | |
| xanthine oxidase | Sigma | X4500 | |
| Excel | Microsoft | ||
| R Studio | Rstudio | https://www.rstudio.com/products/rstudio/ | |
| KC4 | Biotek Insturments | discontinued |
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