Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Måling af Trans-Plasma membran elektron Transport af C2C12 Myotubes

Published: May 4, 2018 doi: 10.3791/57565
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Biology, Saint Louis University
* These authors contributed equally

Summary

Målet med denne protokol er spektrofotometrisk overvåge trans-plasma membran elektron transport udnytte ekstracellulære elektronacceptorer og analysere enzymatisk interaktioner, der kan opstå med disse ekstracellulære elektronacceptorer.

Abstract

Trans-plasma membran elektron transport (tPMET) spiller en rolle i beskyttelsen af celler fra intracellulære reduktiv stress samt beskyttelse mod beskadigelse af ekstracellulære oxidanter. Denne proces til at transportere elektroner fra intracellulære reduktionsmidler til ekstracellulære oxidanter er ikke veldefineret. Her præsenterer vi spektrofotometriske assays af C2C12 myotubes til at overvåge tPMET udnytter de ekstracellulære elektronacceptorer: vandopløselige tetrazolium salt-1 (WST-1) og 2,6-dichlorophenolindophenol (DPIP eller DCIP). Gennem reduktion af disse elektronacceptorer er vi i stand til at overvåge denne proces i en real-time analyse. Med tilføjelsen af enzymer såsom Ascorbat oxidase (AO) og superoxiddismutase (SOD) for assays, kan vi afgøre, hvilken del af tPMET er Ascorbat eksport eller superoxid produktion, henholdsvis. Mens WST-1 blev vist sig at producere stabile resultater med lav baggrund, kunne DPIP være re oxideret efter tilsætning af AO og SOD, hvilket blev demonstreret med spektrofotometriske analyse. Denne metode viser en real-time, multi godt, hurtig spektrofotometriske assay med fordele frem for andre metoder, der anvendes til at overvåge tPMET, som Ferricyanid (FeCN) og ferricytochrome c reduktion.

Introduction

Renset plasma membraner evne til at reducere elektronacceptorer har ført til den opfattelse, at plasma membranen har en iboende redox kapacitet1. Tidligere set i svampe, planter og dyr, er tPMET en proces, der er fælles for flere organismer2,3,4,5. Specifikt, er denne proces blevet påvist i Saccharomyces cerevisiae, gulerod celler, erytrocytter, lymfocytter, osteosarkom, melanom, makrofager, skeletmuskulatur og neutrofile2,3, 4 , 5 , 6 , 7. i en proces, der transporterer elektroner over plasmamembran at reducere ekstracellulære oxidanter, tPMET er involveret i mange cellulære funktioner, herunder: celle vækst5,8, celle levedygtighed9, jern metabolisme10, celle signalering11,12,13, og beskyttelse mod reaktive ilt arter12,14,15. På grund af Tpmet's involvering i mange cellulære funktioner, en ubalance i tPMET har været en hypotese for at bidrage til udviklingen af nogle alvorlige sundhedsmæssige betingelser, herunder kræft16, hjerte-kar-sygdom17, og metabolisk syndrom18.

Der er flere måder at overvåge overførslen af elektroner over plasmamembran, men den mest udbredte teknik er at vurdere reduktion af ekstracellulære elektronacceptorer gennem kolorimetriske assays. Almindeligt anvendte ekstracellulære elektronacceptorer er tetrazolium salte, DPIP, FeCN og ferricytochrome c19,20. De mest almindeligt anvendte tetrazolium salt er en anden generation salt kendt som WST-119. Dette stof er lettere at udnytte i kolorimetriske assays i forhold til første generation tetrazolium salte på grund af to sulfonat grupper, der øger dens vand opløselighed21. WST-1, er sammenholdt med mellemliggende elektron acceptor 1-methoxy-phenazine methosulfate (mPMS), reduceret i to enkelt-elektron overførsel begivenheder. Denne reduktion ændres svagt farvede oxiderede form af WST-1 til en mere intens, gule formazankoncentrationen20,22. WST-1 har en høj molær ekstinktion koefficient på 37 x 103 M-1cm-1, fører til et højt assay følsomhed21,22. DPIP er også udnyttes som en ekstracellulære elektron acceptoren til at overvåge tPMET. Det har vist sig at DPIP kan reduceres extracellularly ved tPMET uden hjælp af mellemliggende elektron acceptorer23,24. På grund af manglende mellemliggende elektronacceptorer, DPIP kan direkte afhentning elektroner fra plasma membran, i modsætning til WST-124. Svarende til DPIP, FeCN har vist sig at være reduceret extracellularly til kaliumferrocyanid af tPMET uden hjælp af mellemliggende elektron acceptorer19,24. I modsætning til WST-1 og DPIP har FeCN en lav molær ekstinktion koefficient fører til en lavere assay følsomhed9. En anden almindeligt anvendte ekstracellulære elektron acceptoren til at overvåge tPMET er ferricytochrome c. svarende til WST-1, ferricytochrome c reduktion stigninger med brug af mellemliggende elektron acceptor, mPMS22. I modsætning til WST-1 men er metoden ferricytochrome c mindre følsomme på grund af en stor baggrund og en lav molær ekstinktion koefficient22.

Her vil vi præsentere en metode for tidstro analyse af tPMET gennem spektrofotometriske assays. Metoden udnyttes de ekstracellulære elektronacceptorer WST-1 og DPIP, som de begge har en høj molær ekstinktion koefficient, mens at være billigere i forhold til de andre almindeligt anvendte ekstracellulære elektronacceptorer som ferricytochrome c. Vi udnyttede phenazine methosulfate (PMS) i stedet for mPMS de har en lignende kemisk makeup og PMS er langt billigere. mPMS er photochemically stabilt som er et vigtigt kendetegn for en kommerciel kit, der har bør for en lang holdbarhed. Men vi gør PMS frisk i hvert assay, så stabilitet ikke bør være et problem. Vi præsenterer også en metode til at vurdere mulige enzymatisk interaktioner (Se figur 1) mellem de ekstracellulære elektron acceptor og enzymer, der kan udnyttes til at yderligere karakterisere processen med tPMET. Specifikt, bestemme enzymer AO og SOD kan bruges, hvilken del af tPMET skyldes Ascorbat transport eller ekstracellulære superoxid udgivelse, to fælles metoder for elektronerne transporteres over plasmamembran.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bemærk: Se figur 1 for en skematisk oversigt over vigtige trin.

1. WST-1 reduktion Assay

  1. Vokse og differentiere C2C12 vedhængende celler ved hjælp af standard celle kultur procedurer7 i en 96-brønd plade udnytte rækker A-F.
    1. Bruge en differentiering medium bestående af Dulbeccos modificerede Eagle Medium (DMEM) suppleret med 2% hest serum, 100 U/mL penicillin og 0,1 mg/mL streptomycin. Inkuber celler ved 37 ° C med 5% CO2.
    2. Når overvågning Ascorbat engagement i tPMET, supplere differentiering medier med 100 µM ascorbinsyre. Tillader cellerne at udruge i differentiering medier til ~ 24-48 h.
  2. Forberede stamopløsninger WST-1 og PMS.
    1. For at gøre en 10 mM bestand af WST-1, opløse 0,033 g WST-1 (formel vægt (FW): 651.34 g/mol) i 5 mL af phosphat bufferet saltvand (PBS). Opbevares ved 4 ° C.
    2. For at gøre en 5 mM bestand af PMS, opløses 0.0023 g af PMS (FW: 306.34 g/mol) i 1,5 mL deioniseret vand H2O (diH2O). Opbevares ved-20 ° C og beskytte mod lys.
  3. Tilføje 0.0108 g glukose til en endelig koncentration på 5 mM til 11,4 mL PBS eller HEPES bufferet saltvand (HBS; 20 mM HEPES natrium salt, 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2,5 mM MgSO4, 1 mM CaCl2). Tilføje 480 µL af 10 mM WST-1 for en endelig koncentration på 400 µM og 48 µL af 5 mM PMS til en endelig koncentration på 20 µM.
  4. Når overvågning Ascorbat engagement i tPMET, skal du opdele løsningen i to 6 mL alikvoter. En alikvot, tilføje 6 µL af diH2O og til anden delprøve tilsættes 6 µL af 2 kU/mL AO til en slutkoncentration på 2 U/mL.
  5. Når overvågning superoxid engagement i tPMET, skal du opdele løsningen i to 6 mL alikvoter. En alikvot, tilføje 55 µL af 0,1 M KPO4 buffer og til anden alikvot tilføje 55 µL af 6,5 kU/mL SPADESTIK til en endelig koncentration på 60 U/mL.
  6. Cellerne vaskes med PBS. Opsug mediet og Tilføj 150 µL PBS. Derefter Aspirér PBS.
    Bemærk: Analysen er udført med forgyldt, tilknyttede celler. Således er der ingen centrifugering eller brug af trypsin i vaskeprocessen.
  7. Tilsæt 100 µL af WST-1 løsning (-) SOD eller (-) AO til kolonnerne 1-6 og tilsæt 100 µL af WST-1 løsning (+) SOD eller (+) AO til kolonne 7-12 i 96-brønd plade. Bruge række G og H som baggrund kontrol (dvs., at overvåge ændringer i absorbans i reagenset alene i brønde uden celler).
  8. Måling af absorbans værdier ved hjælp af spektrofotometret hver 10 min til 1 time på 438 nm.
  9. Efter læsning, Aspirér medierne og vaske hver godt med 150 µL af PBS. Derefter Aspirér PBS.
  10. Beregne ændringen i absorbans for hver brønd ved at fratrække den indledende Absorbansen for en brønd fra absorbans på ethvert tidspunkt for at nå. Korrigere denne ændring for ændringen i absorbans (hvis nogen) observeret i baggrunden brøndene (dvs., brønde med assay løsning men ingen celler).
  11. For analyse, normalisere absorbans data til 60 min kontrol måling eller vaske brønde med PBS eller HBS og derefter udføre en bicinchoninic syre (BCA) protein assay.
  12. Tilføj 2 mg/mL bovint serumalbumin (BSA) standard (spænder fra 0,5-2 µL for standardkurven, afhængigt af graden af sammenløbet af celler) Tom brønde (række G og H), derefter tilføje BCA reagens i alle pladens huller.
  13. Kvantificere data via nmol WST-1 reduktion pr. µg af protein. Bruge 37 mM-1 cm-1 22 som extinction koefficient for reduceret WST-1 på 438 nm.

2. DPIP reduktion Assay

  1. Vokse og differentiere C2C12 vedhængende celler med samme procedure som trin 1.1.
  2. Forberede lager 10 mM DPIP løsning som følger. 0.029 g DPIP opløses (FW: 290.08 g/mol) i 10 mL af diH2O. Bekræft koncentration af DPIP ved måling af absorbans på 600 nm med et spektrofotometer. Brug 1 mM-1 cm-1 23 som extinction koefficient for reduceret DPIP på 600 nm. Opbevares ved 4 ° C.
  3. Tilføje 0.0108 g glukose til 11.880 mL PBS til en endelig koncentration på 5 mM. Tilføje 120 µL af 10 mM DPIP til en endelig koncentration på 100 µM.
  4. Når overvågning Ascorbat engagement i tPMET, skal du opdele løsningen i to 6 mL alikvoter. En alikvot, tilføje 6 µL af diH2O og til anden delprøve tilsættes 6 µL af 2 kU/mL AO til en slutkoncentration på 2 U/mL.
  5. Når overvågning superoxid engagement i tPMET, skal du opdele løsningen i to 6 mL alikvoter. En alikvot, tilføje 55 µL af 0,1 M KPO4 buffer og til anden alikvot tilføje 55 µL af 6,5 kU/mL SPADESTIK til en endelig koncentration på 60 U/mL.
  6. Opsug mediet og vaske cellerne i 150 µL af PBS. Opsug PBS og tilsæt 100 µL af DPIP løsning (-) SOD eller (-) AO til kolonnerne 1-6 og tilsæt 100 µL af DPIP løsning (+) SOD eller (+) AO til kolonne 7-12 i 96-brønd plade. Bruge rækker G og H vil som baggrund kontrol (dvs., at overvåge ændringer i absorbans i reagenset alene i brønde uden celler).
  7. Absorbansen måles på 600 nm ved hjælp af spektrofotometret hver 10 min til 1 h. kvantificere ændringen i absorbans i forhold til kontrol ved 60 min. svarende til trin 1.9-1.13.

3. bestemmelse af om reduceret elektronacceptorer er substrater for AO eller SOD

  1. 5.436 mL PBS eller HBS, tilføje 240 µL af 10 mM WST-1 for en endelig koncentration på 400 µM og 24 µL af 5 mM PMS til en endelig koncentration på 20 µM.
    1. Til DPIP, tilsættes 60 µL af 10 mM DPIP, til en endelig koncentration på 100 µM, 5.940 mL PBS eller HBS.
  2. Tilsæt 100 µL af løsning til hver godt i en flad bund 96-brønd plade i mangel af celler og absorbansen måles i et spektrofotometer ved 438 nm for WST-1, eller 600 nm, for DPIP.
  3. Tilføj 1 µL af 10 mM Ascorbat til halvdelen af brønde til en endelig koncentration på 100 μM. Overvåge absorbansen, indtil det stabiliserer.
  4. Ved stabilisering, tilsæt 1 µL af 200 U/mL AO til en slutkoncentration på 2 U/mL til hver brønd eller tilføje 1 µL af 6 kU/mL SPADESTIK til en endelig koncentration på 60 U/mL for hver godt og overvåge Absorbansen for 1 h.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Statistik blev udført med ANAVA med gentagne foranstaltninger ved hjælp af RStudio statistisk software25. Stikprøver er angivet i figur legender.

For at overvåge tPMET, blev C2C12 myotubes udnyttet sammen med ekstracellulære elektronacceptorer, WST-1 og DPIP. AO blev brugt til at bestemme, hvilken del af WST-1 og DPIP reduktion skyldtes Ascorbat efflux og SOD blev brugt til at bestemme, hvilken del af WST-1 reduktion skyldtes ekstracellulære superoxid frigivelse. Som vist i figur 2, er C2C12 myotubes i stand til at tPMET som set ved reduktion af WST-1. Med tilføjelsen af AO, blev WST-1 reduktion undertrykt af ~ 30% angiver, at ~ 30% af tPMET var eksport af Ascorbat (figur 2A). Med tilføjelsen af SOD, blev WST-1 reduktion undertrykt af ~ 70%, der angiver, at ~ 70% af tPMET blev due ekstracellulære superoxid release (figur 2B). Når DPIP blev udnyttet som en ekstracellulære elektron acceptor med tilsætning af AO, DPIP reduktion blev undertrykt over 100% (figur 3). Dette rejste spørgsmål om gyldigheden af ved hjælp af DPIP med AO for at vurdere bidrag af Ascorbat.

For at undersøge om reduceret WST-1 er et substrat for AO eller SOD, blev WST-1 reduceret med ascorbinsyre. AO eller SOD blev tilføjet, og absorbansen blev overvåget. Efter 1 time var der ingen ændring i absorbans mellem den reducerede form af WST-1 uden AO eller SOD og reduceret form af WST-1 med AO eller SOD (figur 4A, B). Derfor, den reducerede WST-1 er ikke et substrat for disse enzymer, og brugen af AO eller SOD sammenholdt med WST-1 er relevante for vurderingen af roller Ascorbat eller superoxid, henholdsvis.

For at finde ud af, hvis et substrat for AO eller SOD reducerede DPIP blev DPIP reduceret med ascorbinsyre. Efter 20 min, AO blev tilføjet, og absorbansen blev overvåget. Reduceret DPIP viste sig at være et substrat for AO, som det ses i figur 5A, hvor DPIP vender tilbage til sin oxiderede form indenfor 40 min. Når SOD blev tilføjet, var DPIP også re oxideret (figur 5B). Reduceret DPIP er derfor et substrat for disse enzymer og ikke en passende ekstracellulære elektron acceptor kan udnyttes med disse enzymer.

Figure 1
Figur 1: en skematisk fremstilling af de vigtigste skridt af elektron transport assays og bestemmelse af enzymatisk samspil med de ekstracellulære elektronacceptorer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: tilføjelse af AO og SOD undertrykker WST-1 reduktion af C2C12 myotubes. (A) tPMET blev analyseret for 60 min. ved hjælp af 400 µM WST-1 og 20 µM PMS med tilsætning af 2 U/mL AO eller diH2O (N = 18/gruppe). (B) tPMET blev analyseret i 60 min. med tilsætning af 60 U/mL SOD eller 0,1 M KPO4 buffer (N = 36/gruppe). p≥ 0,05 på det angivne tidspunkt. Fejllinjer udgør standard fejl af middelværdien og kan være for lille til at visualisere. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: tilføjelse af AO undertrykker DPIP reduktion af C2C12 myotubes. tPMET blev analyseret for 60 min. ved hjælp af 100 µM DPIP med eller uden tilsætning af 2 U/mL AO (N = 36/gruppe). p≥ 0,05 på det angivne tidspunkt. Fejllinjer udgør standard fejl af middelværdien og kan være for lille til at visualisere. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: reduceret WST-1 er ikke et substrat for AO eller SOD. (A) WST-1 blev reduceret med Ascorbat. Efter 45 min, AO blev tilføjet, og absorbansen blev overvåget for 1 h. Ingen ændring i absorbans blev observeret. (B) proceduren, der er den samme som ovenfor, bortset fra SOD blev tilføjet efter 45 min. Ingen ændring i absorbans blev observeret (N = 24/gruppe). Fejllinjer udgør standard fejl af middelværdien og kan være for lille til at visualisere. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: reduceret DPIP er et substrat for AO og SOD. (A) DPIP blev reduceret med Ascorbat. Efter 20 min, AO blev tilføjet, og absorbansen blev overvåget. Indenfor 40 min, prøverne vendte tilbage til deres oprindelige absorbans, der angiver, at reducerede DPIP er et substrat for AO. (B) DPIP blev reduceret med Ascorbat. Efter 20 min, SOD blev tilføjet, og absorbansen blev overvåget. Over tid, den reducerede DPIP var igen oxideret, der angiver, at reduceret DPIP er et substrat for SOD (N = 24/gruppe). Fejllinjer udgør standard fejl af middelværdien og kan være for lille til at visualisere. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: skematisk skildrer tPMET. I denne model af tPMET, kan Ascorbat (eller en anden elektron luftfartsselskab) eksporteret af cellen reducere ekstracellulære PMS. Derudover generere NADPH oxidases ekstracellulære superoxid, som kan reducere WST-1 direkte eller reducere det indirekte via reduktion af PMS. Elektroner fra andre donorer, plasma membran kan også reducere PMS, som kan donere elektroner til enten WST-1 eller O2 med efterfølgende WST-1 reduktion. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi har præsenteret to metoder for at udnytte ekstracellulære elektronacceptorer, WST-1 og DPIP, i spektrofotometrisk assays til at overvåge tPMET i C2C12 myotubes. Med væksten i cellelinjer i standard kultur procedurer og et spektrofotometer Pladelæser er det muligt at overvåge tPMET med disse elektronacceptorer i en simpel mikrotiterplade assay. WST-1 reduktion er reproducerbare fra godt til godt inden for en analyse, men der er den daglige variation. Den daglige variationskoefficient (CV) udnytte PBS som bufferen er 0,18 og CV udnytte HBS, da bufferen er 0,23.

Fra tidligere litteratur udnytter mPMS og WST-1, har vi ændret denne protokol, specifikt, for brug af PMS. Således fejlfinding omfattede fastlæggelse af de relevante koncentrationer af PMS og WST-1 til brug med myotubes beskrevet. Vi har også fastslået, at temperatur (i en række 23-37 ° C) ikke er et afgørende element for analysen, mens ryste plade før hver absorbans læsning er vigtigt. Disse spørgsmål bør dog undersøges for andre cellelinjer, som analysen anvendes. Resultaterne vedrørende SOD og AO evne til at oxidere direkte reduceret WST-1 tyder på, at screening af nye assay komponenter for denne egenskab er et nøgleaspekt i fejlfinding.

Vores data tyder på, at PMS bør udnyttes i forbindelse med WST-1 for at fremkalde optimal WST-1 reduktion. Vi fandt, at i en 1 mL volumen, 100 µM Ascorbat reducerer 322 nmol WST-1 pr. minut ved tilstedeværelse af PMS, hvilke er krævede nemlig direkte reduktion af WST-1 ved Ascorbat. I en 1 mL volumen oxiderer 2 U/mL af AO Ascorbat med en sats på 4.400 nmol/s eller 800 gange hurtigere end reduktionen af WST-1 ved Ascorbat. Enzymatisk aktivitet af AO er tydeligvis meget hurtigere end direkte reduktion af PMS/WST-1 ved Ascorbat. Vi forventer, at det samme ville følge for superoxid og SOD, selvom vi ikke har et system til at måle den absolutte antal WST-1 reduktion af superoxid.

For at afgøre, om inddragelse af PMS påvirker WST-1 reduktion af superoxid, brugte vi en xanthin oxidase (4,5 mU/mL) / hypoxanthine (0,1 mM) superoxid genererer systemet som tidligere beskrevet26,27. Optagelse af PMS ca fordobler WST-1 fradrag af dette system. Det forekommer således, at PMS medierer overførslen af elektroner fra superoxid til WST-1.

Yderligere evaluering kravet om PMS for cellulære WST-1 reduktion, analyseres vi reduktion i tilstedeværelse eller fravær af PMS og WST-1, og fandt, at PMS er påkrævet for cellulære WST-1 reduktion. Når cellerne inkuberes i assay reagens indeholdende PMS alene (i mangel af WST-1), der er en stigning i absorbans ved 438 nm. Dette afspejler sandsynligvis en ophobning af semiquinone form af PMS (PMS-SQ), der har en peak absorbans på 440 nm28. Ophobning af PMS-SQ tyder på, at PMS mindskes hurtigere, end det kan passere elektroner til O2 til at producere superoxid. Ophobning af PMS-SQ er således i overensstemmelse med den rapporterede langsom reduktion af O2 af PMS-SQ sammenlignet med satsen for fuldt reduceret PMS28.

Vi har også fremlagt en protokol for at afgøre, om elektronacceptorer er substrater for de enzymer, der kan udnyttes til at overvåge tPMET. Ved at overvåge reduktion af de ekstracellulære elektronacceptorer i et spektrofotometer, efterfulgt af tilsætning af enzym af interesse, er det muligt at afgøre, om elektron acceptoren er et substrat for disse enzymer. Gennem denne metode, har vi vist, at nedsat DPIP er et substrat for AO og SOD, hvilket viser, at det ikke er en egnet elektron acceptoren til at overvåge Ascorbat efflux og superoxid eksport.

Proceduren for test eller ej assay komponenter såsom SOD eller AO skabe artefakter er en betydelig forbedring over eksisterende metoder. For eksempel, er reduceret DPIP et substrat for SOD, tyder på, at offentliggjorte data opnået med anvendelse af DPIP og SOD skal fortolkes i overensstemmelse hermed. Vores resultater støtter tidligere forskning udført af Dayan og Dawson, hvor absorbansen af leuco 2,6-dichloroindophenol blev overvåget efter tilsætning af AO: DPIP blev oxideret angiver, at det er et substrat for AO29. Men vores resultater tilføje forbindelse til forskning udført af Tan og Berridge24, som Bellavite et al. 30, der udnyttede SOD til at hæmme DPIP reduktion. I en undersøgelse foretaget af Tan og Berridge sammenligne elektronacceptorer WST-1, DPIP og FeCN i HeLa celler, så de, at reduktion af nogle af elektronacceptorer blev undertrykt i overværelse af SOD. Reduktion af WST-1, sammenholdt med mPMS, var hæmmet ~ 80% i overværelse af SOD, mens reduktionen af DPIP var hæmmet af 40%. Reduktion af FeCN, sammenholdt med en alternativ mellemliggende elektron acceptor, var ikke hæmmes ved tilstedeværelse af SOD24. Når evaluering tilstand af elektron udveksling mellem NADPH oxidases og DPIP eller cytokrom c, Bellavite et al. fandt at DPIP og cytokrom c reduceres af NADPH oxidases, og at denne reduktion hæmmes væsentligt af SOD30. Berridge og Tan har også vist, at SOD kan hæmme WST-1 nedsættelse af 80% i mus celler linjer af 32Dcl23, WEHI3B, og J774 samt menneskelige cellelinjer af Jurkat, MALME3M og 143B6,31. Med menneskers primære neutrofile celler blev WST-1 reduktion hæmmet 95% i overværelse af SOD6,32.

Data her tyder på, at det er vigtigt at kontrollere, at enzymer, der anvendes til at vurdere specifikke bidrag af eksporterede molekyler til tPMET re ikke kan oxidere reduceret form af ekstracellulære elektron acceptor. Vi fandt, at (data ikke vist) jernholdige chlorid og jernholdige sulfat ikke var opløselige i PBS. I HBS og phenol rød-fri DMEM, blev de hurtigt oxideret, demonstrerer uforenelighed med HBS eller DMEM som assay medier. Derimod bruger AO og SOD ikke kaliumferrocyanid som et substrat, tyder på, at det er en egnet ekstracellulære elektron acceptor, hvis dens lave extinction koefficient ikke er et problem.

En af de vigtigste begrænsninger af denne analyse er at PMS/WST-1 og DPIP kan reduceres ved flere electron donorer, såsom NAD (P) H, Ascorbat og flavonoider som quercetin og myricetin19,33,34. Men dette kan løses ved tilsætning af enzymer (f.eks., SOD, AO) eller hæmmere at fastlægge specifikke bidragydere til PMS/WST-1 eller DPIP reduktion. En anden begrænsning er, at DPIP kan fungere som et substrat for AO og SOD. Disse enzymer bør derfor ikke udnyttes i forbindelse med DPIP til at overvåge tPMET. En yderligere vigtig begrænsning af denne undersøgelse er mulighed for PMS og andre redox variatorer at producere superoxid26,35,36. Dette er illustreret i figur 6. På anden side, PMS sig efter sigende har ingen direkte effekt på tPMET32. Derudover har Tan og Berridge32 vist at NADPH oxidase (NOX) hæmmer, diphenyleneiodinium chlorid (DPI), kan undertrykke de fleste WST-1 reduktion, tyder på, at DPI-følsomme tPMET kan være en specifik foranstaltning af NOX bidrag til tPMET. En anden begrænsning er, at vi ser små ændringer i absorbans, når udnytte WST-1. Vi har fundet, at når WST-1 er frisklavet og celler er sammenflydende, den største ændring i absorbans er set. Tidligere undersøgelser i P388 cellelinjer har vist, at mængden af formazankoncentrationen produceret positivt korrelerer med celle nummer21. Derfor, jo mere sammenflydende cellerne er så jo større reduktion i WST-1. Dette kan rettes til ved normalisering til mikrogram af protein til hver brønd.

En advarsel vedrørende denne analyse er, at det primært er designet til at vurdere globale tPMET. Selv om det kan manipuleres til at overvåge flere former for tPMET, som eksempel på Ascorbat efflux, kunne mere specifikke assays være mere passende, når målet ikke kræver målinger inden for rammerne af tPMET. Fox eksempel, hvis superoxid er den vigtigste interesse, der er en række andre muligheder for at overvåge superoxid, såsom brug af sonder herunder fluorescerende uigennemtrængelige sonder, aconitase og nitroblue tetrazolium37.

Eksisterende sonder til at overvåge tPMET som DPIP, FeCN og ferricytochrome c, nuværende ulemper. For eksempel, reduceret DPIP er et substrat for AO og SOD, FeCN har en lav molær ekstinktion koefficient, der begrænser dens nytte i real-time assays og cytokrom c er dyre. Derudover kan nogle af disse sonder producere høj baggrund fører til lav følsomhed ved måling af en ændring i absorbans32. WST-1 har vist sig ikke at være et substrat for enzymer såsom AO og SOD. Derudover har WST-1 en høj molær ekstinktion koefficient og en lav baggrunden reaktion, at skabe en mere følsomme tPMET assay. Bevæger sig fremad, kan dette assay udnyttes med en bred vifte af hæmmere til bedre at forstå processen med tPMET, knytte sti af elektron transport i en given cellelinje og føre til bedre forståelse af hvordan en celle redox miljøet opretholdes.

Kritiske trin i denne protokol omfatter fastlæggelse af, at cellerne er klar til eksperimenter (~ 70% sammenflydende) samt gøre analysereagenserne, specielt WST-1 og PMS, frisk i hvert assay. Det er også afgørende at vaske cellerne før tilsætning af analysereagenserne. DMEM udnyttes i denne protokol indeholder ikke Ascorbat, selv om vi supplere differentiering medium med Ascorbat. En række tilgængelige medier indeholder Ascorbat. Imidlertid er cellerne vasket før tilsætning af analysereagenserne, som er Ascorbat-fri, at fjerne enhver resterende Ascorbat fra mediet. Som en del af tPMET kan tilskrives molekylære efflux (fx, Ascorbat eksport), er det vigtigt at starte spektrofotometriske målinger umiddelbart efter tilsætning af assay reagens for ikke at gå glip af de første øjeblikke af efflux. Det er også afgørende at medtage baggrunden brønde for hver enkelte reagens i et eksperiment. Assay vælgere beskrevet i denne hvidbog forårsaget ubetydelig baggrund ændring i absorbans. Men nogle tilsætningsstoffer (f.eks. phloretin) kan fremme en væsentlig baggrund reaktion. Det er således vigtigt at baggrunden trækkes ud, når data er analyseret til at fjerne eventuelle forstyrrende virkninger, at reagenserne, der selv kan producere.

Sammenfattende protokol præsenteres her giver et middel til vurdering af tPMET og foreslår en række forbehold og aspekter af protokollen, som bør tages i betragtning, når du anvender analysen på forskellige cellelinjer og/eller vurderingen af specifikke bidragydere ( Ascorbat og superoxid bruges her) til tPMET.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Vi vil gerne takke Thomas Bell, Lyn Mattathil, Mark Mannino og Neej Patel for deres tekniske support. Dette arbejde blev støttet af USA 's Public Health Service award R15DK102122 fra National Institute for Diabetes og Digestive og nyre sygdomme (NIDDK) til Jonathan Fisher. Håndskriftets indhold er udelukkende ansvarlig for forfattere og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter af NIDDK eller National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C2C12 myoblasts American Type Culture Collection  CRL-1772
Dulbecco's modified eagle's medium - low glucose Sigma D6046
Fetal Plex animal serum complex Gemini Bio-Products  100-602
penicillin-streptomycin Sigma 516106
horse serum Gibco Technologies 16050-130
Dulbecco's phosphate buffered saline Sigma D8537
trypsin-EDTA Sigma T4049
15 cm culture dishes TPP 93150
96 well culture plates TPP 92096
2-(4-Iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium Sodium Salt (WST-1) Accela ChemBio  Inc SY016315
phenazine methosulfate  Sigma P9625
L-ascorbic acid Sigma A5960
ascorbate oxidase  Sigma A0157
superoxide dismutase  Sigma S5395
2,6-dichloroindophenol sodium salt  ICN Biomedicals 215011825
D-(+)-glucose Sigma G7528
HEPES sodium salt Sigma H3784
sodium chloride Sigma S7653
potassium chloride Fisher Scientific  BP366
magnesium sulfate heptahydrate Sigma M5921
calcium chloride dihydrate Sigma C7902
potassium phosphate Fisher Scientific  BP363
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific 23225
Powerwave X-I spectrophotometer Biotek Insturments discontinued 
Spectronic Genesys 5 Spectrophotometer Thermo Scientific 336001
PureGrade 96-well microplate, F-bottom, clear, untreated, non-sterile MidSci 781602
Iron (II) chloride tetrahydrate Sigma 220299
Iron (II) sulfate heptahydrate Sigma 215422
hypoxanthine Sigma H9636
xanthine oxidase Sigma X4500
Excel Microsoft
R Studio Rstudio https://www.rstudio.com/products/rstudio/
KC4 Biotek Insturments discontinued 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kilberg, M. S., Christensen, H. N. Electron-transferring enzymes in the plasma membrane of the Ehrlich ascites tumor cell. Biochemistry. 18 (8), 1525-1530 (1979).
  2. Crane, F. L., Roberts, H., Linnane, A. W., Low, H. Transmembrane ferricyanide reduction by cells of the yeast Saccharomyces cerevisiae. J Bioenerg Biomembr. 14 (3), 191-205 (1982).
  3. Craig, T. A., Crane, F. L. Evidence for trans-plasma membrane electron transport system in plact cells. Proc. Indiana Acad. Sci. 90, 150-155 (1981).
  4. Mishra, R. K., Passow, H. Induction of intracellular ATP synthesis by extracellular ferricyanide in human red blood cells. J Membr Biol. 1 (1), 214-224 (1969).
  5. Crane, F. L., Sun, I. L., Clark, M. G., Grenbing, C., Low, H. Transplasma-membrane redox systems in growth and development. Biochim Biophys Acta. 811, 233-264 (1985).
  6. Berridge, M. V., Tan, A. S. Trans-plasma membrane electron transport: a cellular assay for NADH- and NADPH-oxidase based on extracellular, superoxide-mediated reduction of the sulfonated tetrazolium salt WST-1. Protoplasma. 205 (1-4), 74-82 (1998).
  7. Eccardt, A. M., et al. Trans-plasma membrane electron transport and ascorbate efflux by skeletal muscle. Antioxidants. 6 (4), 89 (2017).
  8. Sun, I. L., Navas, P., Crane, F. L., Morre, D. J., Low, H. NADH diferric transferrin reductase in liver plasma membrane. J Biol Chem. 262 (33), 15915-15921 (1987).
  9. Larm, J. A., Vaillant, F., Linnane, A. W., Lawen, A. Up-regulation of the plasma membrane oxidoreductase as a prerequisite for the viability of human Namalwa rho 0 cells. J Biol Chem. 269 (48), 30097-30100 (1994).
  10. Inman, R. S., Coughlan, M. M., Wessling-Resnik, M. Extracellular ferrireductase activity of K562 cells is coupled to transferrin-independent iron transport. Biochemistry. 33, 11850-11857 (1994).
  11. Castillo-Olivares, A., Esteban del Valle, A., Marquez, J., Nunez de Castro, I., Medina, M. A. Ehrlich cell plasma membrane redox system is modulated through signal transduction pathways involving cGMP and Ca2+ as second messengers. J Bioenerg Biomembr. 27 (6), 605-611 (1995).
  12. Medina, M. A., del Castillo-Olivares, A., Nunez de Castro, I. Multifunctional plasma membrane redox systems. Bioessays. 19 (11), 977-984 (1997).
  13. Medina, M. A., del Castillo-Olivares, A., Schweigerer, L. Plasma membrane redox activity correlates with N-myc expression in neuroblastoma cells. FEBS Lett. 311 (2), 99-101 (1992).
  14. Diaz-Gomez, C., Villalba, J. M., Perez-Vicente, R., Crane, F. Ascorbate Stabilization Is Stimulated in rho(0)HL-60 Cells by CoQ10 Increase at the Plasma Membrane. Biochem Biophys Res Commun. 234 (0), 79-81 (1997).
  15. Navarro, F., et al. Protective role of ubiquinone in vitamin E and selenium-deficient plasma membranes. Biofactors. 9 (2-4), 163-170 (1999).
  16. Herst, P. M., Berridge, M. V. Cell surface oxygen consumption: a major contributor to cellular oxygen consumption in glycolytic cancer cell lines. Biochim Biophys Acta. 1767 (2), 170-177 (2007).
  17. Baoutina, A., Dean, R. T., Jessup, W. Trans-plasma membrane electron transport induces macrophage-mediated low density lipoprotein oxidation. FASEB J. 15 (9), 1580-1582 (2001).
  18. Furukawa, S., et al. Increased oxidative stress in obesity and its impact on metabolic syndrome. J Clin Invest. 114 (12), 1752-1761 (2004).
  19. Del Principe, D., Avigliano, L., Savini, I., Catani, M. V. Trans-plasma membrane electron transport in mammals: functional significance in health and disease. Antioxid Redox Signal. 14 (11), 2289-2318 (2011).
  20. Berridge, M. V., Tan, A. S. High-Capacity Redox Control at the Plasma Membrane of Mammalian Cells Trans-Membrane, Cell Surface, and Serum NADH-Oxidases. Antioxidants & Redox Signaling. 2 (2), 231-242 (2000).
  21. Ishiyama, M., Shiga, M., Sasamoto, K., Mizoguchi, M., He, P. G. A New Sulfonated Tetrazolium Salt That Produces a Highly Water-Soluble Formazan Dye. Chemical & Pharmaceutical Bulletin. 41 (6), 1118-1122 (1993).
  22. Berridge, M. V., Herst, P. M., Tan, A. S. Tetrazolium dyes as tools in cell biology: New insights into their cellular reduction. Biotechnology Annual Review. 11, 127-152 (2005).
  23. Gurtoo, H. L., Johns, D. G. On the interaction of the electron acceptor 2,6-dichlorophenolindophenol with bovine milk xanthine oxidase. J Biol Chem. 246 (2), 286-293 (1971).
  24. Tan, A. S., Berridge, M. V. Distinct trans-plasma membrane redox pathways reduce cell-impermeable dyes in HeLa cells. Redox Rep. 9 (6), 302-306 (2004).
  25. R: A language and environment for statistical computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. (2013).
  26. Peskin, A. V., Winterbourn, C. C. A microtiter plate assay for superoxide dismutase using a water-soluble tetrazolium salt (WST-1). Clinica Chimica Acta. 293 (1-2), 157-166 (2000).
  27. Higaki, Y., et al. Oxidative stress stimulates skeletal muscle glucose uptake through a phosphatidylinositol 3-kinase-dependent pathway. Am J Physiol Endocrinol Metab. 294 (E889-E897), (2008).
  28. Zuagg, W. Spectroscopic characteristics and some chemical propertiesof N-methylphenazinium methyl sulfate (phenazine methosulfate) and pyocyanine at the oxidation level. J Biol Chem. 239 (11), 3964-3970 (1964).
  29. Dayan, J., Dawson, C. R. Substrate specificity of ascorbate oxidase. Biochem Biophys Res Commun. 73 (2), 451-458 (1976).
  30. Bellavite, P., della Bianca, V., Serra, M. C., Papini, E., Rossi, F. NADPH oxidase of neurtrophils forms superoxide anion but does not reduce cytochrome c and dichlorophenolindophenol. FEBS. 170 (1), 157-161 (1984).
  31. Berridge, M. V., Tan, A. S., McCoy, K. D., Wang, R. The biochemical and cellular basis of cell proliferation assays that use tetrazolium salts. Biochemica. 4, 15-20 (1996).
  32. Tan, A. S., Berridge, M. V. Superoxide produced by activated neutrophils efficiently reduces the tetrazolium salt, WST-1 to produce a soluble formazan: a simple colorimetric assay for measuring respiratory burst activation and for screening anti-inflammatory agents. J Immunol Methods. 238 (1-2), 59-68 (2000).
  33. Phillips, P. A., et al. Myricetin induces pancreatic cancer cell death via the induction of apoptosis and inhibition of the phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) signaling pathway. Cancer Letters. 308 (2), 181-188 (2011).
  34. Altundag, E., et al. Quercetin-induced cell death in human papillary thyroid cancer (B-CPAP) cells. Journal of thyroid research. 2016 (8), (2015).
  35. Ukeda, H., Kawana, D., Maeda, S., Sawamura, M. Spectrophotometric Assay for Superoxide Dismutase Based on the Reduction of Highly Water-soluble Tetrazolium Salts by Xanthine-Xanthine Oxidase. Biosci Biotechnol Biochem. 63 (3), 485-488 (1999).
  36. Halaka, F. G., Babcock, G. T., Dye, J. L. Properties of 5-methylphenazinium methyl sulfate. Reaction of the oxidized form with NADH and of the reduced form with oxygen. J Biol Chem. 257 (3), 1458-1461 (1982).
  37. Maghzal, G. J., Krause, K. H., Stocker, R., Jaquet, V. Detection of reactive oxygen species derived from the family of NOX NADPH oxidases. Free Radic Biol Med. 53 (10), 1903-1918 (2012).

Tags

Biokemi spørgsmålet 135 tPMET WST-1 DPIP Ascorbat superoxid C2C12 myotubes spektrofotometriske assay
Måling af Trans-Plasma membran elektron Transport af C2C12 Myotubes
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kelly, S. C., Eccardt, A. M.,… More

Kelly, S. C., Eccardt, A. M., Fisher, J. S. Measuring Trans-Plasma Membrane Electron Transport by C2C12 Myotubes. J. Vis. Exp. (135), e57565, doi:10.3791/57565 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter