Summary
El objetivo de este protocolo es espectrofotometría monitor plasma trans membrana transporte de electrones utilizando aceptadores del electrón extracelular y analizar las interacciones enzimáticas que pueden ocurrir con estos aceptadores del electrón extracelular.
Abstract
Transporte de electrones de la membrana trans-plasma (tPMET) desempeña un papel en la protección de las células del estrés reductor intracelular, así como protección contra el daño por oxidantes extracelulares. Este proceso de transporte de electrones de reductores intracelulares a extracelulares oxidantes no está bien definida. Aquí presentamos ensayos espectrofotométricos por C2C12 miotubos para monitorear tPMET utilizando los aceptadores del electrón extracelular: 1 sal de tetrazolio soluble en agua (WST-1) y 2, 6-dichlorophenolindophenol (DPIP o DCIP). A través de la reducción de estos aceptadores del electrón, que son capaces de controlar este proceso en un análisis en tiempo real. Con la adición de enzimas como la ascorbato oxidasa (AO) y superóxido dismutasa (SOD) para el análisis, podemos determinar que la porción de tPMET es debido a la producción de exportación o superóxido ascorbato, respectivamente. Mientras WST-1 fue demostrada para producir resultados estables con bajo fondo, DPIP pudo ser nuevamente oxidado después de la adición de la AO y césped, que se demostró con análisis espectrofotométrico. Este método demuestra un análisis espectrofotométrico en tiempo real, multi-bien, rápido con ventajas sobre otros métodos utilizados para controlar tPMET como ferricianuro (FeCN) y reducción c ferricytochrome.
Introduction
La capacidad de las membranas de plasma purificadas para reducir aceptadores del electrón ha llevado a la vista que la membrana plasmática tiene una capacidad inherente de redox de1. Visto previamente en hongos, plantas y animales, tPMET es un proceso común a múltiples organismos2,3,4,5. En concreto, este proceso ha sido demostrado en Saccharomyces cerevisiae, zanahoria células, eritrocitos, linfocitos, osteosarcoma, melanoma, macrófagos, músculo esquelético y neutrófilos2,3, 4 , 5 , 6 , 7. en un proceso que transporta electrones a través de la membrana de plasma para reducir oxidantes extracelulares, tPMET participa en muchas funciones celulares incluyendo: célula crecimiento5,8, de la viabilidad de la célula9, hierro metabolismo10,11,12,13y la protección de especies de oxígeno reactivo12,14,15de señalización de la célula. Debido a la implicación de tPMET en muchas funciones celulares, un desequilibrio de tPMET ha presumido para contribuir al desarrollo de algunas condiciones de salud graves, incluyendo cáncer16,17de las enfermedades cardiovasculares, metabólicos y síndrome18.
Hay varias formas para controlar a la transferencia de electrones a través de la membrana del plasma, pero es la técnica más ampliamente utilizada evaluar la reducción de los aceptores de electrones extracelular a través de análisis colorimétricos. Aceptadores del electrón extracelular comúnmente utilizados son las sales de tetrazolio, DPIP, FeCN y ferricytochrome c19,20. La sal de tetrazolio más comúnmente utilizado es una segunda generación sal conocida como WST-119. Este compuesto es más fácil de utilizar en el análisis colorimétricos en comparación a las sales de tetrazolio de primera generación debido a dos grupos sulfonato, que aumentan su solubilidad de agua21. WST-1, junto con el intermedio electrón aceptador 1-metoxi-phenazine methosulfate (mPMS), se reduce en eventos de transferencia de electrones solo dos. Esta reducción cambia la forma oxidada de color débil de WST-1 a un precipitado más intenso, amarillo20,22. WST-1 tiene un coeficiente de extinción molar alta de 37 x 103 M-1cm-1, conduce a un análisis alta sensibilidad21,22. DPIP también es utilizado como un aceptor de electrones extracelular para controlar tPMET. Se ha demostrado que puede reducirse extracellularly DPIP por tPMET sin la ayuda de aceptadores de electrones intermedios23,24. Debido a la ausencia de aceptadores del electrón intermedio, DPIP puede directamente electrones Pick-up de la membrana del plasma, a diferencia de WST-124. Similar a la DPIP, FeCN ha visto reducirse extracelularmente a ferrocianuro, tPMET sin la ayuda de aceptadores de electrones intermedios19,24. A diferencia de WST-1 y DPIP, FeCN tiene un coeficiente de extinción molar baja conduce a un menor análisis sensibilidad9. Otro aceptor de electrones extracelular utilizados para monitorear tPMET es ferricytochrome c. Similar a WST-1, ferricytochrome c reducción aumenta con el uso del aceptador del electrón intermedio, mPMS22. A diferencia de WST-1 sin embargo, el método c ferricytochrome es menos sensible debido a una alta formación y un coeficiente de extinción molar baja22.
Aquí presentamos un método para el análisis en tiempo real de tPMET a través de análisis espectrofotométricos. El método utilizado los aceptadores del electrón extracelular WST-1 y DPIP, pues ambos tienen un coeficiente de extinción molar alta mientras que siendo menos costosa en comparación con los otros comúnmente utilizados aceptadores del electrón extracelular como c ferricytochrome. Utilizamos phenazine methosulfate (PMS) en lugar de multiprocesamiento tienen una composición química similar y PMS es mucho menos costoso. mPMS es fotoquímicamente estable que es una característica importante de un kit comercial que necesita una larga vida útil. Sin embargo, hacemos PMS fresca para cada ensayo, por lo que la estabilidad no debe ser un problema. También presentamos un método para evaluar posibles interacciones enzimáticas (ver figura 1) entre el aceptador del electrón extracelulares y enzimas que pueden ser utilizadas para caracterizar el proceso de tPMET. En concreto, las enzimas AO y el césped puede ser utilizado determinan la parte de tPMET es debido al transporte de ascorbato o liberación de superóxido extracelular, dos métodos comunes para los electrones que se transportará a través de la membrana plasmática.
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Protocol
Nota: Vea la figura 1 para una descripción esquemática de los pasos claves.
1. ensayo de reducción de WST-1
- Crecer y diferenciar las células adherentes C2C12 utilizando estándar de la célula cultura procedimientos7 en una placa de 96 pozos utilizando filas A-f.
- Utilizar un medio de diferenciación que consta de medio modificado Eagle de Dulbecco (DMEM) suplementado con 2% de suero de caballo, 100 U/mL de penicilina y estreptomicina de 0,1 mg/mL. Incube las células a 37 ° C con 5% CO2.
- Al medirse la implicación de ascorbato en tPMET, suplemento de medios de diferenciación con el ácido ascórbico de 100 μm. Permitir que las células al incubar en medio de la diferenciación para ~ 24-48 h.
- Preparar soluciones WST-1 y PMS.
- Para hacer un stock de 10 mM de WST-1, disolver 0,033 g de WST-1 (peso fórmula (PF): 651.34 g/mol) en 5 mL de fosfato tampón salino (PBS). Almacenar a 4 ° C.
- Para hacer un stock de 5 mM del PMS, disolver 0,0023 g de PMS (FW: 306.34 g/mol) en 1,5 mL de desionizada H2O (diH2O). Almacenar a-20 ° C y proteger de la luz.
- Añadir 0,0108 g de glucosa, para una concentración final de 5 mM a 11,4 mL de PBS o HEPES tamponada con solución salina (HBS; sal de sodio HEPES 20 mM, 140 mM NaCl, KCl, 2, 5 mM de MgSO4, de 5 mM 1 mM CaCl2). Añadir 480 μl de 10 mM WST-1 para una concentración final de 400 μm y 48 μl de 5 mM PMS para una concentración final de 20 μm.
- Al medirse la implicación de ascorbato en tPMET, divida la solución en dos alícuotas de 6 mL. A una alícuota, añadir 6 μl de diH2O y a la otra alícuota agregar 6 μl de 2 kU/mL AO para una concentración final de 2 U/mL.
- Al medirse la implicación de superóxido en tPMET, divida la solución en dos alícuotas de 6 mL. A una alícuota, agregar 55 μl de 0,1 M KPO4 tampón y a la otra alícuota agregar 55 μl de 6.5 kU/mL de sodio a una concentración final de 60 U/mL.
- Lavar las células con PBS. Aspire el medio y agregar 150 μL PBS. Luego aspirar el PBS.
Nota: El ensayo se realiza con las células plateadas, adjuntadas. Así, hay no hay centrifugación o el uso de la tripsina en el proceso de lavado. - Añada 100 μl de solución de WST-1 (-) SOD o (-) AO a las columnas 1-6 y agregar 100 μl de solución de WST-1 (+) de sodio o (+) AO para columnas 7-12 en la placa de 96 pocillos. Utilizar filas G y H como controles de fondo (es decir, para monitorear el cambio en la absorbancia del reactivo solamente en pozos sin células).
- Los valores de absorbancia con el espectrofotómetro cada 10 min durante 1 h a 438 nm.
- Después de la lectura, los medios de comunicación de aspirar y lavar cada pozo con 150 μL de PBS. Luego aspirar el PBS.
- Calcular el cambio en la absorbancia de cada pocillo restando la absorbancia inicial para un pozo de la absorbencia en cualquier momento para bien. Corregir este cambio para el cambio en la absorbencia (si cualquier) observado en los pozos de fondo (es decir, pozos con solución de ensayo pero sin células).
- Para el análisis, normalizar los datos de absorbancia para el control de medición de 60 minutos o lavar los pocillos con PBS o HBS y luego realizar un análisis de proteína bicinchoninic ácido (BCA).
- Añadir albúmina de suero bovino (BSA) estándar de 2 mg/mL (rango de 0.5-2 μL para la curva estándar, dependiendo del grado de confluencia de las células) en los pocillos vacíos (filas G y H), luego añadir el reactivo BCA en todos los pocillos.
- Cuantificar los datos mediante nmol de WST-1 reducción por μg de proteína. Utilizar 37 mM-1 cm-1 22 como el coeficiente de extinción para WST-1 reducida en 438 nm.
2. ensayo de reducción de DPIP
- Crecer y diferenciar células adherentes C2C12 con el mismo procedimiento que el paso 1.1.
- Preparar solución DPIP stock 10 mM como sigue. Disolver 0,029 g de DPIP (FW: 290.08 g/mol) en 10 mL de diH2O. confirmar la concentración de DPIP midiendo absorbancia a 600 nm con un espectrofotómetro. Utilizar 1 mM-1 cm-1 23 como el coeficiente de extinción para la DPIP reducida a 600 nm. Almacenar a 4 ° C.
- Añadir a 11,880 mL de PBS para una concentración final de 5 mM 0,0108 g de glucosa. Añadir 120 μl de 10 mM DPIP para una concentración final de 100 μm.
- Al medirse la implicación de ascorbato en tPMET, divida la solución en dos alícuotas de 6 mL. A una alícuota, añadir 6 μl de diH2O y a la otra alícuota agregar 6 μl de 2 kU/mL AO para una concentración final de 2 U/mL.
- Al medirse la implicación de superóxido en tPMET, divida la solución en dos alícuotas de 6 mL. A una alícuota, agregar 55 μl de 0,1 M KPO4 tampón y a la otra alícuota agregar 55 μl de 6.5 kU/mL de sodio a una concentración final de 60 U/mL.
- Los medios de comunicación de aspirar y lavar las células en 150 μL de PBS. Aspire el PBS y añadir 100 μl de solución de DPIP (-) SOD o (-) AO a las columnas 1-6 y agregar 100 μl de solución de DPIP (+) de sodio o (+) AO para columnas 7-12 en la placa de 96 pocillos. Utilizar filas G y H será como controles de fondo (es decir, para monitorear el cambio en la absorbancia del reactivo solamente en pozos sin células).
- Medir la absorbancia a 600 nm utilizando espectrofotómetro cada 10 minutos para 1 h. cuantificar el cambio en absorbancia con respecto al control en el minuto 60 similar a pasos 1.9-1.13.
3. determinación de si los aceptadores del electrón reducida son sustratos para AO o TEPES
- Añadir a 5,436 mL de PBS o HBS, 240 μl de 10 mM WST-1 para una concentración final de 400 μm y 24 μl de 5 mM PMS para una concentración final de 20 μm.
- De DPIP, añadir 60 μL de 10 mM DPIP, para una concentración final de 100 μm, a 5,940 mL de PBS o HBS.
- Añada 100 μl de solución para cada bien en una placa de 96 pocillos de fondo plano en la ausencia de células y medir la absorbancia en un espectrofotómetro a 438 nm, para WST-1 y 600 nm, de DPIP.
- Añadir 1 μl de ascorbato 10 mM a la mitad de los pozos a una concentración final de 100 μM. Monitorear la absorbancia hasta que se estabilice.
- Estabilización, añadir 1 μl de 200 U/mL AO para una concentración final de 2 U/mL en cada pocillo o añadir 1 μl de césped de 6 kU/mL para una concentración final de 60 U/mL a cada uno bien y monitorear la absorbancia de 1 h.
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Representative Results
Las estadísticas se realizaron con ANOVA con medidas repetidas utilizando el software estadístico de RStudio25. Tamaños de muestra se indican en las leyendas de la figura.
Para controlar tPMET, miotubos C2C12 se utilizaron junto con aceptadores del electrón extracelular, WST-1 y DPIP. AO se utilizó para determinar que porción del WST-1 y reducción de DPIP fue debido a la emanación de ascorbato y césped se utilizó para determinar que la porción de reducción de WST-1 fue debido a la liberación de superóxido extracelular. Como se muestra en la figura 2, C2C12 miotubos son capaces de tPMET como se ve por la reducción del WST-1. Con la adición de AO, reducción de WST-1 fue suprimida por ~ 30% indicando que el ~ 30% de tPMET era debido a la exportación de ascorbato (figura 2A). Con la adición de SOD, reducción de WST-1 fue suprimida por el ~ 70%, indicando que el ~ 70% de tPMET era debida liberación de superóxido extracelular (figura 2B). Cuando DPIP fue utilizado como un aceptor de electrones extracelular con la adición de AO, reducción de DPIP fue suprimida más del 100% (figura 3). Esto planteó preguntas sobre la validez del uso de DPIP con AO para evaluar la contribución de ascorbato.
Para buscar en si menor WST-1 es un sustrato para AO o TEPES, WST-1 fue reducido con ácido ascórbico. AO o TEPES fue agregado, y la absorbancia fue supervisada. Después de 1 h, no había cambio en absorbancia entre la forma reducida del WST-1 sin AO o SOD y la forma reducida del WST-1 AO o SOD (Figura 4A, B). Por lo tanto, el reducido WST-1 no es un sustrato de estas enzimas, y el uso de AO o SOD junto con WST-1 es apropiado para la evaluación de funciones de ascorbato o superóxido, respectivamente.
Para determinar si la DPIP reducida es un sustrato para AO o TEPES, DPIP fue reducido con ácido ascórbico. Después de 20 min, AO fue agregado, y la absorbancia fue supervisada. DPIP reducida mostró ser un sustrato para el AO, como se ve en la figura 5A, donde DPIP vuelve a su forma oxidada dentro de 40 minutos. Cuando SOD fue agregada, DPIP fue volver a oxidado (figura 5B). Por lo tanto, DPIP reducida es un sustrato de estas enzimas y no un aceptador del electrón extracelular apropiado para ser utilizado con estas enzimas.
Figura 1: una representación esquemática de los pasos clave de las pruebas de transporte de electrones y la determinación de interacciones enzimáticas con los aceptadores del electrón extracelular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: la adición de la AO y SOD suprime WST-1 reducción de miotubos C2C12. TPMET (A) se analizó durante 60 min 400 μm WST-1 y 20 μm PMS con la adición de 2 U/mL AO o diH2O (N = 18/grupo). TPMET (B) se analizó por 60 min con la adición de SOD de 60 U/mL o 0.1 M KPO4 buffer (N = 36/grupo). p≥ 0.05 en el momento indicado. Barras de error representan el error estándar de la media y pueden ser demasiado pequeñas para visualizar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: la adición de AO suprime reducción de DPIP por C2C12 miotubos. tPMET analizó durante 60 min con 100 μm DPIP con o sin la adición de 2 U/mL AO (N = 36/grupo). p≥ 0.05 en el momento indicado. Barras de error representan el error estándar de la media y pueden ser demasiado pequeñas para visualizar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: reducción WST-1 no es un sustrato para AO o TEPES. (A) WST-1 fue reducido con ascorbato. Después de 45 min, AO fue agregado, y la absorbancia fue supervisada por 1 h. No se observó ningún cambio en la absorbencia. (B) el procedimiento es el mismo que el anterior, excepto SOD fue agregada después de 45 minutos. No se observó ningún cambio en la absorbencia (N = 24/grupo). Barras de error representan el error estándar de la media y pueden ser demasiado pequeñas para visualizar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: DPIP reducida es un sustrato para AO y SOD. (A) DPIP se redujo con ascorbato. Después de 20 min, AO fue agregado, y la absorbancia fue supervisada. Dentro de 40 minutos, las muestras se volvieron a su absorbancia original, indicando que la DPIP reducida es un substrato para el AO. (B) DPIP se redujo con ascorbato. Después de 20 min, SOD fue agregada, y la absorbancia fue supervisada. Con el tiempo, la DPIP reducida fue volver a oxidado, lo que indica que una reducción en DPIP es un sustrato para el césped (N = 24/grupo). Barras de error representan el error estándar de la media y pueden ser demasiado pequeñas para visualizar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: esquema que representa tPMET. En este modelo de tPMET, ascorbato (u otro portador del electrón) exportados por la célula puede reducir PMS extracelular. Además, oxidasas de NADPH generan superóxido extracelular, que se puede reducir directamente el WST-1 o reducir indirectamente mediante la reducción del síndrome premenstrual. Electrones de otros donantes de la membrana plasmática también pueden reducir el síndrome premenstrual, que puede donar electrones a WST-1 o O2 con reducción subsecuente de la WST-1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Hemos presentado dos métodos para utilizar aceptadores del electrón extracelular, WST-1 y DPIP, en ensayos espectrofotométricos para controlar tPMET en miotubos C2C12. Con el crecimiento de líneas celulares en los procedimientos de cultivo estándar y un lector espectrofotómetro de placas, es posible monitorizar tPMET con estos aceptadores del electrón en un análisis simple de la microplaca. WST-1 reducción es reproducible de pozo a pozo dentro de un ensayo, pero existe variabilidad día a día. El día a día coeficiente de variación (CV) utilizando PBS como el búfer es 0.18 y el CV utilizando HBS como el tampón de 0.23.
De la literatura anterior utilizando multiprocesamiento y WST-1, hemos modificado el presente Protocolo, específicamente, para el uso de PMS. Por lo tanto, solución de problemas incluye determinar las concentraciones apropiadas de PMS y WST-1 para el uso con los miotubos se describe. También determinamos que temperatura (en un rango de 23-37 ° C) no es un componente crítico para el análisis, mientras la agitación de la placa antes de cada lectura de absorbancia es importante. Sin embargo, estos temas deben ser investigados para otras líneas celulares a la cual se aplica el análisis. Los resultados con respecto a la capacidad de SOD y AO para oxidar directamente reducido WST-1 sugieren que la investigación de nuevos componentes del ensayo de esta propiedad es un aspecto clave de la solución de problemas.
Nuestros datos sugieren que el PMS debe utilizarse junto con WST-1 para obtener una óptima reducción de WST-1. Encontramos que en un volumen de 1 mL, ascorbato μm 100 reduce 322 nmol de WST-1 minuto en presencia de PMS, que es necesario para la reducción directa del WST-1 por el ascorbato. En un volumen de 1 mL, 2 U/mL de AO oxida ascorbato a razón de 4.400 nmol/s o 800 veces más rápido que la reducción de la WST-1 por el ascorbato. Claramente, la actividad enzimática de la AO es mucho más rápido que la reducción directa de PMS/WST-1 por ascorbato. Esperamos que el mismo seguiría para superóxido y césped, aunque no tenemos un sistema para medir la tasa absoluta de WST-1 reducción por superóxido.
Para determinar si la inclusión del síndrome premenstrual afecta la reducción de la WST-1 por superóxido, utilizamos una xantina oxidasa (4.5 mU/mL) / superóxido hipoxantina (0.1 mM) que genera el sistema anteriormente descrito26,27. Inserción de PMS aproximadamente duplica la tasa de reducción de WST-1 por este sistema. Así pues, parece que PMS media a transferencia de electrones del superóxido a WST-1.
Para evaluar el requisito de PMS para la reducción de WST-1 celular, nos evaluaron reducción en la presencia o ausencia del síndrome premenstrual y WST-1 y encontró que el PMS es requerido para la reducción de WST-1 celular. Cuando las células se incuban en reactivo de ensayo que contiene PMS sola (en ausencia de WST-1), hay un aumento en la absorbencia a 438 nm. Esto probablemente refleja una acumulación de la forma del semiquinone del síndrome premenstrual (PMS-SQ) que tiene una absorbancia máxima a 440 nm28. Acumulación de PMS-SQ sugiere que el PMS se está reduciendo más rápido que puede pasar electrones a O2 para producir superóxido. Así, la acumulación de PMS-SQ es consistente con el reportado reducción lenta de O2 por PMS-cuadrados en comparación con la tasa reducida totalmente PMS28.
También hemos presentado un protocolo para determinar si los aceptadores del electrón son substratos para las enzimas que pueden ser utilizados para controlar tPMET. Mediante el control de la reducción de los aceptadores del electrón extracelular en un espectrofotómetro seguido por la adición de la enzima de interés, es posible determinar si el aceptor de electrones es substrato para estas enzimas. A través de este método, hemos demostrado que la DPIP reducida es un substrato para el AO y que indica que no es un aceptador del electrón adecuado para el control de exportación de superóxido y la emanación de ascorbato de sodio.
El procedimiento para la prueba si o no los componentes del ensayo como SOD o AO crean artefactos es una mejora significativa sobre los métodos existentes. Por ejemplo, DPIP reducida es un sustrato para el césped, lo que sugiere que deben interpretarse en consecuencia datos obtenidos con el uso de DPIP y SOD. Nuestros resultados apoyan investigaciones anteriores realizadas por Dayan y Dawson en el que la absorbancia del 2, 6-dicloroindofenol leuco fue supervisada después de la adición de AO: DPIP fue oxidado indicando que es un sustrato para AO29. Sin embargo, nuestros resultados agregar contexto a la investigación llevada a cabo por Tan y Berridge24, así como Bellavite et al. 30, que SOD para inhibir la reducción de la DPIP. En un estudio realizado por Tan y Berridge comparando los aceptadores del electrón de WST-1, DPIP y FeCN en células HeLa, vieron que la reducción de algunos de los aceptadores del electrón fue suprimida en presencia de la SOD. La reducción de WST-1, en conjunto con multiprocesamiento, fue inhibido el ~ 80% en presencia de césped mientras que la reducción de la DPIP fue inhibida en un 40%. La reducción de FeCN, junto con un aceptor de electrones intermedios alternativos, no se inhibió en presencia de sodio24. Cuándo evaluar el modo de electrones intercambio entre oxidasas de NADPH y DPIP o citocromo c, Bellavite et al. , encontraron que DPIP y citocromo c se reduzcan por oxidasas de NADPH y que esta reducción es significativamente inhibida por SOD30. Berridge y Tan también ha demostrado que la SOD puede inhibir WST-1 reducción en un 80% en líneas de células de ratón de 32Dcl23, WEHI3B y J774 como en líneas celulares humanas de Jurkat, MALME3M y 143B6,31. Con células humanas de neutrófilos primarias, reducción de WST-1 fue inhibido 95% en la presencia de césped6,32.
Los datos aquí sugieren que es importante verificar que enzimas utilizadas para evaluar las contribuciones específicas de moléculas exportadas a tPMET no volver a oxidan la forma reducida del aceptador del electrón extracelular. Se encontró que el cloruro ferroso (datos no mostrados) y sulfato ferroso no se soluble en PBS. En HBS y DMEM libre de rojo de fenol, ellos fueron oxidados rápidamente, demostrando la incompatibilidad con HBS o DMEM como medios de análisis. Por el contrario, AO y SOD no utilice ferrocianuro potásico como sustrato, sugiriendo que es un aceptor de electrones extracelular adecuado si su coeficiente de extinción baja no es un problema.
Una de las principales limitaciones de este ensayo es que PMS/WST-1 y DPIP puede reducirse por varios donantes del electrón, como el NAD (P) H, ascorbato y flavonoides como quercetina y miricetina19,33,34. Sin embargo, esto se puede solucionar mediante la adición de enzimas (por ejemplo, césped, AO) o inhibidores para determinar contribuyentes específicos para reducción del PMS/WST-1 o DPIP. Otra limitación es que DPIP puede actuar como un sustrato para AO y SOD. Así, estas enzimas no deben utilizarse en conjunto con DPIP para controlar tPMET. Una limitación importante adicional de este estudio es la capacidad del síndrome premenstrual y otros ciclistas de redox para producir superóxido26,35,36. Esto se ilustra en la figura 6. Por otra parte, PMS sí mismo al parecer no tiene ningún efecto directo en tPMET32. Además, Tan y Berridge32 han demostrado que el inhibidor de NADPH oxidasa (NOX), cloruro de diphenyleneiodinium (PPP), puede suprimir la mayoría de WST-1 reducción, sugiriendo que tPMET DPI-sensible puede ser una medida específica de la contribución de NOX a tPMET. Otra limitación es que podemos ver pequeños cambios en la absorbancia al utilizar WST-1. Hemos encontrado que cuando WST-1 se hace fresco y las células son confluentes, se considera el mayor cambio en la absorbencia. Estudios anteriores realizados en líneas de células P388 han demostrado que la cantidad de formazan producida positivamente correlaciona con celular número21. Por lo tanto, cuanto más confluentes las células son entonces mayor será la reducción en WST-1. Esto puede ser corregido para normalización de microgramos de proteína para cada bien.
Una advertencia con respecto a este ensayo es que está diseñado principalmente para evaluar tPMET global. Aunque se puede manipular para controlar múltiples formas de tPMET, como en el ejemplo de emanación de ascorbato, ensayos más específicos sería más apropiados cuando el objetivo no requiere de medidas en el contexto de tPMET. Ejemplo del zorro, si el superóxido es el principal interés, hay un número de otras vías para controlar superóxido, tales como el uso de puntas de prueba incluyendo sondas impermeables fluorescentes y aconitase nitroazul de tetrazolio37.
Existen sondas para controlar tPMET como DPIP, FeCN y ferricytochrome c, desventajas presentes. Por ejemplo, DPIP reducida es un sustrato para AO y SOD, FeCN tiene un coeficiente de extinción molar bajo que limita su utilidad en los análisis en tiempo real y citocromo c es costoso. Además, algunas de estas puntas de prueba pueden producir alta fondo conduce a baja sensibilidad al medir un cambio en la absorbancia32. WST-1 se ha demostrado que no es un sustrato para enzimas como AO y SOD. Además, WST-1 tiene un coeficiente de extinción molar alta y una reacción de bajo fondo, creando un ensayo más sensible de la tPMET. Avanzando, este ensayo puede ser utilizado con una amplia gama de inhibidores para mejor entender el proceso de tPMET, mapa de la ruta de transporte de electrones en una línea celular determinada y conducir a una mejor comprensión de cómo se mantiene el ambiente de redox de la célula.
Pasos críticos de este protocolo incluyen determinar que las células están listas para la experimentación (~ 70% confluente) así como los reactivos de análisis, específicamente WST-1 y PMS, fresca para cada ensayo. También es importante lavar las células antes de la adición de los reactivos de ensayo. El DMEM utilizado en el presente Protocolo no contiene ascorbato, aunque complementamos medio de diferenciación con ascorbato. Un número de medios disponibles contienen ascorbato. Sin embargo, las células se lavan antes de la adición de los reactivos del ensayo, que están libres de ascorbato, para quitar cualquier ascorbato residual del medio. Como una porción del tPMET es atribuible al flujo molecular (por ejemplo, exportación de ascorbato), es importante empezar las lecturas espectrofotométricas inmediatamente después de la adición del reactivo de ensayo para no te pierdas los primeros momentos de la emanación. Además, es fundamental incluir pozos de fondo para cada reactivo individual en un experimento. Los componentes de análisis descritos en este documento causaron fondo insignificante cambio en absorbancia. Sin embargo, algunos aditivos (por ejemplo, phloretin) pueden promover una reacción de fondo substancial. Por lo tanto, es importante que el fondo se resta hacia fuera cuando se analizan los datos para eliminar los efectos de confusión que los reactivos se pueden producir.
En Resumen, el protocolo que presentamos proporciona un medio de evaluación de tPMET y sugiere una serie de advertencias y aspectos del protocolo que debe tenerse en cuenta al aplicar el análisis a diferentes líneas celulares o evaluar (contribuyentes específicos ascorbato y superóxido aquí) a tPMET.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Nos gustaría agradecer a Thomas Bell, Lyn Mattathil, Mark Mannino y Neej Patel por su soporte técnico. Este trabajo fue financiado por concesión de servicio de salud pública de Estados Unidos R15DK102122 del Instituto Nacional de Diabetes y digestivo y enfermedades del riñón (NIDDK) a Jonathan Fisher. El contenido del manuscrito es responsabilidad exclusiva de los autores y no representan necesariamente la opinión oficial de la NIDDK o los institutos nacionales de salud.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C2C12 myoblasts | American Type Culture Collection | CRL-1772 | |
| Dulbecco's modified eagle's medium - low glucose | Sigma | D6046 | |
| Fetal Plex animal serum complex | Gemini Bio-Products | 100-602 | |
| penicillin-streptomycin | Sigma | 516106 | |
| horse serum | Gibco Technologies | 16050-130 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline | Sigma | D8537 | |
| trypsin-EDTA | Sigma | T4049 | |
| 15 cm culture dishes | TPP | 93150 | |
| 96 well culture plates | TPP | 92096 | |
| 2-(4-Iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium Sodium Salt (WST-1) | Accela ChemBio Inc | SY016315 | |
| phenazine methosulfate | Sigma | P9625 | |
| L-ascorbic acid | Sigma | A5960 | |
| ascorbate oxidase | Sigma | A0157 | |
| superoxide dismutase | Sigma | S5395 | |
| 2,6-dichloroindophenol sodium salt | ICN Biomedicals | 215011825 | |
| D-(+)-glucose | Sigma | G7528 | |
| HEPES sodium salt | Sigma | H3784 | |
| sodium chloride | Sigma | S7653 | |
| potassium chloride | Fisher Scientific | BP366 | |
| magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | M5921 | |
| calcium chloride dihydrate | Sigma | C7902 | |
| potassium phosphate | Fisher Scientific | BP363 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Powerwave X-I spectrophotometer | Biotek Insturments | discontinued | |
| Spectronic Genesys 5 Spectrophotometer | Thermo Scientific | 336001 | |
| PureGrade 96-well microplate, F-bottom, clear, untreated, non-sterile | MidSci | 781602 | |
| Iron (II) chloride tetrahydrate | Sigma | 220299 | |
| Iron (II) sulfate heptahydrate | Sigma | 215422 | |
| hypoxanthine | Sigma | H9636 | |
| xanthine oxidase | Sigma | X4500 | |
| Excel | Microsoft | ||
| R Studio | Rstudio | https://www.rstudio.com/products/rstudio/ | |
| KC4 | Biotek Insturments | discontinued |
References
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