Summary
Aquí describimos los métodos usando microscopia confocal de disco de spinning solo eventos fagocíticas imagen por residente macrófagos peritoneales de ratón. Los protocolos pueden ampliarse a otras células fagocíticas.
Abstract
Fagocitosis juega un papel clave en la defensa del huésped, así como en el mantenimiento y desarrollo de tejido y consiste en los cambios rápidos, mediada por el receptor del citoesqueleto de actina, envuelven y fagocitar las partículas grandes. Aunque se han identificado receptores fagocíticos, vías de señalización corriente abajo y efectores, tales como Rho GTPasas, la remodelación citoesqueleto dinámico de eventos fagocíticas mediada por receptores específicos siguen siendo confusos. Hace cuatro décadas, dos mecanismos distintos de la fagocitosis, ejemplificado por receptores de Fcγ (FcγR) y receptor de complemento (CR) - mediada por la fagocitosis, se identificaron mediante microscopía electrónica. Atascamiento de la inmunoglobulina G (IgG)-partículas opsonizadas a FcγRs provoca la protuberancia de extensiones de membrana fina, que inicialmente forman una copa fagocítica llamada alrededor de la partícula antes de que se convierte en totalmente incluido y retraído dentro de la célula. En cambio, las partículas complemento opsonizadora parecen hundirse en el fagocito después de atar a los receptores de complemento. Estos dos modos de fagocitosis, formación de Copa fagocítica y se hunde, se han convertido en un bien establecido en la literatura. Sin embargo, las distinciones entre los dos modos han velado por los informes que complemento mediada por receptor fagocitosis puede inducir varias protuberancias de la membrana. Con la disponibilidad de técnicas de imagen de alta resolución, se requieren ensayos de fagocitosis que permiten visualización 3D (tres dimensiones) en tiempo real de lo específicos receptores fagocíticos mediato la captación de partículas individuales. Más utilizados enfoques para el estudio de la fagocitosis, como ensayos de punto final, pierda la oportunidad de entender lo que está sucediendo en el interfaz de partículas y de los fagocitos. Aquí describimos ensayos fagocíticos, usando microscopia confocal de disco spinning Time-lapse, que permite imágenes en 3D de eventos simples fagocíticas. Además, se describen ensayos inequívocamente de la imagen del receptor Fcγ - o complemento fagocitosis mediada por receptor.
Introduction
Veinte años antes de la observación de Metchnikoff de células fagocíticas mesenchyme en larvas de estrellas de mar, en 1882 y posterior desarrollo de su teoría de la fagocitosis1, Ernest Haeckel describió, en 1862, la inmersión de las partículas de colorante insoluble de sangre células de Tetis fimbris (fimbria de Tethys), una especie de rapaz mar slug (Ernest Haeckel. Die Radiolarien (Rhizopoda radiaria): Eine Monographie; Druck und Verlag von Georg Reimer, Berlín, 1862). Él describió explícitamente protuberancias de la membrana envolvente de las partículas, que posteriormente fueron tomadas en el citoplasma y acumuladas en el núcleo celular. Más de 100 años más tarde, un estudio pionero realizado por Kaplan sugirió que había al menos dos morfológicamente distintos mecanismos de fagocitosis2. Kaplan mostraron mediante microscopía electrónica de barrido peritoneal del ratón macrófagos ingestión un ovejas opsonizadora IgG eritrocitos usando extensiones de la membrana delgada que alcanzaron encima y envolvieron firmemente la partícula, inicialmente dando lugar a una forma de taza estructura. Fagocitarias Copa formación requiere polimerización de la actina ya que fue abrogada por la citocalasina toxina fúngica permeable a la célula B, conocido por bloquear la actinia dinámica3. En contraste, ovejas eritrocitos opsonizadora con complemento apareció directamente en los macrófagos sin la generación de extensiones de la membrana, aunque en algunas imágenes, volantes de membrana se pueden ver en los retrocesos inmediatos de las partículas que se hunde. A diferencia de la formación de Copa fagocítica, complemento mediada por receptor en era insenstive citocalasina B tratamiento2. En los experimentos descritos por Kaplan, complemento opsonización se realizó por incubación de inmunoglobulina M (IgM) con la etiqueta oveja glóbulos rojos con el suero de los ratones del complemento C5-deficiente, que evita la hemólisis por el terminal del complemento C5-dependiente complementan el complejo.
Los dos modos de fagocitosis, formación de Copa fagocítica y hundirse, identificados por Kaplan se han convertido en opinión establecida en el campo4,5,6,7,8,9 . Sin embargo, las imágenes de alta resolución utilizan en el estudio original de Kaplan2, así como un estudio similar por Munthe-Kaas et al. 10, sólo proporcionan copias instantáneas de eventos fagocíticas. En una revisión reciente, Rougerie et al. 11 destacó que las diferencias morfológicas entre FcγR y CR-mediada por la fagocitosis quedan por aclararse, y, además, volantes de membrana han sido observados durante el complemento mediada por receptor de partículas captación2. Imágenes de células vivas de eventos fagocíticas simples que abarcan desde la captura de la partícula a internalización, combinada con genéticamente modificados modelos de ratón, podrían mejorar grandemente nuestra comprensión de cómo los fagocitos capturan e ingieren partículas. Un método podría ser usar microscopía de fuerza rápida atómica (AFM) que permite la proyección de imagen topográfica de ultra alta resolución (10-20 nm) de las células vivas. Recientemente, se ha desarrollado un sistema rápido de AFM12 , que es conveniente para las superficies de células imágenes rápidamente con de poco ruido. Esta técnica tiene la ventaja de parámetros de alta resolución, topográficos y de mecánica de la vida las células se pueden medir a intervalos cortos (segundos), a diferencia de la microscopía electrónica de barrido, que exige la fijación y secado de punto crítico de células. Otro enfoque es la microscopia confocal 3D Time-lapse, que está ampliamente disponible, aunque fototoxicidad y blanqueo son factores limitantes durante grabaciones. Este enfoque es muy versátil y permite óptico seccionado con alta resolución espacial y permite extraordinaria flexibilidad en el etiquetado con una asombrosa gama de sondas fluorescentes, incluyendo proteínas fluorescentes genéticamente codificadas. Aquí describimos ensayos de fagocitosis usando microscopia confocal de disco de spinning Time-lapse que permiten alta resolución espaciotemporal de eventos fagocíticas mediado por el receptor.
Protocol
Los protocolos siguen los lineamientos de nuestro Comité de ética de investigación local, así como las pautas de cuidado de los animales.
1. aislamiento de los macrófagos peritoneales de ratón residente
- Sacrificar el ratón (3 – 4 meses de edad (ambos sexos); por ejemplo C57BL/6 cepa) con una sobredosis del isoflurane anestésico volátil (> 5% en aire) o dióxido de carbono13, seguido por dislocación cervical. Inducción de la anestesia puede ser fácilmente evaluada por pérdida de enderezamiento reflejo14, así como por la pérdida del reflejo de retirada de la pata.
- Después de limpiar la barriga del ratón con etanol al 80% en agua, hacer una incisión en la piel de la línea media y exponer la pared abdominal subyacente.
- Coloque un catéter de plástico de 24 G en el peritonium y lavado de la cavidad con solución salina tamponada de 2 x 4,5 mL helado Hank (HBSS), sin Ca2 + y Mg2 +por medio de una jeringa de plástico de 5 mL. Mientras que la inyección, deje unos 0,5 mL residual HBSS (5-4.5 mL (inyectada) = 0,5 mL) en la jeringa en caso de tejido es aspirado dentro de la punta del catéter y tiene que ser expulsado. Transferir la suspensión aspirada en un tubo de fondo redondo polipropileno 14 mL y centrifugar a 300 x g durante 6,5 min a temperatura ambiente.
Nota: La punta del catéter plástico es Roma, que, en comparación con una aguja, minimiza el daño a los contenidos abdominales. Normalmente, siguiente suave masaje abdominal, suspensión peritoneal 8 mL puede ser obtenido de la cavidad peritoneal. - Deseche el sobrenadante y resuspender las células peritoneales en 1 mL bicarbonato-RPMI 1640 medio libre con 20 mM Hepes, 10% suero bovino fetal inactivado con calor y antibióticos como la penicilina (100 unidades/mL) y estreptomicina (100 μg/mL), preparada por diluir 100 x penicilina/estreptomicina 1: 100. Esto normalmente da una concentración de alrededor de 6 x 106 células/mL.
Nota: Aproximadamente el 30% de células peritoneales aisladas son macrófagos, mientras que las otras células (más pequeñas) son linfocitos, predominantemente de células B.
2. siembra de células peritoneales en canal se desliza
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Después de haber efectuado la suspensión hacia arriba y hacia abajo para reducir la aglutinación de células, Pipetear 100 suspensión μL en el canal prellenado (volumen, 100 μL) de una diapositiva de canal revestido de fibronectina (un canal de 100 μl tiene las dimensiones (longitud x anchura x altura): 50 x 5 mm 0.4 mm).
- Rellenar previamente la cámara agregando medio de RPMI 1640 (Hepes) suplementada con suero 1 mL a uno de los dos embalses de la diapositiva del canal, inclinando el portaobjetos y luego aspirar el medio del embalse de aguas abajo (figura 1).
- Burbujas de aire eliminar indeseado, o tiras largas de aire en el canal agregando mediano de 1 – 2 mL a uno de los dos embalses, bien aplicando un tapón del depósito y después bombeando el aire a través de la presión con el pulgar rítmica de la tapa y, en caso necesario, inclinar el portaobjetos. Después de expulsar el aire, incline el portaobjetos con el depósito sin la tapa (y que contiene medio) hacia abajo antes de quitar la tapa para evitar que sean succionado nuevamente al canal de aire.
- Rellenar previamente la cámara agregando medio de RPMI 1640 (Hepes) suplementada con suero 1 mL a uno de los dos embalses de la diapositiva del canal, inclinando el portaobjetos y luego aspirar el medio del embalse de aguas abajo (figura 1).
- Incubar el portaobjetos de la canal, sembrado con células en una cámara húmeda durante 2 h a 37 ° C en ausencia de CO2 (CO2 no es necesario desde el HCO3-/CO2 sistema es sustituido por Hepes). Los deslizadores de canal pueden colocarse convenientemente en un estante, que tiene ocho diapositivas. Por lo general, 6 – 8 diapositivas se preparan de un ratón, aunque a 10 o más es posible.
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Retire la rejilla y cambiar el Medio RPMI 1640 (Hepes) en cada diapositiva bicarbonato con Medio RPMI 1640, suplementado con suero bovino fetal 10%, así como la penicilina/estreptomicina.
- Inclinar el portaobjetos y aspirar medio primero desde el depósito inferior y luego desde el depósito superior. A continuación, añadir 1 mL del medio de nuevo a uno de los embalses, incline el medio deslizante y aspirar desde el embalse de aguas abajo, después que ha atravesado el canal.
- Después de este paso de lavado (intercambio medio), llene la diapositiva del canal mediante la adición de medio de 1 mL a uno de los embalses.
Nota: Pasos utilizando diapositivas canal de lavado es muy sencillo y eficaz en términos de intercambio de la solución y eliminación de las células no adherentes. Tenga en cuenta que el Medio RPMI 1640 (bicarbonato) es normalmente previamente incubado con 5% CO2 durante la noche para asegurar el equilibrio térmico y de pH.
- Incube las células durante la noche a 37 ° C en una incubadora humidificada con 5% CO2. Realizar experimentos en el día siguiente.
3. aislamiento de eritrocitos humanos
- Día 2 (segundo día de experimentos, después de incubación durante la noche de los macrófagos peritoneales aislados), recoger 1 – 2 mL de sangre venosa periférica de un donante sano en un tubo heparinizado. Transferir 1 mL a un tubo de microcentrífuga de 2,0 mL (polipropileno) de fondo redondo, centrifugar a 300 x g durante 5 minutos a 18 ° C (ajuste empírico) y retirar el sobrenadante (plasma y buffy coat).
- Suavemente Aspire 100 μl de eritrocitos sedimentados y mezclar este volumen 1:1 con Medio RPMI 1640 (Hepes) modificado (se describe a continuación) en un tubo de microcentrífuga de 2,0 mL de fondo redondo. Etiquetar el tubo "1:1".
Nota: Contiene el Medio RPMI 1640 (Hepes) utilizado en el día 2 (de ensayos) después de aislar las células, además de 10% suero bovino fetal inactivado con calor, penicilina (100 unidades/mL), estreptomicina (100 μg/mL) y 1 mM N-(2-mercaptopropionyl) glicina (para reducir fototoxicidad). En adelante, este medio se denomina Medio RPMI 1640 (Hepes) "modificado". - Pipetear 4 μL de la suspensión de eritrocitos 1:1 diluido en 2 mL modificado Medio RPMI 1640 (Hepes), la pipeta en un tubo de microcentrífuga de 2,0 mL (repetir este paso, es decir, preparar 2 tubos). Etiquetar cada tubo de "4:2000". Colocar los tubos "1:1" y "4:2000" en el hielo.
4. etiquetado de la membrana plasmática de macrófagos
- Quite las diapositivas canal sembrados de la incubadora de CO2 e intercambiar el Medio RPMI 1640 (bicarbonato) en cada diapositiva para Medio RPMI 1640 (Hepes) modificado. A continuación, colocar las células en una cámara húmeda a 37 ° C en ausencia de CO2.
Nota: Después de la incubación y lavado, se eliminan la mayoría de los linfocitos desde el canal. La mayoría de las restantes células adherentes son los macrófagos, que se pueden identificar morfológicamente o por tinción de inmunofluorescencia con anticuerpos anti-F4/80. Alrededor del 95% de los residente macrófagos peritoneales de ratón son F4/80 positivo. - Diluir anti-ratón marcada fluorescencia verde F4/80 anticuerpo (almacenado a 4 ° C) 1:40 en Medio RPMI 1640 (Hepes) modificado. Tomar un portaobjetos, inclinarlo y Pipetear 100 μl (gota a gota) de la mezcla de anticuerpos en la apertura del canal 100 μl de la diapositiva (ver figura 1). Aspire el medio que desemboca en el embalse aguas abajo. Incube las células durante 20 min a 37 ° C (ambiente humidificado, sin CO2). Durante el período de incubación, etiqueta de los glóbulos rojos humanos (ver sección 5).
Nota: Como se refirió anteriormente, CO2 no es necesario desde el HCO3-/CO2 sistema es sustituido por Hepes. - Después de 20 minutos tiempo de incubación (durante el cual glóbulos rojos humanos son manchados y opsonizadora), lavado de la diapositiva mediante la adición de 1 mL modificado Medio RPMI 1640 (Hepes) a uno de los reservorios y aspirando el medio después de que ha fluido a través del canal, facilitado por inclinación de la diapositiva. Añada 1 mL medio para el almacenaje a corto plazo o proceder a un experimento (es decir, pipeteo en partículas (eritrocitos opsonizadas) y fagocitosis de imagen por microscopía confocal de disco de spinning Time-lapse).
5. etiquetado de la membrana plasmática de eritrocitos humanos
- Comenzar el etiquetado de los glóbulos rojos humanos inmediatamente después de la incubación de una diapositiva de macrófagos con verde fluorescente etiquetado anticuerpo de anti-F4/80 (después de la sección 4.2). Después de mezclar suave, tome 400 μL de uno de los tubos de "4:2000" (ver sección 3.3) y dispensar en un tubo de microcentrífuga de 2,0 mL (fondo redondo). Tiempo de la suspensión a alrededor de 37 ° C (ver párrafo siguiente). Agregue la mancha naranja/rojo fluorescente membrana del plasma de 0.4 μL (alícuotas almacenadas-20 ° C), mezclar e incubar a 37 ° C durante 5 minutos.
Nota: Un bloque de aluminio calentado, colocado dentro de la campana de flujo laminar, es útil para reducir al mínimo pérdida de calor mientras se preparan diapositivas. Los tubos pueden colocarse en pozos de diámetro del bloque de calefacción y un independiente, o placa de aluminio integrado, climatizada puede servir como un espacio de trabajo. - Después del período de incubación de 5 minutos, prepare el primer paso de lavado agregando 1600 μl modificado RPMI 1640 (Hepes) mediano (para llenar el tubo de microcentrífuga de 2.0 mL).
- Centrifugar el tubo a 300 x g durante 5 minutos a 18 ° C (ajuste empírico). Una pelotilla roja compacta debe ser visible en la pared (es decir, fuera del centro) en la parte inferior del tubo. Gire el tubo de modo que el sedimento quede mirando hacia arriba y retire con cuidado todo el sobrenadante sucesivamente (en dos pasos) usando una pipeta de 1-1.5 mL.
- Después de aspirar el sobrenadante, agregar 2.000 μl modificado RPMI 1640 (Hepes) media, mezclar (para resuspender las células) y repita los pasos anteriores de la aspiración de la centrifugación y el sobrenadante.
- Resuspender el precipitado (de membrana plasmática teñida y 2 x lavado de glóbulos rojos) con 400 μL de Medio RPMI 1640 (Hepes) modificado. Etiquetar el tubo PMS (abreviatura para tinción de la membrana plasmática).
Nota: Como alternativa, el éster de succinimidyl de un derivado de la rhodamina sensibles al pH, que se convierte en más fuertemente fluorescente en pH ácido, podría ser utilizado para etiquetar los glóbulos rojos humanos. En este caso, la intensidad de fluorescencia además sirve como una medida de la maduración del fagosoma después de que las partículas han sido internalizadas.
6. opsonización (etiquetado) de los glóbulos rojos humanos con el ratón la inmunoglobulina G (IgG)
- Añadir 1 μl (IgG2b) del ratón monoclonal (clon HIR2) humana CD235a anticuerpo (1 mg/mL) (almacenada a-20 ° C) al tubo etiquetado PMS (ver secciones 5.2-5.5), que contiene el plasma membrana manchada humanas glóbulos rojos suspendidos en 400 μL de medio. CD235a (también conocido como glycophorin A) es una Sialoglicoproteína de membrana específicos de linaje eritroide.
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Incubar a 37 ° C durante 8 minutos Nota eso opsonización de los eritrocitos humanos con IgG causa aglutinación celular. Aunque la aglutinación puede servir como un indicador visual de opsonización, es indeseable para la proyección de imagen de solo efectos fagocíticos. Para evitar la aglutinación, repetidamente mezclar la suspensión de células (cada 1 min) usando, por ejemplo, una variable pipeta de 20 – 200 μL volumen situado a 200 μl.
- Hacia el final del período de incubación de 8 min, si deseado, lave el portaobjetos de macrófago, que se incubaron con verde fluorescente etiquetados anticuerpo anti-F4/80, con 1 mL modificado Medio RPMI 1640 (Hepes). Que sean ambos reservorios de la diapositiva del canal libres de medio después de los pasos de lavado.
7. la fagocitosis de la membrana del Plasma de la proyección de imagen manchada y IgG recubierto de glóbulos rojos humanos
- Después de la incubación de 8 minutos con el anticuerpo anti-CD235a (sección 6.2), Pipetear 100 suspensión μl que contiene membrana plasmática teñida y opsonizadora de IgG humanas glóbulos rojos en el canal de la diapositiva que contiene macrófagos marcados con verde fluorescente anti-F4 / 80 anticuerpo (paso 4). Así, rojo fluorescentes, opsonizadora de IgG humanas glóbulos rojos se agregan al verdes fluorescentes fagocitos (macrófagos).
- Tan pronto como se han añadido los glóbulos rojos humanos, Monte la diapositiva del canal en un microscopio confocal de disco giratorio (con la incubadora de la etapa a 37 ° C) para la proyección de imagen, por ejemplo, a través de 60 X / 1.49 lente objetivo de inmersión en aceite. Comenzar tan pronto como sea posible, la proyección de imagen ya que las partículas comienzan a asentarse dentro de 1 minuto.
Nota: Con perlas fluorescentes con un diámetro de 100 nm, mide, por el análisis de punto de propagación funciones, resoluciones XY x = 0,22 μm, y = 0,23 μm (láser de 488 nm) y x = 0.27 μm, y = 0.27 μm (561 nm láser). Sin embargo, para reducir el fotoblanqueo y fototoxicidad durante proyección de imagen 3D Time-lapse de las células vivas, transigimos resolución espacial utilizando 2 x 2 binning. Binning aumenta sensibilidad (mejora la relación señal a ruido) y la velocidad de fotogramas permitidas, pero a expensas de la resolución espacial. - Utilizar un enfoque perfecto (o similar) sistema para evitar la deriva de enfoque durante las grabaciones. Después de activar el sistema de enfoque perfecto, utilice el control de offset para centrarse en las protuberancias lamellipodial macrófago inmediatamente sobre el cubreobjetos (ver nota abajo) de la diapositiva del canal. Este nivel de atención corresponde a Z = 0 μm. obtener Z-pila del μm-1 a + 16 μm en pasos de 0,8 μm, que asciende a 22 Z-rebanadas. Pilas de Z pueden, por ejemplo, obtener en una tasa de 1 pila (para cada canal) cada 15 s para un total de 16 min.
Nota: Largos periodos de grabación sufren pérdidas de calidad de imagen, principalmente debido al fotoblanqueo. Pilas de Z son adquiridas para cada uno de los dos canales: los macrófagos son imágenes utilizando un láser 488 (canal verde) y glóbulos rojos humanos son imágenes utilizando un láser 561 (canal rojo). Usando este acercamiento, se pueden obtener varias opiniones de macrófagos ingieren IgG opsonizadora glóbulos rojos humanos en diferentes puntos de tiempo (por ejemplo, ver figura 2).
Nota: Configuración típica del sistema (2 x 2 binning) es: canal verde (20,5% láser (50 mW; 488 nm) de energía, sensibilidad 101 (rango 0 – 255) y tiempo de exposición de 200 ms); canal rojo (10,5% láser (50 mW; 561 nm) energía, sensibilidad 101 (rango, 0-255) y 98 ms tiempo de exposición).
Nota: La parte inferior de la diapositiva del canal es un polímero con el mismo grosor que un cubreobjetos de vidrio #1.5 y las mismas propiedades ópticas del vidrio y, en particular, el material tiene la ventaja de permeabilidad de gas.
8. imágenes de fagocitosis de membrana plasmática teñida y recubiertos por complemento glóbulos rojos humanos
- Membrana plasmática opsonize complemento manchado y sangre roja humana IgG opsonizadora células semejantemente a las secciones 5 y 6, excepto, en lugar de pipeteo 4 μL de la suspensión de eritrocitos 1:1 diluido en Medio RPMI 1640 (Hepes) de 2 mL modificado, como se describe en la sección 3.3, Pipetear 4 μL en Medio RPMI 1640 (Hepes) de 1 mL modificado y por consiguiente la etiqueta el tubo 4:1, 000. Así, los glóbulos rojos humanos son 2 x más concentrado.
- Proceder con los pasos en las secciones 4 y 5, pero empezando con la 4:1,000 en lugar de la acción de 4:2,000 diluido de glóbulos rojos humanos (4:1, 000 y 4:2,000 se refieren a las diluciones subsecuentes de las inicialmente 1:1 diluidos glóbulos rojos humanos descritos en las secciones 3.1 y 3.2).
- Sacrificar un ratón nulo del C5 (por ejemplo, B10. D2 -Hc0 H2d H2-T18c/oSnJ; Laboratorio de Jackson) por la inhalación de isoflurano (> 5% en aire) seguida de decapitación y recoger la sangre. Generalmente de goteo de 0.8 mL de sangre en un tubo de plástico de 14 mL de fondo redondo inmediatamente después de decapitación e inhalación isoflurane.
- Después de 1 h, cuando la sangre se coagula completamente, transferir el líquido residual en un tubo de microcentrífuga de 2.0 mL y centrifugar a 300 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Posteriormente, recoger el suero amarillento. Por lo general, recuperamos null suero de al menos 200 μL C5. Coloque el suero null C5 en hielo.
- Después de 4 min de incubación de la membrana plasmática teñida glóbulos rojos humanos con IgG, añadir otro 1 μl de anticuerpo anti-CD235a (dar 2 x concentrado) y luego tomar 50 μl de la suspensión de células y mezclar en un tubo de microcentrífuga de 2.0 mL separadas que contienen null de C5 de 50 μl suero. Continuar mezclando varias veces (cada 1 min) transfiriendo hacia arriba y hacia abajo, como en la sección 6.2, para otros 4 minutos. Así, después de este paso, se incuban los glóbulos rojos humanos con anticuerpo anti-CD235a para un total de 8 minutos.
Nota: El período de incubación de 4 min con suero null C5 es suficiente para activar la cascada del complemento clásica y opsonize los glóbulos rojos humanos con C3b, que es dividido por el Factor I a iC3b.
9. confirmación de IgG - y C3b-opsonización de los eritrocitos humanos
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Incubar las células con cabra anti-ratón (secundaria) IgG anticuerpo conjugado a un fluoróforo fluorescente verde o rojo para confirmar opsonización de los eritrocitos humanos con anticuerpo de ratón anti-CD235a IgG (IgG2b; ver sección 6.1).
- Añadir 1 μl mouse anti-CD235a IgG y el anticuerpo 1 μl fluorescencia etiquetada anti-ratón secundaria a una suspensión de 400 μL de glóbulos rojos humanos e incubar a 37 ° C durante 8 minutos. Posteriormente, Lave dos veces (como en las secciones 5.2-5.5).
- Resuspender el sedimento celular con 400 μL modificado RPMI 1640 (Hepes) Deslice el medio y Pipetear 100 μl de la suspensión en un canal (ver figura 1) para la proyección de imagen confocal de la fluorescencia.
Nota: Las células que mata (aglutinan) después de lavar y resuspensión, pero lavar es necesario reducir la fluorescencia del fondo debido a anticuerpo secundario independiente.
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Confirmar la opsonización de los eritrocitos humanos, previamente marcados con ratón IgG e incubadas con suero de ratón nulo de C5, con C3b/iC3b mediante, por ejemplo, anticuerpo de rata anti-ratón C3b/iC3b/C3c y un anticuerpo secundario, por ejemplo, anticuerpo de cabra anti-rat IgG conjugado a un fluoróforo fluorescente verde.
- Repita los pasos en la sección 8 usando eritrocitos humanos sin manchas.
- Añadir 0,25 μl etiquetado fluorescente anticuerpos anti-ratón iC3b/C3b/C3c la mezcla μl 100 (50 μl IgG marcado con glóbulos rojos humanos + suero de ratón nulo de C5 de μl 50) e incubar a 37 ° C durante 8 minutos.
- Lavar dos veces, Resuspender el precipitado en 100 μl modificado RPMI 1640 (Hepes) medio y pipeta de la suspensión en un canal (ver figura 1) para la proyección de imagen confocal de la fluorescencia.
Representative Results
En la figura 1se muestra un diagrama esquemático de la diapositiva del canal utilizado para la proyección de imagen de la fagocitosis mediante microscopía confocal spinning Time-lapse. Glóbulos rojos humanos (hRBCs) se tiñen con el marcador rojo fluorescente membrana del plasma CellMask Orange, mientras que los macrófagos peritoneales residentes de ratón aislados (Ms) están marcados con verde fluorescente Alexa Fluor 488-anticuerpo conjugado con anti-F4/80 ( Figura 2), que sirve como un marcador específico de los macrófagos de ratón y una etiqueta de la membrana plasmática. Glóbulos rojos humanos puede opsonizadora con IgG (mIgG) del ratón o mouse IgM (mIgM), por incubar las células con el anticuerpo anti-CD235a IgG (o IgM) (CD235a, también conocido como glicoforina A, es una proteína expresada específicamente en glóbulos rojos humanos). La proyección de imagen 3D Time-lapse de macrófagos fluorescentes verdes presentada con rojo fluorescentes glóbulos rojos humanos permite la visualización de eventos fagocíticas sola partícula (figura 2). Una observación más cercana de eventos simples fagocíticas permite detalles de la captura de la partícula y la ingestión a delinearse. Por ejemplo, la captura de un opsonizadora mIgG humano glóbulo rojo por un filopodium de macrófagos, una proyección delgada, dedo-como puede observarse (Figura 3A; vea también Horsthemke et al. 15). por otra parte, el exprimir de una célula de sangre roja humana durante la formación de Copa fagocítica puede observarse (Figura 3A). Sobre la introducción de suero dulce ratón, opsonizadora mIgG, o glóbulos rojos opsonizadora mIgM, humanos activan la cascada del complemento clásico, que culmina en la formación de un complejo de ataque a membrana hemolítico. La cinética de la hemólisis mediada por complemento puede medirse por las células con doble tinción con CellMask Orange y calceína la proyección de imagen. Verde fluorescente calceína citosólica se libera rápidamente de las células durante la hemólisis (figura 3B).
Figura 1: manejo de diapositivas del canal revestido de fibronectina. Diapositiva de canal (A) A consta de dos embalses conectados por un canal con las dimensiones diapositivas de 50 x 5 mm 0,4 mm. canal inicialmente se prellena aplicando medio 1-2 mL a uno de los dos embalses y inclinando el portaobjetos. Tapas (B) pueden ser colocados en los depósitos antes de la incubación. Las tapas se pueden utilizar convenientemente para bombear burbujas de aire no deseados antes de la siembra el canal con las células. Canal de 100 μl (C) el aire burbuja-libre puede ser llenado mediante Pipeteo directamente medio en la boca de un canal. Este paso se utiliza, por ejemplo, a los macrófagos de la semilla en una diapositiva o para añadir gfluorophore (verde fluorescente)-anticuerpo conjugado de anti-F4/80, que sirve como una etiqueta de la membrana, así como un marcador de macrófagos de ratón. (D) después de pipeteo partículas como opsonizadas glóbulos rojos humanos, en un canal sembrado con fluorescencia manchados los macrófagos, la diapositiva se puede colocar en el escenario de un microscopio invertido y microscopia confocal de disco de spinning Time-lapse puede ser realiza. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: imagen 3D Time-lapse de fagocitosis. (A) esquema que muestra la opsonización de membrana plasmática teñida (rojo fluorescente) glóbulos rojos humanos (hRBCs) con anticuerpos de ratón (m) anti-CD235a de la inmunoglobulina G (mIgG) y presentación de la etiqueta hRBCs a los macrófagos de ratón (Ms), etiquetado (verde fluorescente) con verde fluoróforo conjugada anti-F4/80 de anticuerpos fluorescentes. (B) Time-lapse imágenes (vistas XZ), obtenidas por microscopía confocal de disco, mostrando la formación de Copa fagocítica y la ingestión de opsonizadora mIgG hRBCs de giro Barra de escala = 10 μm. (C) reconstrucciones 3D mostrando macrófagos ingieren opsonizadora mIgG hRBCs. Correspondiente vista XZ (para 3 de los puntos de tiempo) aparecen en representan distancias de cuadrícula B. 5.07 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: captura de una partícula por una filopodium. Time-lapse imágenes, obtenidas por microscopía confocal de disco, que muestra un macrófago del ratón captura una inmunoglobulina de ratón G (mIgG) de giro-opsonizadas humana glóbulos rojos (hRBC) vía un filopodium (flechas en la parte superior del panel), una proyección en forma de dedo. Tenga en cuenta que el glóbulo rojo pierde sus crenations durante fagocitarias Copa formación. Además, la Copa fagocítica aparece para exprimir el envuelto de glóbulos rojos (indicado por las flechas en el panel inferior). Barra de escala = 10 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
La gran mayoría de los ensayos de fagocitosis, especialmente punto final y ensayos de alto rendimiento, no proporcionan la visualización de cómo las partículas son realmente capturadas, envuelto e ingeridas. Estudios pioneros por Munthe-Kaas et al. 10 y Kaplan2 en la década de 1970 sugirieron que sorprendentemente diferentes reorganizaciones citoesqueléticas estuvieron implicados en la fagocitosis de IgG opsonizadora versus opsonizadora complemento de partículas (células de sangre rojas de ovejas). Aquí describimos ensayos de fagocitosis usando microscopia confocal de disco giratorio que permiten proyección de imagen de alta resolución, en tiempo real de eventos simples fagocíticas. Fagocito de nuestro modelo es el los macrófagos peritoneales residentes de ratón, que puede ser aislada con mínimo manejo y utilizamos eritrocitos humanos recién aislados como partículas. Sin embargo, los ensayos de fagocitosis podrían aplicarse a otros fagocitos como los macrófagos derivados de médula ósea de ratón o neutrófilos, macrófagos derivados de monocitos humanos y líneas de celulares de macrófagos de ratón, neutrófilos de sangre periférica. En el caso de los fagocitos humanos o ratón neutrófilos, alternativa etiquetado fluorescente anticuerpos se necesitarían como fluorescencia etiquetada anti-CD14 (monocitos/macrófagos humanos) los anticuerpos16 o anticuerpos (Ly - 6 G) anti-Gr-1 (ratón neutrófilos).
Unopsonized glóbulos rojos humanos, como los glóbulos rojos de oveja utilizada tradicionalmente, son inertes en el sentido de que estas células son no (o, al menos, muy rara vez) ingeridas por los macrófagos peritoneales de ratón. De este modo, en contraste con perlas de poliestireno, actividad de bajo fondo. Glóbulos rojos humanos puede ser convenientemente opsonizadora con inmunoglobulinas de ratón IgG o IgM anticuerpos monoclonales contra CD235a (glycophorin A), un marcador específico de humanos eritrocitos (glóbulos rojos) y de precursores eritroides17, 18. en ensayos paralelos, fluorescencia etiquetada anti-IgG o IgM secundarios anticuerpos de ratón pueden ser aplicados para confirmar la opsonización. Las clases de anticuerpos IgG e IgM son hemaglutininas, sustancias (anticuerpos) que producen glóbulos rojos se aglutinan. Para evitar la aglutinación, intermitentemente mezclar la suspensión de células durante el período de incubación de 8 minutos con el anticuerpo anti-CD235a, y luego agregar la suspensión mezclada directamente a una que contiene macrófagos canal diapositiva (revestimiento de fibronectina) sin un paso de lavado . Pasos de lavado implican sedimentación de los eritrocitos por centrifugación, que promueve fuertemente la aglutinación. Antes opsonizante glóbulos rojos humanos, etiquetamos la membrana con una sonda fluorescente lipofílica de naranja y rojo. Este sondeo es brillantemente fluorescente en el inicio de grabaciones time-lapse, pero la señal poco a poco se desvanece, probablemente en gran parte debido al fotoblanqueo19. Además, los macrófagos y el revestimiento de fibronectina de la diapositiva será débil/rojo naranja fluorescente durante grabaciones. Este problema es probablemente debido al lavado de glóbulos rojos humanos después de etiquetar. En lugar de utilizar un marcador fluorescente lipofílico de la membrana de plasma, glóbulos rojos humanos podría ser etiquetados con un derivado de rodamina pH-sensible utilizando su amina reactiva succinimidyl ester15,20. Esto tiene la ventaja de permitir la visualización de la maduración del fagosoma ya que aumenta la intensidad de la fluorescencia con la disminución de pH15,20, pero este enfoque tiene la desventaja que actualmente se encuentran preparaciones reactivo éster caro e inestable después de la reconstitución en medio acuoso.
IgG-opsonizadora glóbulos rojos humanos son ingeridos a través de FcγRs, que se puede confirmar utilizando los macrófagos peritoneales aisladas de NOTAM21 o Fcer1g- / - ratones (Fcer1g knockout). Los macrófagos NOTAM opsonizadora IgG eritrocitos humanos se unen, pero carecen de ITAM (immunoreceptor motivo de activación basados en tirosina) - mediada de señalización necesaria para inducir la fagocitosis, mientras que los macrófagos de nocaut Fcer1g no expresan superficial FcγRs. IgG - u opsonizadora IgM humanas glóbulos rojos pueden ser además opsonizadora con C3b (que es hendida a iC3b) por incubar las células con el suero recién aislado de un ratón nulo complemento C5 (tipo suero provoca hemólisis). Las opsoninas IgG e IgM activan la cascada del complemento clásico, que conduce a la formación de poros (complejos de ataque de membrana) y lisis celular. En ratones que carecen de complemento C5, la cascada del complemento procede a complementar el escote de C3 y C5 convertasa carece de sustrato necesario para catalizar la vía terminal. Desarrollamos análisis simple para medir la cinética de la cascada del complemento. En Resumen, glóbulos rojos humanos puede co marcadas con un rojo fluorescente, marcador de membrana plasmática y el fluoróforo verde fluorescente, citosólico. Sobre la formación de lo complejos de ataque a membrana, formada por componentes del complemento C5-C9, el fluoróforo citosólico es rápidamente (en segundos) perdido desde el citosol. Visualización de la función end-effector (citólisis) de la cascada del complemento indica que el tiempo de incubación de 4 minutos es suficiente para opsonización C3b/iC3b de glóbulos rojos humanos. En ensayos paralelos, C3b/iC3b capa de glóbulos rojos humanos puede ser fácilmente había evaluada después de aplicar una mezcla de anti-ratón C3b y etiquetada fluorescente anticuerpos secundarios. En este caso, se requiere un paso de lavado para eliminar los anticuerpos no Unidos fluorescentes. Aunque la etapa de lavado consiste en sedimentaion de células por centrifugación, que promueve la aglutinación, opsonización exitosa puede evaluarse fácilmente mediante microscopía confocal. Fagocitosis mediada por receptor de complemento puede ser reflejada por cualquier aplicación IgG- / células de sangre roja humana opsonizadora iC3b NOTAM o Fcer1g- / - macrófagos o introduciendo IgM- / sangre roja humana opsonizadora iC3b células de macrófagos de tipo salvaje. Opsonizadora IgM de las células de sangre no son reconocidas por el FcγRs que contiene el ITAM (FcγRIII, FcγRI y FcγRIV) necesarias para la fagocitosis de partículas opsonizadora IgG22.
Para imagen fagocíticas eventos, la membrana plasmática de los macrófagos pueden ser etiquetadas con el anticuerpo conjugado de anti-F4/80 fluoróforo fluorescente verde, que también sirve como un marcador específico de los macrófagos de ratón. Glóbulos rojos humanos pueden procesar rojo fluorescente por la incubación con un marcador rojo naranja fluorescente membrana del plasma, como se señaló anteriormente. Este marcador de membrana plasmática lipofílico evita posibles efectos de confusión de etiquetas basados en anticuerpos. Rojo fluorescentes glóbulos rojos humanos, con o sin opsonización, se puede pipetearse directamente en el canal 100 μl de una diapositiva de canal y 3D Time-lapse reflejada por una 60 X 1.49 aceite de inmersión (o similar) objetivo realizado usando el 488 nm y 561 nm láser líneas , respectivamente, de un microscopio confocal (o similar) de disco de spinning. Es tentador para optimizar el sistema de proyección de imagen de alta resolución, pero la adquisición de pilas de Z repetidas sobre 16 minutos o así que puede causar fototoxicidad y photobleaching considerable. Optamos por utilizar 2 x 2 binning para promover buenos cocientes signal-to-noise y permite reducciones en la intensidad de excitación o tiempos de exposición, pero a expensas de la resolución óptica. Además, para reducir la fototoxicidad, agregamos un tesoro de especies reactivas de oxígeno al medio. En futuros estudios, los análisis podrían modificarse para la fagocitosis de células de sangre rojas humanas apoptotic de la imagen. Aplicación de un ionóforo Ca2 + , como A23187, puede utilizarse para inducir la fosfatidilserina externalización23, un "eat me" señal y sello de la temprana apoptosis24,25.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por las becas HA 3271/4-1 y HA 3271/4-2 del DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft) y la concesión FF-2016-05 de EXC 1003 (racimo de la excelencia 1003), las células en movimiento (CiM), DFG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 G plastic catheter | B Braun Mesungen AG, Germany | 4254503-01 | Used for peritoneal lavage |
| Hank’s buffered salt solution without Ca2+ and Mg2+ | Thermo Fisher Scientific | 14170120 | Used for peritoneal lavage |
| 14 mL polypropylene round bottom tubes | BD Falcon | 352059 | Used to collect peritoneal cells |
| RPMI 1640 medium containing 20 mM Hepes | Sigma-Aldrich | R7388 | Basis medium for assays |
| Heat-inactivated fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10082139 | Used as supplement for RPMI 1640 media |
| 100x penicillin/streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Used as supplement for RPMI 1640 media |
| Fibronectin-coated µ-Slide I chambers | Ibidi, Martinsried, Germany | 80102 | Channel slides used for assays |
| µ-Slide (anodized aluminum) rack | Ibidi, Martinsried, Germany | 80003 | Autoclavable stackable rack for channel slides |
| RPMI 1640 medium containing bicarbonate | Sigma-Aldrich | R8758 | Medium for overnight culture |
| N-(2-mercaptopropionyl)glycine | Sigma-Aldrich | M6635 | Scavenger of reactive oxygen species |
| Alexa Fluor 488-conjugated rat (IgG2a) monoclonal (clone BM8) anti-mouse F4/80 antibody | Thermo Fisher Scientific | MF48020 | Mouse macrophage marker and plasma membrane label |
| CellMask Orange | Thermo Fisher Scientific | C10045 | Red fluorescent plasma membrane stain |
| Succinimidyl ester of pHrodo | Thermo Fisher Scientific | P36600 | Amine-reactive succinimidyl ester of pHrodo |
| Mouse (IgG2b) monoclonal (clone HIR2) anti-human CD235a | Thermo Fisher Scientific | MA1-20893 | Used to opsonize human red blood cells with IgG |
| Alexa Fluor 594-conjugated goat anti-mouse (secondary) IgG antibody | Abcam | Ab150116 | Used to confirm opsonization of human red blood cells with mouse IgG |
| Rat anti-mouse C3b/iC3b/C3c antibody | Hycult Biotech | HM1065 | Used to confirm C3b/iC3b opsonization of human red blood cells |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rat IgG antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11006 | Used as secondary antibody to confirm C3b/iC3b opsonization |
| Calcein/AM | Thermo Fisher Scientific | C3100MP | Used to load human red blood cells with Calcein |
| UltraVIEW Vox 3D live cell imaging system | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Spinning disk confocal microscope system | |
| Nikon Eclipse Ti inverse microscope | Nikon, Japan | Inverted microscope | |
| CSU-X1 spinning disk scanner | Yokogawa Electric Corporation, Japan | Nipkow spinning disk unit | |
| 14-bit Hamamatsu C9100-50 Electron Multiplying-Charged Couple Device (EM-CCD) peltier-cooled camera | Hamamatsu Photonics Inc., Japan | EM-CCD camera of the spinning disk confocal microscope system | |
| 488 nm solid state laser, 50 mW | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Laser (488 nm) source of spinning disk confocal microscope system | |
| 561 nm solid state laser, 50 mW | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Laser (561 nm) source of spinning disk confocal microscope system |
References
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