Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

نموذج اعتلال عضلة القلب الناجم عن ميتوتريكسات في الزرد الكبار

Published: June 7, 2018 doi: 10.3791/57567
Automatic Translation
*1,2,3, *2,3, 2,3,4, 1,2,3
1Clinical and Translational Sciences Track, Mayo Clinic Graduate School of Biomedical Sciences, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Mayo Clinic, 3Division of Cardiovascular Diseases, Mayo Clinic, 4Institute of Life Science, Beijing University of Chinese Medicine
* These authors contributed equally

Summary

يتم وصف أسلوب لإنشاء نموذج اعتلال عضلة القلب الناجم عن ميتوتريكسات في الزرد الكبار (دانيو rerio) هنا. طريقتين بديل للحقن داخل وتعرض وتناقش شروط لتقليل الاختلافات بين مختلف مجموعات تجريبية.

Abstract

قد استخدمت الزرد الكبار وراثيا موجوداً (دانيو rerio) متزايدة كنموذج فقاريات لفهم الأمراض البشرية مثل اعتلال عضلة القلب. بسبب الراحة وقابليتها للمعالجات الجينية عالية الإنتاجية، توليد نماذج المكتسبة باعتلال عضلة القلب، مثل نموذج ميتوتريكسات الناجمة عن اعتلال عضلة القلب (DIC) في الزرد الكبار، هو فتح أبواب مجالات بحثية جديدة، بما في ذلك اكتشاف معدلات اعتلال عضلة القلب عن طريق الفحص الجيني إلى الأمام. يختلف عن النموذج DIC الزرد الجنينية، الأولى الحاد والمزمن مراحل اعتلال عضلة القلب في وقت لاحق يمكن تحديدها في النموذج DIC الزرد الكبار، مما يتيح دراسة آليات تعتمد على مرحلة الإشارات والاستراتيجيات العلاجية. ومع ذلك، يمكن الحصول على نتائج متغير مع الطراز الحالي، حتى في أيدي محققين ذوي خبرة. لتيسير تنفيذ نموذج DIC في المستقبل، نقدم بروتوكول مفصلة حول كيفية إنشاء هذا النموذج DIC في الزرد الكبار ووصف طريقتين بديل للحقن (الملكية الفكرية) داخل. نحن مناقشة الخيارات بشأن كيفية الحد من التفاوتات في الحصول على نتائج يمكن الاعتماد عليها وتقدم اقتراحات بشأن كيفية تفسير النتائج على نحو مناسب.

Introduction

وضعت ميتوتريكسات (دوكس)، كما يدعى Adriamycin، كالعقاقير المضادة الورم منذ الستينات1،2. الآن ما زال بنشاط كالمخدرات العلاج الكيميائي مهم لنطاق عريض من الأورام. ومع ذلك، التطبيق السريري دوكس أعاقها عن السمية تعتمد على الجرعة، وخاصة كارديوتوكسيسيتي تتميز بأعراض متغيرة تتراوح بين التغييرات electrocardiographic أعراض التهاب التامور والتليف اعتلال عضلة القلب 1 , 2-وحتى الآن، أثارت الفرضيات الرئيسية الثلاثة على الأقل لشرح مدينة دبي للإنترنت، بما في ذلك تنشيط الأكسجين التفاعلية الأنواع (روس)1،3،4،5، تثبيط topoisomerase (ثانيا-β 6،TOP2β)7، والتحوير للكالسيوم داخل الخلية الإصدار1،،من89. تتراكم الأدلة تشير أيضا إلى الاستعداد الوراثي كعامل خطر رئيسي لمدينة دبي للإنترنت10،11،،من1213. الهويات الجينات ذات الصلة بهذه الميول DIC، مع ذلك، لا تزال غير معروفة إلى حد كبير. ديكسرازوكساني هو عامل adjuvant فقط وافق "لنا الغذاء" والدواء (FDA) لعلاج DIC، لكن مع التنفيذ المحدود14،،من1516، مما يؤكد الحاجة إلى تحديد إضافية الاستراتيجيات العلاجية. ولذلك يتم استكشاف نماذج حيوانية لمدينة دبي للإنترنت لهذه الأغراض. نظراً لإمكانية الوصول والبساطة، الدراسات الميكانيكية في مدينة دبي للإنترنت نماذج يمكن أن يكون آثار أوسع نطاقا في أنواع أخرى من القلب: المرضية المشتركة قد تكون مشتركة بين القلب مسببات مختلفة، لا سيما في لاحقاً المراحل المرضية17،18،،من1920.

بالإضافة إلى نماذج القوارض من مدينة دبي للإنترنت، تم تطوير نماذج DIC الزرد بإنتاجية أعلى لتسهيل اكتشاف العوامل الوراثية الجديدة والمداواة. أنشئ نموذج DIC جنينية في الأجنة الزرد شفافة لفحص المركبات العلاجية21. نظراً لأن القلب أمراض ظهور الكبار مع المرضية تدريجيا، اعتلال عضلة القلب الزرد الكبار نماذج تم وضع22،،من2324،،من2526. ونحن إنشاء أول نموذج المكتسبة لاعتلال عضلة القلب الناجمة عن فقر الدم المزمن24، تليها مدينة دبي للإنترنت كنموذج المكتسبة باعتلال عضلة القلب الثاني في الزرد الكبار23. ووجدنا أن حقن بولس واحد من دوكس في الزرد الكبار يدفع كارديوتوكسيسيتي يتكون من مرحلة حادة تقريبا خلال أسبوع واحد بعد انتهاء الحقن (wpi)، تليها مرحلة مزمنة من اعتلال عضلة القلب إلى 6 أشهر بعد الحقن. بينما هابلوينسوفيسينسي الهدف آليا من ربمسن(mtor) يساعد اعتلال عضلة القلب الذي يبالغ في المرحلة المزمنة، وفيات الأسماك في المرحلة الحادة، مما يؤكد قيمة النموذج DIC الكبار نستشف تعتمد على المرحلة 23من الآليات. كذلك أثبتنا أنه يمكن استخدام نموذج DIC الكبار التأكيد على مجموعة من الزرد insertional القلب (ZIC) طفرات التي تتولد عن طريق نهج القائم على ينقول الطفرات insertional27. شاشة تجريبية حددت 3 الجينات المعروفة اعتلال عضلة القلب، فضلا عن 6b دناج (Hsp40) هومولوج، الفصيلية ب والأعضاء (dnajb6b) كالجديدة DIC قابلية الجينات28. ولذلك، أدت توليد نموذج DIC الكبار في الزرد إلى منهجية جديدة تمكن بصورة منهجية تحديد المعدلات الوراثية لمدينة دبي للإنترنت، التي تكمل القائمة على نطاق الجينوم جمعية دراسة (جواس) ومحور الصفات الكمية (QTL ) التحليل.

وخلال جيل وتنفيذ نموذج DIC الزرد الكبار، لاحظنا وجود تباينات كبيرة فيما بين الباحثين مختلفة و/أو حتى بين الحقن المختلفة التي يقوم بها المحقق نفسه. طبيعة طولية من الطراز يفرض تحديات لتسجيل النتائج من المحققين مختلفة وفي عملية استكشاف الأخطاء وإصلاحها متسلسلة. لتسهيل استخدام هذا الذي يحفز اعتلال عضلة القلب الإجهاد طريقة بسيطة من مجتمع البحث، يمكننا وصف لنا البروتوكول بالتفصيل، هذا نوعين من الحقن بالملكية الفكرية، ومناقشة اعتبارات الحد من التباينات بين مختلف الباحثين.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وأجريت جميع الإجراءات الموصوفة هنا وفقا للدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية (الأكاديميات الوطنية الصحافة-2011)، والتي وافق عليها برعاية الحيوان المؤسسية عيادة مايو كلينيك واستخدام اللجنة.

1-إعداد الزرد الكبار

  1. إعداد أزواج تربية كافية في عبور الدبابات للحصول على الأقل مرتين كالعديد من الأسماك الإجمالية اللازمة لحقن دوكس. إذا مقارنة الأسماك مع مختلف الخلفيات الوراثية، تولد جميع الأسماك خلال نفس الأسبوع لضمان مطابقة سن ضوابط.
  2. جمع أجنة الأسماك في صباح اليوم التالي، ونقلها إلى أطباق بتري 100 مم، والاحتفاظ بها في حاضنة 28.5 درجة مئوية. الاحتفاظ بالأجنة في كثافة منخفضة (< طبق بيتري الأجنة/100).
  3. تحديث الماء الجنين يوميا لتجنب اختلال الجنس، وإزالة البيض الميت يدوياً في الوقت مناسب باستخدام ماصة نقل.
  4. وضع نفس عدد الأجنة في كل دبابة (على سبيل المثال، المتوسطة الأجنة/3 ل 60 دبابة في البداية) لضمان مطابقة كثافة عناصر التحكم.
  5. بدء باراميسيا التغذية في التسميد بعد 4 أيام (إدارة الشرطة الاتحادية).
  6. فحص الأسماك يوميا خلال مرحلة الأحداث. ضبط عدد الأسماك حسب الحاجة لضمان الأسماك مشابهة الكثافة.
  7. عندما تصل الأسماك إلى 4 أسابيع عمر، نقل الأسماك تصل إلى 20 في كل دبابة متوسطة ل 3 جديدة لتحقيق مزيد من النمو. ابدأ لتغذية السمك مع الجمبري أجاج مظلل حية.

2-إعداد وتخزين حل الأسهم دوكس

ملاحظة: يمكن شراء دوكس من الشركات الحيوية المختلفة. ويكتسب المجمع عادة كمسحوق في حاويات البنى الداكن.

  1. دقة إذابة مسحوق دوكس في الماء المتأين الشطب لضمان لا كتل مرئية، مع تركيز 5 ملغ/مل نهائي كحل الأسهم. 1 مل الكوة دوكس المخزون في كل أنبوبة 1.5 مل قفل صندوق الأمانات. لف الأنابيب 1.5 مل مع ورقة رقائق الألومنيوم لحماية دوكس من التعرض للضوء.
    ملاحظة: إجراء هذه الخطوة في غطاء كيميائية.
  2. يبقى الحل دوكس الأسهم عند 4 درجة مئوية للتخزين. للتخزين على المدى الطويل (> 4 أسابيع) لحل دوكس الأسهم، وتنفيذ 3 المقطع الاختياري الوارد وصفها أدناه.

3-مراقبة نوعية دوكس باستخدام أجنة الزرد (اختياري)

ملاحظة: هو دوكس كلا الرطوبة-وحساسة للضوء، ولذلك فإنه يمكن أن يفقد فعاليته المخدرات للنمذجة DIC بعد التخزين الموسعة. دوكس تم شراؤها من شركات مختلفة، أو دفعات مختلفة حتى من نفس الشركة، أنها مفيدة لمعايرة فعاليته المخدرات باستخدام البرية من نوع (WT) الزرد الأجنة قبل إجراء التجارب على الأسماك الكبار. هذا الأسلوب مشتق من الزرد عنها جنينية DIC نموذجي21.

  1. جمع WT الزرد الأجنة من أزواج 2 على الأقل من الأسماك. ديتشوريوناتي الأجنة في التسميد بعد 24 ساعة (hpf) يدوياً باستخدام حقنه بإبرة صغيرة. وبدلاً من ذلك، علاج الجنين مع بروتيناز ك بتركيز نهائي 10 ميكروغرام/مل لمدة 10-15 دقيقة في حاضنة 30 درجة مئوية. تحديث الماء الأجنة بعد ديتشوريوناتيون. إزالة أجنة ميتة والحفاظ على الأجنة 36 على الأقل لكل دفعة.
  2. تمييع الحل دوكس الأسهم في الماء الأجنة الطازجة إلى تركيز نهائي من 100 ميكرومتر. حجم الحل هو 100 ميليلتر لكل الأجنة 3. مزيج الحل دوكس المخفف بدوامة. ينبغي أن يكون الحل النهائي المخفف ضوء، اللون الأحمر.
  3. إضافة 100 ميليلتر/بئر الحل دوكس المخفف لصفيحة شفافة نظيفة 96-جيدا.
  4. تأخذ 3 أجنة ديتشوريوناتيد مع ماصة نقل بلاستيك، والحفاظ على الأجنة قرب نهاية طرف ماصة. وضع طرف الماصة في كل بئر مع الحل دوكس. واسمحوا نهاية الطرف تلمس الحل والسماح للأجنة للسباحة في البئر.
    ملاحظة: تجنب دفع الأجنة، الذي سيتم إضافة المزيد من المياه في البئر وتمييع الحل دوكس يدوياً.
  5. تحديث الحل دوكس في 48 هبف. وبحلول ذلك الوقت، مراقبة الآبار تحت مجهر مع 10 X التكبير لتحديد الأجنة أو أجنة ميتة (وقف نبضات القلب) مع وذمة. عد وإزالة أي أجنة ميتة في الوقت مناسب، إلا يمكن أن تموت الأجنة الباقية معرضة للحل مع أجنة ميتة بسرعة كذلك.
  6. فحص الأجنة في 72 هبف والتعويل عليها. يعتبر علاج دوكس "فعالية المخدرات جيدة" إذا > وفاة 25% (وقف نبضات القلب) يمكن ملاحظتها في دفعات كلا من الأجنة.

4-حقن قبل إعداد

ملاحظة: تستخدم حقن دوكس الأسماك من 8 أسابيع إلى 6 أشهر من العمر. أوزان الجسم (BWs) من الأسماك البرية الهندي تناذر (ويك) نضجت بالحقن يمكن أن تتراوح بين 0.2-0.5 ز.

  1. سريع الأسماك عن 24 ساعة قبل الحقن.
  2. تخدير السمك مع الماء الجنين الذي يحتوي على تريكايني 0.16 mg/mL. استخدام ورقة تصفية نظيفة لتجفيف المياه من كلا الجانبين من الجسم. قياس وزن الجسم لكل الأسماك على نطاق. تجميع الأسماك داخل الفرق 10% في الحرب البيولوجية لحقن لاحق.
    ملاحظة: للتقليل من حجم العمل في هذه الخطوة، تعتبر الأسماك داخل الفرق 10% في الأسلحة البيولوجية بنفس الحجم؛ ولذلك، تعد دوكس العامل حل واحد وفقا لما يعني الأسلحة البيولوجية.
  3. تخطط لضخ كل الأسماك الكبار مع 5 ميليلتر للحل. حساب تركيز العامل دوكس وفقا لإعداد الأسماك و BWs.
    ملاحظة: لدراسة كارديوتوكسيسيتي المزمنة تصل إلى 6 أشهر، استخدم دوكس عند جرعة قدرها 20 مغ/كغ. لدراسة كارديوتوكسيسيتي الحادة من دوكس، يمكن زيادة الجرعة دوكس ما يصل إلى 50 مغ/كغ من وزن الجسم.
  4. تمييع دوكس المخزون في 1 × الحل هانك الملح المتوازن (حبس) للمقابلة العامل تركيزات. دوامة لخلط الحل. باختصار تدور إلى أسفل لجمع الحل.

5-دوكس الحقن في الأسماك الكبار

  1. المكان نظيف 100 مم طبق بيتري مع اسفنجة داخله، تحت مجهر تشريح، ثم قم بضبط التركيز. قص الأسفنج جعل تجويف حوالي 4 سم في طول عقد من أسماك. جعل تجويف أطول لأسماك كبيرة.
  2. إعداد إبرة ز 34 مع 10 ميليلتر الصغرى-حقنه. شطف الإبرة مع المخزن المؤقت x HBSS 1 لإزالة أي فقاعات وكتل من المحاقن والأنابيب.
  3. تخدير السمك الكبار في الماء الجنين الذي يحتوي على تريكيني 0.16 ملغ/مل لمدة 2 دقيقة.
    ملاحظة: يمكن أن تؤدي إلى أنيسثيتيزاتيون فترة طويلة أكثر من 5 دقيقة تليها الحقن دوكس الأسماك الموت.
  4. نقع الأسفنج في الماء الجنين مع تريكايني، ونقل الأسماك إلى الأسفنج للحقن.
  5. إجراء حقن دوكس الملكية الفكرية بأي من الأساليب اثنين هو موضح أدناه.
    1. حقن الملكية الفكرية الكلاسيكية29
      1. ضع السمك مع البطن حتى في تجويف الأسفنج. بسرعة إدراج الإبرة، مع 45° زاوية لجسم الأسماك في خط الوسط بين الزعانف الحوضية، واختراق حوالي 1-2 مم-الإفراج عن جميع دوكس الحل ببطء. الانتظار 5 s قبل سحب الإبرة. تحقق من تسليم دوكس بلون أحمر تظهر في بطن السمك.
    2. حقن IP البديلة
      1. ضع الأسماك أفقياً على الأسفنج مع الأمامي إلى اليمين. بلطف استقرار الأسماك استخدام ملقط نهاية غير حادة مع اليد اليسرى وأمسك بالصغير-المحاقن مع اليد اليمنى.
      2. ضع الإبرة تحت الخط الجانبي أعلى الزعنفة الحوضية، مع المجسم مشطوف الحواف متقابلة لأعلى. لافتاً في موقف 07:00 ص بزاوية 45 درجة، إدراج الإبرة 3-4 مم تجويف الأسماك الواقعة بين الحوض وزعانف الشرج ومن ثم خفض المكبس ببطء. تحقق من تسليم دوكس بلون أحمر تظهر في بطن السمك.
  6. بسرعة نقل الأسماك حقن لخزان عبور نظيفة مليئة بالمياه العذبة نظام السماح للأسماك لاسترداد. شطف الإبرة مرة واحدة مع المخزن المؤقت x HBSS 1 بين الحقن.

6-بعد حقن الأسماك الإدارة

  1. بعد الحقن، إرجاع السمك للنظام مع تشغيل الدورة الدموية. إذا كان ذلك ممكناً، الاحتفاظ بالأسماك دوكس تعامل بشكل منفصل من النظام الرئيسي لتجنب التلوث المتبادل بين الدبابات المختلفة التي تشترك في الدورة الدموية.
  2. الأسماك حقن لآخر 24 ساعة للانتعاش بسرعة. مراقبة الأسماك يوميا خلال الأسبوع الأول. إزالة السمك الميت في الوقت مناسب لتجنب العدوى للأسماك الأخرى.
    ملاحظة: موت الأسماك خلال 24 ساعة الأولى من المحتمل بسبب الآفات البدنية الناجمة عن الحقن.
  3. كذلك المحافظة على الأسماك أكد دوكس للملاحظات الطولية. إزالة السمك الميت في الوقت المناسب لتجنب العدوى إلى غيرها من الأسماك في الخزان.
    ملاحظة: يتم توثيق إعداد الأسماك لإنشاء منحنى البقاء على قيد الحياة.
  4. استخدام فحوصات تجريبية مختلفة للنمط الظاهري الأسماك أكد دوكس، مثل تخطيط صدى القلب30وظيفة القلب مراسل الخط المعدلة وراثيا23، السباحة التحدي26، والتقدير الكمي لأخرى يعيد البناء المرضية علامات23.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وترد هنا طريقتين لإجراء حقن الملكية الفكرية لنموذج DIC في الزرد الكبار. أثناء استخدام الكلاسيكية، وأنشئت الملكية الفكرية حقن الأسلوب29، لوحظ أن الحل دوكس حقن (اللون الأحمر) يمكن أن طين في بعض الأحيان الخروج من الموقع حيث اخترقت الإبرة. يستخدم الحقن IP البديلة في موقع آخر لاختراق الإبرة هو 3-4 ملم بعيداً عن الصفاق حيث يتم تحريرها في دوكس (الشكل 1A)، الذي يمنع فعلياً التسرب (الشكل 1B، ج 1). ويتجلى النجاح في إيصال دوكس في الصفاق لكلا أساليب التوزيع السريع من اللون الأحمر في جميع أنحاء البطن الأسماك، الذي يكون مرئياً على الجانب المعاكس من موضع الحقن.

يؤدي حقن دوكس مداوي 50 مغ/كغ باستخدام الأسلوب IP البديلة للسمية الحادة، حيث يموت معظم الأسماك خلال أسبوع واحد (الشكل 2). على النقيض من ذلك، حقن دوكس جرعتي 20 مغ/كغ باستخدام أسباب أسلوب IP البديلة تقريبا لا موت الأسماك خلال الأسبوعين الأولين، وموت الأسماك ~ 10% في wpi 4 (الشكل 3A). حقن دوكس جرعتي 20 مغ/كغ باستخدام الأسلوب الملكية الفكرية الكلاسيكية المعارض موت الأسماك ~ 30% في wpi 4 (الشكل 3). معرض الأسماك حقن بأي من الطريقتين وفاة أسماك ~ 20% مماثلة من 4 wpi إلى 10 wpi (الشكل 3، د).

ونحن قد الاستدانة كاسبر ؛ Tg(cmlc2:nusDsRed) الأسماك لتقييم تطور خلل القلب في مدينة دبي للإنترنت نموذج (الشكل 4 أ)23. هيئة شفافة تمكن وثائق قلب الحمراء الانقباضية (الشكل 4 باء) والانبساطي (الشكل 4) مراحل تحت مجهر الفلورسنت. بعد حقن 20 ملغ/كغ دوكس باستخدام الأسلوب IP البديلة، يمكن اكتشاف انخفاض وظيفة البطين بدءاً من wpi 4 (الشكل 4).

Figure 1
رقم 1: طرق الحقن. حقن (1A) الخطط لحقن الملكية الفكرية الكلاسيكية (ب) والملكية الفكرية البديلة (أ) الأساليب. الدائرة الحمراء تشير إلى دوكس المشترك إطلاق موقع لطرق الحقن اثنين. دوائر خضراء تشير إلى مواقع اختراق الإبرة. وتقدر المسافات استناداً أسماك ويك الكبار تزن حوالي 0.3 نتائج تمثيلية زاي (1B، ج 1) يشير إلى نجاح في إيصال دوكس استخدام أسلوبين الحقن داخل. ويمكن ملاحظة احمرار داخل بطن السمك الكبار فورا بعد الحقن. تم فحص الأسماك حقن مرة أخرى بعد الشفاء 5 دقيقة في مياه العذبة نظام. حبس: هانك س 1 لموازنة الحل الملح. ووظفت الزرد ويك WT. شريط الحجم: 5 مم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: منحنيات بقاء الممثل من الزرد الكبار بعد الإجهاد دوكس مع حقن دوكس 50 مغ/كغ- يظهر 3 مجموعات من حقن دوكس في دفعات مختلفة من وزن الأسماك الكبار في 3-6 أشهر عمر. في المجموع، n = 24 الأسماك كانوا يعملون في مجموعة عنصر التحكم x HBSS 1، و n = 8 الأسماك يعملن في كل دفعة حقن دوكس. لا يوجد فرق في الأحياء السمكية لوحظ بين أساليب حقن اثنين. ووظفت الزرد ويك WT. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: منحنيات بقاء الممثل من الزرد الكبار بعد الإجهاد دوكس مع حقن دوكس 20 مغ/كغ، والمقارنة بين أسلوبين الحقن داخل- (3 أ) الأسماك البقاء ضمن 0-4 أسابيع بعد الولادة دوكس بالحقن داخل الكلاسيكية. الأسماك في المائة عدد في الأسبوع يعتبر 0 إلى 100%. (3) بقاء الأسماك بعد 4 أسابيع بعد تسليم دوكس بالحقن داخل الكلاسيكية. الأسماك في المائة عدد في الأسبوع 4 يعتبر 100%. البقاء على قيد الحياة (3 ج) الأسماك ضمن 0-4 أسابيع بعد الولادة دوكس بالحقن داخل البديلة. الأسماك في المائة عدد في الأسبوع يعتبر 0 إلى 100%. (3D) الأسماك البقاء على قيد الحياة بعد 4 أسابيع بعد الولادة دوكس بالحقن داخل البديلة. الأسماك في المائة عدد في الأسبوع 4 يعتبر 100%. البيانات المعروضة في (3A) و (3B) 9 دفعات مختلفة من حقن دوكس من مجموع أسماك حقن 223 في 3-6 أشهر عمر. البيانات المعروضة في (3 ج) و (3D) 14 دفعات مختلفة من حقن دوكس من سمكة حقن 335 مجموع في 2-6 أشهر عمر. وتسجل أرقام الأسماك الحية أسبوعيا. أشرطة الخطأ تمثل الانحراف المعياري في النسبة المئوية للبقاء على قيد الحياة بين دفعات مختلفة في كل أسبوع. ووظفت الزرد ويك WT. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: تقييم وظيفة القلب الممثل بعد الإجهاد دوكس استخدام كاسبر ؛ Tg(cmlc2:nusDsRed) الأسماك. كاسبر (4A) صورة فوتوغرافية للكبار ؛ Tg(cmlc2:nusDsRed) الأسماك. مقياس بار = 1 سم. (4B) صورة الممثل طين أحمر في نهاية مرحلة الانقباضية كاسبر نضجت؛ Tg(cmlc2:nusDsRed) الأسماك. خط متقطع يمثل نهاية القطر الانقباضي (البيئة والتنمية المستدامة). صورة (ج 4) الممثل طين أحمر في نهاية مرحلة االنبساطي كاسبر نضجت؛ Tg(cmlc2:nusDsRed) الأسماك. تم استخراج الصور في (4) و (ج 4) من أفلام قلب ينبض التقاطها مع 6.3 x التكبير باستخدام مجهر فلوري تشريح. خط متقطع يمثل نهاية االنبساطي القطر (اد). مقياس بار = 1-(د 4) الممثل وظيفة القلب تقاس باستخدام كاسبر ؛ Tg(cmlc2:nuDsRed) الزرد الكبار بعد حقن دوكس 20 مغ/كغ. وقيست اد، والبيئة والتنمية المستدامة كما هو موضح في (4B) و (ج 4) للأسماك الفردية، والبطين تقصير الكسر ويحسب بالصيغة (− اد ESD)/اد. إلى حد كبير تم الكشف عن انخفاض الكسر البطين تقصير في 4 أسابيع وما بعدها. تم استخدام أسلوب داخل البديلة. يتم عرض القيم كالخطأ القياسي ± يعني. n ≥ 3 في كل مجموعة. تم استخدام الاختبار t الطالب لمقارنة بين مجموعتين. ف < 0.05. وقد تم تعديل هذه الأرقام من دينغ et al. 23 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

نموذج DIC تدريجي، لتم تحديد جرعة 20 ملغ/كغ دوكس تجريبيا كأعلى جرعة التي لا تتسبب في موت الأسماك الكبيرة خلال 1 wpi لكن النتائج لا تزال في موت الأسماك والحد من وظيفة القلب بعد wpi 4 (الشكل 3 و 4 الشكل). هذه الجرعة مماثلة لتلك التي يكثر استخدامها في نماذج DIC القوارض (15-25 مغ/كغ) وإلى حدود الجرعة التراكمية في البشر (550 مغ/م2، وما يعادل 15 مغ/كغ)4،7،،من3132 , 33-جرعات كبيرة من دوكس، مثل 50 مغ/كغ، إظهار موت الأسماك الكبيرة خلال wpi 1، حيث يمكن استخدامها لدراسة فقط الحاد من الردود السامة القلب إلى دوكس23،28.

وخلال تنفيذ هذا النموذج DIC، لاحظنا أنه من الصعب بالنسبة للمحققين الجدد إعادة إنتاج نفس النتائج في البداية. حتى بالنسبة للمحققين ذوي الخبرة، حوالي 20 ٪ اختلاف وفيات في المرحلة المزمنة لا يزال يمكن بين حقن مختلفة (الشكل 3)، مما يشير إلى عوامل التباس البيولوجية أونتشاراكتيريزيد في الطراز الحالي. على الرغم من أقل من نموذج مثالي، ما زلنا نعتقد أن هذا النموذج DIC الحالية كافية لجعل اكتشاف الصوت بسبب الأدلة التالية. أولاً، بعد عدة ممارسات، النتائج من نموذج DIC يمكن بعد ذلك تسجيل بين معظم، إذا كان المحققون، وليس كلها. ثانيا، استناداً إلى هذا النموذج DIC، حددنا 4 المعدلات الوراثية ذات مغزى. وأيد الأدلة القائمة من تقارير الأدب 3 منهم اعتلال عضلة القلب الجينات34،35،،من3637. من 4ال واحد هو دناج homolog الفصيلية الأعضاء ب 6 (DNAJB6)، التي ثبت أن جين عضلة جديدة مدعومة دراسة الجينية بشرية28. وهكذا، نستنتج أن النتائج استناداً إلى مجموعات تجريبية داخل استخدام عناصر تحكم صارم مطابقة العمر لا تزال عالية قابلة للتكرار، أن كان الطراز DIC بشكلها الحالي ليست موثوقة للمقارنة بين التجريبية.

العوامل المؤثرة الأخرى التي تسهم في التناقض الملاحظ في نموذجنا DIC الحالي المحتمل وتشمل ما يلي: الشيخوخة (1)، والفرق بين الجنسين قد تم اعتبار حاسم من عوامل خطر الإصابة بأمراض القلب والأوعية الدموية بما في ذلك مدينة دبي للإنترنت38، 39،40. بينما لا يزال كلا المؤسسين المفترضة لفحصها في نموذجنا على وجه التحديد، نلاحظ أن عمر الأسماك تميل إلى أن تكون أكثر حساسية للسمية دوكس (البيانات لا تظهر). الاختلافات بين دفعة ولاحظ استخدام كلا الأسلوبين IP (الشكل 3) هي ساهمت أيضا يرجح أن هذه المؤسسين اثنين. (2) مختلفة من أكبر نماذج حيوانية، حجم الزرد الكبار الصغيرة. وهكذا، يمكن أن تكون المحلية الضرر الناجم عن حقن دوكس أكثر شديدة ومتغير. (3) موت الأسماك حقن قد تنجم عن سمية دوكس في الأجهزة الأخرى (مثل، سمية كلوية)، بالإضافة إلى القلب. بينما هناك حاجة إلى تجارب مصممة بعناية أكبر للتصدي لكل عامل من العوامل المؤثرة الأخرى المذكورة آنفا، الأعمال السابقة تشير إلى أن التحذيرات التالية سوف تساعد على تقليل الاختلافات المظهرية: أولاً، من المهم لضمان فعالية دوكس. مسحوق دوكس ينبغي أن تظل دائماً في منطقة جافة ومظلمة، والحلول ينبغي التعامل معها بعناية لتقليل التعرض للضوء. من المستحسن أن إعداد الحلول العامل دوكس طازجة في كل مرة قبل حقن الأسماك. عادة لا نستخدم الأسهم دوكس الحلول بعد 4 أسابيع في مخزن. عندما يكون هناك شك، أداء 3 المقطع الاختياري في هذا البروتوكول باستخدام نموذج DIC الجنينية سريعة لمعايرة فعالية المخدرات من كل دفعة دوكس. وثانيا، تزامن الأسماك الكبار محوري. نفس السلالة الأسماك يحتاج إلى أن تثار بنفس الكثافة، التأكد من حجم الجسم مماثلة. ثم أننا قبل اختيار الأسماك مع BWs مماثلة لحساب الجرعة. من المستحسن للحفاظ على الأسماك على الأقل مرتين كثيرة في مجموع لعملية الاختيار هذه. هي صام جميع الأسماك عن 24 ساعة قبل عملية الاختيار المسبق. ثالثا، من المستحسن دائماً استخدام الأسماك من نفس العمر، والجنس الأسماك قبل الحقن دوكس بسبب معدلات النمو المختلفة واستجابات القلب يحتمل أن تكون مختلفة إلى دوكس.

فقد لاحظنا أن معظم الاستنتاجات غير متناسقة يمكن أن يعزى إلى مجموعة عناصر تحكم مشكوك فيها. ولذلك، نوصي المحققين جديدة إلى نموذج DIC لحقن دوكس الممارسة قبل إجراء تجارب حقيقية. عندما يتم حقن 20 مغ/كغ دوكس باستخدام أسلوب الحقن IP بديل، يمكن الإشارة إلى أسلوب حقن جيدا قبل وفاة أسماك ما يقرب من صفر خلال wpi 1 دوكس ومعدل وفيات متسقة نسبيا في حقن دوكس بعد 2-3 أشهر. دليل نماذج ناجحة في نهاية المطاف هو الحد الفهرس القلب الوظيفية، التي يمكن يمكن تحديدها كمياً عن طريق تخطيط صدى القلب25،30، باستخدام كاسبر ؛ Tg(cmlc2:nusDsRed) خط المحورة وراثيا، أو باستخدام المطورة حديثا السابقين فيفو--على أساس فحص وظيفة القلب (البيانات لا تظهر).

بالإضافة إلى حقن IP، طرق إيصال المخدرات الأخرى مثل حقن الرجعية-المداري41، أيضا كثيرا ما تستخدم التغذية42، واحتضان المياه عن طريق الفم في الزرد الكبار. ونحن لم تعتمد النهج حقن الرجعية-المداري، رغم افراجها المخدرات مباشرة في نظام الدورة الدموية، ونظرا لعدم وجود طريقة للتحقق من صحة إيصال الأدوية الناجحة، كما يمكن بسهولة حجب احمرار دوكس بنزيف محتمل. حاولنا وضع بروتوكول تسليم شفوي عن طريق تضمين دوكس مع امتصاص الغلوتين42، التي كانت مختلطة مع وجبات الطعام لتغذية الأسماك الكبار. للأسف، مع ما يصل إلى الجرعة التراكمية من 150 مغ/كغ المستخدمة خلال فترة تغذية 4 أسابيع، نحن لم يلاحظ أي كارديوتوكسيسيتي شديدة، مما يوحي بعدم فعالية الشفوي دوكس التسليم. بدلاً من ذلك، أن أسلوب تزقيمية شفوي يمكن أن يكون كذلك استكشاف43. وعلاوة على ذلك، بروتوكول الحضانة مغطس الأسماك في محلول يحتوي على دوكس هو أيضا طريق تسليم محتملة التي يمكن أن تختبر في المستقبل.

نعترف بأن أحد أوجه القصور الرئيسية لنموذج DIC الحالي هو أسلوب حقن بلعه واحدة، مما قد يؤدي إلى ارتفاع السمية والأضرار المحلية إلى الأجهزة الداخلية. تم تصميم هذا النهج للحد من أعباء العمل وزيادة الإنتاجية، حيث يمكن إجراء الفحص الوراثي في إنتاجية عالية في الأسماك الكبار28. في المستقبل، وينبغي متابعة النماذج مع حقنات متعددة من دوكس في الجرعات المنخفضة، التي سوف الخص أفضل DIC لوحظ في مرضى السرطان تعامل مع العلاج الكيميائي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب يعلن لا تضارب المصالح.

Acknowledgments

هذا العمل كان تدعمها جزئيا "منحة تنمية عالم" من "جمعية القلب الأمريكية" (14SDG18160021 إلى YD)، R01 المعاهد الوطنية للصحة في "الولايات المتحدة" يمنح HL 81753 و 107304 HL إلى XX، ومؤسسة مايو كلينيك إلى س س.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Crossing tank Aquaneering ZHCT100 Fish breeding
Incubator ThermoFisher Maintaining embryo
3 L medium tank Aquaneering ZT280 Maintaining fish
Paramecia Carolina 131560 Food for juvenile fish
Live hatched brine shrimp in house Food for adult fish
Doxorubicin hydrochloride Sigma D1515-10MG
1.5 ml safe-lock tube Eppendorf No. 022363204 For drug storage
Aluminum foil paper Fisher 1213104 For preventing light exposure
Proteinase K Roche No. 03115887001 For dechorionating embryo
Hank's balanced salt solution (HBBS) ThermoFisher 14025076 Vehicle for DOX
100 mm petri dish Falcon 431741
10 μL NanoFil micro-syringe WPI NANOFIL For injection
34 gauge needle WPI NF34BV-2 For injection
Tricaine Argent MS-222 Anesthetizing fish
96 well plate Costar 3539 For embryo drug treatment
Transfer pipette Bel-art product F37898 For transfering embryo

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Octavia, Y., et al. Doxorubicin-induced cardiomyopathy: from molecular mechanisms to therapeutic strategies. J Mol Cell Cardiol. 52 (6), 1213-1225 (2012).
  2. Singal, P. K., Iliskovic, N. Doxorubicin-induced cardiomyopathy. N Engl J Med. 339 (13), 900-905 (1998).
  3. Angsutararux, P., Luanpitpong, S., Issaragrisil, S. Chemotherapy-Induced Cardiotoxicity: Overview of the Roles of Oxidative Stress. Oxid Med Cell Longev. , 795602 (2015).
  4. Ichikawa, Y., et al. Cardiotoxicity of doxorubicin is mediated through mitochondrial iron accumulation. J Clin Invest. 124 (2), 617-630 (2014).
  5. Zhang, Y. W., Shi, J., Li, Y. J., Wei, L. Cardiomyocyte death in doxorubicin-induced cardiotoxicity. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 57 (6), 435-445 (2009).
  6. Sawyer, D. B. Anthracyclines and heart failure. N Engl J Med. 368 (12), 1154-1156 (2013).
  7. Zhang, S., et al. Identification of the molecular basis of doxorubicin-induced cardiotoxicity. Nat Med. 18 (11), 1639-1642 (2012).
  8. Dodd, D. A., et al. Doxorubicin cardiomyopathy is associated with a decrease in calcium release channel of the sarcoplasmic reticulum in a chronic rabbit model. J Clin Invest. 91 (4), 1697-1705 (1993).
  9. Mitry, M. A., Edwards, J. G. Doxorubicin induced heart failure: Phenotype and molecular mechanisms. Int J Cardiol Heart Vasc. 10, 17-24 (2016).
  10. Aminkeng, F., et al. A coding variant in RARG confers susceptibility to anthracycline-induced cardiotoxicity in childhood cancer. Nat Genet. 47 (9), 1079-1084 (2015).
  11. Deng, S., et al. Dystrophin-deficiency increases the susceptibility to doxorubicin-induced cardiotoxicity. Eur J Heart Fail. 9 (10), 986-994 (2007).
  12. Leong, S. L., Chaiyakunapruk, N., Lee, S. W. Candidate Gene Association Studies of Anthracycline-induced Cardiotoxicity: A Systematic Review and Meta-analysis. Sci Rep. 7 (1), 39 (2017).
  13. Wasielewski, M., et al. Potential genetic predisposition for anthracycline-associated cardiomyopathy in families with dilated cardiomyopathy. Open Heart. 1 (1), e000116 (2014).
  14. Lebrecht, D., et al. Dexrazoxane prevents doxorubicin-induced long-term cardiotoxicity and protects myocardial mitochondria from genetic and functional lesions in rats. Br J Pharmacol. 151 (6), 771-778 (2007).
  15. QuanJun, Y., et al. Protective Effects of Dexrazoxane against Doxorubicin-Induced Cardiotoxicity: A Metabolomic Study. PLoS One. 12 (1), e0169567 (2017).
  16. Seifert, C. F., Nesser, M. E., Thompson, D. F. Dexrazoxane in the prevention of doxorubicin-induced cardiotoxicity. Ann Pharmacother. 28 (9), 1063-1072 (1994).
  17. Adams, J. W., et al. Enhanced Galphaq signaling: a common pathway mediates cardiac hypertrophy and apoptotic heart failure. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (17), 10140-10145 (1998).
  18. Bowles, N. E., Bowles, K. R., Towbin, J. A. The "final common pathway" hypothesis and inherited cardiovascular disease. The role of cytoskeletal proteins in dilated cardiomyopathy. Herz. 25 (3), 168-175 (2000).
  19. Kroumpouzou, E., et al. Common pathways for primary hypertrophic and dilated cardiomyopathy. Hybrid Hybridomics. 22 (1), 41-45 (2003).
  20. Towbin, J. A., Bowles, K. R., Bowles, N. E. Etiologies of cardiomyopathy and heart failure. Nat Med. 5 (3), 266-267 (1999).
  21. Liu, Y., et al. Visnagin protects against doxorubicin-induced cardiomyopathy through modulation of mitochondrial malate dehydrogenase. Sci Transl Med. 6 (266), 266ra170 (2014).
  22. Asimaki, A., et al. Identification of a new modulator of the intercalated disc in a zebrafish model of arrhythmogenic cardiomyopathy. Sci Transl Med. 6 (240), 240ra274 (2014).
  23. Ding, Y., et al. Haploinsufficiency of target of rapamycin attenuates cardiomyopathies in adult zebrafish. Circ Res. 109 (6), 658-669 (2011).
  24. Sun, X., et al. Cardiac hypertrophy involves both myocyte hypertrophy and hyperplasia in anemic zebrafish. PLoS One. 4 (8), e6596 (2009).
  25. Sun, Y., et al. Activation of the Nkx2.5-Calr-p53 signaling pathway by hyperglycemia induces cardiac remodeling and dysfunction in adult zebrafish. Dis Model Mech. 10 (10), 1217-1227 (2017).
  26. Yang, J., Shah, S., Olson, T. M., Xu, X. Modeling GATAD1-Associated Dilated Cardiomyopathy in Adult Zebrafish. J Cardiovasc Dev Dis. 3 (1), (2016).
  27. Ding, Y., et al. Trapping cardiac recessive mutants via expression-based insertional mutagenesis screening. Circ Res. 112 (4), 606-617 (2013).
  28. Ding, Y., et al. A modifier screen identifies DNAJB6 as a cardiomyopathy susceptibility gene. JCI Insight. 2 (8), (2017).
  29. Kinkel, M. D., Eames, S. C., Philipson, L. H., Prince, V. E. Intraperitoneal injection into adult zebrafish. J Vis Exp. (42), (2010).
  30. Wang, L. W., et al. Standardized echocardiographic assessment of cardiac function in normal adult zebrafish and heart disease models. Dis Model Mech. 10 (1), 63-76 (2017).
  31. Desai, V. G., et al. Development of doxorubicin-induced chronic cardiotoxicity in the B6C3F1 mouse model. Toxicol Appl Pharmacol. 266 (1), 109-121 (2013).
  32. Zhu, W., Shou, W., Payne, R. M., Caldwell, R., Field, L. J. A mouse model for juvenile doxorubicin-induced cardiac dysfunction. Pediatr Res. 64 (5), 488-494 (2008).
  33. Chatterjee, K., Zhang, J., Honbo, N., Karliner, J. S. Doxorubicin cardiomyopathy. Cardiology. 115 (2), 155-162 (2010).
  34. Bang, C., et al. Cardiac fibroblast-derived microRNA passenger strand-enriched exosomes mediate cardiomyocyte hypertrophy. J Clin Invest. 124 (5), 2136-2146 (2014).
  35. Rassaf, T., Kelm, M. Protection from diabetic cardiomyopathy - putative role of the retinoid receptor-mediated signaling. J Mol Cell Cardiol. 59, 179-180 (2013).
  36. Wahbi, K., et al. Dilated cardiomyopathy in patients with mutations in anoctamin 5. Int J Cardiol. 168 (1), 76-79 (2013).
  37. Zhou, M. D., Sucov, H. M., Evans, R. M., Chien, K. R. Retinoid-dependent pathways suppress myocardial cell hypertrophy. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (16), 7391-7395 (1995).
  38. Hershman, D. L., et al. Doxorubicin, cardiac risk factors, and cardiac toxicity in elderly patients with diffuse B-cell non-Hodgkin's lymphoma. J Clin Oncol. 26 (19), 3159-3165 (2008).
  39. Silber, J. H., Barber, G. Doxorubicin-induced cardiotoxicity. N Engl J Med. 333 (20), 1359-1360 (1995).
  40. Von Hoff, D. D., et al. Risk factors for doxorubicin-induced congestive heart failure. Ann Intern Med. 91 (5), 710-717 (1979).
  41. Pugach, E. K., Li, P., White, R., Zon, L. Retro-orbital injection in adult zebrafish. J Vis Exp. (34), (2009).
  42. Zang, L., Morikane, D., Shimada, Y., Tanaka, T., Nishimura, N. A novel protocol for the oral administration of test chemicals to adult zebrafish. Zebrafish. 8 (4), 203-210 (2011).
  43. Collymore, C., Rasmussen, S., Tolwani, R. J. Gavaging adult zebrafish. J Vis Exp. (78), (2013).

Tags

الطب، 136 قضية، ميتوتريكسات، اعتلال عضلة القلب، المرحلة الحادة، والمرحلة المزمنة، الزرد، والحقن داخل، ونموذج المرض
نموذج اعتلال عضلة القلب الناجم عن ميتوتريكسات في الزرد الكبار
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ma, X., Ding, Y., Wang, Y., Xu, X. A … More

Ma, X., Ding, Y., Wang, Y., Xu, X. A Doxorubicin-induced Cardiomyopathy Model in Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (136), e57567, doi:10.3791/57567 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter