Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

En Doxorubicin-induceret kardiomyopati Model i voksen zebrafisk

Published: June 7, 2018 doi: 10.3791/57567
Automatic Translation
*1,2,3, *2,3, 2,3,4, 1,2,3
1Clinical and Translational Sciences Track, Mayo Clinic Graduate School of Biomedical Sciences, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Mayo Clinic, 3Division of Cardiovascular Diseases, Mayo Clinic, 4Institute of Life Science, Beijing University of Chinese Medicine
* These authors contributed equally

Summary

En metode til at generere en doxorubicin-induceret kardiomyopati model i voksen zebrafisk (Danio rerio) er beskrevet her. To alternative måder at intraperitoneal injektion præsenteres og betingelser, der skal reducere variationer mellem forskellige eksperimentelle grupper diskuteres.

Abstract

Den genetisk tilgængelige voksen zebrafisk (Danio rerio) er blevet mere og mere brugt som en hvirveldyr model for at forstå menneskers sygdomme såsom kardiomyopati. På grund af dens bekvemmelighed og imødekommenhed til høj overførselshastighed genetiske manipulationer, åbner generation af erhvervede kardiomyopati modeller, såsom doxorubicin-induceret kardiomyopati (DIC) model i voksen zebrafisk, døre til nye forskning veje, herunder at opdage kardiomyopati modifikatorer via fremad genetisk screening. Forskellig fra den embryonale zebrafisk DIC model, både indledende akut og senere kronisk faser af kardiomyopati kan bestemmes i den voksne zebrafisk DIC model, giver undersøgelsen etape-afhængige signaling mekanismer og terapeutiske strategier. Dog kan varierende resultater opnås med den nuværende model, selv i hænderne på erfarne efterforskere. For at lette fremtidig gennemførelse af DIC model, præsenterer vi en detaljeret protokol om hvordan man kan generere denne DIC model i voksen zebrafisk og beskrive to alternative måder at intraperitoneal (IP) injektion. Vi diskutere yderligere muligheder at reducere variationer for at få pålidelige resultater og stille forslag om, hvordan man korrekt fortolke resultaterne.

Introduction

Doxorubicin (DOX), også kaldet Adriamycin, er blevet udviklet som en anti-neoplastiske medicin siden 1960s1,2. Det er nu endnu bruges aktivt som en vigtig kemoterapeutiske stof for et bredt spektrum af tumorer. Men kliniske anvendelse af DOX var hæmmet af dens dosisafhængig toksicitet, især cardiotoxicity karakteriseret ved variabel symptomerne spænder fra asymptomatisk elektrokardiografiske ændringer til pericarditis og decompensated kardiomyopati 1 , 2. indtil mindst tre store hypoteser er blevet rejst for at forklare DIC, herunder aktiveret reaktive ilt arter (ROS)1,3,4,5, hæmning af topoisomerase II-β ( TOP2β)6,7, og graduering af intracellulære calcium frigive1,8,9. Akkumulere beviser foreslår også genetisk disposition som en central risikofaktor for DIC10,11,12,13. Gen identiteter relateret til disse DIC prædisposition, men stadig stort set ukendt. Save er det eneste adjuverende agent godkendt af US Food and Drug Administration (FDA) til behandling af DIC, men med begrænset gennemførelsen14,15,16, understreger behovet for at identificere yderligere terapeutiske strategier. Dyremodeller af DIC er derfor undersøgt for disse formål. På grund af deres tilgængelighed og enkelhed, Mekanistiske undersøgelser på DIC modeller kunne potentielt har bredere virkninger på andre typer af cardiomyopatier: fælles patogenese kan deles mellem cardiomyopatier af forskellige etiologies, især på senere patologisk faser17,18,19,20.

Ud over gnavere modeller af DIC, er zebrafisk DIC modeller med højere overførselshastighed blevet udviklet for at lette opdagelsen af nye genetiske faktorer og therapeutics. En embryonale DIC model har været etableret i gennemsigtig zebrafisk embryoner til screening terapeutiske forbindelser21. Cardiomyopatier er voksen indsættende sygdomme med en progressiv patogenese, udviklet voksen zebrafisk kardiomyopati modeller har været22,23,24,25,26. Vi genereres den første erhvervede model for kardiomyopati som følge af kronisk anæmi24, efterfulgt af DIC som den anden erhvervede kardiomyopati model i voksen zebrafisk23. Vi fandt, at injektion af en enkelt bolus af DOX i voksen zebrafisk inducerer cardiotoxicity, der består af en akut fase groft inden for 1 uge efter injektion (wpi), efterfulgt af en kronisk fase af kardiomyopati til 6 måneder efter injektion. Mens haploinsufficiency til mekanistiske målet på rapamycin(mtor) forbedringer kardiomyopati i den kroniske fase, overdriver det fiskedødelighed på den akutte fase, hvilket understreger værdien af den voksne DIC model at skelne fase-afhængige mekanismer23. Vi viste yderligere, at den voksne DIC model kan bruges til at understrege en samling af zebrafisk pattedyrsceller hjerte (ZIC) mutanter, der bliver genereret via en transposon-baserede pattedyrsceller mutagenese tilgang27. En pilot skærm identificeret 3 kendte kardiomyopati gener samt DnaJ (Hsp40) homolog, underfamilie B og medlem 6b (dnajb6b) som ny DIC modtagelighed gener28. Derfor, generation af voksen DIC model i zebrafisk førte til en ny metode, der systematisk muliggør identifikation af genetisk modificering af DIC, som supplerer de eksisterende genome-wide association studier (GWAS) og kvantitative træk locus (QTL ) analyse.

Under den generation og gennemførelse af voksen zebrafisk DIC model bemærkede vi betydelige variationer mellem forskellige forskere og/eller selv blandt forskellige injektioner udført af den samme investigator. Langsgående arten af modellen stiller udfordringer til at registrere resultaterne fra forskellige efterforskere og den sekventielle fejlfindingsprocessen. For at lette anvendelsen af denne enkle kardiomyopati-inducerende stress metode af Fællesskabets forskning, vi beskriver vores protokol i detaljer, findes to typer IP injektion, og diskutere overvejelser for at reducere variationer mellem forskellige forskere.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle procedurer, der beskrives her blev udført i overensstemmelse med retningslinjer for pleje og anvendelse af forsøgsdyr (nationale akademier pressen. 2011), og de blev godkendt af Mayo Clinic institutionelle Animal Care og brug udvalget.

1. voksen zebrafisk forberedelse

  1. Oprette tilstrækkelige ynglende par i krydser tanke at erhverve mindst dobbelt så mange som den samlede fisk brug for DOX injektion. Hvis man sammenligner fisk med forskellige genetiske baggrunde, avle alle fisk inden for den samme uge for at sikre alder-matchede kontrol.
  2. Indsamle fisk embryoner næste morgen, overføre dem til 100 mm petriskåle, og holde dem i en 28,5 ° C inkubator. Opbevare embryoner på en lav densitet (< 100 embryoner/petriskål).
  3. Opdater embryo vand dagligt for at undgå sex ubalance, og manuelt fjerne døde æg i tide ved hjælp af en overførsel pipette.
  4. Sætte det samme antal embryoner i hver tank (f.eks 60 embryoner/3 L mellemlang tank i første omgang) til at sikre tæthed-matchede kontrol.
  5. Start paramecia fodring på 4 dage efter befrugtning (dpf).
  6. Inspicere fisken dagligt i juvenil fase. Justere fisk antallet efter behov for at sikre samme fisk tæthed.
  7. Når fisk når 4 ugens i alder, overføre op til 20 fisk i hver ny 3 L mellemlang tank for yderligere vækst. Begynde at fodre fisk med levende skraverede artemia.

2. tilberedning og opbevaring af DOX stamopløsning

Bemærk: DOX kan købes fra forskellige bio-virksomheder. Sammensat er normalt erhvervet som et pulver i mørk brun containere.

  1. DOX pulveret i afioniseret vand for at sikre ingen klumper er synlige, med en endelig koncentration på 5 mg/mL som stamopløsningen grundigt opløses. Alikvot 1 mL af DOX bestand i hver 1,5 mL sikker-lock tube. Wrap 1,5 mL rør med aluminium folie papir til at beskytte DOX fra lys eksponering.
    Bemærk: Udfør dette trin i en kemisk hætte.
  2. Holde DOX stamopløsningen ved 4 ° C for opbevaring. Til langtidsopbevaring (> 4 uger) af DOX stamopløsning, udføre den valgfrie sektion 3 beskrevet nedenfor.

3. kvalitetskontrol af DOX ved hjælp af zebrafisk embryoner (valgfri)

Bemærk: DOX er både fugt - og lysfølsomt, så det kan miste sin medicin effektivitet for modellering DIC efter opbevaring. DOX købt fra forskellige firmaer, eller endda forskellige partier fra samme firma, er det nyttigt at kalibrere sit stof effektivitet ved hjælp af wild-type (WT) zebrafisk embryoner før gennemføre eksperimenter på voksne fisk. Denne metode er afledt af en rapporteret zebrafisk embryonale DIC model21.

  1. Indsamle WT zebrafisk embryoner fra mindst 2 par af fisk. Dechorionate embryoner på 24 timer efter befrugtning (hpf) manuelt ved hjælp af en sprøjte med en mikro nål. Alternativt, behandle embryo med proteinase K i endelig koncentration på 10 µg/mL for 10-15 min i en 30 ° C inkubator. Opdater embryo vand efter dechorionation. Fjerne døde embryoner og vedligeholde mindst 36 embryoner af hvert parti.
  2. Fortynd DOX stamopløsning i friske embryoner vand til en endelig koncentration på 100 µM. Rumfang af opløsning er 100 µL for hver 3 embryoner. Bland den fortyndede DOX løsning af vortex. Den endelige fortyndede løsning bør være en lys, rød farve.
  3. Tilsæt 100 µL/brønd af fortyndede DOX løsning af en ren 96-brønd gennemsigtig plade.
  4. Tag 3 dechorionated embryoner med en plastik overførsel pipette, og opbevare embryoner tæt på slutningen af pipette tip. Sætte pipette spidsen i hver brønd med DOX løsning. Lad ende af spidsen touch løsningen og tillade embryoner til at svømme i brønden.
    Bemærk: Undgå manuelt skubbe embryoner, som vil tilføje mere vand i brønden og fortyndes DOX løsning.
  5. Opdater DOX løsning på 48 hpf. På dette tidspunkt, observere brønde under et mikroskop med 10 X forstørrelse at identificere døde embryoner (ophør af hjerteslag) eller embryoner med ødem. Tælle og fjerne eventuelle døde embryoner i tide, ellers de resterende embryoner udsat for løsning med døde embryoner kan dø hurtigt så godt.
  6. Kontrollere embryoner på 72 hpf og tælle dem. DOX behandling anses "god medicin effektivitet" Hvis > 25% død (ophør af hjerteslag) kan observeres i begge partier af embryoner.

4. før injektion forberedelse

Bemærk: Fisk på 8 uger til 6 måneder, der bruges til DOX injektion. Kroppen vægte (Bettina) af en modnet vilde indiske Karyotype (WIK) fisk skal injiceres kan variere fra 0,2-0,5 g.

  1. Fast fisk i 24 timer før injektion.
  2. Bedøver fisken med Foster vand indeholdende 0.16 mg/mL tricaine. Brug en ren filtrerpapir tørre vandet fra begge sider af kroppen. Måling af BW hver fisk på en skala. Gruppere fisk inden for 10% forskel i BW for senere injektion.
    Bemærk: For at minimere arbejdsbyrden på dette trin, fisk inden for 10% forskel i BW anses den samme størrelse; Derfor forberede en DOX brugsopløsning ifølge deres middelværdi BW.
  3. Planlæg at indsprøjtes hver voksne fisk med 5 µL af løsning. Beregne DOX arbejder koncentration efter fisk numre og BWs.
    Bemærk: For at studere kronisk cardiotoxicity op til 6 måneder, bruge DOX i en dosis på 20 mg/kg. For at studere akut cardiotoxicity af DOX, kan DOX dosis øges op til 50 mg/kg BW.
  4. Fortynd DOX bestanden i 1 x Hanks afbalanceret saltopløsning (HBSS) for tilsvarende arbejde koncentrationer. Vortex at blande opløsningen. Kort spin ned til at indsamle løsningen.

5. DOX injektion i voksne fisk

  1. Sted en ren 100 mm petriskål med en svamp inde i det, under et mikroskop for dissektion, derefter justere fokus. Skære svamp for at gøre et hulrum på ca 4 cm i længden at holde en fisk. Gøre en længere hulrum til en større fisk.
  2. Forberede en 34 G nål med en 10 µL mikro-sprøjte. Skyl nålen med 1 x HBSS buffer til at fjerne eventuelle bobler og blokke fra sprøjten og slanger.
  3. Bedøver den voksne fisk i embryo vand indeholdende 0.16 mg/mL tricaine for 2 min.
    Bemærk: Langvarig anesthetization over 5 min. efterfulgt af DOX injektion kan let forårsage fisk død.
  4. Blød svamp i embryo vand med tricaine, og overføre fisk på svamp til injektion.
  5. Udføre IP DOX injektion af enten af de to metoder beskrevet nedenfor.
    1. Klassisk IP injektion29
      1. Placer fisk med underlivet op i hulrummet af svamp. Hurtigt indsætte nålen med en 45° vinkel til selve fisk i midterlinjen mellem bugfinnerne, og trænge igennem ca 1-2 mm. frigive alle DOX løsning langsomt. Vent 5 s inden du trækker ud af nålen. Kontrollere DOX levering af en synlig rød farve i fisk bugen.
    2. Alternative IP injektion
      1. Læg fisken lateralt på svamp med den forreste til højre. Forsigtigt stabilisere fisk med en stump ende pincet med venstre hånd, og hold mikro-sprøjten med højre hånd.
      2. Placer nålen under sidelinjen over bugfinnen, med facet opad. Peger på 7 klokken med en 45° vinkel, indsætte nålen 3-4 mm til fisk hulrum beliggende mellem den bækken og anal finnerne, og derefter langsomt trykkes stemplet. Kontrollere DOX levering af en synlig rød farve i fisk bugen.
  6. Hurtigt overføre den injicerede fisk til en ren passage tank fyldt med frisk system vand til at tillade fisken hen til genoprette. Skyl nål engang med 1 x HBSS buffer mellem injektioner.

6. efter injektion fisk Management

  1. Efter injektion, returnere fisk system med løbende omsætning. Hvis det er muligt, opretholde DOX-behandlet fisk adskilt fra de vigtigste system til at undgå krydskontaminering mellem forskellige tanke, der deler omsætning.
  2. Hurtigt injiceres fisk for en anden 24 h til recovery. Observere fisk dagligt under den første uge. Fjerne den døde fisk i tide til at undgå smitte til andre fisk.
    Bemærk: Fisk døde indenfor de første 24 timer er sandsynligvis på grund af fysiske læsioner forårsaget af injektion.
  3. Yderligere fastholde den DOX-understregede fisk for langsgående observationer. Fjerne døde fisk i tide til at undgå infektioner til andre fisk i akvariet.
    Bemærk: Fisk numre er dokumenteret for at generere en overlevelse kurven.
  4. Bruge forskellige eksperimentelle assays til fænotype DOX-understregede fisk, som ekkokardiografi30, hjertefunktion reporter transgene linje23, svømning udfordring26og kvantificering af andre patologiske remodeling markører23.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Her, præsenteres to metoder til at udføre IP injektion til model DIC i voksen zebrafisk. Mens du bruger den klassiske, etablerede IP injektion metode29, blev det bemærket, at den injicerede DOX løsning (rød farve) undertiden kunne sive ud fra den placering, hvor nålen gennemtrænges. Den alternative IP injektion bruger en anden placering for nål penetration, der er 3-4 mm fra bughinden hvor DOX er frigivet (figur 1A), der effektivt forhindrer lækage (figur 1B, 1 C). Vellykket levering af DOX i bughinden for begge metoder fremgår af hurtig distribution af den røde farve i hele fisk bugen, som er synlig på den modsatte side af injektion locus.

Injektion af DOX doseret på 50 mg/kg ved hjælp af den alternative IP metode fører til alvorlig toksicitet, hvor størstedelen af fisk dør inden for en uge (figur 2). Derimod doseret injektion af DOX på 20 mg/kg ved hjælp af de alternative IP metode forårsager næsten ingen fisk død i løbet af de første 2 uger og ~ 10% fisk død på 4 wpi (figur 3A). Injektion af DOX doseret på 20 mg/kg ved hjælp af metoden klassisk IP udstiller ~ 30% fisk død på 4 wpi (figur 3 c). Fisk injiceres med enten metoden udviser en lignende ~ 20% fisk døden fra 4 wpi til 10 wpi (figur 3B, D).

Vi har gearede casper; TG(cmlc2:nusDsRed) fisk at vurdere progression af cardiac dysfunktion i DIC model (figur 4A)23. Den gennemsigtige krop gør det muligt for dokumentation af et rødt hjerte på både systolisk (figur 4B) og diastolisk (figur 4 c) stadier under et mikroskop for fluorescerende. Efter injektion af 20 mg/kg DOX ved hjælp af den alternative IP metode, kan ventrikel funktion tilbagegang påvises startende fra 4 wpi (figur 4D).

Figure 1
Figur 1: injektion ruter. (1A) skemaer af den klassiske IP injektion (b) og alternative IP injektion (a) metoder. Den røde cirkel angiver den fælles DOX frigive site for to injektion metoderne. Grønne cirkler angive nål penetration sites. Afstandene er anslået ud fra en voksen WIK fisk vejer ca 0.3 g. (1B, 1 C) repræsentative resultater med angivelse af en vellykket DOX levering ved hjælp af to intraperitoneal injektion metoder. Rødme inde voksne fisk bugen kan bemærkes umiddelbart efter injektion. Injiceres fisk blev tjekket igen efter 5 min recovery i en frisk system vand. HBSS: 1 x Hank afbalanceret saltopløsning. WT WIK zebrafisk var ansat. Skalalinjen: 5 mm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: repræsentative overlevelse kurver af voksen zebrafisk efter DOX stress med 50 mg/kg DOX injektion. Vist er 3 sæt af DOX injektioner i forskellige partier af WT voksne fisk på 3-6 måneder. I alt, n = 24 fisk var ansat i 1 x HBSS kontrolgruppe, og n = 8 fisk var ansat i hver batch injiceres med DOX. Ingen forskel i fisk overlevelse blev konstateret mellem to injektion metoderne. WT WIK zebrafisk var ansat. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: repræsentant overlevelse kurver af voksen zebrafisk efter DOX stress med 20 mg/kg DOX injektion og sammenligningen mellem to intraperitoneal injektion metoder. (3A) fisk overlevelse inden for 0-4 uger efter DOX levering af klassiske intraperitoneal injektion. Procent fisk nummer i uge 0 blev betragtet som 100%. (3B) fisk overlevelse efter 4 uger post DOX levering af klassiske intraperitoneal injektion. Procent fisk nummer i uge 4 blev betragtet som 100%. (3 C) fisk overlevelse inden for 0-4 uger efter DOX levering af alternative intraperitoneal injektion. Procent fisk nummer i uge 0 blev betragtet som 100%. (3D) fisk overlevelse efter 4 uger efter DOX levering af alternative intraperitoneal injektion. Procent fisk nummer i uge 4 blev betragtet som 100%. Data, der vises i (3A) og (3B) er 9 forskellige batches af DOX injektion fra en total 223 injiceres fisk på 3-6 måneder. Data, der vises i (3 C) og (3D) er 14 forskellige batches af DOX injektion fra en total 335 injiceres fisk på 2-6 måneder. Antallet af levende fisk registreres ugentligt. Fejllinjer udgør standard afvigelse i procent for overlevelse blandt forskellige partier på hver uge. WT WIK zebrafisk var ansat. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Repræsentative hjertefunktion vurdering efter DOX stress ved hjælp af casper; TG(cmlc2:nusDsRed) fisk. (4A) et fotografi af en voksen casper; TG(cmlc2:nusDsRed) fisk. Skalalinjen = 1 cm. (4B) repræsentativt billede af en rød ventrikel ved systolisk slutstadiet af en modnet casper; TG(cmlc2:nusDsRed) fisk. -Streg-linje repræsenterer slutningen systolisk diameter (ESD). (4 C) repræsentative billede af en rød ventrikel på den diastoliske slutstadiet af en modnet casper; TG(cmlc2:nusDsRed) fisk. Billeder i (4B) og (4 C) blev udvundet fra film af et bankende hjerte fanget med et fluorescerende dissektion mikroskop ved hjælp af 6,3 x forstørrelse. -Streg-linje repræsenterer slutningen diastolisk diameter (EDD). Skalalinjen = 1 mm. (4 D) repræsentative hjertets funktion måles ved hjælp af casper; TG(cmlc2:nuDsRed) voksen zebrafisk efter 20 mg/kg DOX injektion. EDD og ESD blev målt som vist i (4B) og (4 C) for enkeltfisk, og ventrikulær brøkdel afkortning beregnes ved formlen (EDD − ESD) / EDD. Betydeligt blev nedsat ventrikulær brøkdel afkortning opdaget på 4 uger og derefter. Den alternative intraperitoneal metode blev anvendt. Værdier er vist som gennemsnit ± standardafvigelse. n ≥ 3 i hver gruppe. Student t -test blev anvendt til sammenligning af to grupper. p < 0,05. Disse tal er blevet ændret fra Ding et al. 23 Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

For at modellere en progressiv DIC, var dosis på 20 mg/kg DOX bestemmes eksperimentelt som den højeste dosis, der ikke medfører væsentlige fisk død under 1 wpi men stadig resulterer i fisk død og reduktion af hjertets funktion efter 4 wpi (figur 3 og Figur 4 c). Denne dosis kan sammenlignes til dem, der ofte anvendes i gnavere DIC modeller (15-25 mg/kg) og den grænse kumulative dosis hos mennesker (550 mg/m2, hvilket svarer til 15 mg/kg)4,7,31,32 , 33. højere doser af DOX, såsom 50 mg/kg, vise betydelige fisk død under 1 wpi, så de kan bruges til at studere kun akut hjerte giftige svar til DOX23,28.

Under gennemførelsen af denne DIC model bemærkede vi, at det var vanskeligt for nye efterforskerne at reproducere de samme resultater i første omgang. Selv for erfarne efterforskere, om en 20% kan variation af dødelighed i den kroniske fase stadig findes blandt forskellige injektioner (figur 3), der angiver uncharacterized biologiske konfunderende faktorer i den aktuelle model. Trods en mindre end perfekt model, mener vi stadig, at denne aktuelle DIC model er tilstrækkeligt til at gøre lyden opdagelse på grund af følgende dokumentation. Først efter flere praksis, kan resultaterne fra modellen DIC senere registreres blandt de fleste, hvis ikke alle, efterforskere. Andet, baseret på denne model, DIC, vi identificeret 4 meningsfuld genetisk modificering. Eksisterende beviser fra litteratur rapporter understøttes 3 af dem som kardiomyopati gener34,35,36,37. 4th en er DnaJ homolog underfamilie B medlem 6 (DNAJB6), som har vist sig for at være en ny kardiomyopati gen understøttes af et menneskets genetiske undersøgelse28. Dermed, vi konkludere, at resultater baseret på intra eksperimentelle grupper ved hjælp af nøje alder-matchede kontrol er stadig meget repeterbare, omend DIC model i sin nuværende form ikke er pålidelige for Inter eksperimentelle sammenligning.

De forstyrrende faktorer, der bidrager til den uoverensstemmelse, der er observeret i vores nuværende DIC model sandsynligvis omfatter følgende: (1) aldring og køn-forskellen er blevet betragtet som afgørende risikofaktorer for hjerte-kar-sygdomme herunder DIC38, 39,40. Mens begge hypotetisk medstifterne fortsat skal testes i vores model specifikt, lagde vi mærke til at alderen fisk har tendens til at være mere følsomme over for DOX toksicitet (data ikke vist). Inter batch variationer observeret både IP metoder (figur 3) er sandsynligvis også har bidraget til disse to medstifterne. (2) forskellige fra større dyremodeller, størrelsen af en voksen zebrafisk er lille. Således er kan lokale skader forårsaget af DOX injektion være mere alvorlige og variabel. (3) injiceres fisk død kan følge af DOX toksicitet i andre organer (f.eks., nyretoksicitet), ud over hjertet. Mens mere omhyggeligt designede eksperimenter er nødvendige for at løse hver af de førnævnte konfunderende faktorer, tidligere arbejde tyder på, at den følgende advarsler vil medvirke til at reducere fænotypiske variationer: for det første er afgørende for at sikre effektiviteten af DOX. DOX pulver bør altid opbevares i et tørt og mørkt område, og løsninger skal håndteres med forsigtighed for at reducere eksponeringen for lys. Det anbefales, at DOX arbejder løsninger være forberedt frisk hver gang før fisk injektion. Vi typisk bruger ikke DOX stamopløsninger efter 4 uger i opbevaring. Når der er tvivl, skal du udføre den valgfrie sektion 3 i denne protokol, ved hjælp af hurtig embryonale DIC model for at kalibrere drug effekten af hver DOX batch. Anden voksne fisk synkronisering er afgørende. Den samme fisk stamme skal være rejst på den samme tæthed, at sikre lignende kropsstørrelse. Vi derefter Vælg på forhånd fisk med lignende BWs til beregning af dosis. Det anbefales at bevare mindst dobbelt så mange fisk i alt til denne foreløbige udvælgelsesproces. Alle fisk er fastet i 24 timer før den foreløbige udvælgelsesproces. For det tredje, anbefales det at altid at bruge fisk af samme alder og køn fisk før DOX injektion på grund af deres forskellige vækstrater og potentielt forskellige kardiale svar til DOX.

Vi har bemærket, at flertallet af inkonsekvent konklusioner kunne tilskrives en tvivlsom kontrolgruppe. Derfor anbefaler vi efterforskere nye DIC model til praksis DOX injektioner før gennemføre egentlige eksperimenter. Når 20 mg/kg DOX injiceres ved hjælp af den alternative IP injektion metode, kan en god injektionsteknik angives med en næsten nul fisk død under den 1 wpi DOX og en forholdsvis ensartet dødelighed på 2-3 måneder post-DOX injektion. Det ultimative bevis for vellykket modellering er reduktion af hjerte-funktionelle indekset, som kunne kvantificeres via ekkokardiografi25,30, ved hjælp af en casper; TG(cmlc2:nusDsRed) transgene linje, eller ved hjælp af et nyudviklet ex vivo-baseret hjertefunktion assay (data ikke vist).

Ud over IP injektion, andre drug delivery ruter som retro-orbital injektion41, anvendes oral fodring42og vand inkubation også ofte i voksen zebrafisk. Vi ikke vedtage retro-orbital injektion tilgang, trods sin direkte stof frigives i omsætning-system på grund af en metode til at validere vellykket medicinafgivelse, som rødme af DOX kan let maskeret af potentielle blødning. Vi prøvede en oral levering protokollen gennem integrering DOX med resorberbare gluten42, som var blandet med måltider til at fodre voksne fisk. Desværre, med op til den akkumulerende dosis på 150 mg/kg anvendes inden for en 4-ugers fodring periode, vi ikke har overholdt en svær cardiotoxicity, tyder på ineffektivitet af oral DOX levering. Alternativt, en mundtlig sonde teknik kunne blive yderligere undersøgt43. Inkubation-protokollen iblødsætning fisk i en oploesning indeholdende DOX er desuden også en potentiel leveringsbetingelser rute, der kunne blive afprøvet i fremtiden.

Vi anerkender, at en af de store begrænsninger i den nuværende DIC model er enkelt bolus injektion metode, som kan medføre høje toksicitet og lokale skader på de indre organer. Denne tilgang blev designet at mindske arbejdsbyrden og til at øge kapaciteten, så der genetisk screening kan foretages på en høj produktivitet i voksne fisk28. I fremtiden, bør modeller med flere injektioner af DOX ved lavere doser forfølges, som bedre vil sammenfatte DIC observeret i patienter behandlet med kemoterapi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet i en del af en videnskabsmand udvikling tilskud fra American Heart Association (14SDG18160021 til YD), amerikanske NIH R01 tilskud HL 81753 og HL 107304 til XX og XX Mayo instituttet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Crossing tank Aquaneering ZHCT100 Fish breeding
Incubator ThermoFisher Maintaining embryo
3 L medium tank Aquaneering ZT280 Maintaining fish
Paramecia Carolina 131560 Food for juvenile fish
Live hatched brine shrimp in house Food for adult fish
Doxorubicin hydrochloride Sigma D1515-10MG
1.5 ml safe-lock tube Eppendorf No. 022363204 For drug storage
Aluminum foil paper Fisher 1213104 For preventing light exposure
Proteinase K Roche No. 03115887001 For dechorionating embryo
Hank's balanced salt solution (HBBS) ThermoFisher 14025076 Vehicle for DOX
100 mm petri dish Falcon 431741
10 μL NanoFil micro-syringe WPI NANOFIL For injection
34 gauge needle WPI NF34BV-2 For injection
Tricaine Argent MS-222 Anesthetizing fish
96 well plate Costar 3539 For embryo drug treatment
Transfer pipette Bel-art product F37898 For transfering embryo

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Octavia, Y., et al. Doxorubicin-induced cardiomyopathy: from molecular mechanisms to therapeutic strategies. J Mol Cell Cardiol. 52 (6), 1213-1225 (2012).
  2. Singal, P. K., Iliskovic, N. Doxorubicin-induced cardiomyopathy. N Engl J Med. 339 (13), 900-905 (1998).
  3. Angsutararux, P., Luanpitpong, S., Issaragrisil, S. Chemotherapy-Induced Cardiotoxicity: Overview of the Roles of Oxidative Stress. Oxid Med Cell Longev. , 795602 (2015).
  4. Ichikawa, Y., et al. Cardiotoxicity of doxorubicin is mediated through mitochondrial iron accumulation. J Clin Invest. 124 (2), 617-630 (2014).
  5. Zhang, Y. W., Shi, J., Li, Y. J., Wei, L. Cardiomyocyte death in doxorubicin-induced cardiotoxicity. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 57 (6), 435-445 (2009).
  6. Sawyer, D. B. Anthracyclines and heart failure. N Engl J Med. 368 (12), 1154-1156 (2013).
  7. Zhang, S., et al. Identification of the molecular basis of doxorubicin-induced cardiotoxicity. Nat Med. 18 (11), 1639-1642 (2012).
  8. Dodd, D. A., et al. Doxorubicin cardiomyopathy is associated with a decrease in calcium release channel of the sarcoplasmic reticulum in a chronic rabbit model. J Clin Invest. 91 (4), 1697-1705 (1993).
  9. Mitry, M. A., Edwards, J. G. Doxorubicin induced heart failure: Phenotype and molecular mechanisms. Int J Cardiol Heart Vasc. 10, 17-24 (2016).
  10. Aminkeng, F., et al. A coding variant in RARG confers susceptibility to anthracycline-induced cardiotoxicity in childhood cancer. Nat Genet. 47 (9), 1079-1084 (2015).
  11. Deng, S., et al. Dystrophin-deficiency increases the susceptibility to doxorubicin-induced cardiotoxicity. Eur J Heart Fail. 9 (10), 986-994 (2007).
  12. Leong, S. L., Chaiyakunapruk, N., Lee, S. W. Candidate Gene Association Studies of Anthracycline-induced Cardiotoxicity: A Systematic Review and Meta-analysis. Sci Rep. 7 (1), 39 (2017).
  13. Wasielewski, M., et al. Potential genetic predisposition for anthracycline-associated cardiomyopathy in families with dilated cardiomyopathy. Open Heart. 1 (1), e000116 (2014).
  14. Lebrecht, D., et al. Dexrazoxane prevents doxorubicin-induced long-term cardiotoxicity and protects myocardial mitochondria from genetic and functional lesions in rats. Br J Pharmacol. 151 (6), 771-778 (2007).
  15. QuanJun, Y., et al. Protective Effects of Dexrazoxane against Doxorubicin-Induced Cardiotoxicity: A Metabolomic Study. PLoS One. 12 (1), e0169567 (2017).
  16. Seifert, C. F., Nesser, M. E., Thompson, D. F. Dexrazoxane in the prevention of doxorubicin-induced cardiotoxicity. Ann Pharmacother. 28 (9), 1063-1072 (1994).
  17. Adams, J. W., et al. Enhanced Galphaq signaling: a common pathway mediates cardiac hypertrophy and apoptotic heart failure. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (17), 10140-10145 (1998).
  18. Bowles, N. E., Bowles, K. R., Towbin, J. A. The "final common pathway" hypothesis and inherited cardiovascular disease. The role of cytoskeletal proteins in dilated cardiomyopathy. Herz. 25 (3), 168-175 (2000).
  19. Kroumpouzou, E., et al. Common pathways for primary hypertrophic and dilated cardiomyopathy. Hybrid Hybridomics. 22 (1), 41-45 (2003).
  20. Towbin, J. A., Bowles, K. R., Bowles, N. E. Etiologies of cardiomyopathy and heart failure. Nat Med. 5 (3), 266-267 (1999).
  21. Liu, Y., et al. Visnagin protects against doxorubicin-induced cardiomyopathy through modulation of mitochondrial malate dehydrogenase. Sci Transl Med. 6 (266), 266ra170 (2014).
  22. Asimaki, A., et al. Identification of a new modulator of the intercalated disc in a zebrafish model of arrhythmogenic cardiomyopathy. Sci Transl Med. 6 (240), 240ra274 (2014).
  23. Ding, Y., et al. Haploinsufficiency of target of rapamycin attenuates cardiomyopathies in adult zebrafish. Circ Res. 109 (6), 658-669 (2011).
  24. Sun, X., et al. Cardiac hypertrophy involves both myocyte hypertrophy and hyperplasia in anemic zebrafish. PLoS One. 4 (8), e6596 (2009).
  25. Sun, Y., et al. Activation of the Nkx2.5-Calr-p53 signaling pathway by hyperglycemia induces cardiac remodeling and dysfunction in adult zebrafish. Dis Model Mech. 10 (10), 1217-1227 (2017).
  26. Yang, J., Shah, S., Olson, T. M., Xu, X. Modeling GATAD1-Associated Dilated Cardiomyopathy in Adult Zebrafish. J Cardiovasc Dev Dis. 3 (1), (2016).
  27. Ding, Y., et al. Trapping cardiac recessive mutants via expression-based insertional mutagenesis screening. Circ Res. 112 (4), 606-617 (2013).
  28. Ding, Y., et al. A modifier screen identifies DNAJB6 as a cardiomyopathy susceptibility gene. JCI Insight. 2 (8), (2017).
  29. Kinkel, M. D., Eames, S. C., Philipson, L. H., Prince, V. E. Intraperitoneal injection into adult zebrafish. J Vis Exp. (42), (2010).
  30. Wang, L. W., et al. Standardized echocardiographic assessment of cardiac function in normal adult zebrafish and heart disease models. Dis Model Mech. 10 (1), 63-76 (2017).
  31. Desai, V. G., et al. Development of doxorubicin-induced chronic cardiotoxicity in the B6C3F1 mouse model. Toxicol Appl Pharmacol. 266 (1), 109-121 (2013).
  32. Zhu, W., Shou, W., Payne, R. M., Caldwell, R., Field, L. J. A mouse model for juvenile doxorubicin-induced cardiac dysfunction. Pediatr Res. 64 (5), 488-494 (2008).
  33. Chatterjee, K., Zhang, J., Honbo, N., Karliner, J. S. Doxorubicin cardiomyopathy. Cardiology. 115 (2), 155-162 (2010).
  34. Bang, C., et al. Cardiac fibroblast-derived microRNA passenger strand-enriched exosomes mediate cardiomyocyte hypertrophy. J Clin Invest. 124 (5), 2136-2146 (2014).
  35. Rassaf, T., Kelm, M. Protection from diabetic cardiomyopathy - putative role of the retinoid receptor-mediated signaling. J Mol Cell Cardiol. 59, 179-180 (2013).
  36. Wahbi, K., et al. Dilated cardiomyopathy in patients with mutations in anoctamin 5. Int J Cardiol. 168 (1), 76-79 (2013).
  37. Zhou, M. D., Sucov, H. M., Evans, R. M., Chien, K. R. Retinoid-dependent pathways suppress myocardial cell hypertrophy. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (16), 7391-7395 (1995).
  38. Hershman, D. L., et al. Doxorubicin, cardiac risk factors, and cardiac toxicity in elderly patients with diffuse B-cell non-Hodgkin's lymphoma. J Clin Oncol. 26 (19), 3159-3165 (2008).
  39. Silber, J. H., Barber, G. Doxorubicin-induced cardiotoxicity. N Engl J Med. 333 (20), 1359-1360 (1995).
  40. Von Hoff, D. D., et al. Risk factors for doxorubicin-induced congestive heart failure. Ann Intern Med. 91 (5), 710-717 (1979).
  41. Pugach, E. K., Li, P., White, R., Zon, L. Retro-orbital injection in adult zebrafish. J Vis Exp. (34), (2009).
  42. Zang, L., Morikane, D., Shimada, Y., Tanaka, T., Nishimura, N. A novel protocol for the oral administration of test chemicals to adult zebrafish. Zebrafish. 8 (4), 203-210 (2011).
  43. Collymore, C., Rasmussen, S., Tolwani, R. J. Gavaging adult zebrafish. J Vis Exp. (78), (2013).

Tags

Medicin sag 136 Doxorubicin kardiomyopati akutte fase kronisk fase zebrafisk intraperitoneal injektion sygdom model
En Doxorubicin-induceret kardiomyopati Model i voksen zebrafisk
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ma, X., Ding, Y., Wang, Y., Xu, X. A … More

Ma, X., Ding, Y., Wang, Y., Xu, X. A Doxorubicin-induced Cardiomyopathy Model in Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (136), e57567, doi:10.3791/57567 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter