Summary
Een methode voor het genereren van een Doxorubicine-geïnduceerde cardiomyopathie model in volwassen zebravissen (Danio rerio) wordt hier beschreven. Twee alternatieve manieren van intraperitoneale injectie worden gepresenteerd en voorwaarden om de variaties tussen verschillende experimentele groepen worden besproken.
Abstract
De genetisch toegankelijk volwassen zebravissen (Danio rerio) is steeds meer gebruikt als een gewervelde model voor het begrip van ziekten bij de mens zoals cardiomyopathie. Vanwege haar gemak en inschikkelijkheid tot hoge doorvoer genetische manipulaties, opent de generatie van verworven cardiomyopathie modellen, zoals de Doxorubicine-geïnduceerde cardiomyopathie (DIC) model in volwassen zebrafish, de deuren naar nieuwe onderzoek wegen, met inbegrip van cardiomyopathie modifiers via voorwaartse genetische screening te ontdekken. Anders dan de embryonale zebrafish DIC model, zowel initiële acute en later chronische fasen van cardiomyopathie kunnen worden bepaald in het volwassen zebrafish DIC model, waardoor de studie van fase-afhankelijke signalering mechanismen en therapeutische strategieën. Echter kunnen variabele resultaten worden verkregen met het huidige model, zelfs in de handen van ervaren onderzoekers. Om te vergemakkelijken de toekomstige uitvoering van de DIC-model, presenteren we een gedetailleerd protocol over het genereren van dit model DIC in volwassen zebravis en beschrijven van twee alternatieve manieren van intraperitoneale injectie van (IP). Verder bespreken we opties over hoe te verminderen variaties voor het verkrijgen van betrouwbare resultaten en verstrekken suggesties aangaande hoe te op de juiste manier interpreteren van de resultaten.
Introduction
Doxorubicine (DOX), ook genoemd adriamycine, is ontwikkeld als een anti-neoplastische drug sinds de jaren 19601,2. Het is nu nog steeds actief als een belangrijke chemotherapeutische drug gebruikt voor een breed spectrum van tumoren. Echter, klinische toepassing van DOX werd gehinderd door de dosis-afhankelijke toxicities, met name cardiotoxicity gekenmerkt door variabele symptomen variërend van asymptomatische electrocardiographic wijzigingen tot pericarditis en gedecompenseerde cardiomyopathie 1 , 2. tot op heden, ten minste drie belangrijke hypothesen naar voren zijn gebracht om uit te leggen DIC, met inbegrip van geactiveerde reactieve zuurstof soorten (ROS)1,3,4,5, remming van topoisomerase II-β () 76,TOP2β), en modulatie van intracellulair calcium vrij1,8,9. Vergaren van bewijs suggereert ook genetische aanleg als een belangrijke risicofactor voor DIC10,11,12,13. Gene identiteiten aan deze predisposities DIC gerelateerde blijven echter grotendeels onbekend. Dexrazoxane is de enige adjuvans agent goedgekeurd door de Amerikaanse Food and Drug Administration (FDA) voor de behandeling van DIC, maar met beperkte uitvoering14,15,16, onderstrepen de noodzaak om te identificeren extra therapeutische strategieën. Dierlijke modellen voor DIC worden daarom onderzocht voor deze doeleinden. Als gevolg van hun toegankelijkheid en eenvoud, mechanistische studies over DIC modellen kon potentieel hebben bredere effecten op andere soorten hartziekten: gemeenschappelijke pathogenese kan worden gedeeld onder hartziekten van andere etiologie, vooral bij later pathologische stadia17,18,19,20.
Naast knaagdier modellen van DIC, zijn zebravis DIC modellen met hogere doorvoer ontwikkeld om de ontdekking van zowel nieuwe genetische factoren en therapeutics. Een embryonale DIC-model is opgezet in de transparante zebrafish embryo's om therapeutische stoffen21te screenen. Gezien het feit dat de hartziekten volwassen begin ziekten met een progressieve pathogenese zijn, ontwikkeld volwassen zebrafish cardiomyopathie modellen geweest22,23,24,25,26. We genereerden de eerste verworven model voor cardiomyopathie ten gevolge van chronische anemie24, gevolgd door DIC als het tweede model van de verworven cardiomyopathie in volwassen zebrafish23. We vonden dat de injectie van een enkele bolus van DOX in volwassen zebrafish cardiotoxicity die uit een acute fase ongeveer binnen 1 week na injectie (wpi) induceert bestaat, gevolgd door een chronische fase van cardiomyopathie omhoog tot 6 maanden na injectie. Terwijl de haploinsufficiency van het mechanistische streefcijfer van rapamycin(mtor) cardiomyopathie uitzitten in de chronische fase, overdrijft het vis mortaliteit in de acute fase, onderstrepen de waarde van de volwassen DIC-model te onderscheiden van fase-afhankelijke mechanismen23. We verder aangetoond dat de volwassen DIC-model kan worden gebruikt voor het benadrukken van een verzameling van zebravis dat cardiale (ZIC) mutanten die worden gegenereerd via een dat mutagenese transposon gebaseerde aanpak27. Een pilot scherm geïdentificeerd 3 bekende cardiomyopathie genen evenals DnaJ (Hsp40) homolog, onderfamilie B, en lid 6b (dnajb6b) als nieuwe DIC gevoeligheid genen28. Dus, de generatie van de volwassen DIC model in zebrafish leidde tot een nieuwe methodiek waarmee systematisch identificatie van genetische modifiers voor DIC, als aanvulling op de bestaande vereniging van genoom-brede studie (GWAS) en kwantitatieve trait locus (QTL ) analyse.
Tijdens de generatie en de uitvoering van de volwassen zebrafish DIC model, hebben we gemerkt aanzienlijke verschillen tussen verschillende onderzoekers en/of zelfs onder verschillende injecties uitgevoerd door de dezelfde onderzoeker. De longitudinale aard van het model legt uitdagingen om te registreren van de resultaten van verschillende onderzoekers en het sequentiële probleemoplossing proces. Ter vergemakkelijking van het gebruik van deze eenvoudige cardiomyopathie-inducerende stress methode door de onderzoekgemeenschap, we ons protocol in detail, deze twee soorten IP-injectie, beschrijven en bespreken van overwegingen ter vermindering van de variaties tussen verschillende onderzoekers.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures die hier beschreven werden uitgevoerd volgens de richtsnoeren voor de zorg en het gebruik van proefdieren (National Academies Press. 2011), en ze door de Mayo kliniek institutionele Animal Care en gebruik Comité zijn goedgekeurd.
1. de volwassen Zebrafish voorbereiding
- Instellen voldoende fokken paren in de kruising van de tanks te verwerven ten minste twee keer zoveel als de totale vis voor DOX injectie nodig. Als het vergelijken van vis met verschillende genetische achtergronden, ras alle vis binnen dezelfde week om leeftijd-matched controles.
- Verzamelen van de embryo's van vis-de volgende ochtend, overbrengen naar 100 mm petrischalen, en bewaar deze op een 28,5 ° C incubator. Houden van embryo's bij een lage dichtheid (< 100 embryo's / petrischaal).
- Vernieuw het embryo water dagelijks te vermijden seks onbalans, en handmatig verwijderen dode eieren in een tijdig met behulp van een precisiepipet overdracht.
- Hetzelfde aantal embryo's zetten in elke tank (bijvoorbeeld 60 embryo's / 3 L medium tank in eerste instantie) om de dichtheid-matched controles.
- Start paramecia voeding op 4 dagen na bevruchting (dpf).
- Controleer de vissen dagelijks in de juveniele fase. Aanpassen van het nummer van de vis zoals die nodig zijn om soortgelijke vis dichtheid.
- Wanneer vis 4 weken oud bereiken, overdracht van maximaal 20 vis in elke nieuwe 3 L medium tank voor verdere groei. Begin met het voeden van de vissen met levende gearceerde Artemia.
2. voorbereiding en opslag van de stockoplossing DOX
Opmerking: DOX kan worden gekocht bij diverse bio-bedrijven. De stof wordt meestal verworven als een poeder in donker bruin containers.
- Grondig los het poeder DOX in-geïoniseerd water om ervoor te zorgen dat geen klontjes zijn zichtbaar, met een eindconcentratie van 5 mg/mL als de stockoplossing. Aliquot 1 mL DOX voorraad in elke buis 1,5 mL safe-lock. Wikkel de 1,5 mL buisjes met aluminiumfolie papier de DOX beschermen tegen blootstelling aan licht.
Opmerking: Deze stap uitvoeren in een chemische kap. - Houd de stockoplossing van DOX bij 4 ° C voor opslag. Voor langdurige opslag (> 4 weken) van DOX stockoplossing, het uitvoeren van de optionele sectie 3 hieronder beschreven.
3. kwaliteitscontrole van DOX gebruik van zebravis embryo's (optioneel)
Opmerking: DOX is zowel vocht - en lichtgevoelige, zodat het de werkzaamheid van de drug voor het modelleren van DIC na uitgebreide opslag kunt verliezen. Voor DOX gekocht bij verschillende bedrijven, of zelfs verschillende partijen van hetzelfde bedrijf, is het nuttig om te kalibreren van de werkzaamheid van de drug gebruik van wild-type (WT) zebrafish embryo's voor het uitvoeren van de experimenten op volwassen vis. Deze methode is afgeleid van een gerapporteerde zebravissen embryonale DIC model21.
- WT zebrafish embryo's van ten minste 2 paren van de vissen verzamelen. Dechorionate embryo's op 24u na bevruchting (hpf) handmatig met behulp van een injectiespuit met een naald micro. U kunt ook behandelen het embryo met proteïnase K op eindconcentratie van 10 µg/mL gedurende 10-15 min. in een 30 ° C incubator. Vernieuw het embryo water na dechorionation. Verwijder dode embryo's en handhaven van ten minste 36 embryo's van iedere partij.
- Verdun de stockoplossing van DOX in verse embryo water met een eindconcentratie van 100 µM. Het volume van de oplossing is 100 µL voor elke 3 embryo's. Meng de verdunde oplossing DOX van de vortex. De uiteindelijke verdunde oplossing moet een licht rode kleur.
- Voeg 100 µL per putje van verdunde DOX oplossing van een transparante schoon 96-wells-plaat.
- Neem 3 dechorionated embryo's met een kunststof transfer pipette, en houden van de embryo's dicht bij het einde van het uiteinde van de pipet. Het uiteinde van de pipet in elk putje met DOX oplossing gebracht. Laat het einde van de tip aanraken van de oplossing en laat de embryo's om te zwemmen in de put.
Opmerking: Vermijd manueel het duwen van de embryo's, die zal toevoegen van meer water in het putje en Verdun de DOX oplossing. - Vernieuw de oplossing DOX bij 48 hpf. Tegen die tijd observeren de putten onder een microscoop met 10 X vergroting te identificeren van dode embryo's (stopzetting voor heartbeat) of embryo's met oedeem. Tellen en verwijder eventuele dode embryo's in een tijdig, anders de resterende embryo's blootgesteld aan de oplossing met dode embryo's snel kunnen sterven ook.
- Controleren van de embryo's op 72 hpf en ze tellen. De DOX behandeling wordt beschouwd als "goede drug werkzaamheid" als > 25% dood (stopzetting voor heartbeat) kan worden waargenomen in beide partijen embryo's.
4. pre injectie voorbereiding
Opmerking: Vis van 8 weken tot 6 maanden van leeftijd wordt gebruikt voor DOX injectie. Het lichaam gewichten (BWs) van een gerijpte vis van de wilde Indische Karyotype (WIK) te worden geïnjecteerd kunnen variëren van 0,2-0,5 g.
- Snel de vis voor 24 h vóór injectie.
- Anesthetize de vis met embryo water bevattende 0.16 mg/mL tricaïne. Gebruik een schone filtreerpapier te drogen van het water aan beide zijden van het lichaam. Meten van het BW van elke vis op een schaal. Groeperen vis binnen 10% verschil in BW voor latere injectie.
Opmerking: Om te minimaliseren van de werklast bij deze stap, vis binnen 10% verschil in BW worden beschouwd als dezelfde grootte; Daarom bereiden een DOX werkoplossing volgens hun gemiddelde BW. - Wilt u elke volwassen vis injecteren met 5 µL van oplossing. Bereken de concentratie DOX werken volgens de cijfers van de vis en BWs.
Opmerking: Gebruik DOX om te bestuderen van chronische cardiotoxicity omhoog tot 6 maanden, bij een dosis van 20 mg/kg. Acute cardiotoxicity van DOX studeren, kan de dosis DOX verhoogd worden tot 50 mg/kg voor BW. - Verdun de DOX voorraad in 1 x Henks evenwichtige zoutoplossing (HBSS) voor de bijbehorende concentraties van de werken. Vortex te mengen van de oplossing. Kort spin down voor het verzamelen van de oplossing.
5. DOX injectie in volwassen vis
- Plaats een schoon 100 mm petrischaal met een spons erin, onder een Microscoop dissectie, vervolgens de focus aanpassen. Snijd de spons te maken van een holte van ongeveer 4 cm in lengte te houden van een vis. Het maken van een langere holte voor een grotere vissen.
- Bereiden een 34 G naald met een 10 µL micro-spuit. Spoel de naald met 1 x HBSS buffer verwijderen alle bubbels en blokken uit de injectiespuit en slang.
- Anesthetize de volwassen vis in het water van de embryo met 0.16 mg/mL tricaïne gedurende 2 minuten.
Let op: Langdurige afstomping meer dan 5 min gevolgd door DOX injectie kan gemakkelijk leiden tot vis dood. - Week de spons in water van de embryo's met tricaïne en overbrengen van de vis op de spons voor injectie.
-
IP DOX injectie uit te voeren door een van de twee manieren die hieronder worden beschreven.
- Klassieke IP-injectie29
- Plaats de vis met de buik omhoog in de holte van de spons. Snel voegt de naald, met een 45° hoek aan het lichaam van de vis in de middellijn tussen de pelvic fins en doordringen ongeveer 1-2 mm. laat alle DOX oplossing langzaam. Wacht 5 s voordat trekken uit de naald. Controleer de DOX levering door een zichtbare rode kleur in de buik van de vis.
- Alternatieve IP-injectie
- Plaats de vis lateraal op de spons met de anterior naar rechts. Zachtjes stabiliseren van de vissen die met behulp van een verlostang botte uiteinde met de linkerhand, en houd de micro-spuit met de rechterhand.
- Plaats de naald onder de zijlijn boven de pelvic fin, met de schuine kant naar boven. Wijzend op de 7 uur positie in een hoek van 45°, plaats de naald 3-4 mm tot de holte van de vis gelegen tussen het bekken en de anale vinnen, en vervolgens drukken langzaam de plunjer. Controleer de DOX levering door een zichtbare rode kleur in de buik van de vis.
- Klassieke IP-injectie29
- Snel overbrengen in de ingespoten vis een schone kruising tank gevuld met verse systeem water om de vis te herstellen. Spoel de naald een keer met 1 x HBSS buffer tussen injecties.
6. na injectie vis Management
- Na injectie, retourneren de vis aan het systeem met het runnen van verkeer Indien mogelijk, handhaven DOX-behandelde vis afzonderlijk van het belangrijkste systeem om te voorkomen dat kruisverontreiniging tussen de verschillende tanks die delen van het verkeer.
- Snel de ingespoten vis voor een ander 24u voor herstel. Observeer de vissen dagelijks tijdens de eerste week. Verwijder de dode vissen in een tijdig om te voorkomen dat infectie aan de andere vissen.
Opmerking: Vis dood binnen de eerste 24 uur zijn waarschijnlijk te wijten aan fysieke letsels veroorzaakt door de injectie. - Verder houden de DOX-benadrukt vis voor longitudinale opmerkingen. Verwijder dode vissen in de tijd om te voorkomen dat infecties met andere vissen in de bak.
Opmerking: Vis nummers worden beschreven voor het genereren van een curve overleven. - Gebruik verschillende experimentele testen aan fenotype de vis DOX-benadrukt, zoals echocardiografie30, hartfunctie verslaggever transgene lijn23, zwemmen uitdaging26, en kwantificering van andere pathologische remodelleren markeringen23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hier worden twee methoden voor het uitvoeren van IP-injectie model DIC in volwassen zebrafish gepresenteerd. Tijdens het gebruik van de klassieke, gevestigde IP-injectie methode29, werd opgemerkt dat de ingespoten DOX oplossing (rode kleur) soms sijpelt kan uit vanaf de locatie waar de naald is doorgedrongen. Het alternatieve IP-injectie maakt gebruik van een andere locatie voor naald penetratie, dat is 3-4 mm afstand van het buikvlies waar de DOX wordt vrijgegeven (figuur 1A), effectief waardoor de lekkage (figuur 1B, 1 C). Succesvolle levering van DOX in het buikvlies voor beide methoden is blijkt uit de snelle distributie van de rode kleur in de buik van de vis, die zichtbaar aan de overkant van de injectie locus is.
Injectie van DOX gedoseerd bij 50 mg/kg met behulp van de alternatieve IP-methode leidt tot ernstige toxiciteit, waar de meerderheid van de vissen sterven binnen een week (Figuur 2). Injectie van DOX gedoseerd daarentegen bij 20 mg/kg met behulp van de alternatieve IP-methode oorzaken bijna geen vis dood tijdens de eerste 2 weken en ~ 10% vis dood op 4 wpi (figuur 3A). Injectie van DOX gedoseerd bij 20 mg/kg met de klassieke IP-methode vertoont ~ 30% vis dood op 4 wpi (Figuur 3 c). Vis ingespoten met beide methoden vertonen een vergelijkbare ~ 20% vis dood van 4 wpi aan 10 wpi (figuur 3B, D).
We hebben benut de casper ; TG(cmlc2:nusDsRed) vis te beoordelen van de progressie van cardiale dysfunctie in de DIC model (figuur 4A)23. De absorberende kunt documentatie van een rood hart op zowel de systolische (figuur 4B) als de diastolische (figuur 4C) fasen onder een TL Microscoop. Na injectie van 20 mg/kg DOX alternatieve IP-methode, kan ventriculaire functie daling worden opgespoord vanaf 4 wpi (Figuur 4 d).
Figuur 1: injectie routes. (1A) schema van de klassieke IP-injectie (b) en alternatieve IP-injectie (a) methoden. De rode cirkel geeft aan dat de gemeenschappelijke DOX vrijgeven van de site voor de twee injectie methoden. Groene cirkels geven de naald penetratie sites. De afstanden zijn geschat op basis van een volwassen WIK vis met een gewicht van ongeveer 0.3 g. (1B, 1 C) representatieve resultaten wijzen op een succesvolle DOX levering met behulp van twee intraperitoneale injectie methoden. Roodheid in de buik van de volwassen vis kan direct na de injectie worden genoteerd. Ingespoten vis werden gecontroleerd weer na 5 min herstel in een nieuw systeem water. HBSS: 1 x Henks evenwichtig zoutoplossing. WT WIK zebrafish werkten. Schaal bar: 5 mm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: vertegenwoordiger overleving curven van volwassen zebrafish na DOX stress met 50 mg/kg DOX injectie. Komt te staan, zijn 3 sets van DOX injecties in verschillende batches van WT volwassen vis op 3-6 maanden oud. In totaal, n = 24 vis werkten in de controlegroep met 1 x HBSS, en n = 8 vis in elke batch ingespoten met DOX werkzaam waren. Geen verschil in vis overblijfsels werden geconstateerd tussen de twee injectie methoden. WT WIK zebrafish werkten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: vertegenwoordiger overleving curven van volwassen zebrafish na DOX stress met 20 mg/kg DOX injectie en de vergelijking tussen twee intraperitoneale injectie methoden. (3A) vis overleven binnen 0-4 weken na DOX levering door klassieke intraperitoneale injectie. Procent vissen nummer op week 0 werd beschouwd als 100%. (3B) vis overleving na 4 weken DOX levering door klassieke intraperitoneale injectie boeken. Procent vissen nummer bij week 4 werd beschouwd als 100%. (3 C) vis overleven binnen 0-4 weken na DOX levering door alternatieve intraperitoneale injectie. Procent vissen nummer op week 0 werd beschouwd als 100%. (3D) vissen overleven na 4 weken volgend op DOX levering door alternatieve intraperitoneale injectie. Procent vissen nummer bij week 4 werd beschouwd als 100%. Gegevensset die wordt getoond in (3A) en (3B) zijn 9 verschillende batches instellen van DOX injectie van een totale 223 ingespoten vis op 3-6 maanden oud. Gegevensset die wordt getoond in (3 C) en (3D) zijn 14 verschillende batches instellen van DOX injectie van een totaal 335 ingespoten vis op 2-6 maanden oud. Het aantal levende vis worden wekelijks opgenomen. Foutbalken vertegenwoordigen standaarddeviatie in percentage van overleven onder verschillende batches instellen op elke week. WT WIK zebrafish werkten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: Vertegenwoordiger hartfunctie beoordeling na DOX stress met behulp van casper; TG(cmlc2:nusDsRed) vis. (4A) een foto van een volwassene casper; TG(cmlc2:nusDsRed) vis. Schaal bar = 1 cm. (4B) representatieve afbeelding van een rood ventrikel op de systolische end-toneel voor een gerijpte casper; TG(cmlc2:nusDsRed) vis. Dash lijn vertegenwoordigt uiteinde systolische diameter (ESD). (4 C) vertegenwoordiger beeld van een rode ventrikel in de diastolische end-toneel voor een gerijpte casper; TG(cmlc2:nusDsRed) vis. Afbeeldingen in (4B) en (4 C) werden gehaald uit de films van een kloppend hart gevangen met een fluorescerende dissectie Microscoop met behulp van 6,3 x vergroting. Dash lijn vertegenwoordigt uiteinde diastolische diameter (EDD). Schaal bar = 1 mm. (4 D) vertegenwoordiger hartfunctie gemeten met behulp van casper; TG(cmlc2:nuDsRed) volwassen zebrafish na 20 mg/kg DOX injectie. EDD- en ESD werden gemeten zoals aangegeven in (4B) en (4 C) voor de afzonderlijke vissen, en ventriculaire breuk verkorting is berekend met de formule (EDD-− ESD) / EDD. Aanzienlijk werd verminderde ventriculaire breuk verkorting ontdekt op 4 weken en daarna. De alternatieve intraperitoneaal methode werd gebruikt. Als de gemiddelde ± standaardafwijking worden waarden weergegeven. n ≥ 3 in elke groep. De Student t -test werd gebruikt voor de vergelijking van de twee groepen. p < 0.05. Deze cijfers zijn gewijzigd van Ding et al. 23 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Om het model een progressieve DIC, werd de dosis van 20 mg/kg DOX experimenteel als de hoogste dosis die niet leidt significante vis dood tijdens 1 wpi, maar nog steeds resultaten in vis dood en de vermindering van de cardiale functie na 4 wpi (Figuur 3 en tot vastgesteld Figuur 4C). Deze dosis is vergelijkbaar aan de veelvuldig bij knaagdieren DIC modellen (15-25 mg/kg) en aan de cumulatieve limietdosis bij de mens (550 mg/m2, dat overeen met 15 mg/kg komt)4,7,31,32 , 33. hogere doseringen van DOX, zoals 50 mg/kg, tonen aanzienlijke vis dood tijdens 1 wpi, zodat ze kunnen worden gebruikt om te studeren alleen acute cardiale toxische reacties op DOX23,28.
Tijdens de uitvoering van dit model DIC merkten we dat het moeilijk voor nieuwe onderzoekers was te reproduceren dezelfde resultaten in eerste instantie. Zelfs voor ervaren onderzoekers, over een 20% kan variatie van sterfte in de chronische fase nog steeds worden gevonden onder verschillende injecties (Figuur 3), met vermelding van genfunctieonderzoek biologische storende factoren in het huidige model. Ondanks een minder dan perfecte model, we nog steeds geloven dat dit huidige DIC-model voldoende is om geluid ontdekking vanwege de volgende bewijsstukken overlegt. Eerst, na verschillende praktijken, de resultaten uit de DIC-model kunnen worden later geregistreerd bij de meeste, als niet alle onderzoekers. Ten tweede, op basis van dit model DIC, we 4 zinvolle genetische parameters geïdentificeerd. Bestaande bewijsmateriaal uit literatuur verslagen ondersteund 3 van hen als cardiomyopathie genen34,35,,36,,37. De 4th een is DnaJ homolog onderfamilie B lid 6 (DNAJB6), die heeft bewezen als een nieuw gen dat wordt ondersteund door een menselijke genetische studie28cardiomyopathie. Dus, we concluderen dat de resultaten op basis van intra experimentele groepen met behulp van strikt leeftijd-matched controles nog steeds zeer herhaalbare, zij het DIC model in zijn huidige vorm niet betrouwbaar voor inter experimentele vergelijking is.
De storende factoren die aan de inconsistentie waargenomen in ons huidige DIC model waarschijnlijk bijdragen omvatten het volgende: (1) veroudering en gender-verschil werden beschouwd als belangrijke risicofactoren voor cardiovasculaire aandoeningen waaronder DIC38, 39,40. Hoewel beide hypothetische medestichters blijven om te worden getest in ons model specifiek, merkte we dat leeftijd vis de neiging om meer gevoelig zijn voor DOX toxiciteit (gegevens niet worden weergegeven). De variaties van de Inter batch waargenomen met behulp van beide IP-methoden (Figuur 3) zijn waarschijnlijk ook bijgedragen aan deze twee medestichters. (2) anders van grotere diermodellen, de grootte van een volwassen zebrafish is klein. Zo kunnen de lokale schade veroorzaakt door DOX injectie meer ernstige en variabele zijn. (3) de dood van ingespoten vis zouden kunnen voortvloeien uit DOX toxiciteit in andere organen (bijv., renale toxiciteit), naast het hart. Terwijl meer zorgvuldig ontworpen experimenten nodig zijn voor het adres van elk van de bovengenoemde storende factoren, eerdere werk suggereert dat de volgende waarschuwing zal helpen verminderen van fenotypische variaties: ten eerste, het is essentieel voor het waarborgen van de doeltreffendheid van DOX. DOX poeder moet altijd worden bewaard op een droge en donkere gebied, en oplossingen moeten worden behandeld met zorg te verminderen blootstelling aan licht. Het wordt aanbevolen dat DOX werkoplossingen telkens vóór injectie vis vers worden bereid. We meestal gebruik geen DOX stamoplossingen na 4 weken in opslag. Wanneer er een twijfel bestaat, wordt de optionele sectie 3 in dit protocol met behulp van de snelle embryonale DIC-model om te kalibreren van de werkzaamheid van de drug van elke batch van DOX uitvoeren. Ten tweede, volwassen vis synchronisatie is cruciaal. Dezelfde vis stam moet worden verhoogd bij de dezelfde dichtheid, om soortgelijke lichaamsgrootte. Vervolgens selecteren we vooraf vis met soortgelijke BWs voor berekening van de dosis. Het wordt aanbevolen om ten minste twee keer zo veel vis in totaal voor dit pre-selectie-proces. Alle vis zijn gevast gedurende 24 uur voordat het pre-selectie-proces. Ten derde, het is aanbevolen om altijd met behulp van vis van dezelfde leeftijd en geslacht van de vis vóór DOX injectie vanwege hun verschillende groeicijfers en het potentieel verschillende cardiale reacties op DOX.
We hebben gemerkt dat het merendeel van de inconsistente conclusies konden worden toegeschreven aan een twijfelachtige controlegroep. Daarom raden we onderzoekers nieuwe aan de DIC-model aan praktijk DOX injecties voor echte experimenten uitvoeren. Wanneer 20 mg/kg DOX wordt geïnjecteerd met behulp van de alternatieve IP-injectie methode, kan een goede injectietechniek worden aangegeven door een bijna nul vis dood tijdens de 1 wpi van DOX en een relatief consistente sterftecijfer op 2-3 maanden post-DOX injectie. Het ultieme bewijs voor succesvolle modellering is de vermindering van de cardiale-functionele index, die kan worden gekwantificeerd via echocardiografie25,30, met behulp van een -casper; TG(cmlc2:nusDsRed) transgene lijn, of met behulp van een nieuw ontwikkelde ex vivo-gebaseerd hartfunctie assay (gegevens niet worden weergegeven).
Naast de IP-injectie, andere drugsroutes levering zoals retro-orbitaal injectie41, worden orale voeding42, en water incubatie ook vaak gebruikt in volwassen zebrafish. Wij deden niet de retro-orbitaal injectie aanpak hanteren, ondanks haar directe drug vrijgeven in de circulatiesysteem, vanwege het ontbreken van een methode voor het valideren van succesvolle drug delivery, zoals de roodheid van DOX kan gemakkelijk worden gemaskeerd door de potentiële bloeden. We hebben geprobeerd een mondelinge levering-protocol via DOX insluiten met absorbeerbare gluten42, dat werd vermengd met maaltijden te voeden volwassen vis. Helaas, met tot de cumulatieve dosis van 150 mg/kg gebruikt binnen 4 weken durende voeding, deed niet zien we een ernstige cardiotoxicity, suggereren de ineffectiviteit van mondelinge DOX levering. U kunt ook zou een mondelinge maagsonde techniek verder onderzocht43. Bovendien, het protocol van de incubatie van vis onderdompelen in een oplossing met DOX is ook een potentiële bezorgingsroute die in de toekomst zou kunnen worden getest.
We erkennen dat een van de belangrijkste beperkingen van het huidige DIC-model is de interne bolus injectie methode, die leiden hoge toxiciteit en lokale schade aan de inwendige organen tot kan. Deze aanpak werd ontworpen om te werkbelasting te verminderen en te verhogen doorvoer, zodat genetische screening kan worden uitgevoerd met een hoge doorvoersnelheid in volwassen vis28. In de toekomst moeten modellen met meerdere injecties van DOX bij lagere doses worden nagestreefd, die zal beter recapituleren de DIC waargenomen bij kankerpatiënten die met chemotherapie behandeld.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflicten.
Acknowledgments
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door een wetenschapper ontwikkeling subsidie van de American Heart Association (14SDG18160021 naar YD), de Amerikaanse NIH R01 verleent HL 81753 en HL 107304 XX, en de Stichting van de Mayo aan XX.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Crossing tank | Aquaneering | ZHCT100 | Fish breeding |
| Incubator | ThermoFisher | Maintaining embryo | |
| 3 L medium tank | Aquaneering | ZT280 | Maintaining fish |
| Paramecia | Carolina | 131560 | Food for juvenile fish |
| Live hatched brine shrimp | in house | Food for adult fish | |
| Doxorubicin hydrochloride | Sigma | D1515-10MG | |
| 1.5 ml safe-lock tube | Eppendorf | No. 022363204 | For drug storage |
| Aluminum foil paper | Fisher | 1213104 | For preventing light exposure |
| Proteinase K | Roche | No. 03115887001 | For dechorionating embryo |
| Hank's balanced salt solution (HBBS) | ThermoFisher | 14025076 | Vehicle for DOX |
| 100 mm petri dish | Falcon | 431741 | |
| 10 μL NanoFil micro-syringe | WPI | NANOFIL | For injection |
| 34 gauge needle | WPI | NF34BV-2 | For injection |
| Tricaine | Argent | MS-222 | Anesthetizing fish |
| 96 well plate | Costar | 3539 | For embryo drug treatment |
| Transfer pipette | Bel-art product | F37898 | For transfering embryo |
References
- Octavia, Y., et al. Doxorubicin-induced cardiomyopathy: from molecular mechanisms to therapeutic strategies. J Mol Cell Cardiol. 52 (6), 1213-1225 (2012).
- Singal, P. K., Iliskovic, N. Doxorubicin-induced cardiomyopathy. N Engl J Med. 339 (13), 900-905 (1998).
- Angsutararux, P., Luanpitpong, S., Issaragrisil, S. Chemotherapy-Induced Cardiotoxicity: Overview of the Roles of Oxidative Stress. Oxid Med Cell Longev. , 795602 (2015).
- Ichikawa, Y., et al. Cardiotoxicity of doxorubicin is mediated through mitochondrial iron accumulation. J Clin Invest. 124 (2), 617-630 (2014).
- Zhang, Y. W., Shi, J., Li, Y. J., Wei, L. Cardiomyocyte death in doxorubicin-induced cardiotoxicity. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 57 (6), 435-445 (2009).
- Sawyer, D. B. Anthracyclines and heart failure. N Engl J Med. 368 (12), 1154-1156 (2013).
- Zhang, S., et al. Identification of the molecular basis of doxorubicin-induced cardiotoxicity. Nat Med. 18 (11), 1639-1642 (2012).
- Dodd, D. A., et al. Doxorubicin cardiomyopathy is associated with a decrease in calcium release channel of the sarcoplasmic reticulum in a chronic rabbit model. J Clin Invest. 91 (4), 1697-1705 (1993).
- Mitry, M. A., Edwards, J. G. Doxorubicin induced heart failure: Phenotype and molecular mechanisms. Int J Cardiol Heart Vasc. 10, 17-24 (2016).
- Aminkeng, F., et al. A coding variant in RARG confers susceptibility to anthracycline-induced cardiotoxicity in childhood cancer. Nat Genet. 47 (9), 1079-1084 (2015).
- Deng, S., et al. Dystrophin-deficiency increases the susceptibility to doxorubicin-induced cardiotoxicity. Eur J Heart Fail. 9 (10), 986-994 (2007).
- Leong, S. L., Chaiyakunapruk, N., Lee, S. W. Candidate Gene Association Studies of Anthracycline-induced Cardiotoxicity: A Systematic Review and Meta-analysis. Sci Rep. 7 (1), 39 (2017).
- Wasielewski, M., et al. Potential genetic predisposition for anthracycline-associated cardiomyopathy in families with dilated cardiomyopathy. Open Heart. 1 (1), e000116 (2014).
- Lebrecht, D., et al. Dexrazoxane prevents doxorubicin-induced long-term cardiotoxicity and protects myocardial mitochondria from genetic and functional lesions in rats. Br J Pharmacol. 151 (6), 771-778 (2007).
- QuanJun, Y., et al. Protective Effects of Dexrazoxane against Doxorubicin-Induced Cardiotoxicity: A Metabolomic Study. PLoS One. 12 (1), e0169567 (2017).
- Seifert, C. F., Nesser, M. E., Thompson, D. F. Dexrazoxane in the prevention of doxorubicin-induced cardiotoxicity. Ann Pharmacother. 28 (9), 1063-1072 (1994).
- Adams, J. W., et al. Enhanced Galphaq signaling: a common pathway mediates cardiac hypertrophy and apoptotic heart failure. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (17), 10140-10145 (1998).
- Bowles, N. E., Bowles, K. R., Towbin, J. A. The "final common pathway" hypothesis and inherited cardiovascular disease. The role of cytoskeletal proteins in dilated cardiomyopathy. Herz. 25 (3), 168-175 (2000).
- Kroumpouzou, E., et al. Common pathways for primary hypertrophic and dilated cardiomyopathy. Hybrid Hybridomics. 22 (1), 41-45 (2003).
- Towbin, J. A., Bowles, K. R., Bowles, N. E. Etiologies of cardiomyopathy and heart failure. Nat Med. 5 (3), 266-267 (1999).
- Liu, Y., et al. Visnagin protects against doxorubicin-induced cardiomyopathy through modulation of mitochondrial malate dehydrogenase. Sci Transl Med. 6 (266), 266ra170 (2014).
- Asimaki, A., et al. Identification of a new modulator of the intercalated disc in a zebrafish model of arrhythmogenic cardiomyopathy. Sci Transl Med. 6 (240), 240ra274 (2014).
- Ding, Y., et al. Haploinsufficiency of target of rapamycin attenuates cardiomyopathies in adult zebrafish. Circ Res. 109 (6), 658-669 (2011).
- Sun, X., et al. Cardiac hypertrophy involves both myocyte hypertrophy and hyperplasia in anemic zebrafish. PLoS One. 4 (8), e6596 (2009).
- Sun, Y., et al. Activation of the Nkx2.5-Calr-p53 signaling pathway by hyperglycemia induces cardiac remodeling and dysfunction in adult zebrafish. Dis Model Mech. 10 (10), 1217-1227 (2017).
- Yang, J., Shah, S., Olson, T. M., Xu, X. Modeling GATAD1-Associated Dilated Cardiomyopathy in Adult Zebrafish. J Cardiovasc Dev Dis. 3 (1), (2016).
- Ding, Y., et al. Trapping cardiac recessive mutants via expression-based insertional mutagenesis screening. Circ Res. 112 (4), 606-617 (2013).
- Ding, Y., et al. A modifier screen identifies DNAJB6 as a cardiomyopathy susceptibility gene. JCI Insight. 2 (8), (2017).
- Kinkel, M. D., Eames, S. C., Philipson, L. H., Prince, V. E. Intraperitoneal injection into adult zebrafish. J Vis Exp. (42), (2010).
- Wang, L. W., et al. Standardized echocardiographic assessment of cardiac function in normal adult zebrafish and heart disease models. Dis Model Mech. 10 (1), 63-76 (2017).
- Desai, V. G., et al. Development of doxorubicin-induced chronic cardiotoxicity in the B6C3F1 mouse model. Toxicol Appl Pharmacol. 266 (1), 109-121 (2013).
- Zhu, W., Shou, W., Payne, R. M., Caldwell, R., Field, L. J. A mouse model for juvenile doxorubicin-induced cardiac dysfunction. Pediatr Res. 64 (5), 488-494 (2008).
- Chatterjee, K., Zhang, J., Honbo, N., Karliner, J. S. Doxorubicin cardiomyopathy. Cardiology. 115 (2), 155-162 (2010).
- Bang, C., et al. Cardiac fibroblast-derived microRNA passenger strand-enriched exosomes mediate cardiomyocyte hypertrophy. J Clin Invest. 124 (5), 2136-2146 (2014).
- Rassaf, T., Kelm, M. Protection from diabetic cardiomyopathy - putative role of the retinoid receptor-mediated signaling. J Mol Cell Cardiol. 59, 179-180 (2013).
- Wahbi, K., et al. Dilated cardiomyopathy in patients with mutations in anoctamin 5. Int J Cardiol. 168 (1), 76-79 (2013).
- Zhou, M. D., Sucov, H. M., Evans, R. M., Chien, K. R. Retinoid-dependent pathways suppress myocardial cell hypertrophy. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (16), 7391-7395 (1995).
- Hershman, D. L., et al. Doxorubicin, cardiac risk factors, and cardiac toxicity in elderly patients with diffuse B-cell non-Hodgkin's lymphoma. J Clin Oncol. 26 (19), 3159-3165 (2008).
- Silber, J. H., Barber, G. Doxorubicin-induced cardiotoxicity. N Engl J Med. 333 (20), 1359-1360 (1995).
- Von Hoff, D. D., et al. Risk factors for doxorubicin-induced congestive heart failure. Ann Intern Med. 91 (5), 710-717 (1979).
- Pugach, E. K., Li, P., White, R., Zon, L. Retro-orbital injection in adult zebrafish. J Vis Exp. (34), (2009).
- Zang, L., Morikane, D., Shimada, Y., Tanaka, T., Nishimura, N. A novel protocol for the oral administration of test chemicals to adult zebrafish. Zebrafish. 8 (4), 203-210 (2011).
- Collymore, C., Rasmussen, S., Tolwani, R. J. Gavaging adult zebrafish. J Vis Exp. (78), (2013).
