Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Doxorubicin-induzierten Kardiomyopathie Model in Erwachsenen Zebrafisch

Published: June 7, 2018 doi: 10.3791/57567
Automatic Translation
*1,2,3, *2,3, 2,3,4, 1,2,3
1Clinical and Translational Sciences Track, Mayo Clinic Graduate School of Biomedical Sciences, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Mayo Clinic, 3Division of Cardiovascular Diseases, Mayo Clinic, 4Institute of Life Science, Beijing University of Chinese Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Eine Methode zur Erzeugung einer Doxorubicin-induzierten Kardiomyopathie-Modell im Erwachsenen Zebrafisch (Danio Rerio) wird hier beschrieben. Zwei alternative Möglichkeiten, intraperitoneale Injektion werden vorgestellt und Bedingungen zur Verringerung der Unterschiede zwischen den verschiedenen Versuchsgruppen werden diskutiert.

Abstract

Der genetisch zugänglich Erwachsene Zebrabärbling (Danio Rerio) wurde zunehmend als ein Wirbeltier Modell eingesetzt, für das Verständnis menschlicher Erkrankungen wie z. B. Kardiomyopathie. Wegen seiner Bequemlichkeit und Bereitschaft zu hoher Durchsatz genetische Manipulationen öffnet die Generation der erworbenen Kardiomyopathie Modelle, wie Doxorubicin-induzierten Kardiomyopathie (DIC) Modell in Erwachsenen Zebrafisch, die Türen für neue Forschungsansätze, einschließlich Kardiomyopathie Modifikatoren über vorwärts genetisches Screening zu entdecken. Anders als bei der embryonalen Zebrafisch-DIC-Modell, Initiale akute und später chronische Phasen der Kardiomyopathie kann im Erwachsenen Zebrafisch DIC Modell ermöglicht die Untersuchung der Bühne-abhängige Signalisierung Mechanismen und therapeutische Strategien bestimmt werden. Allerdings erhalten Sie unterschiedliche Ergebnisse mit dem aktuellen Modell, auch in den Händen von erfahrenen Ermittlern. Um zukünftige Umsetzung des DIC-Modells zu erleichtern, präsentieren wir Ihnen ein detailliertes Protokoll zum Generieren dieser DIC-Modell im Erwachsenen Zebrafisch und zwei alternative Möglichkeiten, intraperitoneale Injektion (IP) zu beschreiben. Wir diskutieren weiter Optionen zur Verringerung der Varianten, um zuverlässige Ergebnisse zu erzielen und geben Anregungen, wie Sie die Ergebnisse richtig zu interpretieren.

Introduction

Doxorubicin (DOX), auch benannt Adriamycin, wurde als "Anti-neoplastische Drug" seit den 1960er Jahren1,2entwickelt. Es ist jetzt noch aktiv als eine wichtige Chemotherapeutikum für ein breites Spektrum von Tumoren eingesetzt. Doch klinische Anwendung der DOX wurde erschwert durch die dosisabhängige Toxizität, insbesondere Kardiotoxizität zeichnet sich durch Variable Symptome von asymptomatischen elektrokardiographischen Veränderungen bis hin zu Perikarditis und dekompensierter Kardiomyopathie 1 , 2. bisher mindestens drei wichtige Hypothesen um zu erklären, DIC, einschließlich aktivierter reaktive Sauerstoff Spezies (ROS)1,3,4,5, Hemmung der Topoisomerase II-β (angehoben worden TOP2β)6,7und Modulation von intrazellulären Calcium release1,8,9. Beweise sammeln, schlägt auch genetischen Veranlagung als entscheidender Risikofaktor für DIC10,11,12,13. Bleiben Sie gen Identitäten im Zusammenhang mit diesen DIC Prädispositionen, jedoch weitgehend unbekannt. Dexrazoxan ist der einzige adjuvante Agent genehmigt durch die US Food and Drug Administration (FDA) zur Behandlung von DIC, aber mit begrenzten Umsetzung14,15,16, unterstreicht die Notwendigkeit, zusätzliche identifizieren therapeutische Strategien. Tiermodelle der DIC sind daher für diese Zwecke erforscht. Aufgrund ihrer Zugänglichkeit und Einfachheit, mechanistische Studien auf DIC Modelle könnte haben breitere Auswirkungen auf andere Arten von Kardiomyopathien: gemeinsame Pathogenese kann gemeinsam genutzt werden Kardiomyopathien der verschiedenen Ätiologien, vor allem bei später pathologischen Stadien17,18,19,20.

Neben der Nager-Modelle von DIC entwickelten Zebrafisch DIC Modelle mit höheren Durchsatz um die Entdeckung der neuen genetischen Faktoren und Therapeutika zu erleichtern. Eine embryonale DIC-Modell wurde in den transparenten Zebrafish Embryos für das screening von therapeutischen Substanzen21eingerichtet. Angesichts der Tatsache, dass der Kardiomyopathien Altersdiabetes Krankheiten mit einer progressiven Pathogenese, entwickelt Erwachsenen Zebrafisch Kardiomyopathie Modelle wurden22,23,24,25,26. Wir erzeugt das erste erworbene Modell für Kardiomyopathie infolge chronischer Anämie24, gefolgt von DIC als das zweite Modell der erworbenen Kardiomyopathie in Erwachsenen Zebrafisch23. Wir fanden, dass die Injektion eines einzigen Bolus von DOX in Erwachsenen Zebrafisch Kardiotoxizität induziert, die aus einer akuten Phase etwa innerhalb 1 Woche nach der Injektion (Wpi), gefolgt von einer chronischen Phase der Kardiomyopathie bis zu 6 Monate nach der Injektion besteht. Während Haploinsufficiency des mechanistischen Ziel von Rapamycin(Mtor) bessert Kardiomyopathie in der chronischen Phase, übertreibt es Fischsterblichkeit in der Akutphase unterstreicht den Wert der Erwachsenen DIC-Modells, Bühne-abhängige zu erkennen Mechanismen23. Wir zeigten weiter, dass die Erwachsenen DIC-Modell verwendet werden kann, auf eine Sammlung von Zebrafisch insertional kardiale (ZIC) Mutanten hinweisen, die über ein Transposon-basierte insertional Mutagenese Ansatz27generiert werden. Ein pilot Bildschirm identifiziert 3 bekannten Kardiomyopathie Gene sowie DnaJ (hps40) Homolog, Unterfamilie B und Mitglied 6 b (dnajb6b) als neue DIC Anfälligkeit Gene28. Daher führte die Generation der Erwachsenen DIC-Modells im Zebrafisch, eine neue Methodik, die systematisch ermöglicht die Identifizierung der genetischen Modifikatoren für DIC, ergänzt die bestehenden genomweite Studie (GWAS) und quantitative Trait Locus (QTL ) Analyse.

Während der Generierung und Implementierung des Erwachsenen Zebrafisch-DIC-Modells haben wir erhebliche Abweichungen zwischen den verschiedenen Wissenschaftlern und/oder auch unter den verschiedenen Injektionen durchgeführt durch den gleichen Prüfer festgestellt. Die longitudinale Natur des Modells erlegt Herausforderungen für Registrierung Ergebnisse von verschiedenen Forschern und der sequentiellen Problembehandlungsprozess. Um die Verwendung dieser einfachen Kardiomyopathie-induzierende Stress-Methode durch die Forschungsgemeinschaft zu erleichtern, wir beschreiben unser Protokoll detailliert vorliegenden zwei Arten von IP-Injektion und Überlegungen zur Verringerung der Unterschiede zwischen den verschiedenen Forschern zu diskutieren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle hier beschriebene Verfahren wurden gemäß dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren (National Academies Press 2011) durchgeführt, und sie wurden durch die Mayo Klinik institutionelle Animal Care und Use Committee genehmigt.

1. Erwachsene Zebrafisch-Vorbereitung

  1. Richten Sie ausreichend Brutpaare im Panzer überqueren mindestens doppelt so viele wie die totale Fische für DOX Injektion benötigt zu erwerben. Wenn Fisch mit verschiedene genetische Hintergründe zu vergleichen, züchten Sie alle Fische innerhalb der gleichen Woche für Alter abgestimmten Kontrollen sorgen.
  2. Sammle Fischembryonen am nächsten Morgen auf 100 mm Petrischalen übertragen, und in einem Inkubator 28,5 ° C aufbewahren. Halten Sie Embryonen bei einer geringen Dichte (< 100 Embryonen/Petrischale).
  3. Aktualisieren der Embryo Wasser täglich Sex Ungleichgewicht zu vermeiden, und manuell entfernen Tote Eier rechtzeitig mit einer transferpipette.
  4. Legen Sie die gleiche Anzahl von Embryonen in jedem Tank (z. B. 60 Embryonen/3 L Medium tank zunächst) für Dichte abgestimmten Kontrollen sorgen.
  5. Starten Sie Pantoffeltierchen Fütterung auf 4 Tage nach Befruchtung (Dpf).
  6. Überprüfen Sie die Fische täglich in der juvenilen Phase. Passen Sie die Anzahl der Fische um ähnliche Fische sicherzustellen Dichte.
  7. Wenn Fisch 4 Wochen des Alters erreichen, transfer bis zu 20 Fische in jeder neuen 3 L mittlerer Panzer für weiteres Wachstum. Start mit live geschlüpften Artemia verfüttern.

2. Herstellung und Aufbewahrung von DOX-Stammlösung

Hinweis: DOX kann aus verschiedenen Bio-Unternehmen erworben werden. Die Verbindung ist in der Regel als Pulver in dunkel braun Container erworben.

  1. Lösen Sie gründlich das DOX-Pulver in deionisiertes Wasser um sicherzustellen, dass keine Klumpen mit einer Endkonzentration von 5 mg/mL als Vorratslösung sichtbar sind auf. Aliquoten 1 mL der DOX Lager in jeder 1,5 mL-Safe-Lock-Rohr. Wickeln Sie die 1,5 mL Röhrchen mit Aluminium-Folie-Papier, das DOX vor Lichteinfall zu schützen.
    Hinweis: Führen Sie diesen Schritt in einer chemischen Kapuze.
  2. Halten Sie die DOX-Stammlösung bei 4 ° C für die Lagerung. Für die langfristige Lagerung (> 4 Wochen) von DOX-Stammlösung, führen die optionalen Abschnitt 3 beschrieben.

3. Qualitätskontrolle von DOX mit Zebrafish Embryos (Optional)

Hinweis: DOX ist sowohl Feuchtigkeit und lichtempfindlich, so dass es die Wirksamkeit von Medikamenten für die Modellierung von DIC nach längerer Lagerung verlieren kann. Für DOX von verschiedenen Unternehmen oder auch verschiedener Chargen von der gleichen Firma gekauft ist es sinnvoll, die Wirksamkeit von Medikamenten mit Wildtyp (WT) Zebrafisch-Embryonen vor der Durchführung der Experimente an ausgewachsenen Fischen zu kalibrieren. Diese Methode stammt aus einer gemeldeten Zebrafish embryonale DIC Modell21.

  1. Sammeln Sie WT Zebrafisch-Embryonen aus mindestens 2 Paare von Fisch. Dechorionate Embryonen im 24 h nach Befruchtung (hpf) manuell mithilfe einer Spritze mit einer Mikro-Nadel. Alternativ behandeln Sie den Embryo mit Proteinase K bei Endkonzentration von 10 µg/mL für 10-15 min in einem 30 ° C Brutschrank. Aktualisieren Sie das Embryo Wasser nach Dechorionation. Entfernen von Toten Embryonen und halten mindestens 36 Embryonen von jeder Charge.
  2. Verdünnen Sie die DOX-Stammlösung in frischen Embryonen Wasser, eine Endkonzentration von 100 µM. Das Volumen der Lösung ist 100 µL für jeden 3 Embryonen. Mischen Sie die verdünnte Lösung der DOX durch Wirbel. Die endgültige verdünnte Lösung sollte eine leichte, rote Farbe.
  3. Fügen Sie 100 µL/Well des verdünnten DOX-Lösung von einem sauberen 96-Well-Sichtscheibe.
  4. Nehmen Sie 3 Dechorionated Embryonen mit einer Kunststoff transferpipette und halten Sie die Embryonen kurz vor dem Ende der Pipettenspitze. Setzen Sie die PIPETTENSPITZE in jede Vertiefung mit DOX Lösung. Lassen Sie das Ende der Spitze berühren die Lösung und die Embryonen in den Brunnen schwimmen lassen.
    Hinweis: Vermeiden Sie manuell drücken die Embryonen, die füllen Sie Wasser in den Brunnen und die DOX Lösung verdünnen.
  5. Aktualisieren Sie die DOX-Lösung bei 48 hpf. Zu diesem Zeitpunkt beobachten Sie die Brunnen unter einem Mikroskop mit 10-facher Vergrößerung, Toten Embryonen (Einstellung der Herzschlag) oder Embryonen mit Ödem zu identifizieren. Zählen Sie und entfernen Sie alle Toten Embryonen sowie rechtzeitig, sonst schnell die restlichen Embryonen ausgesetzt, die Lösung mit Toten Embryonen sterben können.
  6. Überprüfen Sie die Embryonen bei 72 hpf und sie zählen. Die DOX-Behandlung gilt als "gutes Medikament Wirksamkeit" Wenn > 25 % Tod (Einstellung der Herzschlag) in den beiden Reihen von Embryonen beobachtet werden.

4. Voreinspritzung Vorbereitung

Hinweis: Fisch von 8 Wochen bis 6 Monate alt sind für die DOX Injektion verwendet. Körpergewicht (BWs) eines gereiften wilden indischen Karyotyp (WIK) Fisches injiziert werden, reichen von 0,2-0,5 g.

  1. Schnell die Fische für 24 h vor der Injektion.
  2. Den Fisch mit Embryo wasserhaltigen 0,16 mg/mL Tricaine zu betäuben. Verwenden Sie ein sauberes Filterpapier trocknen das Wasser von beiden Seiten des Körpers. Das BW jeden Fisch auf einer Skala zu messen. Gruppieren Sie Fisch innerhalb 10 % Unterschied im BW zur späteren Injektion.
    Hinweis: Um die Arbeitsbelastung bei diesem Schritt zu minimieren, gelten Fische innerhalb von 10 % Unterschied im BW die gleiche Größe; Daher bereiten Sie eine DOX funktionierende Lösung entsprechend ihren Mittelwert BW.
  3. Plan, jeder Erwachsene Fisch mit 5 µL Lösung zu injizieren. Berechnen Sie die DOX Arbeit Konzentration nach dem Fisch Zahlen und BWs.
    Hinweis: Um chronische Kardiotoxizität bis zu 6 Monaten zu untersuchen, verwenden Sie DOX bei einer Dosis von 20 mg/kg. Um akute Kardiotoxizität von DOX zu studieren, kann bis zu 50 mg/kg BW die DOX-Dosis erhöht werden.
  4. Verdünnen Sie die DOX-Lager in 1 x Hank es ausgeglichene Salzlösung (HBSS) für die entsprechenden Arbeiten Konzentrationen. Wirbel um die Lösung zu mischen. Kurz spin-down, um die Lösung zu sammeln.

(5) DOX Injektion bei ausgewachsenen Fischen

  1. Ort eine saubere 100 mm Petrischale mit einem Schwamm in seinem Inneren, unter dem Mikroskop Dissektion, dann stellen Sie den Fokus. Schneiden Sie den Schwamm einen Hohlraum von ca. 4 cm in der Länge um einen Fisch zu halten machen. Machen Sie einen längeren Hohlraum für eine größere Fische.
  2. Bereiten Sie eine 34 G-Nadel mit einer 10 µL Mikro-Spritze. Spülen Sie die Nadel mit 1 X HBSS Puffer um Luftblasen und Blöcke aus der Spritze und Schläuche zu entfernen.
  3. Die Erwachsenen Fische im Embryo wasserhaltigen 0,16 mg/mL Tricaine 2 min. lang zu betäuben.
    Hinweis: Längere Anesthetization über 5 min gefolgt von DOX Injektion kann leicht dazu führen Fische Tod.
  4. Weichen Sie den Schwamm im Embryo Wasser mit Tricaine und übertragen Sie die Fische auf den Schwamm für die Injektion.
  5. Durchführen Sie IP DOX Injektion durch eine der beiden Methoden, die unten beschrieben.
    1. Klassische IP-Injektion29
      1. Positionieren Sie den Fisch mit dem Bauch bis in den Hohlraum des Schwammes. Schnell setzen Sie die Nadel mit einem 45° Winkel auf den Körper des Fisches in der Mittellinie zwischen den Bauchflossen und dringen ca. 1-2 mm. alle DOX Lösung langsam loslassen. Warten Sie 5 s vor dem Herausziehen der Nadelöhrs. Überprüfen Sie die DOX-Lieferung durch eine sichtbare rote Farbe in den Bauch des Fisches.
    2. Alternative IP-Injektion
      1. Legen Sie den Fisch seitlich auf den Schwamm mit der vorderen auf der rechten Seite. Vorsichtig die Fische mit einem stumpfen Ende Zangen mit der linken Hand zu stabilisieren und die Mikro-Spritze mit der rechten Hand halten.
      2. Positionieren Sie die Nadel unter die Seitenlinie oberhalb der Beckenflosse mit der schräge nach oben. Stechen Sie auf 07:00-Position in einem 45 °-Winkel zeigen die Nadel ca. 3-4 mm zum Fisch Hohlraum befindet sich zwischen den Becken und die analen Flossen, und dann drücken Sie langsam den Kolben. Überprüfen Sie die DOX-Lieferung durch eine sichtbare rote Farbe in den Bauch des Fisches.
  6. Übertragen Sie schnell die injizierten Fische auf einen sauberen Übergang Tank mit frischen System Wasser um die Fische wieder zu ermöglichen. Spülen Sie die Nadel einmal mit 1 X HBSS Puffer zwischen den Injektionen.

6. nach der Injektion Fisch Management

  1. Nach der Injektion zurück die Fische auf das System mit fließendem Verkehr. Wenn möglich, halten Sie DOX-behandelten Fische separat vom Hauptsystem Cross-Kontamination unter verschiedenen Panzern zu vermeiden, die die Zirkulation zu teilen.
  2. Die injizierten Fische schnell für ein weiteres 24 h für die Wiederherstellung. Beobachten Sie die Fische während der ersten Woche täglich. Entfernen Sie die Toten Fische rechtzeitig um Infektion zu den anderen Fischen zu vermeiden.
    Hinweis: Fisch Todesfälle innerhalb der ersten 24 h sind wahrscheinlich durch körperliche Verletzungen, die durch die Injektion.
  3. Weitere pflegen Sie die DOX-gestresste Fische für längs-Beobachtungen. Entfernen Sie tote Fische in Zeit, Infektionen, andere Fische in den Tank zu vermeiden.
    Hinweis: Fisch-Nummern sind dokumentiert, um ein Überleben Kurve zu erzeugen.
  4. Verwenden Sie verschiedene experimentelle Tests zum Phänotyp der DOX-gestresste Fische wie Echokardiographie30, Herzfunktion Reporter transgene Linie23, Schwimmen Herausforderung26und Quantifizierung von anderen pathologischen Umbau Markierungen am23.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Hier sind zwei Methoden, um IP-Injektion zu Modell DIC in Erwachsenen Zebrafisch durchführen präsentiert. Bei der Verwendung der klassischen, etablierten IP-Injektion Methode29, wurde festgestellt, dass die injizierte DOX-Lösung (rote Farbe) vom Standort manchmal heraus sickern könnte wo die Nadel eingedrungen. Die alternative IP-Injektion verwendet einen anderen Speicherort für Nadel-Durchdringung, die 3-4 mm entfernt das Peritoneum ist, wo die DOX freigesetzt (Abbildung 1A), die effektiv verhindert das Auslaufen (Abbildung 1 b, 1 C). Erfolgreiche Durchführung der DOX in das Peritoneum für beide Methoden zeigt sich schnelle Verteilung der roten Farbe in dem Bauch des Fisches, die auf der gegenüberliegenden Seite der Injektion Locus sichtbar ist.

Injektion von DOX dosiert bei 50 mg/kg der alternative IP-Methode führt zu schweren Toxizität, wo sterben die meisten Fische innerhalb einer Woche (Abbildung 2). Im Gegensatz dazu dosiert Injektion von DOX bei 20 mg/kg mit der alternative IP-Methode Ursachen fast keine Fische Tod während der ersten 2 Wochen und ca. 10 % Fisch Tod 4 Wpi (Abbildung 3A). Injektion von DOX dosiert bei 20 mg/kg mit der klassischen IP-Methode weist auf ~ 30 % Fisch Tod im 4 Wpi (Abbildung 3). Fisch mit beiden Methoden injiziert weisen einen ähnlichen Tod ~ 20 % Fisch aus 4 Wpi 10 Wpi (Abb. 3 b, D).

Wir haben die Casper genutzt; TG(cmlc2:nusDsRed) Fische zu beurteilen, das Fortschreiten der kardialen Dysfunktion in der DIC Modell (Abb. 4A)23. Die durchsichtigen Körper ermöglicht Dokumentation eines roten Herzens systolischen (Abbildung 4 b) und diastolische (Abbildung 4) Stufen unter fluoreszierendem Mikroskop. Nach Injektion von 20 mg/kg DOX die alternative IP-Methode verwenden kann Rückgang der linksventrikulären Funktion erkannt werden, ausgehend von 4 Wpi (Abbildung 4).

Figure 1
Abbildung 1: Injektion Routen. (1A) Schaltpläne der klassischen IP-Injektion (b) und alternative IP-Injektion (a) Methoden. Der rote Kreis zeigt die gemeinsame DOX Freigabe Website für die beiden Methoden. Grüne Kreise zeigen die Nadel Eindringen Websites. Die Entfernungen sind anhand eines Erwachsenen WIK Fische mit einem Gewicht von ca. 0,3 g. (1 b, 1 C) repräsentative Ergebnisse zeigt eine erfolgreiche DOX-Lieferung mit zwei intraperitoneale Injektionsmethoden geschätzt. Rötung im adulten Fische Bauch kann unmittelbar nach der Injektion festgestellt werden. Eingespritzte Fische wurden wieder nach 5 min Erholung in einem frischen System Wasser überprüft. HBSS: 1 X Hank ausgewogen Salzlösung. WT-WIK Zebrafisch waren beschäftigt. Maßstab: 5 mm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Repräsentative überleben Kurven Erwachsenen Zebrafisch DOX Stress mit 50 mg/kg DOX Injektion nach. Gezeigt werden 3 Sätze von DOX-Injektionen bei verschiedenen Chargen WT geschlechtsreifer Fische im Alter von 3-6 Monaten. In total, n = 24 Fische waren beschäftigt, in der 1 X HBSS Kontrollgruppe und n = 8 Fische waren in jeder Charge injiziert mit DOX beschäftigt. Keinen Unterschied in der Fisch-Überlebensraten zwischen den beiden Methoden festgestellt wurden. WT-WIK Zebrafisch waren beschäftigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Repräsentative überleben Kurven Erwachsenen Zebrafisch DOX Stress mit 20 mg/kg DOX Injektion und der Vergleich zwischen beiden intraperitoneale Injektionsmethoden nach. (3A) Fische überleben innerhalb von 0-4 Wochen nach Lieferung der DOX durch klassische intraperitoneale Injektion. Prozent Fisch Anzahl in Woche 0 100 % galt. (3 b) fischüberleben nach 4 Wochen-DOX Lieferung durch klassische intraperitoneale Injektion Post. Prozent Fisch Anzahl bei Woche 4 galt als 100 %. (3 C) Fische überleben innerhalb von 0-4 Wochen nach Lieferung der DOX durch alternative intraperitoneale Injektion. Prozent Fisch Anzahl in Woche 0 100 % galt. (3D) Fische Überleben nach 4 Wochen nach DOX Lieferung durch alternative intraperitoneale Injektion. Prozent Fisch Anzahl bei Woche 4 galt als 100 %. Daten in (3A) und (3 b) sind 9 verschiedene Chargen von DOX Injektion von insgesamt 223 injizierten Fisch im Alter von 3-6 Monaten. Daten in (3 C) und (3D) sind 14 verschiedene Chargen von DOX Injektion von insgesamt 335 injizierten Fisch im Alter von 2-6 Monaten. Die lebenden Fische sind wöchentlich verzeichnet. Fehlerbalken darzustellen Standardabweichung in Prozent des Überlebens unter verschiedenen Chargen an jede Woche. WT-WIK Zebrafisch waren beschäftigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: Repräsentative Herzfunktion Bewertung nach DOX Stress mit Casper; TG(cmlc2:nusDsRed) Fisch. (4A) ein Foto eines Erwachsenen Casper; TG(cmlc2:nusDsRed) Fisch. Maßstabsleiste = 1 cm. (4 b) repräsentatives Bild der rote Herzkammer bei der systolischen Endstadium der eine gereifte Casper; TG(cmlc2:nusDsRed) Fisch. Gestrichelte Linie stellt systolischen Enddurchmesser (ESD). (4 C) Vertreter Bild des roten Ventrikels in der Ende diastolische Phase von einem gereiften Casper; TG(cmlc2:nusDsRed) Fisch. Bilder (4 b) und (4 C) wurden aus Filmen des schlagenden Herzens erfasst mit einem fluoreszierenden Dissektion Mikroskop mit 6,3 X Vergrößerung extrahiert. Gestrichelte Linie stellt diastolische Enddurchmesser (EDD). Maßstabsleiste = 1 mm. (4D) repräsentative Herzfunktion gemessen mit Casper; TG(cmlc2:nuDsRed) Erwachsene Zebrafisch nach 20 mg/kg DOX Injektion. EDD und ESD wurden gemessen, wie in (4 b) und (4 C) für die einzelnen Fische und ventrikuläre Bruchteil Verkürzung wird berechnet, indem die Formel (EDD − ESD) / EDD. Verminderte Linksventrikuläre Bruchteil Verkürzung wurde deutlich bei 4 Wochen und danach erkannt. Die intraperitoneale Alternativmethode diente. Werte werden als der Mittelwert ± Standardfehler angezeigt. n ≥ 3 in jeder Gruppe. Der Student t -Test wurde für den Vergleich der beiden Gruppen verwendet. p < 0,05. Diese Zahlen wurden von Ding Et Al. modifiziert 23 Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Um eine progressive DIC zu modellieren, wurde die Dosis von 20 mg/kg DOX experimentell als die höchste Dosis ermittelt, die keine signifikante Fisch Tod während 1 Wpi, aber immer noch die Ergebnisse im Fisch Tod und die Verringerung der Herzfunktion nach 4 Wpi (Abbildung 3 und verursacht Abbildung 4). Diese Dosis ist vergleichbar mit denen häufig in Nager DIC-Modelle (15-25 mg/kg) und der Grenze kumulative Dosis beim Menschen (550 mg/m2, das entspricht 15 mg/kg)4,7,31,32 , 33. höhere Dosen von DOX, z. B. 50 mg/kg, zeigen deutliche Fische Tod während 1 Wpi, damit sie verwendet werden können, um nur akuten kardialen toxischen Reaktionen auf DOX23,28zu studieren.

Bei der Umsetzung dieses Modells DIC bemerkten wir, dass es schwierig für neue Ermittler zunächst die gleichen Ergebnisse zu reproduzieren. Selbst für erfahrene Ermittler etwa 20 % Variation der Sterblichkeit in der chronischen Phase noch unter verschiedenen Injektionen (Abbildung 3), Angabe des fußgelenkes biologische Störfaktoren im aktuellen Modell finden. Trotz weniger als perfektes Modell glauben wir noch, dass dieses aktuelle Modell DIC ausreicht, um solide Entdeckung durch folgende Nachweise zu machen. Erstens können nach verschiedene Praktiken, die Ergebnisse aus dem DIC Modell später bei den meisten, wenn nicht alle Ermittler registriert werden. Zweitens wurden basierend auf diesem Modell DIC, 4 sinnvolle genetische Modifikatoren. Vorliegenden Erkenntnisse aus Literatur Berichten unterstützt 3 davon als Kardiomyopathie Gene34,35,36,37. Die 4 istth eine DnaJ Homolog Unterfamilie B Mitglied 6 (DNAJB6), die sich bewährt hat, um ein neues Kardiomyopathie-gen von einer menschlichen genetischen Studie28unterstützt werden. So schließen wir, dass Ergebnisse basierend auf Intra Versuchsgruppen mit stringent Alter abgestimmten Kontrollen noch sehr wiederholbar sind, wenn auch das DIC-Modell in seiner jetzigen Form nicht zuverlässig für Inter experimentellen Vergleich ist.

Die Störfaktoren, die die Widersprüchlichkeit in unser derzeitiges DIC Modell wahrscheinlich beobachtet beitragen, gehören die folgenden: (1) altern und Unterschied zwischen den Geschlechtern gelten als entscheidende Risikofaktoren für Herz-Kreislauf-Krankheiten einschließlich DIC38, 39,40. Während die beiden hypothetischen Mitbegründer bleiben um in unserem Modell speziell getestet werden, haben wir bemerkt, dass im Alter von Fisch sind in der Regel empfindlicher auf DOX Toxizität (Daten nicht gezeigt). Die intercharge Variationen beobachtet mit beiden IP-Methoden (Abbildung 3) sind wahrscheinlich auch zu diesen beiden Mitbegründer beigetragen. (2) anders als bei größeren Tiermodellen, die Größe eines Erwachsenen Zebrafisch ist klein. So kann lokale Schäden durch DOX Injektion schwerer und variabel sein. (3) Tod des injizierten Fisch kann von DOX Toxizität in anderen Organen (z.B. renale Toxizität), neben dem Herzen führen. Während mehr durchdachte Experimente erforderlich sind, um jeden der oben genannten Einflussfaktoren behandeln, bisherige Arbeit legt nahe, dass die folgenden Vorsichtshinweise werden dazu beitragen, phänotypische Variationen: Erstens ist es entscheidend für die Wirksamkeit von DOX zu garantieren. DOX Pulver sollte immer in einem trockenen, dunklen Raum gehalten werden, und Lösungen behandelt werden, mit Sorgfalt, Lichteinwirkung zu reduzieren. Es wird empfohlen, dass DOX gebrauchslösungen jedesmal vor der Injektion der Fisch frisch zubereitet werden. Wir verwenden in der Regel keine DOX Stammlösungen nach 4 Wochen eingelagert. Wenn es Zweifel gibt, führen Sie die optionalen Abschnitt 3 in diesem Protokoll mit dem schnellen embryonalen DIC-Modell, um die Wirksamkeit von Medikamenten jeder Charge DOX zu kalibrieren. Zweitens, geschlechtsreifer Fische Synchronisation ist von zentraler Bedeutung. Der gleiche Fisch Belastung muss auf die gleiche Dichte, um ähnliche Körpergröße sicherzustellen angesprochen werden. Dann wurde Fisch mit ähnlichen BWs für die Dosisberechnung vorher auswählen. Es wird empfohlen, mindestens doppelt so viele Fische insgesamt für diese Vorauswahl zu pflegen. Alle Fische sind für 24 h vor der Vorauswahl gefastet. Drittens, empfiehlt es sich, immer mit Fisch in ähnlichen Alter und den Fisch vor der DOX Injektion aufgrund ihrer unterschiedlichen Wachstumsraten und potenziell unterschiedlichen kardiale Reaktionen auf DOX Sex.

Wir haben festgestellt, dass die Mehrheit der inkonsistenten Schlussfolgerungen zu einer fragwürdigen Kontrollgruppe zugeschrieben werden könnte. Daher empfehlen wir Ermittler neu in das Modell DIC Praxis DOX Injektionen vor der Durchführung realer Experimente. Bei 20 mg/kg DOX Methode alternative IP-Injektion gespritzt wird, kann ein guter Injektionstechnik durch einen fast null Fische Tod während der 1 Wpi DOX und eine relativ konsistent Sterblichkeitsrate bei 2 bis 3 Monate Post-DOX Injektion angezeigt werden. Der ultimative Beweis für die erfolgreiche Modellierung ist die Reduzierung des Herz-Kreislauf-funktionalen Index, die über Echokardiographie25,30, quantifiziert werden konnte, mithilfe einer Casper. TG(cmlc2:nusDsRed) transgene Linie oder mithilfe eines neu entwickelten ex Vivo-basierte Herzfunktion Assay (Daten nicht gezeigt).

Orale Ernährung42und Wasser Inkubation ist neben der IP-Injektion, andere Routen des Drogenhandels Lieferung wie Retro-Orbital Injektion41, häufig auch in Erwachsenen Zebrafisch eingesetzt. Wir nicht Herangehen der Retro-Orbital-Injektion, trotz seiner direkten Medikament Freigabe in das Zirkulationssystem, aufgrund des Fehlens einer Methode zur erfolgreichen Drug-Delivery, zu überprüfen, wie die Rötung der DOX durch mögliche Blutungen leicht maskiert werden kann. Wir haben versucht eine mündliche Übermittlungsprotokoll durch Einbettung DOX mit resorbierbaren Gluten42, die zu den Mahlzeiten, Erwachsene Fische ernähren sich gemischt wurde. Leider beobachteten mit bis die kumulative Dosis von 150 mg/kg verwendet innerhalb 4 Wochen Fütterung, wir schweren Kardiotoxizität, die Unwirksamkeit der mündlichen DOX Lieferung vorschlagen. Alternativ könnte eine orale Magensonde Technik weiter erforschten43. Die Inkubation Protokoll Einweichen Fisch in eine Lösung mit DOX ist übrigens auch als möglicher Weg der Lieferung, der in der Zukunft geprüft werden könnte.

Wir anerkennen, dass eine große Einschränkung des aktuellen Modells DIC die einzigen Bolus-Injektion-Methode ist die hohe Toxizität und lokale Schäden an den inneren Organen führen könnten. Dieser Ansatz war, Arbeitslasten zu reduzieren und zur Steigerung des Durchsatzes, so konzipiert, dass genetisches Screening auf einen hohen Durchsatz bei ausgewachsenen Fischen28durchgeführt werden kann. In Zukunft sollen Modelle mit mehreren Injektionen von DOX bei niedrigeren Dosen verfolgt werden, die wird besser rekapitulieren die DIC in mit Chemotherapie behandelten Krebspatienten beobachtet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde teilweise von einem Wissenschaftler Development Grant von der American Heart Association unterstützt (14SDG18160021, YD), die USA NIH R01 gewährt HL 81753 und HL 107304 XX und der Mayo Foundation bis XX.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Crossing tank Aquaneering ZHCT100 Fish breeding
Incubator ThermoFisher Maintaining embryo
3 L medium tank Aquaneering ZT280 Maintaining fish
Paramecia Carolina 131560 Food for juvenile fish
Live hatched brine shrimp in house Food for adult fish
Doxorubicin hydrochloride Sigma D1515-10MG
1.5 ml safe-lock tube Eppendorf No. 022363204 For drug storage
Aluminum foil paper Fisher 1213104 For preventing light exposure
Proteinase K Roche No. 03115887001 For dechorionating embryo
Hank's balanced salt solution (HBBS) ThermoFisher 14025076 Vehicle for DOX
100 mm petri dish Falcon 431741
10 μL NanoFil micro-syringe WPI NANOFIL For injection
34 gauge needle WPI NF34BV-2 For injection
Tricaine Argent MS-222 Anesthetizing fish
96 well plate Costar 3539 For embryo drug treatment
Transfer pipette Bel-art product F37898 For transfering embryo

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Octavia, Y., et al. Doxorubicin-induced cardiomyopathy: from molecular mechanisms to therapeutic strategies. J Mol Cell Cardiol. 52 (6), 1213-1225 (2012).
  2. Singal, P. K., Iliskovic, N. Doxorubicin-induced cardiomyopathy. N Engl J Med. 339 (13), 900-905 (1998).
  3. Angsutararux, P., Luanpitpong, S., Issaragrisil, S. Chemotherapy-Induced Cardiotoxicity: Overview of the Roles of Oxidative Stress. Oxid Med Cell Longev. , 795602 (2015).
  4. Ichikawa, Y., et al. Cardiotoxicity of doxorubicin is mediated through mitochondrial iron accumulation. J Clin Invest. 124 (2), 617-630 (2014).
  5. Zhang, Y. W., Shi, J., Li, Y. J., Wei, L. Cardiomyocyte death in doxorubicin-induced cardiotoxicity. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 57 (6), 435-445 (2009).
  6. Sawyer, D. B. Anthracyclines and heart failure. N Engl J Med. 368 (12), 1154-1156 (2013).
  7. Zhang, S., et al. Identification of the molecular basis of doxorubicin-induced cardiotoxicity. Nat Med. 18 (11), 1639-1642 (2012).
  8. Dodd, D. A., et al. Doxorubicin cardiomyopathy is associated with a decrease in calcium release channel of the sarcoplasmic reticulum in a chronic rabbit model. J Clin Invest. 91 (4), 1697-1705 (1993).
  9. Mitry, M. A., Edwards, J. G. Doxorubicin induced heart failure: Phenotype and molecular mechanisms. Int J Cardiol Heart Vasc. 10, 17-24 (2016).
  10. Aminkeng, F., et al. A coding variant in RARG confers susceptibility to anthracycline-induced cardiotoxicity in childhood cancer. Nat Genet. 47 (9), 1079-1084 (2015).
  11. Deng, S., et al. Dystrophin-deficiency increases the susceptibility to doxorubicin-induced cardiotoxicity. Eur J Heart Fail. 9 (10), 986-994 (2007).
  12. Leong, S. L., Chaiyakunapruk, N., Lee, S. W. Candidate Gene Association Studies of Anthracycline-induced Cardiotoxicity: A Systematic Review and Meta-analysis. Sci Rep. 7 (1), 39 (2017).
  13. Wasielewski, M., et al. Potential genetic predisposition for anthracycline-associated cardiomyopathy in families with dilated cardiomyopathy. Open Heart. 1 (1), e000116 (2014).
  14. Lebrecht, D., et al. Dexrazoxane prevents doxorubicin-induced long-term cardiotoxicity and protects myocardial mitochondria from genetic and functional lesions in rats. Br J Pharmacol. 151 (6), 771-778 (2007).
  15. QuanJun, Y., et al. Protective Effects of Dexrazoxane against Doxorubicin-Induced Cardiotoxicity: A Metabolomic Study. PLoS One. 12 (1), e0169567 (2017).
  16. Seifert, C. F., Nesser, M. E., Thompson, D. F. Dexrazoxane in the prevention of doxorubicin-induced cardiotoxicity. Ann Pharmacother. 28 (9), 1063-1072 (1994).
  17. Adams, J. W., et al. Enhanced Galphaq signaling: a common pathway mediates cardiac hypertrophy and apoptotic heart failure. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (17), 10140-10145 (1998).
  18. Bowles, N. E., Bowles, K. R., Towbin, J. A. The "final common pathway" hypothesis and inherited cardiovascular disease. The role of cytoskeletal proteins in dilated cardiomyopathy. Herz. 25 (3), 168-175 (2000).
  19. Kroumpouzou, E., et al. Common pathways for primary hypertrophic and dilated cardiomyopathy. Hybrid Hybridomics. 22 (1), 41-45 (2003).
  20. Towbin, J. A., Bowles, K. R., Bowles, N. E. Etiologies of cardiomyopathy and heart failure. Nat Med. 5 (3), 266-267 (1999).
  21. Liu, Y., et al. Visnagin protects against doxorubicin-induced cardiomyopathy through modulation of mitochondrial malate dehydrogenase. Sci Transl Med. 6 (266), 266ra170 (2014).
  22. Asimaki, A., et al. Identification of a new modulator of the intercalated disc in a zebrafish model of arrhythmogenic cardiomyopathy. Sci Transl Med. 6 (240), 240ra274 (2014).
  23. Ding, Y., et al. Haploinsufficiency of target of rapamycin attenuates cardiomyopathies in adult zebrafish. Circ Res. 109 (6), 658-669 (2011).
  24. Sun, X., et al. Cardiac hypertrophy involves both myocyte hypertrophy and hyperplasia in anemic zebrafish. PLoS One. 4 (8), e6596 (2009).
  25. Sun, Y., et al. Activation of the Nkx2.5-Calr-p53 signaling pathway by hyperglycemia induces cardiac remodeling and dysfunction in adult zebrafish. Dis Model Mech. 10 (10), 1217-1227 (2017).
  26. Yang, J., Shah, S., Olson, T. M., Xu, X. Modeling GATAD1-Associated Dilated Cardiomyopathy in Adult Zebrafish. J Cardiovasc Dev Dis. 3 (1), (2016).
  27. Ding, Y., et al. Trapping cardiac recessive mutants via expression-based insertional mutagenesis screening. Circ Res. 112 (4), 606-617 (2013).
  28. Ding, Y., et al. A modifier screen identifies DNAJB6 as a cardiomyopathy susceptibility gene. JCI Insight. 2 (8), (2017).
  29. Kinkel, M. D., Eames, S. C., Philipson, L. H., Prince, V. E. Intraperitoneal injection into adult zebrafish. J Vis Exp. (42), (2010).
  30. Wang, L. W., et al. Standardized echocardiographic assessment of cardiac function in normal adult zebrafish and heart disease models. Dis Model Mech. 10 (1), 63-76 (2017).
  31. Desai, V. G., et al. Development of doxorubicin-induced chronic cardiotoxicity in the B6C3F1 mouse model. Toxicol Appl Pharmacol. 266 (1), 109-121 (2013).
  32. Zhu, W., Shou, W., Payne, R. M., Caldwell, R., Field, L. J. A mouse model for juvenile doxorubicin-induced cardiac dysfunction. Pediatr Res. 64 (5), 488-494 (2008).
  33. Chatterjee, K., Zhang, J., Honbo, N., Karliner, J. S. Doxorubicin cardiomyopathy. Cardiology. 115 (2), 155-162 (2010).
  34. Bang, C., et al. Cardiac fibroblast-derived microRNA passenger strand-enriched exosomes mediate cardiomyocyte hypertrophy. J Clin Invest. 124 (5), 2136-2146 (2014).
  35. Rassaf, T., Kelm, M. Protection from diabetic cardiomyopathy - putative role of the retinoid receptor-mediated signaling. J Mol Cell Cardiol. 59, 179-180 (2013).
  36. Wahbi, K., et al. Dilated cardiomyopathy in patients with mutations in anoctamin 5. Int J Cardiol. 168 (1), 76-79 (2013).
  37. Zhou, M. D., Sucov, H. M., Evans, R. M., Chien, K. R. Retinoid-dependent pathways suppress myocardial cell hypertrophy. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (16), 7391-7395 (1995).
  38. Hershman, D. L., et al. Doxorubicin, cardiac risk factors, and cardiac toxicity in elderly patients with diffuse B-cell non-Hodgkin's lymphoma. J Clin Oncol. 26 (19), 3159-3165 (2008).
  39. Silber, J. H., Barber, G. Doxorubicin-induced cardiotoxicity. N Engl J Med. 333 (20), 1359-1360 (1995).
  40. Von Hoff, D. D., et al. Risk factors for doxorubicin-induced congestive heart failure. Ann Intern Med. 91 (5), 710-717 (1979).
  41. Pugach, E. K., Li, P., White, R., Zon, L. Retro-orbital injection in adult zebrafish. J Vis Exp. (34), (2009).
  42. Zang, L., Morikane, D., Shimada, Y., Tanaka, T., Nishimura, N. A novel protocol for the oral administration of test chemicals to adult zebrafish. Zebrafish. 8 (4), 203-210 (2011).
  43. Collymore, C., Rasmussen, S., Tolwani, R. J. Gavaging adult zebrafish. J Vis Exp. (78), (2013).

Tags

Medizin Ausgabe 136 Doxorubicin Kardiomyopathie akute Phase chronischen Phase Zebrafisch intraperitoneale Injektion Krankheitsmodell
Doxorubicin-induzierten Kardiomyopathie Model in Erwachsenen Zebrafisch
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ma, X., Ding, Y., Wang, Y., Xu, X. A … More

Ma, X., Ding, Y., Wang, Y., Xu, X. A Doxorubicin-induced Cardiomyopathy Model in Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (136), e57567, doi:10.3791/57567 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter