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वयस्क Zebrafish में एक डॉक्सोरूबिसिन-प्रेरित Cardiomyopathy मॉडल

Published: June 7, 2018 doi: 10.3791/57567
Automatic Translation
*1,2,3, *2,3, 2,3,4, 1,2,3
1Clinical and Translational Sciences Track, Mayo Clinic Graduate School of Biomedical Sciences, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Mayo Clinic, 3Division of Cardiovascular Diseases, Mayo Clinic, 4Institute of Life Science, Beijing University of Chinese Medicine
* These authors contributed equally

Summary

वयस्क zebrafish (ढाणियो rerio) में एक डॉक्सोरूबिसिन प्रेरित cardiomyopathy मॉडल उत्पंन करने के लिए एक विधि यहां वर्णित है । intraperitoneal इंजेक्शन के दो वैकल्पिक तरीके प्रस्तुत कर रहे हैं और विभिन्न प्रयोगात्मक समूहों के बीच बदलाव को कम करने के लिए शर्तें चर्चा कर रहे हैं ।

Abstract

आनुवंशिक रूप से सुलभ एडल्ट zebrafish (ढाणियो rerio) को cardiomyopathy जैसे मानव रोगों को समझने के लिए एक हड्डीवाला मॉडल के रूप में प्रयोग तेजी से किया गया है । क्योंकि अपनी सुविधा और उच्च प्रवाह आनुवंशिक जोड़तोड़ के लिए, इस तरह के डॉक्सोरूबिसिन-प्रेरित cardiomyopathy (उद्योग) वयस्क zebrafish में मॉडल के रूप में अधिग्रहीत cardiomyopathy मॉडल, की पीढ़ी, नए अनुसंधान के रास्ते के लिए दरवाजे खोल रही है, आगे आनुवंशिक स्क्रीनिंग के माध्यम से खोज cardiomyopathy संशोधक सहित । भ्रूण zebrafish उद्योग मॉडल से अलग, दोनों प्रारंभिक तीव्र और बाद में cardiomyopathy के पुराने चरणों वयस्क zebrafish उद्योग मॉडल में निर्धारित किया जा सकता है, मंच के अध्ययन पर निर्भर संकेतन तंत्र और चिकित्सीय रणनीतियों को सक्षम करने से । हालांकि, चर परिणाम मौजूदा मॉडल के साथ अनुभवी जांचकर्ताओं के हाथों में भी प्राप्त किया जा सकता है । के लिए उद्योग मॉडल के भविष्य के कार्यांवयन की सुविधा, हम कैसे वयस्क zebrafish में इस उद्योग मॉडल उत्पंन करने के लिए और intraperitoneal (आईपी) इंजेक्शन के दो वैकल्पिक तरीके का वर्णन पर एक विस्तृत प्रोटोकॉल मौजूद । हम आगे कैसे रूपांतरों को कम करने के लिए विश्वसनीय परिणाम प्राप्त करने और कैसे उचित परिणाम की व्याख्या करने पर सुझाव देने पर विकल्पों पर चर्चा की ।

Introduction

डॉक्सोरूबिसिन (DOX), भी Adriamycin नाम, 1960 के दशक के बाद से एक विरोधी नवोत्पादित दवा के रूप में विकसित किया गया है1,2. यह अब भी सक्रिय रूप से ट्यूमर का एक व्यापक स्पेक्ट्रम के लिए एक महत्वपूर्ण कीमोथेरेपी दवा के रूप में प्रयोग किया जाता है । हालांकि, DOX के नैदानिक आवेदन अपनी खुराक पर निर्भर विषाक्तता, विशेष रूप से चर स्पर्शोन्मुख electrocardiographic परिवर्तन से pericarditis और क्षतिपूर्ति cardiomyopathy से लेकर लक्षण द्वारा विशेषता के द्वारा बाधा उत्पंन किया गया था cardiotoxicity 1 , 2. तारीख करने के लिए, सक्रिय प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS)1,3,4,5, चतुर्थ तोपोइसोमेरसे द्वितीय के निषेध सहित, कम से कम तीन प्रमुख परिकल्पनाओं को उद्योग की व्याख्या करने के लिए उठाया गया है-β ( TOP2β)6,7, और intracellular कैल्शियम रिलीज1,8,9का मॉडुलन । सबूत जमते भी10,11,12,13के लिए एक निर्णायक जोखिम कारक के रूप में आनुवंशिक गड़बड़ी का पता चलता है । जीन पहचान इन उद्योग की गड़बड़ियों से संबंधित है, तथापि, मोटे तौर पर अनजान रहते हैं । Dexrazoxane केवल सहायक अमेरिकी खाद्य और औषधि प्रशासन (एफडीए) द्वारा अनुमोदित के लिए उद्योग के इलाज के एजेंट है, लेकिन सीमित कार्यांवयन14,15,16के साथ, के लिए अतिरिक्त की पहचान की जरूरत स्कोरिंग चिकित्सीय रणनीतियों । उद्योग के पशु मॉडल है इसलिए इन प्रयोजनों के लिए पता लगाया । उनके पहुंच और सादगी के कारण, यंत्रवत मॉडल पर अध्ययन संभावित cardiomyopathies के अंय प्रकार पर व्यापक प्रभाव हो सकता है: आम रोगजनन अलग etiologies के cardiomyopathies के बीच साझा किया जा सकता है, विशेष रूप से बाद में रोग चरणों17,18,19,20.

इसके अलावा, उच्च प्रवाह के साथ zebrafish मॉडल उद्योग के मॉडल को कुतर दिया, दोनों नए आनुवंशिक कारकों और चिकित्सकीय की खोज की सुविधा के लिए विकसित किया गया है । एक भ्रूण उद्योग मॉडल चिकित्सीय यौगिकों21स्क्रीनिंग के लिए पारदर्शी zebrafish भ्रूण में स्थापित किया गया है । यह देखते हुए कि cardiomyopathies एक प्रगतिशील रोगजनन के साथ वयस्क शुरुआत रोग हैं, वयस्क zebrafish cardiomyopathy मॉडल22,23,24,25,26विकसित किया गया है । हम पुराने एनीमिया24से जिसके परिणामस्वरूप cardiomyopathy के लिए पहली बार अधिग्रहीत मॉडल उत्पंन, वयस्क zebrafish23में दूसरा अधिग्रहीत cardiomyopathy मॉडल के रूप में उद्योग के बाद । हमने पाया है कि एक एकल बोल्स के इंजेक्शन वयस्क zebrafish में cardiotoxicity कि एक तीव्र चरण के होते है लगभग 1 सप्ताह के बाद इंजेक्शन (wpi), cardiomyopathy की एक पुरानी चरण के बाद से 6 महीने के बाद इंजेक्शन । जबकि rapamycin(mtor) के यंत्रवत लक्ष्य की haploinsufficiency जीर्ण चरण में cardiomyopathy उंनति, यह तीव्र चरण में मछली मृत्यु दर अतिरंजित, वयस्क उद्योग मॉडल के मूल्य को रेखांकित करने के लिए विचार मंच पर निर्भर 23तंत्र । हम आगे का प्रदर्शन किया है कि वयस्क उद्योग के मॉडल के लिए zebrafish संमिलन कार्डियक (ZIC) म्यूटेंट है कि एक transposon के माध्यम से उत्पंन किया जा रहा है के एक संग्रह में तनाव इस्तेमाल किया जा सकता है आधारित सम्मिलनी mutagenesis दृष्टिकोण27। एक पायलट स्क्रीन की पहचान 3 ज्ञात cardiomyopathy जीन के रूप में अच्छी तरह के रूप में DnaJ (Hsp40) homolog, उपपरिवार बी, और सदस्य घमण्ड (dnajb6b) नए उद्योग के रूप में झेलते जीन28। इसलिए, zebrafish में वयस्क उद्योग मॉडल की पीढ़ी के नेतृत्व में एक नई पद्धति है कि व्यवस्थित रूप से उद्योग के लिए आनुवंशिक संशोधक की पहचान सक्षम बनाता है, जो मौजूदा जीनोम व्यापक संघ अध्ययन (GWAS) और मात्रात्मक विशेषता लोकस पूरक (QTL विश्लेषण.

पीढ़ी और वयस्क zebrafish उद्योग मॉडल के कार्यांवयन के दौरान, हम विभिंन शोधकर्ताओं के बीच महत्वपूर्ण बदलाव देखा और/या यहां तक कि एक ही अंवेषक द्वारा प्रदर्शन अलग इंजेक्शन के बीच । मॉडल के अनुदैर्ध्य प्रकृति विभिंन जांचकर्ताओं से परिणाम दर्ज करने के लिए और अनुक्रमिक समस्या निवारण प्रक्रिया के लिए चुनौतियों लगाता है । अनुसंधान समुदाय द्वारा इस सरल cardiomyopathy उत्प्रेरण तनाव विधि के उपयोग की सुविधा के लिए, हम विस्तार से हमारे प्रोटोकॉल का वर्णन, आईपी इंजेक्शन के दो प्रकार के वर्तमान, और विभिंन शोधकर्ताओं के बीच बदलाव को कम करने के लिए विचार पर चर्चा ।

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Protocol

सभी प्रक्रियाओं यहां वर्णित की देखभाल और प्रयोगशाला पशुओं के उपयोग के लिए गाइड के अनुसार प्रदर्शन किया गया (राष्ट्रीय अकादमियों प्रेस. २०११), और वे मेयो क्लिनिक संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया ।

१. प्रौढ Zebrafish तयारी

  1. स्थापित करने के लिए टैंक पार में पर्याप्त प्रजनन जोड़े के रूप में कई के रूप में कुल DOX इंजेक्शन के लिए आवश्यक मछली के लिए दो बार प्राप्त । यदि अलग आनुवंशिक पृष्ठभूमि के साथ मछली की तुलना, एक ही सप्ताह के भीतर सभी मछली नस्ल-मिलान नियंत्रण सुनिश्चित करने के लिए ।
  2. अगली सुबह मछली भ्रूण ले लीजिए, उंहें १०० mm पेट्री व्यंजन को हस्तांतरण, और उंहें एक २८.५ डिग्री सेल्सियस मशीन में रहते हैं । भ्रूण को कम घनत्व पर रखें (< 100 भ्रूण/पेट्री डिश) ।
  3. यौन असंतुलन से बचने के लिए दैनिक भ्रूण पानी ताज़ा करें, और मैंयुअल रूप से एक समय पर फैशन में एक हस्तांतरण पिपेट का उपयोग कर मृत अंडे को हटा दें ।
  4. प्रत्येक टैंक में भ्रूण की एक ही संख्या रखो (उदाहरण के लिए, ६० भ्रूण/3 एल मध्यम टैंक शुरू में) घनत्व मिलान नियंत्रण सुनिश्चित करने के लिए ।
  5. 4 दिन बाद निषेचन (dpf) में paramecia फीडिंग शुरू करें ।
  6. जुवेनाइल स्टेज के दौरान रोजाना मछलियों का निरीक्षण करते हैं । समान मछली घनत्व सुनिश्चित करने के लिए आवश्यकतानुसार मछली संख्या समायोजित करें ।
  7. जब मछली की उंर के 4 सप्ताह तक पहुंच, आगे की वृद्धि के लिए एक नया 3 एल मध्यम टैंक में 20 मछली को हस्तांतरण । जीना रची नमकीन चिंराट के साथ मछली फ़ीड शुरू करो ।

2. तैयारी और DOX स्टॉक समाधान का भंडारण

नोट: DOX विभिंन जैव कंपनियों से खरीदा जा सकता है । यौगिक आमतौर पर गहरे भूरे रंग के कंटेनर में एक पाउडर के रूप में अधिग्रहीत किया जाता है ।

  1. अच्छी तरह से de-जल में DOX पाउडर भंग सुनिश्चित करने के लिए कोई झुरमुट नहीं दिख रहे हैं, 5 मिलीग्राम/एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के साथ शेयर समाधान के रूप में । Aliquot प्रत्येक १.५ मिलीलीटर सुरक्षित-लॉक ट्यूब में DOX स्टॉक की 1 मिलीलीटर । लपेटें एल्यूमीनियम पंनी कागज के साथ १.५ मिलीलीटर ट्यूबों प्रकाश जोखिम से DOX की रक्षा के लिए ।
    नोट: एक रासायनिक डाकू में इस कदम का प्रदर्शन ।
  2. भंडारण के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर DOX स्टॉक समाधान रखें । लंबी अवधि के भंडारण के लिए (> 4 सप्ताह) DOX स्टॉक समाधान के लिए, नीचे वर्णित वैकल्पिक अनुभाग 3 निष्पादित करें ।

3. Zebrafish भ्रूण का उपयोग DOX की गुणवत्ता नियंत्रण (वैकल्पिक)

नोट: DOX दोनों नमी और प्रकाश के प्रति संवेदनशील है, तो यह विस्तारित भंडारण के बाद मॉडलिंग उद्योग के लिए अपनी दवा प्रभावकारिता खो सकते हैं । विभिंन कंपनियों, या एक ही कंपनी से भी अलग बैचों से खरीदा DOX के लिए, यह वयस्क मछली पर प्रयोगों का आयोजन करने से पहले जंगली प्रकार (WT) zebrafish भ्रूण का उपयोग कर अपनी दवा प्रभावकारिता जांचने के लिए उपयोगी है । इस विधि एक रिपोर्ट zebrafish भ्रूण उद्योग मॉडल21से व्युत्पंन है ।

  1. WT zebrafish भ्रूण को मछली के कम से 2 जोड़े से ले लीजिए । 24 में Dechorionate भ्रूण पोस्ट-निषेचन (hpf) मैंयुअल रूप से एक माइक्रो सुई के साथ एक सिरिंज का उपयोग करके । वैकल्पिक रूप से, एक 30 डिग्री सेल्सियस मशीन में 10-15 मिनट के लिए 10 µ g/एमएल के अंतिम एकाग्रता में proteinase कश्मीर के साथ भ्रूण का इलाज । dechorionation के बाद भ्रूण का पानी रिफ्रेश करें । मृत भ्रूण को हटाने और प्रत्येक बैच के कम से ३६ भ्रूण को बनाए रखने ।
  2. १०० µ एम के अंतिम एकाग्रता के लिए ताजा भ्रूण पानी में DOX स्टॉक समाधान पतला समाधान की मात्रा हर 3 भ्रूण के लिए १०० µ एल है । भंवर द्वारा पतला DOX समाधान मिश्रण । अंतिम पतला समाधान एक प्रकाश, लाल रंग होना चाहिए ।
  3. जोड़ें १०० µ एक साफ ९६-अच्छी तरह से पारदर्शी प्लेट के पतला DOX समाधान के एल/
  4. एक प्लास्टिक हस्तांतरण पिपेट के साथ 3 dechorionated भ्रूण ले लो, और पिपेट टिप के अंत के पास भ्रूण रखने के लिए । DOX समाधान के साथ एक अच्छी तरह से पिपेट टिप रखो । टिप के अंत समाधान को छूने और भ्रूण अच्छी तरह से तैरने के लिए अनुमति देते हैं ।
    नोट: से बचने के मैंयुअल रूप से भ्रूण, जो अच्छी तरह से और DOX समाधान पतला में अधिक पानी जोड़ देगा धक्का ।
  5. DOX समाधान ४८ hpf पर ताज़ा करें । इस समय तक, मृत भ्रूण की पहचान करने के लिए 10x आवर्धन के साथ एक खुर्दबीन के नीचे कुओं का निरीक्षण (दिल की धड़कन की समाप्ति) या शोफ के साथ भ्रूण. गिनती और एक समय पर फैशन में किसी भी मृत भ्रूण को हटा दें, अंयथा शेष मृत भ्रूण के साथ समाधान के लिए उजागर भ्रूण जल्दी के रूप में अच्छी तरह से मर सकते हैं ।
  6. ७२ hpf पर भ्रूण की जांच करें और उंहें गिनती । DOX उपचार माना जाता है "अच्छी दवा प्रभावकारिता" अगर > 25% मौत (दिल की धड़कन की समाप्ति) भ्रूण के दोनों बैचों में मनाया जा सकता है ।

4. पूर्व इंजेक्शन तैयारी

नोट: 8 सप्ताह की आयु के 6 महीने की मछली DOX इंजेक्शन के लिए उपयोग किया जाता है । एक परिपक्व जंगली भारतीय कैरयोटाइप (WIK) मछली का इंजेक्शन किया जा करने के लिए शरीर के वजन (जैविक हथियारों) 0.2-0.5 जी से रेंज कर सकते हैं ।

  1. इंजेक्शन से पहले 24 घंटे के लिए मछली फास्ट ।
  2. ०.१६ मिलीग्राम/एमएल tricaine युक्त भ्रूण पानी के साथ मछली Anesthetize । शरीर के दोनों किनारों से पानी सूखने के लिए एक साफ फिल्टर पेपर का इस्तेमाल करें । एक पैमाने पर प्रत्येक मछली के BW उपाय । BW में 10% अंतर के भीतर समूह मछली बाद में इंजेक्शन के लिए एक साथ ।
    नोट: इस कदम पर कार्यभार को कम करने के लिए, BW में 10% अंतर के भीतर मछली एक ही आकार माना जाता है; इसलिए, एक DOX अपने मतलब BW के अनुसार समाधान काम कर तैयार करते हैं ।
  3. योजना के समाधान के 5 µ एल के साथ प्रत्येक वयस्क मछली इंजेक्षन करने के लिए । मछली की संख्या और जैविक हथियारों के अनुसार DOX कार्य एकाग्रता की गणना ।
    नोट: क्रोनिक cardiotoxicity का अध्ययन करने के लिए 6 महीने, 20 मिलीग्राम/किग्रा की एक खुराक पर DOX का उपयोग करें । DOX की एक्यूट cardiotoxicity का अध्ययन करने के लिए, DOX खुराक BW के ५० मिलीग्राम/किलो तक बढ़ाया जा सकता है ।
  4. इसी काम की सांद्रता के लिए 1x हांक के संतुलित नमक समाधान (HBSS) में DOX शेयर पतला । भंवर मिश्रण करने के लिए समाधान । संक्षेप में हल इकट्ठा करने के लिए नीचे स्पिन ।

5. वयस्क मछली में DOX इंजेक्शन

  1. इसके अंदर एक स्पंज के साथ एक साफ १०० mm पेट्री डिश प्लेस, एक विच्छेदन खुर्दबीन के नीचे, तो ध्यान समायोजित करें । एक मछली पकड़ करने के लिए लंबाई में लगभग 4 सेमी की एक गुहा बनाने के लिए स्पंज काटें । एक बड़ी मछली के लिए एक लंबी गुहा बनाओ ।
  2. एक 10 µ एल माइक्रो सिरिंज के साथ एक ३४ जी सुई तैयार करें. सिरिंज और टयूबिंग से किसी भी बुलबुले और ब्लॉकों को दूर करने के लिए 1x HBSS बफर के साथ सुई कुल्ला ।
  3. Anesthetize भ्रूण पानी में वयस्क मछली युक्त ०.१६ मिलीग्राम/एमएल tricaine 2 मिनट के लिए ।
    नोट: 5 मिनट से अधिक लंबे समय तक anesthetization DOX इंजेक्शन के बाद आसानी से मछली मौत का कारण बन सकता है ।
  4. tricaine के साथ भ्रूण पानी में स्पंज सोख, और इंजेक्शन के लिए स्पंज पर मछली हस्तांतरण ।
  5. या तो दो तरीकों के नीचे वर्णित द्वारा आईपी DOX इंजेक्शन प्रदर्शन ।
    1. क्लासिक आईपी इंजेक्शन29
      1. पेट के साथ मछली स्पंज की गुहा में स्थिति । जल्दी सुई डालें, एक ४५ ° कोण के साथ श्रोणि पंख के बीच midline में मछली के शरीर के लिए, और लगभग 1-2 मिमी घुसना. सभी DOX समाधान धीरे जारी । सुई बाहर खींचने से पहले 5 एस रुको । मछली के पेट में दिखने वाले लाल रंग से DOX डिलिवरी की जांच करें ।
    2. वैकल्पिक आईपी इंजेक्शन
      1. मछली बाद में सही करने के लिए पूर्वकाल के साथ स्पंज पर प्लेस । धीरे बाएं हाथ से एक कुंद अंत संदंश का उपयोग कर मछली स्थिर, और माइक्रो दाहिने हाथ से सिरिंज पकड़ो ।
      2. ऊपर का सामना करना पड़ बेवल के साथ, श्रोणि फिन के ऊपर पार्श्व रेखा के नीचे सुई की स्थिति । एक ४५ ° कोण पर 7 बजे की स्थिति की ओर इशारा करते हुए, सुई 3-4 मिमी डालने के लिए मछली गुहा श्रोणि और गुदा पंख के बीच स्थित है, और फिर धीरे गोताख़ोर दबाना । मछली के पेट में दिखने वाले लाल रंग से DOX डिलिवरी की जांच करें ।
  6. जल्दी से एक साफ पार ताजा प्रणाली पानी से भरा टैंक को इंजेक्शन मछली हस्तांतरण करने के लिए मछली ठीक करने की अनुमति । इंजेक्शन के बीच 1x HBSS बफर के साथ एक बार सुई कुल्ला ।

6. पोस्ट इंजेक्शन मछली प्रबंधन

  1. इंजेक्शन के बाद, चल संचलन के साथ प्रणाली के लिए मछली वापस । यदि संभव हो तो, DOX-इलाज मछली अलग से मुख्य प्रणाली से बचने के लिए विभिंन टैंकों कि संचलन साझा के बीच पार संक्रमण को बनाए रखने ।
  2. तेजी से वसूली के लिए एक और 24 एच के लिए इंजेक्शन मछली । पहले सप्ताह के दौरान दैनिक मछली का निरीक्षण । एक समय पर फैशन में मृत मछली को दूर करने के लिए अंय मछलियों को संक्रमण से बचने के ।
    नोट: पहले 24 घंटे के भीतर मछली मौतों इंजेक्शन की वजह से शारीरिक घावों के कारण की संभावना है ।
  3. इसके अलावा अनुदैर्ध्य टिप्पणियों के लिए DOX-तनाव मछली बनाए रखें । टैंक में अन्य मछलियों के लिए संक्रमण से बचने के लिए समय में मृत मछली निकालें ।
    नोट: मछली की संख्या एक अस्तित्व वक्र उत्पंन करने के लिए प्रलेखित हैं ।
  4. DOX-बल दिया मछली, जैसे इकोकार्डियोग्राफी30, कार्डियक फंक्शन रिपोर्टर ट्रांसजेनिक लाइन23, तैराकी चैलेंज26, और अन्य रोग phenotype के ठहराव के लिए विभिन्न प्रायोगिक परख का उपयोग करें मार्करों23.

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Representative Results

यहां, दो तरीके वयस्क zebrafish में मॉडल उद्योग के लिए आईपी इंजेक्शन प्रदर्शन करने के लिए प्रस्तुत कर रहे हैं । जबकि क्लासिक, स्थापित आईपी इंजेक्शन विधि29का उपयोग करते हुए, यह है कि इंजेक्शन DOX समाधान (लाल रंग) के स्थान से कभी भी बाहर रसना सकता है, जहां सुई प्रवेश उल्लेख किया गया था । वैकल्पिक आईपी इंजेक्शन सुई प्रवेश के लिए एक अलग स्थान का उपयोग करता है कि 3-4 मिमी जहां DOX जारी किया गया है (चित्रा 1a), जो प्रभावी रूप से रिसाव को रोकता है (आंकड़ा1b, 1C) से दूर है । दोनों तरीकों के लिए DOX के सफल प्रसव के लिए मछली पेट, जो इंजेक्शन लोकस के विपरीत पक्ष पर दिख रहा है भर में लाल रंग के तेजी से वितरण द्वारा सबूत है ।

DOX खुराक के इंजेक्शन पर ५० मिलीग्राम/वैकल्पिक आईपी विधि का उपयोग कर गंभीर विषाक्तता की ओर जाता है, जहां मछली के बहुमत एक सप्ताह (चित्रा 2) के भीतर मर जाते हैं । इसके विपरीत, DOX खुराक के इंजेक्शन पर 20 मिलीग्राम/kg वैकल्पिक IP विधि का उपयोग कर लगभग कोई मछली मौत के पहले 2 सप्ताह के दौरान और ~ 10% 4 wpi में मछली मौत (3 ए आंकड़ा) का कारण बनता है । DOX खुराक के इंजेक्शन पर 20 मिलीग्राम/उत्कृष्ट आईपी विधि प्रदर्श का उपयोग ~ 30% 4 wpi में मछली मौत (चित्रा 3सी) । मछली या तो विधि प्रदर्शन के साथ एक समान ~ 20% मछली मौत 4 wpi से 10 wpi (चित्र 3 बी, डी) ।

हम कैस्पर leveraged है ; टीजी (cmlc2: nusDsRed) मछली उद्योग मॉडल में हृदय रोग की प्रगति का आकलन करने के लिए (आंकड़ा 4a)23. पारदर्शी शरीर एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के तहत दोनों सिस्टोलिक (चित्रा 4B) और डायस्टोलिक (आंकड़ा 4c) चरणों में एक लाल दिल के प्रलेखन सक्षम बनाता है । के इंजेक्शन के बाद 20 मिलीग्राम/DOX वैकल्पिक आईपी विधि का उपयोग कर, वेंट्रिकुलर समारोह गिरावट 4 wpi (चित्रा 4d) से शुरू पता लगाया जा सकता है ।

Figure 1
चित्रा 1: इंजेक्शन मार्गों । (1a) क्लासिक आईपी इंजेक्शन के योजनाबद्ध (ख) और वैकल्पिक आईपी इंजेक्शन (ए) तरीकों । लाल वृत्त दो इंजेक्शन तरीकों के लिए आम DOX जारी साइट को इंगित करता है । हरे घेरे सुई पैठ साइटों संकेत मिलता है । दूरी एक वयस्क WIK लगभग ०.३ जी (1b, 1C) प्रतिनिधि एक सफल DOX दो intraperitoneal इंजेक्शन तरीकों का उपयोग कर वितरण का संकेत परिणाम का वजन मछली के आधार पर अनुमानित हैं । वयस्क मछली पेट के अंदर लाली इंजेक्शन के तुरंत बाद नोट किया जा सकता है । इंजेक्शन मछली एक ताजा प्रणाली पानी में 5 मिनट वसूली के बाद फिर से जांच की गई । HBSS: 1x है हांक संतुलित नमक समाधान । WT WIK zebrafish कार्यरत थे. स्केल बार: 5 मिमी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: प्रतिनिधि अस्तित्व घटता वयस्क zebrafish के साथ DOX तनाव निंनलिखित ५० मिलीग्राम/kg DOX इंजेक्शन । दिखाया WT वयस्क मछली के विभिंन बैचों में DOX इंजेक्शन के 3 सेट उंर के 3-6 महीने में कर रहे हैं । कुल में, n = 24 मछली 1x HBSS नियंत्रण समूह में कार्यरत थे, और n = 8 मछली प्रत्येक बैच में कार्यरत थे DOX के साथ इंजेक्शन । मछली के अस्तित्व में कोई अंतर नहीं दो इंजेक्शन तरीकों के बीच नोट किया गया । WT WIK zebrafish कार्यरत थे. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: प्रतिनिधि अस्तित्व घटता वयस्क zebrafish के बाद DOX तनाव के साथ 20 मिलीग्राम/kg DOX इंजेक्शन और दो intraperitoneal इंजेक्शन तरीकों के बीच तुलना. (3ए) क्लासिक intraperitoneal इंजेक्शन द्वारा DOX प्रसव के बाद 0-4 सप्ताह के भीतर मछली अस्तित्व । 0 सप्ताह में प्रतिशत मछली संख्या १००% के रूप में माना जाता था । (3बी) मछली उत्तरजीविता 4 सप्ताह के बाद क्लासिक intraperitoneal इंजेक्शन द्वारा DOX डिलिवरी पोस्ट । 4 सप्ताह में प्रतिशत मछली संख्या १००% के रूप में माना जाता था । (3सी) वैकल्पिक intraperitoneal इंजेक्शन द्वारा DOX प्रसव के बाद 0-4 सप्ताह के भीतर मछली अस्तित्व । 0 सप्ताह में प्रतिशत मछली संख्या १००% के रूप में माना जाता था । (3 डी) मछली जीवन रक्षा 4 वैकल्पिक intraperitoneal इंजेक्शन द्वारा DOX प्रसव के बाद सप्ताह के बाद । 4 सप्ताह में प्रतिशत मछली संख्या १००% के रूप में माना जाता था । में दिखाया गया डेटा (3ए) और (बी2) DOX इंजेक्शन के 9 विभिंन बैचों से एक कुल २२३ इंजेक्शन मछली की उंर के 3-6 महीने में कर रहे हैं । में दिखाया गया डेटा(3 सी) और (3d) DOX इंजेक्शन के 14 विभिंन बैचों से एक कुल ३३५ इंजेक्शन मछली की उंर के 2-6 महीने में कर रहे हैं । लाइव मछली की संख्या साप्ताहिक दर्ज की गई हैं । त्रुटि पट्टियां प्रत्येक सप्ताह में विभिंन बैचेस के बीच अस्तित्व के प्रतिशत में मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं । WT WIK zebrafish कार्यरत थे. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: प्रतिनिधि कार्डियक फंक्शन असेसमेंट निम्न DOX तनाव कैस्पर का उपयोग ; टीजी (cmlc2: nusDsRed) फिश. (4a) एक वयस्क कैस्पर की एक तस्वीर ; टीजी (cmlc2: nusDsRed) फिश. स्केल बार = 1 सेमी. (4B) एक परिपक्व कैस्पर के अंत सिस्टोलिक चरण में एक लाल निलय की प्रतिनिधि छवि ; टीजी (cmlc2: nusDsRed) फिश. डैश लाइन अंत सिस्टोलिक व्यास (एसड) का प्रतिनिधित्व करता है । (4c) एक परिपक्व कैस्पर के अंत डायस्टोलिक चरण में एक लाल निलय की प्रतिनिधि छवि ; टीजी (cmlc2: nusDsRed) फिश. में छवियां (4B) और (4c) एक धड़कन दिल की फिल्मों से निकाले गए एक फ्लोरोसेंट विच्छेदन माइक्रोस्कोप 6.3 x आवर्धन का उपयोग कर के साथ कब्जा कर लिया । डैश रेखा अंत डायस्टोलिक व्यास (EDD) का प्रतिनिधित्व करती है । स्केल बार = 1 mm. (4d) प्रतिनिधि कार्डिएक समारोह कैस्पर का उपयोग कर मापा ; टीजी (cmlc2: nuDsRed) वयस्क zebrafish बाद 20 मिलीग्राम/kg DOX injection. EDD और एसड मापा गया के रूप में (4B) और (4c) व्यक्तिगत मछली के लिए में दिखाया गया है, और वेंट्रिकुलर अंश छोटा सूत्र द्वारा गणना की है (EDD − एसड)/EDD. काफी कम वेंट्रिकुलर अंश छोटा 4 सप्ताह और उसके बाद में पाया गया था । वैकल्पिक intraperitoneal पद्धति का उपयोग किया गया । मान मतलब ± मानक त्रुटि के रूप में दिखाए जाते हैं । n प्रत्येक समूह में ≥ 3 । दो ग्रुप की तुलना के लिए स्टूडेंट टी टेस्ट का इस्तेमाल किया गया । *p < 0.05. ये आंकड़े डिंग एट अल से संशोधित किए गए हैं । 23 कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

एक प्रगतिशील उद्योग मॉडल के लिए, 20 मिलीग्राम/kg DOX की खुराक प्रयोग के रूप में सबसे अधिक खुराक है कि 1 wpi के दौरान महत्वपूर्ण मछली मौत का कारण नहीं है, लेकिन अभी भी मछली मौत और हृदय समारोह की कमी में परिणाम के रूप में निर्धारित किया गया था 4 wpi (चित्रा 3 और चित्र 4c) । यह खुराक उन अक्सर कुतर उद्योग मॉडल में इस्तेमाल किया (15-25 मिलीग्राम/) और मनुष्यों में सीमा संचयी खुराक के लिए तुलनीय है (५५० मिलीग्राम/एम2, 15 मिलीग्राम/4,7,31,३२ के बराबर है जो , ३३. DOX की अधिक खुराक, जैसे ५० मिलीग्राम/1 wpi के दौरान महत्वपूर्ण मछली मौत दिखाने के लिए, तो वे DOX23,28के लिए केवल तीव्र हृदय विषाक्त प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

इस उद्योग मॉडल के कार्यांवयन के दौरान, हमने देखा कि नए जांचकर्ताओं के लिए एक ही परिणाम शुरू में पुन: पेश करने के लिए मुश्किल था । यहां तक कि अनुभवी जांचकर्ताओं के लिए, जीर्ण चरण में मृत्यु दर का एक 20% रूपांतर के बारे में अभी भी अलग इंजेक्शन (चित्रा 3) के बीच पाया जा सकता है, मौजूदा मॉडल में विलक्षण जैविक निराधार कारकों का संकेत है । एक से कम सही मॉडल के बावजूद, हम अभी भी विश्वास है कि इस वर्तमान उद्योग मॉडल के कारण निंनलिखित सबूत के ध्वनि खोज करने के लिए पर्याप्त है । सबसे पहले, कई प्रथाओं के बाद, उद्योग मॉडल से परिणाम बाद में सबसे अधिक के बीच पंजीकृत किया जा सकता है, नहीं तो सब, जांचकर्ताओं । दूसरा, इस उद्योग मॉडल के आधार पर, हम 4 सार्थक आनुवंशिक संशोधक की पहचान की । साहित्य रिपोर्टों से मौजूदा सबूत cardiomyopathy जीन३४,३५,३६,३७के रूप में उनमें से 3 का समर्थन किया । 4वें एक DnaJ homolog उपपरिवार के बी सदस्य 6 (DNAJB6) है, जो एक नया cardiomyopathy जीन एक मानव आनुवंशिक अध्ययन28द्वारा समर्थित होना सिद्ध किया गया है । इस प्रकार, हम निष्कर्ष है कि अंतर प्रयोगात्मक समूहों के आधार पर इसरो का उपयोग कर उंर मिलान नियंत्रण अभी भी बेहद दोहराया जा रहा है, हालांकि इसके वर्तमान रूप में उद्योग के मॉडल के लिए विश्वसनीय नहीं है अंतर प्रयोगात्मक तुलना ।

प्राप्त कारकों है कि विसंगति में योगदान हमारे वर्तमान उद्योग मॉडल में मनाया जाने की संभावना निंनलिखित शामिल हैं: (1) उंर बढ़ने और लिंग-अंतर३८सहित हृदय रोगों के लिए महत्वपूर्ण जोखिम कारक के रूप में माना गया है, ३९,४०. जबकि दोनों परिकल्पना cofounders रहने के लिए हमारे मॉडल में विशेष रूप से परीक्षण किया जाएगा, हम नोटिस किया था कि वृद्ध मछली को और अधिक DOX विषाक्तता के प्रति संवेदनशील हो जाते है (नहीं दिखाया डेटा) । अंतर बैच रूपांतरों दोनों आईपी तरीकों का उपयोग कर मनाया (चित्रा 3) भी संभावना इन दो cofounders के लिए योगदान कर रहे हैं । (2) बड़े पशु मॉडल से अलग, एक वयस्क zebrafish के आकार छोटा है । इस प्रकार, DOX इंजेक्शन की वजह से स्थानीय क्षति और अधिक गंभीर और चर हो सकता है । (3) इंजेक्शन मछली की मौत के अन्य अंगों में DOX विषाक्तता से परिणाम हो सकता है (जैसे, गुर्दे विषाक्तता), दिल के अलावा. जबकि अधिक सावधानी से डिजाइन किए गए प्रयोगों के लिए aforementioned निराधार कारकों में से प्रत्येक के पते की जरूरत है, पिछले काम पता चलता है कि निंनलिखित सावधानी phenotypic विविधताओं को कम करने में मदद मिलेगी: पहला, यह DOX की प्रभावकारिता की गारंटी के लिए महत्वपूर्ण है । DOX पाउडर हमेशा एक सूखे और अंधेरे क्षेत्र में रखा जाना चाहिए, और समाधान प्रकाश के लिए जोखिम को कम करने के लिए देखभाल के साथ नियंत्रित किया जाना चाहिए । यह सिफारिश की है कि DOX काम समाधान मछली इंजेक्शन से पहले नए सिरे से हर बार तैयार हो । हम आमतौर पर भंडारण में 4 सप्ताह के बाद स्टॉक DOX समाधान का उपयोग नहीं करते । जब वहां एक शक है, इस प्रोटोकॉल में वैकल्पिक खंड 3 त्वरित भ्रूण उद्योग मॉडल का उपयोग करने के लिए प्रत्येक DOX बैच की दवा प्रभावकारिता जांचना । दूसरा, वयस्क मछली तुल्यकालन निर्णायक है । एक ही मछली तनाव को एक ही घनत्व पर उठाया जाना चाहिए, इसी तरह शरीर के आकार को सुनिश्चित करने के लिए । हम तो खुराक गणना के लिए समान जैविक हथियारों के साथ पूर्व चयन मछली । यह पहले से ही इस पूर्व चयन प्रक्रिया के लिए कुल में कई मछली के रूप में दो बार बनाए रखने की सिफारिश की है । सभी मछली पूर्व चयन प्रक्रिया से पहले 24 ज के लिए तेजी से कर रहे हैं । तीसरा, यह हमेशा इसी तरह की उंर के मछली का उपयोग करने की सिफारिश की है, और क्योंकि उनके विभिंन विकास दर और DOX को संभावित रूप से विभिंन हृदय प्रतिक्रियाओं के DOX इंजेक्शन से पहले मछली सेक्स ।

हमने पाया है कि असंगत निष्कर्ष के बहुमत एक संदिग्ध नियंत्रण समूह को जिंमेदार माना जा सकता है । इसलिए, हम जांचकर्ताओं को असली प्रयोगों का आयोजन करने से पहले DOX इंजेक्शन अभ्यास करने के लिए उद्योग मॉडल के लिए नए की सलाह देते हैं । जब 20 मिलीग्राम/केजी DOX वैकल्पिक आईपी इंजेक्शन विधि का उपयोग कर इंजेक्शन है, एक अच्छा इंजेक्शन तकनीक DOX के 1 wpi और एक अपेक्षाकृत अनुरूप मृत्यु दर के दौरान लगभग शून्य मछली मौत द्वारा संकेत दिया जा सकता 2-3 महीने के बाद DOX इंजेक्शन. सफल मॉडलिंग के लिए अंतिम सबूत कार्डियक-कार्यात्मक सूचकांक है, जो एक कैस्पर का उपयोग करके इकोकार्डियोग्राफी25,30के माध्यम से quantified जा सकता है की कमी है ; टीजी (cmlc2: nusDsRed) ट्रांसजेनिक लाइन, या एक नव विकसित पूर्व vivoआधारित कार्डियक फंक्शन परख (डेटा नहीं दिखाया गया है) का उपयोग करके ।

आईपी इंजेक्शन के अलावा, इस तरह के रेट्रो कक्षीय इंजेक्शन४१, मौखिक खिला४२, और पानी की गर्मी के रूप में अंय दवा वितरण मार्गों भी अक्सर वयस्क zebrafish में इस्तेमाल किया जाता है । हम रेट्रो कक्षीय इंजेक्शन दृष्टिकोण अपनाने नहीं था, इसके प्रत्यक्ष संचलन प्रणाली में जारी दवा के बावजूद, एक विधि की कमी के कारण सफल दवा वितरण मांय करने के लिए, के रूप में DOX की लालिमा आसानी से संभावित रक्तस्राव से नकाबपोश किया जा सकता है । हम अवशोषित लस४२, जो भोजन के साथ मिश्रित करने के लिए वयस्क मछली फ़ीड के साथ DOX embedding के माध्यम से एक मौखिक वितरण प्रोटोकॉल की कोशिश की । दुर्भाग्य से, एक 4 सप्ताह के भोजन की अवधि के भीतर इस्तेमाल १५० मिलीग्राम/kg के संचय की खुराक तक के साथ, हम किसी भी गंभीर cardiotoxicity का पालन नहीं किया, मौखिक DOX वितरण की कारगरता का सुझाव. वैकल्पिक रूप से, एक मौखिक gavage तकनीक आगे४३का पता लगाया जा सकता है । इसके अलावा, एक DOX युक्त समाधान में मछली भिगोने की मशीन प्रोटोकॉल भी एक संभावित वितरण मार्ग है कि भविष्य में परीक्षण किया जा सकता है ।

हम स्वीकार करते है कि वर्तमान उद्योग मॉडल की प्रमुख सीमाओं में से एक एकल बोल्स इंजेक्शन विधि है, जो उच्च विषाक्तता और आंतरिक अंगों को स्थानीय नुकसान में परिणाम सकता है । इस दृष्टिकोण को वर्कलोड को कम करने के लिए और प्रवाह को बढ़ाने के लिए डिज़ाइन किया गया था, ताकि आनुवंशिक स्क्रीनिंग वयस्क मछली28में एक उच्च प्रवाह में आयोजित किया जा सकता है । भविष्य में, कम मात्रा में DOX के कई इंजेक्शन के साथ मॉडल का पीछा किया जाना चाहिए, जो बेहतर दोहराऊंगा के कैंसर कीमोथेरेपी के साथ इलाज रोगियों में मनाया जाएगा ।

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Disclosures

लेखकों के हितों का कोई टकराव नहीं की घोषणा ।

Acknowledgments

इस काम के हिस्से में अमेरिकी हार्ट एसोसिएशन (14SDG18160021 YD) से एक वैज्ञानिक विकास अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था, अमेरिका NIH R01 अनुदान एचएल ८१७५३ और एचएल १०७३०४ xx, और मेयो xx के लिए फाउंडेशन ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Crossing tank Aquaneering ZHCT100 Fish breeding
Incubator ThermoFisher Maintaining embryo
3 L medium tank Aquaneering ZT280 Maintaining fish
Paramecia Carolina 131560 Food for juvenile fish
Live hatched brine shrimp in house Food for adult fish
Doxorubicin hydrochloride Sigma D1515-10MG
1.5 ml safe-lock tube Eppendorf No. 022363204 For drug storage
Aluminum foil paper Fisher 1213104 For preventing light exposure
Proteinase K Roche No. 03115887001 For dechorionating embryo
Hank's balanced salt solution (HBBS) ThermoFisher 14025076 Vehicle for DOX
100 mm petri dish Falcon 431741
10 μL NanoFil micro-syringe WPI NANOFIL For injection
34 gauge needle WPI NF34BV-2 For injection
Tricaine Argent MS-222 Anesthetizing fish
96 well plate Costar 3539 For embryo drug treatment
Transfer pipette Bel-art product F37898 For transfering embryo

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चिकित्सा अंक १३६ डॉक्सोरूबिसिन cardiomyopathy तीव्र चरण जीर्ण चरण zebrafish intraperitoneal इंजेक्शन रोग मॉडल
वयस्क Zebrafish में एक डॉक्सोरूबिसिन-प्रेरित Cardiomyopathy मॉडल
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Ma, X., Ding, Y., Wang, Y., Xu, X. A … More

Ma, X., Ding, Y., Wang, Y., Xu, X. A Doxorubicin-induced Cardiomyopathy Model in Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (136), e57567, doi:10.3791/57567 (2018).

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