Summary
Un metodo per generare un modello di cardiomiopatia indotta da doxorubicina in adulto zebrafish (Danio rerio) è descritto qui. Vengono presentati due modi alternativi di iniezione intraperitoneale e le condizioni per ridurre le variazioni tra i diversi gruppi sperimentali sono discusse.
Abstract
Il geneticamente accessibile adulto zebrafish (Danio rerio) è stato utilizzato sempre più come un modello di vertebrati per comprendere le malattie umane quali cardiomiopatia. Per la sua comodità e disponibilità a manipolazioni genetiche a resa elevata, la generazione di modelli acquisiti cardiomiopatia, ad esempio il modello di cardiomiopatia indotta da doxorubicina (DIC) in zebrafish adulto, sta aprendo le porte a nuove vie di ricerca, tra cui scoprire modificatori di cardiomiopatia tramite screening genetico in avanti. Diverso dal modello DIC zebrafish embrionali, sia iniziale acuta e poi croniche fasi di cardiomiopatia possono essere determinate nel modello zebrafish adulto DIC, consentendo lo studio dei meccanismi di segnalazione di fase-dipendente e strategie terapeutiche. Tuttavia, la variabili risultati possono essere ottenuti con il modello attuale, anche nelle mani di esperti ricercatori. Per facilitare la futura attuazione del modello DIC, presentiamo un protocollo dettagliato su come generare questo modello DIC in zebrafish adulto e descrivere due modi alternativi di iniezione intraperitoneale (IP). Più ulteriormente discutiamo le opzioni su come ridurre le variazioni per ottenere risultati affidabili e fornire suggerimenti su come interpretare correttamente i risultati.
Introduction
Doxorubicina (DOX), anche denominato adriamicina, è stato sviluppato come un farmaco anti-tumorale dai anni 19601,2. Ora è ancora attivamente usato come un farmaco chemioterapico importante per un ampio spettro di tumori. Tuttavia, applicazione clinica di DOX è stata ostacolata dalla sua tossicità dose-dipendente, soprattutto cardiotossicità caratterizzata da sintomi variabili che vanno da cambiamenti elettrocardiografici asintomatici a pericardite e scompensata cardiomiopatia 1 , 2. ad oggi, almeno tre ipotesi principali sono state sollevate per spiegare DIC, tra cui attivato reattive dell'ossigeno (ROS) specie1,3,4,5, inibizione della topoisomerasi II-β ( TOP2β)6,7e la modulazione del calcio intracellulare rilasciare1,8,9. Raccogliendo la prova suggerisce anche la predisposizione genetica come fondamentale fattore di rischio per DIC10,11,12,13. Identità di gene relativo a queste predisposizioni di DIC, tuttavia, rimangono in gran parte sconosciuti. Dexrazoxano è l'unico agente adiuvante approvato per la US Food and Drug Administration (FDA) per il trattamento di DIC, ma con limitata attuazione14,15,16, sottolineando la necessità di individuare ulteriori strategie terapeutiche. Modelli animali di DIC sono quindi esplorati per questi scopi. A causa della loro semplicità e accessibilità, studi meccanicistici su modelli DIC potrebbero avere conseguenze più ampie su altri tipi di cardiomiopatie: patogenesi comune potrebbero essere condivisa tra cardiomiopatie delle eziologie differenti, soprattutto a seguito fasi patologiche17,18,19,20.
Oltre ai modelli del roditore di DIC, modelli DIC zebrafish con un throughput più elevato sono stati sviluppati per facilitare la scoperta di nuovi fattori genetici e di terapeutica. Un modello embrionale di DIC è stato stabilito negli embrioni di zebrafish trasparente per lo screening di composti terapeutici21. Dato che le cardiomiopatie sono malattie di inizio adulto con una patogenesi progressiva, cardiomiopatia di zebrafish adulto modelli sono stati sviluppati22,23,24,25,26. Abbiamo generato il primo modello acquisito per cardiomiopatia derivanti da anemia cronica24, seguita da DIC come il secondo modello di cardiomiopatia acquisite in zebrafish adulto23. Abbiamo trovato che l'iniezione di un singolo bolo di DOX in zebrafish adulto induce la cardiotossicità che consiste in una fase acuta all'incirca entro 1 settimana post-iniezione (wpi), seguita da una fase cronica di cardiomiopatia post-all'iniezione 6 mesi. Mentre aploinsufficienza del meccanicistico bersaglio della rapamicina(mtor) migliora la cardiomiopatia nella fase cronica, si esagera mortalità dei pesci alla fase acuta, sottolineando il valore del modello adulto DIC a discernere fase-dipendente meccanismi di23. Abbiamo inoltre dimostrato che il modello DIC adulto può essere utilizzato per sollecitare una raccolta di zebrafish cardiaco (ZIC) mutanti inserzionali che vengono generati tramite un approccio basato su trasposone mutagenesi inserzionale27. Un pilota schermo identificato 3 geni noti cardiomiopatia così come DnaJ (Hsp40) omologo, sottofamiglia B e membro 6b (dnajb6b) come nuova DIC suscettibilità geni28. Di conseguenza, la generazione del modello adulto DIC in zebrafish hanno portato a una nuova metodologia che sistematicamente consente l'identificazione di geni modificatori per DIC, che integra il studio di associazione genome-wide esistente (GWAS) e quantitative trait locus (QTL ) analisi.
Durante la generazione e l'attuazione del modello DIC zebrafish adulto, abbiamo notato variazioni significative tra i diversi ricercatori e/o anche tra diverse iniezioni eseguite dallo sperimentatore stesso. La natura longitudinale del modello impone sfide alla registrazione risultati da diversi ricercatori e al processo di risoluzione dei problemi sequenza. Per facilitare l'uso di questo semplice metodo di stress che inducono cardiomiopatia di comunità di ricerca, descriviamo il nostro protocollo in dettaglio, presenti due tipi di iniezione del IP e discutere considerazioni per ridurre le variazioni tra i diversi ricercatori.
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Protocol
Tutte le procedure qui descritte sono state eseguite in conformità con la guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio (National Academies Press. 2011), e sono stati approvati dal comitato di uso e Mayo Clinic istituzionale Animal Care.
1. adulto Zebrafish preparazione
- Impostare sufficienti coppie riproduttrici in attraversamento serbatoi per acquisire almeno due volte come molti come il pesce totale necessario per l'iniezione di DOX. Se confronto pesce con diverso background genetico, allevare pesci tutti nella stessa settimana per garantire controlli di pari età.
- Raccogliere gli embrioni di pesce la mattina successiva, trasferirli a 100mm di Petri e tenerli in un'incubatrice di 28,5 ° C. Mantenere gli embrioni a bassa densità (< 100 embrioni/Petri dish).
- Aggiornare l'embrione acqua ogni giorno per evitare squilibri di sesso e rimuovere manualmente le uova morte in modo tempestivo, utilizzando una pipetta di trasferimento.
- Mettere lo stesso numero di embrioni in ciascun serbatoio (ad esempio, 60 embrioni/3 L mezzo serbatoio inizialmente) per garantire controlli appaiati densità.
- Avviare Paramisha alimentazione al momento della post-fecondazione 4 giorni (dpf).
- Ispezionare il pesce tutti i giorni durante la fase giovanile. Regolare il numero di pesci come necessario per garantire pesci simili densità.
- Quando pesce raggiunge 4 settimane di età, trasferire fino a 20 pesci in ogni nuovo carro armato medio 3 L per un'ulteriore crescita. Iniziare a nutrire i pesci con Artemia tratteggiato dal vivo.
2. preparazione e conservazione della soluzione di riserva di DOX
Nota: DOX può essere acquistato da vari bio-aziende. Il composto si acquista solitamente come una polvere in contenitori marrone scuri.
- Sciogliere completamente la polvere DOX in acqua deionizzata per garantire che grumi non sono visibili, con una concentrazione finale di 5 mg/mL come soluzione di riserva. Aliquotare 1 mL di stock DOX in ogni provetta di sicuro-blocco di 1,5 mL. Avvolgere le provette da 1,5 mL con foglio di carta alluminio per proteggere il DOX da esposizione alla luce.
Nota: Eseguire questo passaggio in una cappa chimica. - Tenere la soluzione di riserva di DOX a 4 ° C per la conservazione. Per l'archiviazione a lungo termine (> 4 settimane) di soluzione di riserva di DOX, eseguire la sezione opzionale 3 descritto di seguito.
3. controllo di qualità di DOX utilizzando embrioni di Zebrafish (opzionali)
Nota: DOX è entrambi sensibili all'umidità e luce-, quindi può perdere la sua efficacia del farmaco per la modellazione DIC Dopo stoccaggio prolungato. Per DOX acquistati da aziende diverse, o anche diversi lotti della stessa azienda, è utile calibrare la sua efficacia di droga utilizzando embrioni di zebrafish di wild type (WT) prima di condurre esperimenti sui pesci adulti. Questo metodo è derivato da un segnalato zebrafish embrionali DIC modello21.
- Raccogliere gli embrioni di zebrafish WT da almeno 2 paia di pesce. Dechorionate embrioni alle 24h post-fertilizzazione (hpf) manualmente utilizzando una siringa con un micro ago. In alternativa, è possibile trattare l'embrione con proteinasi K a concentrazione finale di 10 µ g/mL per 10-15 min in un incubatore a 30 ° C. Aggiornare l'acqua embrione dopo dechorionation. Rimuovere embrioni morti e mantenere almeno 36 embrioni di ogni lotto.
- Diluire la soluzione stock di DOX in embrione fresco acqua ad una concentrazione finale di 100 µM. Il volume della soluzione è di 100 µ l per ogni 3 embrioni. Mescolare la soluzione diluita di DOX Vortex. La soluzione finale diluita deve essere una luce, colore rosso.
- Aggiungere 100 µ l/pozzetto di soluzione diluita di DOX di un piatto trasparente pulito 96 pozzetti.
- Prendere 3 dechorionated embrioni con una pipetta di trasferimento in plastica e mantenere gli embrioni vicino alla fine della punta della pipetta. Mettere la punta della pipetta in tutti i pozzetti con soluzione DOX. Lasciate che la punta di toccare la soluzione ed gli embrioni a nuotare nel pozzo.
Nota: Evitare di spingere manualmente gli embrioni, che aggiungerà più acqua nel pozzo e diluire la soluzione DOX. - Aggiornare la soluzione DOX 48 hpf. Da questo momento, osservare i pozzi sotto un microscopio con ingrandimento 10x per identificare embrioni morti (cessazione del battito cardiaco) o embrioni con l'edema. Contare e rimuovere eventuali embrioni morti in modo tempestivo, altrimenti i rimanenti embrioni esposti alla soluzione con embrioni morti possono morire rapidamente pure.
- Verifica gli embrioni a 72 hpf e contarli. Il trattamento di DOX è considerato "l'efficacia dei farmaci buono" se > 25% morte (cessazione del battito cardiaco) può essere osservata in entrambi i batch di embrioni.
4. pre-iniezione preparazione
Nota: Pesce di 8 settimane a 6 mesi di età sono utilizzati per l'iniezione di DOX. Il peso corporeo (BWs) di un pesce selvatico indiano Karyotype (WIK) stagionato deve essere iniettato può variare da 0,2-0,5 g.
- Velocemente il pesce per 24 h prima dell'iniezione.
- Anestetizzare il pesce con acqua ed embrione tricaina 0,16 mg/mL. Utilizzare un filtro di carta pulito per asciugare l'acqua da entrambi i lati del corpo. Misurare il BW di ogni pesce su una scala. Gruppo i pesci all'interno di 10% di differenza in BW successiva iniezione.
Nota: Per ridurre al minimo il carico di lavoro in questa fase, pesci all'interno di 10% di differenza in BW sono considerati la stessa dimensione; quindi, preparare una soluzione di lavoro di DOX secondo loro media BW. - Prevede di iniettare ogni pesce adulto con 5 µ l di soluzione. Calcolare la concentrazione di DOX lavoro secondo i numeri di pesci e BWs.
Nota: Per studio cardiotossicità cronica fino a 6 mesi, utilizzare DOX ad una dose di 20 mg/kg. Per studiare la cardiotossicità acuta di DOX, la dose DOX può essere aumentata fino a 50 mg/kg di BW. - Diluire lo stock DOX 1 x soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) per concentrazioni di lavoro corrispondenti. Vortice per miscelare la soluzione. Brevemente di rotazione verso il basso per raccogliere la soluzione.
5. DOX iniezione in pesci adulti
- Posto un 100mm pulito Petri con una spugna all'interno di esso, sotto un microscopio di dissezione, quindi regolare la messa a fuoco. Tagliare il Pan di Spagna per rendere una cavità di circa 4 cm di lunghezza per tenere un pesce. Fare una cavità più lungo per un pesce più grande.
- Preparare un ago 34 G con un 10 µ l micro-siringa. Sciacquare l'ago con 1 x HBSS buffer per rimuovere eventuali bolle e blocchi dalla siringa e tubazione.
- Anestetizzare il pesce adulto in embrione acqua contenente tricaina 0,16 mg/mL per 2 min.
Nota: Amputate prolungata oltre 5 min seguito da iniezione di DOX può facilmente causare pesce morte. - Mettere a bagno la spugna in acqua di embrione con tricaina e trasferire il pesce su spugna per iniezione.
-
Eseguire l'iniezione di DOX IP da uno dei due metodi descritti di seguito.
- Classico IP iniezione29
- Posizionare il pesce con l'addome fino nella cavità della spugna. Inserire l'ago, con un 45° angolo per il corpo dei pesci in linea mediana tra le pinne pelviche e penetrare circa 1-2 mm. rilasciare rapidamente tutta la soluzione di DOX lentamente. Attendere 5 s prima di estrarre l'ago. Controllare che la fornitura DOX di un colore rosso visibile nel ventre del pesce.
- Iniezione del IP alternativo
- Mettere il pesce lateralmente sulla spugna con l'anteriore a destra. Delicatamente stabilizzare il pesce utilizzando una pinzetta punta smussata con la mano sinistra e tenere la micro-siringa con la mano destra.
- Posizionare l'ago sotto la linea laterale sopra la pinna pelvica, con lo smusso rivolto verso l'alto. Puntando alla posizione 7 in un angolo di 45 °, inserire l'ago 3-4 mm alla cavità di pesce situata tra il bacino e le pinne anali e poi premere lentamente lo stantuffo. Controllare che la fornitura DOX di un colore rosso visibile nel ventre del pesce.
- Classico IP iniezione29
- Trasferire velocemente il pesce iniettato su un incrocio pulito serbatoio riempito con acqua fresca sistema per consentire il pesce recuperare. Sciacquare l'ago una volta con 1 tampone di x HBSS tra le iniezioni.
6. dopo l'iniezione pesce Management
- Dopo l'iniezione, è possibile restituire il pesce al sistema con l'esecuzione di circolazione. Se possibile, mantenere pesce DOX-trattati separatamente dal sistema principale per evitare la contaminazione incrociata tra i diversi serbatoi che condividono la circolazione.
- Veloce il pesce iniettato per altre 24 ore per il recupero. Osservare il pesce tutti i giorni durante la prima settimana. Togliere il pesce morto in modo tempestivo per evitare il contagio di altri pesci.
Nota: Pesci morti entro le prime 24 ore sono probabilmente a causa di lesioni fisiche causate tramite l'iniezione. - Inoltre mantenere il pesce DOX-sollecitato per osservazioni longitudinali. Rimuovere i pesci morti in tempo per evitare le infezioni di altri pesci nella vasca.
Nota: I numeri di pesci sono documentati per generare una curva di sopravvivenza. - Utilizzare diversi saggi sperimentali al fenotipo dei pesci DOX-sollecitato, quali ecocardiografia30, funzione cardiaca reporter transgenici linea23, nuotare sfida26e quantificazione degli altri rimodellamento patologico marcatori23.
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Representative Results
Qui, vengono presentati due metodi per eseguire l'iniezione di IP al modello DIC in zebrafish adulto. Mentre si utilizza il classico, istituito IP metodo di iniezione29, è stato notato che la soluzione iniettata di DOX (colore rosso) potrebbe a volte fuoriuscita dalla posizione dove l'ago ha penetrato. L'iniezione di IP alternativa utilizza un percorso diverso per la penetrazione dell'ago che è 3-4 mm dal peritoneo dove viene rilasciato il DOX (Figura 1A), che impedisce efficacemente la fuoriuscita (Figura 1B, 1C). Consegna di successo di DOX nel peritoneo per entrambi i metodi è evidenziato dalla rapida distribuzione del colore rosso in tutto il ventre del pesce, che è visibile sul lato opposto del locus iniezione.
Iniezione di DOX dosato a 50 mg/kg utilizzando il metodo alternativo di IP porta a tossicità severa, dove la maggior parte dei pesci muore entro una settimana (Figura 2). Al contrario, l'iniezione di DOX dosato a 20 mg/kg se si utilizza il metodo cause alternative IP quasi nessun pesce di morte durante le prime 2 settimane e ~ 10% pesce alle 4 wpi (Figura 3A). Iniezione di DOX dosato a 20 mg/kg con il metodo classico di IP esibisce ~ 30% pesce morte alle 4 wpi (Figura 3). Pesce iniettati con entrambi i metodi presentano una simile morte ~ 20% di pesce da wpi 4 a 10 wpi (Figura 3B, D).
Noi abbiamo sfruttato il casper ; TG(cmlc2:nusDsRed) pesce per valutare la progressione di disfunzione cardiaca in DIC modello (Figura 4A)23. Il corpo trasparente consente la documentazione di un cuore rosso sia sistolica (Figura 4B) e diastolica (Figura 4) fasi sotto un microscopio fluorescente. Dopo l'iniezione di 20 mg/kg DOX utilizzando il metodo alternativo di IP, declino di funzione ventricolare può essere rilevato a partire da 4 wpi (Figura 4).
Figura 1: percorsi iniezione. Iniezione (1A) schemi di iniezione IP classico (b) e IP alternativo (a) metodi. Il cerchio rosso indica il comune DOX rilasciando il sito per i metodi di due iniezione. Cerchi verdi indicano i siti di penetrazione dell'ago. Le distanze sono stimate in base a un pesce adulto WIK risultati rappresentativi di circa 0,3 g. (1B, 1C) che indica una consegna di DOX successo utilizzando due metodi di iniezione intraperitoneale di pesatura. Rossore nel ventre del pesce adulto può notare immediatamente dopo l'iniezione. Pesce iniettati sono stati controllati nuovamente dopo 5 min di recupero in acqua un sistema di fresco. HBSS: 1 x matassa soluzione salina equilibrata. WT WIK zebrafish sono stati impiegati. Barra della scala: 5 mm. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: curve di sopravvivenza rappresentativo di zebrafish adulto che segue lo sforzo DOX con iniezione di DOX di 50 mg/kg. Vengono mostrati 3 serie di iniezioni di DOX in diversi lotti di pesci adulti WT a 3-6 mesi di età. In totale, n = 24 pesce sono stati impiegati nel gruppo di controllo 1 x HBSS e n = 8 pesci sono stati impiegati in ogni batch iniettato con DOX. Nessuna differenza nei pesci sopravvivenze sono state notate fra i metodi di due iniezione. WT WIK zebrafish sono stati impiegati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: curve di sopravvivenza rappresentativo di zebrafish adulto che segue lo sforzo DOX con iniezione di DOX di 20 mg/kg e il confronto tra due metodi di iniezione intraperitoneale. Sopravvivenza (3A), pesci all'interno di 0-4 settimane dopo la consegna DOX tramite l'iniezione intraperitoneale classico. Per cento di pesce numero alla settimana 0 è stato considerato come 100%. (3B) sopravvivenza dei pesci dopo 4 settimane dopo la consegna DOX tramite l'iniezione intraperitoneale classico. Per cento di pesce numero alla settimana 4 è stato considerato come 100%. Sopravvivenza (3C), pesci all'interno di 0-4 settimane dopo la consegna DOX tramite l'iniezione intraperitoneale alternativo. Per cento di pesce numero alla settimana 0 è stato considerato come 100%. (3D) sopravvivenza dopo 4 settimane dopo la consegna DOX tramite l'iniezione intraperitoneale alternativa di pesce. Per cento di pesce numero alla settimana 4 è stato considerato come 100%. I dati indicati in (3A) e (3B) sono 9 diversi lotti di iniezione di DOX da un totale di 223 pesce iniettato al 3-6 mesi di età. I dati indicati in (3 C) e (3D) sono 14 diversi lotti di iniezione di DOX da un totale di 335 pesce iniettato al 2-6 mesi di età. I numeri di pesci vivi sono registrati settimanalmente. Barre di errore rappresentano la deviazione standard in percentuale di sopravvivenza tra lotti diversi ogni settimana. WT WIK zebrafish sono stati impiegati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Valutazione di funzione cardiaca rappresentante segue lo sforzo DOX utilizzando casper ; TG(cmlc2:nusDsRed) pesce. Casper (4A), una fotografia di un adulto ; TG(cmlc2:nusDsRed) pesce. Barra della scala = 1 cm. (4B) immagine rappresentativa di un ventricolo rosso nella fase sistolica di fine di un casper stagionato; TG(cmlc2:nusDsRed) pesce. Linea tratteggiata rappresenta fine diametro sistolico (ESD). Immagine (4C), rappresentante di un ventricolo rosso nella fase diastolica di fine di un casper stagionato; TG(cmlc2:nusDsRed) pesce. Immagini (4B) e (4 C) sono stati estratti dal film di un cuore che batte catturato con un microscopio fluorescente dissezione con 6,3 ingrandimenti. Linea tratteggiata rappresenta il diametro diastolico fine (EDD). Barra della scala = 1 mm. (4D) rappresentante funzione cardiaca misurata utilizzando casper ; TG(cmlc2:nuDsRed) zebrafish adulto dopo l'iniezione di DOX di 20 mg/kg. EDD ed ESD sono stati misurati come mostrato in (4B) e (4C) per singolo pesce, ventricolare e riduzione della frazione è calcolata con la formula (EDD − ESD) / EDD. Significativamente ridotta frazione ventricolare accorciamento è stato rilevato a 4 settimane e da allora in poi. È stato utilizzato il metodo alternativo intraperitoneale. I valori vengono visualizzati come media ± errore standard. n ≥ 3 in ogni gruppo. Il test t di Student è stato utilizzato per il confronto dei due gruppi. p < 0.05. Queste cifre sono state modificate da Ding et al. 23 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Per modellare un DIC progressivo, la dose di 20 mg/kg DOX è stata determinata sperimentalmente come la dose massima che non provoca morte significativa dei pesci durante 1 wpi ma ancora risultati nella morte dei pesci e la riduzione della funzione cardiaca dopo 4 wpi (Figura 3 e Figura 4). Questa dose è paragonabile a quelli frequentemente utilizzati nei modelli del roditore di DIC (15-25 mg/kg) e la dose cumulativa di limite in esseri umani (550 mg/m2, che è equivalente a 15 mg/kg)4,7,31,32 , 33. le dosi elevate di DOX, ad esempio 50 mg/kg, mostrano la morte di pesce significativo durante 1 wpi, in modo che possano essere utilizzati per studiare le risposte tossiche cardiache acute solo a DOX23,28.
Durante l'implementazione di questo modello DIC, abbiamo notato che era difficile per gli investigatori di nuovi a riprodurre gli stessi risultati inizialmente. Anche per gli investigatori esperti, circa un 20% variazione di mortalità nella fase cronica si trovano ancora tra diverse iniezioni (Figura 3), che indica i fattori di confusione biologici atipici nel modello corrente. Nonostante un modello perfetto di meno, crediamo ancora che questo modello DIC corrente è sufficiente per rendere il suono scoperta a causa delle seguenti prove. In primo luogo, dopo diverse pratiche, i risultati del modello DIC possono essere successivamente registrati tra la maggior parte, se non tutti, gli investigatori. In secondo luogo, basato su questo modello DIC, abbiamo identificato 4 modificatori genetici significativi. 3 di loro come cardiomiopatia geni34,35,36,37supportata la prova esistente da rapporti della letteratura. 4th uno è membro DnaJ omologo subfamily B 6 (DNAJB6), che ha dimostrato di essere un nuovo gene di cardiomiopatia, supportato da un studio genetico umano28. Quindi, possiamo concludere che risultati basati su gruppi intra-sperimentali utilizzando comandi di pari età rigorosamente sono ancora altamente ripetibili, anche se il modello DIC nella sua forma attuale non è affidabile per il confronto Inter-sperimentale.
I fattori di confusione che contribuiscono l'incoerenza osservato nel nostro attuale modello DIC probabile includono i seguenti: (1) invecchiare e differenza di genere sono stati considerati come cruciali fattori di rischio per malattie cardiovascolari compreso DIC38, 39,40. Mentre entrambi co-fondatori ipotizzate rimangono per essere testato in modo specifico nel nostro modello, abbiamo notato che invecchiati pesci tendono ad essere più sensibili alla tossicità DOX (dati non mostrati). Le variazioni inter-batch osservate utilizzando sia metodi di IP (Figura 3) sono anche probabilmente contribuite a questi due co-fondatori. (2) diversi da modelli animali più grandi, le dimensioni di un adulto zebrafish sono piccola. Così, locali danni causati tramite l'iniezione di DOX possono essere più grave e variabile. (3) la morte di pesci iniettato potrebbe derivare da tossicità DOX in altri organi (ad es., tossicità renale), oltre a cuore. Mentre gli esperimenti più accuratamente progettati sono necessarie per affrontare ognuno dei suddetti fattori confondenti, lavoro precedente suggerisce che le seguenti precauzioni verranno aiuterà a ridurre le variazioni fenotipiche: in primo luogo, è fondamentale per garantire l'efficacia di DOX. Polvere DOX deve essere sempre in un luogo asciutto e scuro, e soluzioni devono essere maneggiati con cura per ridurre l'esposizione alla luce. È consigliabile che le soluzioni di lavoro DOX essere preparata fresca ogni volta prima dell'iniezione di pesce. In genere non usiamo soluzioni «stock» DOX dopo 4 settimane nel deposito. Quando non c'è dubbio, è possibile eseguire la sezione 3 opzionale in questo protocollo utilizzando il modello di DIC embrionale rapido per calibrare l'efficacia della droga di ogni lotto DOX. Secondo, la sincronizzazione di pesci adulti è fondamentale. Lo stesso ceppo di pesce deve essere generato presso la stessa densità, per garantire dimensioni corporee simili. Quindi pre-selezioniamo pesce con BWs simili per il calcolo della dose. Si raccomanda di mantenere almeno due volte come molti pesci in totale per questo processo di pre-selezione. Tutti i pesci sono a digiuno per 24 h prima del processo di pre-selezione. In terzo luogo, è consigliabile sempre usando i pesci di simile età e al sesso il pesce prima dell'iniezione di DOX a causa della loro tassi di crescita diversi e risposte potenzialmente differenti cardiache al DOX.
Abbiamo notato che la maggior parte delle conclusioni incoerenti potrebbe essere attribuita a un gruppo di controllo discutibile. Si consiglia pertanto, investigatori nuovi al modello DIC alle iniezioni di DOX di pratica prima di condurre esperimenti reali. Quando 20 mg/kg DOX è iniettato utilizzando il metodo di iniezione IP alternativo, una tecnica di iniezione buona può essere indicata da una quasi zero morte di pesce durante la 1 wpi di DOX e un tasso di mortalità relativamente coerente al sito di iniezione di 2-3 mesi post-DOX. La prova finale per successo di modellazione è la riduzione dell'indice cardiaco-funzionale, che può essere quantificata tramite ecocardiografia25,30, utilizzando un casper ; TG(cmlc2:nusDsRed) linea transgenica, o utilizzando una nuova concezione ex vivo-base di analisi di funzione cardiaca (dati non mostrati).
Oltre all'iniezione di IP, altri percorsi di consegna della droga come retro-orbitale iniezione41, alimentazione42e acqua incubazione orale è spesso utilizzati in zebrafish adulto. Noi non ha adottato l'approccio di iniezione retro-orbitale, nonostante la sua droga diretto rilasciando dentro il sistema di circolazione, a causa della mancanza di un metodo per convalidare la somministrazione di farmaci di successo, come il rossore di DOX possa essere facilmente mascherato da potenziali emorragie. Abbiamo provato un protocollo di consegna orale attraverso l'incorporamento di DOX con glutine assorbibile42, che è stato mescolato con i pasti per nutrire pesci adulti. Purtroppo, con fino alla dose cumulativa di 150 mg/kg utilizzato all'interno di un periodo di 4 settimane di alimentazione, non abbiamo osservato alcuna cardiotoxicity severo, suggerendo l'inefficacia della consegna orale di DOX. In alternativa, una tecnica di alimentazione mediante sonda gastrica orale potrebbe essere ulteriormente esplorato43. Inoltre, il protocollo di incubazione di pesce di ammollo in una soluzione contenente DOX è anche un percorso di consegna potenziali che poteva essere testato in futuro.
Riconosciamo che uno dei principali limiti dell'attuale modello di DIC è il metodo di iniezione singolo bolo, che potrebbe causare elevata tossicità e locale danno agli organi interni. Questo approccio è stato progettato per ridurre i carichi di lavoro e per aumentare il throughput, affinché lo screening genetico può essere condotta in un alto throughput in pesci adulti28. In futuro, dovrebbero essere perseguiti modelli con iniezioni multiple di DOX alle dosi più basse, che saranno meglio ricapitolare il DIC osservato nei pazienti oncologici trattati con chemioterapia.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano conflitti di interessi.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto in parte da una sovvenzione di sviluppo scienziato dal Associazione americana del cuore (14SDG18160021 a YD), gli Stati Uniti NIH R01 concede HL 81753 e HL 107304 a XX e la Fondazione di Mayo a XX.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Crossing tank | Aquaneering | ZHCT100 | Fish breeding |
| Incubator | ThermoFisher | Maintaining embryo | |
| 3 L medium tank | Aquaneering | ZT280 | Maintaining fish |
| Paramecia | Carolina | 131560 | Food for juvenile fish |
| Live hatched brine shrimp | in house | Food for adult fish | |
| Doxorubicin hydrochloride | Sigma | D1515-10MG | |
| 1.5 ml safe-lock tube | Eppendorf | No. 022363204 | For drug storage |
| Aluminum foil paper | Fisher | 1213104 | For preventing light exposure |
| Proteinase K | Roche | No. 03115887001 | For dechorionating embryo |
| Hank's balanced salt solution (HBBS) | ThermoFisher | 14025076 | Vehicle for DOX |
| 100 mm petri dish | Falcon | 431741 | |
| 10 μL NanoFil micro-syringe | WPI | NANOFIL | For injection |
| 34 gauge needle | WPI | NF34BV-2 | For injection |
| Tricaine | Argent | MS-222 | Anesthetizing fish |
| 96 well plate | Costar | 3539 | For embryo drug treatment |
| Transfer pipette | Bel-art product | F37898 | For transfering embryo |
References
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