Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

En doksorubicin-indusert kardiomyopati modell i voksen sebrafisk

Published: June 7, 2018 doi: 10.3791/57567
Automatic Translation
*1,2,3, *2,3, 2,3,4, 1,2,3
1Clinical and Translational Sciences Track, Mayo Clinic Graduate School of Biomedical Sciences, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Mayo Clinic, 3Division of Cardiovascular Diseases, Mayo Clinic, 4Institute of Life Science, Beijing University of Chinese Medicine
* These authors contributed equally

Summary

En metode for å generere en doksorubicin-indusert kardiomyopati modell i voksen sebrafisk (Danio rerio) er beskrevet her. To alternative måter å intraperitoneal injeksjon presenteres og forhold til å redusere variasjoner blant annet eksperimentelle diskuteres.

Abstract

Den genetisk tilgjengelig voksen sebrafisk (Danio rerio) har blitt stadig mer brukt som virveldyr modell for å forstå menneskelig sykdommer som kardiomyopati. På grunn av sin bekvemmelighet og amenability til høy gjennomstrømning genetisk manipulasjon, åpner generering av ervervet kardiomyopati modeller, som doksorubicin-indusert kardiomyopati (DIC) modellen i voksen sebrafisk, dørene til nye forskning muligheter, inkludert oppdage kardiomyopati modifikatorer via frem genetisk screening. Forskjellig fra embryonale sebrafisk DIC modellen, både første akutt og senere kronisk faser av kardiomyopati kan bestemmes i voksen sebrafisk DIC modellen muliggjør studiet av scenen-avhengige signalnettverk mekanismer og strategier. Imidlertid kan variable resultater oppnås med den gjeldende modellen, selv i hendene på erfarne etterforskere. For å lette framtidige gjennomføringen av DIC modell, presenterer vi en detaljert protokoll å generere denne DIC modellen i voksen sebrafisk og beskrive to alternative måter å intraperitoneal (IP) injeksjon. Vi diskutere ytterligere alternativer på Hvordan redusere varianter for å få pålitelige resultater og gi forslag på hvordan riktig tolke resultatene.

Introduction

Doksorubicin (DOX), også kalt Adriamycin, har blitt utviklet som en anti-neoplastic narkotika siden 1960-tallet1,2. Det er nå fortsatt aktivt brukes som en viktig chemotherapeutic stoff for et bredt spekter av svulster. Men klinisk anvendelse av DOX ble hindret av sine doseavhengig toksisitet, spesielt Kardiotoksisitet variabel symptomer mellom asymptomatiske electrocardiographic endringer Perikarditt og dekompensert kardiomyopati 1 , 2. dato minst tre store hypoteser har vært reist for å forklare DIC, inkludert aktivert reaktive oksygen arter (ROS)1,3,4,5, hemming av topoisomerase II-β ( TOP2β)6,7og modulering av intracellulær kalsium slipper1,8,9. Samler bevis også foreslår genetisk predisposisjon som en avgjørende risikofaktor for DIC10,11,12,13. Gene identiteter knyttet til disse DIC predisposisjoner, beholdes imidlertid stort sett ukjent. Dexrazoxane er den eneste adjuvant agenten godkjent av US Food and Drug Administration (FDA) for å behandle DIC, men med begrenset implementering14,15,16, understreker behovet for å identifisere flere strategier. Dyr modeller av DIC er derfor utforsket for disse formålene. På grunn av sin tilgjengelighet og enkelhet, mekanistisk studier på DIC modeller kan potensielt har bredere virkninger på andre typer cardiomyopathies: felles patogenesen kan deles blant cardiomyopathies av forskjellige etiologies, spesielt i senere patologisk stadier17,18,19,20.

I tillegg til gnager modeller av DIC, er sebrafisk DIC modeller med høyere gjennomstrømming utviklet for å lette oppdagelsen av både nye genetiske faktorer og therapeutics. En embryonale DIC modell er etablert i gjennomsiktig sebrafisk embryo for screening terapeutiske forbindelser21. Gitt at cardiomyopathies voksen utbruddet sykdommer med en progressiv patogenesen, utviklet voksen sebrafisk kardiomyopati modeller har vært22,23,24,25,26. Vi utviklet den første ervervede modellen for kardiomyopati skyldes kronisk anemi24, etterfulgt av DIC som andre ervervet kardiomyopati modell i voksen sebrafisk23. Vi fant at injeksjon av en enkelt bolus av DOX i voksen sebrafisk induserer Kardiotoksisitet som består av en akutt fase omtrent innen 1 uke etter injeksjon (wpi), etterfulgt av en kronisk fase av kardiomyopati til 6 måneder etter injeksjon. Mens haploinsufficiency av mekanistisk målet på rapamycin(mtor) ameliorates kardiomyopati på den kroniske fasen, overdriver den fiskedød på den akutte fasen, understreker verdien av voksen DIC modellen å skjelne scenen-avhengig mekanismer23. Vi viste videre at voksen DIC modellen kan brukes til en rekke sebrafisk insertional hjerte (ZIC) mutanter som genereres via en transposon-baserte insertional mutagenese tilnærming27. En pilot skjerm identifisert 3 kjent kardiomyopati gener samt DnaJ (Hsp40) homolog, gruppe B og medlem 6b (dnajb6b) som nye DIC mottakelighet gener28. Derfor generering av voksen DIC modellen i sebrafisk førte til en ny metodologi som systematisk gjør identifikasjoner av genetisk modifikatorer DIC, som utfyller den eksisterende genomet hele foreningen studie (GWAS) og kvantitative egenskap locus (QTL ) analyse.

Under generasjon og implementering av voksen sebrafisk DIC modellen, la vi merke til betydelige variasjoner blant ulike forskere og/eller selv blant annerledes innsprøytninger utført av den samme etterforskeren. Langsgående natur modellen pålegger utfordringer å registrere resultatene fra forskjellige etterforskere og sekvensiell feilsøkingsprosessen. For å lette bruken av denne enkle kardiomyopati-inducing stress metoden av forskningen fellesskapet, vi beskrive våre protokollen, finnes to typer IP injeksjon, og diskutere hensyn for å redusere variasjoner blant ulike forskere.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle prosedyrene som er beskrevet her ble utført i henhold til guiden og bruk av forsøksdyr (National Academies trykk. 2011), og de ble godkjent av Mayo Clinic institusjonelle Animal Care og bruk komiteen.

1. voksen sebrafisk forberedelse

  1. Definere tilstrekkelig avl par i krysset stridsvogner å kjøpe minst dobbelt så mange som totalt fisken nødvendig for DOX injeksjon. Hvis sammenligne fisk med ulik genetisk bakgrunn, rase alle fiskene i den samme uken slik alder-matchet kontroller.
  2. Samle fisk embryo neste morgen, overføre dem til 100 mm Petri retter og holde dem i en 28,5 ° C inkubator. Holde embryoer på lav tetthet (< 100 embryo/Petriskål).
  3. Oppdatere embryoet vann daglig for å unngå sex ubalanse og fjerne manuelt døde eggeskall i tide med en overføring pipette.
  4. Sette samme antall embryo i hvert kar (for eksempel 60 embryo/3 L medium tank først) å sikre tetthet-matchet kontroller.
  5. Starte paramecia fôring på 4 dager etter befruktning (dpf).
  6. Kontrollere fisken daglig under ungfisk-stadiet. Justere hvor fisk som nødvendig å sikre lignende fisk tetthet.
  7. Når fisk når 4 ukens av alderen, overføre opptil 20 fisk i hver nye 3 L medium tank for videre vekst. Begynn å mate fisken med live skravert saltlake reker.

2. forberedelse og lagring av DOX lagerløsning

Merk: DOX kan kjøpes fra ulike bio-selskaper. Sammensatt er vanligvis kjøpt som et pulver i mørk brun beholdere.

  1. Grundig oppløse den DOX pulveret i de-ionisert vann for å sikre at ingen klumper er synlig, med en siste konsentrasjon av 5 mg/mL som lager løsning. Aliquot 1 mL DOX aksjer i hver 1,5 mL safe-lock rør. Pakk 1,5 mL rør med aluminiumsfolie papir å beskytte DOX fra lyseksponering.
    Merk: Utføre dette trinnet i en kjemisk hette.
  2. Hold DOX lager løsningen på 4 ° C for lagring. For langtidslagring (> 4 uker) av DOX lagerløsning, utføre valgfri del 3 beskrevet nedenfor.

3. kvalitetskontroll av DOX bruker sebrafisk embryo (valgfritt)

Merk: DOX er både fukt - og lys-sensitive, så mister det narkotika effekt for modellering DIC etter lengre lagring. For DOX kjøpt fra ulike selskaper og med forskjellige partier fra samme selskap, er det nyttig å kalibrere narkotika effekt med vill-type (WT) sebrafisk embryo før gjennomfører eksperimenter på voksen fisk. Denne metoden er avledet fra en rapportert sebrafisk embryonale DIC modell21.

  1. Samle WT sebrafisk embryoer fra minst 2 par av fisk. Dechorionate embryoer på 24 timer etter befruktning (hpf) manuelt ved å bruke en sprøyte med en mikro nål. Alternativt, behandle embryoet med proteinasen K på siste konsentrasjon av 10 µg/mL i 10-15 minutter i en 30 ° C inkubator. Oppdater embryoet vannet etter dechorionation. Fjern døde embryoer og opprettholde minst 36 embryoene til hvert parti.
  2. Fortynne DOX lager løsningen i frisk embryoet vann til en siste konsentrasjon av 100 µM. Volumet av løsning er 100 µL for hver 3 embryoer. Bland utvannet DOX løsningen av vortex. Den endelige utvannet løsningen skal være lys, rød farge.
  3. Legg 100 µL/vel utvannet DOX løsning av en ren 96-brønns gjennomsiktig plate.
  4. Ta 3 dechorionated embryo med en plast overføring pipette, og holde embryoene nær slutten av pipette spissen. Sette pipette spissen i hver brønn DOX løsning. La slutten av tuppen berører løsningen og la embryoene å svømme i brønnen.
    Merk: Unngå manuelt skyve embryoer, som vil legge mer vann i brønnen og fortynne DOX løsningen.
  5. Oppdatere DOX løsningen på 48 hpf. På denne tiden, observere brønnene under et mikroskop med 10 X forstørrelse å identifisere døde embryo (opphør av hjerteslag) eller embryo med ødem. Telle og fjerne alle døde embryo i tide, ellers de gjenværende embryoene utsatt for løsningen med døde embryo kan dø raskt også.
  6. Sjekk embryoene på 72 hpf og telle dem. DOX behandlingen anses "god narkotika effekt" om > 25% død (opphør av hjerteslag) kan observeres i begge grupper av embryo.

4. før injeksjon forberedelse

Merk: Fisk 8 uker til 6 måneders alder brukes for DOX injeksjon. Kroppen vekter (BWs) til modnet Wild indiske Karyotype (WIK) fisk skal injiseres kan variere fra 0,2 til 0.5 g.

  1. Rask fisken for 24 timer før injeksjon.
  2. Bedøve fisken med embryoet vann som inneholder 0,16 mg/mL tricaine. Bruk en ren filter papir for å tørke vannet fra begge sider av kroppen. Måle BW hver fisk på en skala. Gruppere fisk innenfor 10% forskjell i BW for senere injeksjon.
    Merk: For å redusere arbeidsbelastningen på dette trinnet, fisk innenfor 10% forskjell i BW er vurdert samme størrelse; derfor forberede en DOX fungerende løsning etter middelverdien BW.
  3. Planlegg å injisere hver voksen fisk med 5 µL av løsning. Beregne DOX arbeider konsentrasjonen i henhold til fisk tall og BWs.
    Merk: for å studere kronisk Kardiotoksisitet opp til 6 måneder, bruke DOX på en dose av 20 mg/kg. For å studere akutt Kardiotoksisitet av DOX, kan DOX dosen økes til 50 mg/kg av BW.
  4. Fortynne DOX bestanden i 1 Hanks balansert salt løsning (HBSS) for tilsvarende jobbe-konsentrasjonene. Vortex å blande løsningen. Kort Nedspinning samle løsningen.

5. DOX injeksjon i voksen fisk

  1. Sted en ren 100 mm Petriskål med en svamp inni den, under disseksjon mikroskop, deretter justere fokus. Skjær svamp å gjøre et hulrom på ca 4 cm i lengde, for å holde en fisk. Lage en lengre hulrom for en større fisk.
  2. Forberede en 34 G nål 10 µL mikro-sprøyte. Skyll nålen med 1 x HBSS buffer fjerne alle bobler og blokker fra sprøyten og rør.
  3. Bedøve voksen fisken i fosteret vann som inneholder 0,16 mg/mL tricaine i 2 minutter.
    Merk: Langvarig anesthetization over 5 min etterfulgt av DOX injeksjon kan lett føre fisk død.
  4. Nyt svamp i fosteret vann med tricaine, og overføre fisken på svamp for injeksjon.
  5. Utføre IP DOX injeksjon av en av de to metodene beskrevet nedenfor.
    1. Klassisk IP injeksjon29
      1. Plasser fisken med magen opp i hulrom av svampen. Raskt sette inn nålen, en 45 ° vinkel til selve fisk i midtlinjen mellom bekken finnene, og trenge ca 1-2 mm. slipper alle DOX løsning sakte. Vente 5 s før dra ut pinnen. Sjekk DOX levering av en synlig rød farge i fisk magen.
    2. Alternativ IP injeksjon
      1. Legg fisken sidelengs på svamp med det fremre til høyre. Forsiktig stabilisere fisken med en stump slutten tang med venstre hånd, og hold den mikro-sprøyten med høyre hånd.
      2. Plasser seeded nedenfor sidelinjen over bekken fin, med skråkanten vender. Peker på 7 klokken posisjon på en vinkel på 45 grader, sette inn nålen 3-4 mm fisken hulrommet ligger mellom underlivet og anal finnene, og deretter sakte trykk ned stempelet. Sjekk DOX levering av en synlig rød farge i fisk magen.
  6. Raskt overføre injisert fisken til en ren krysset tank fylt med frisk system vann slik at fisken å gjenopprette. Skyll nålen gang med 1 x HBSS buffer mellom injeksjoner.

6. etter injeksjon fisk

  1. Etter injeksjon, returnere fisken til systemet med rennende blodsirkulasjonen. Hvis mulig, opprettholde DOX-behandlet fisk separat fra hovedsiden system å unngå kryss-smitte blant forskjellige tanker som deler sirkulasjon.
  2. Rask injisert fisken for en annen 24 h for utvinning. Observere fisken daglig i løpet av første uken. Fjern den døde fisken i tide å unngå smitte til andre fisken.
    Merk: Fisk dødsfall i de første 24 h er sannsynlig på grunn av fysiske lesjoner forårsaket av injeksjon.
  3. Videre opprettholde DOX-stresset fisken for langsgående observasjoner. Fjerne død fisk i tid for å unngå infeksjoner å annet fisken inne akvariet.
    Merk: Fisk tall er dokumentert for å generere en overlevelse kurve.
  4. Bruk annerledes eksperimentell analyser til fenotypen DOX-stresset fisken, som echocardiography30, hjertefunksjon reporter transgene linje23, svømme utfordring26og kvantifisering av andre patologisk remodeling markører23.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Her presenteres to metoder for å utføre IP injeksjon modellen DIC i voksen sebrafisk. Mens du bruker den klassiske, etablerte IP injeksjon metoden29, ble det bemerket at injisert DOX løsningen (rød farge) kan noen ganger sive ut fra plasseringen der nålen trengt. Alternativ IP injeksjon bruker et annet sted for p penetrasjon som er 3-4 mm fra peritoneum der DOX slippes (figur 1A), som effektivt forhindrer lekkasje (figur 1B, 1 C). Vellykket leveranse av DOX i peritoneum i begge er dokumentert av rask distribusjon av den røde fargen gjennom fisk magen, som er synlig på motsatt side av injeksjon locus.

Injeksjon av DOX dosert ved 50 mg/kg med metoden for alternativ IP fører til alvorlige toksisitet, hvor fleste fisk dør innen en uke (figur 2). Derimot dosert injeksjon av DOX ved 20 mg/kg med de alternative IP metoden forårsaker nesten ingen fisk død under de første to ukene og ~ 10% fisk død på 4 wpi (figur 3A). Injeksjon av DOX dosert ved 20 mg/kg med metoden for klassisk IP utstillinger ~ 30% fisk død 4 wpi (Figur 3 c). Fisk injisert med disse metodene viser en lignende ~ 20% fisk død fra 4 wpi 10 wpi (figur 3B, D).

Vi har også casper; TG(cmlc2:nusDsRed) fisk å vurdere utviklingen av cardiac dysfunksjon i DIC modell (figur 4A)23. Gjennomsiktig kroppen kan dokumentasjon av et rødt hjerte både systolisk (figur 4B) og diastolisk (figur 4C) stadier under fluorescerende mikroskop. Etter injeksjon av 20 mg/kg DOX bruker den alternative IP-metoden, kan ventrikkel funksjonen nedgangen oppdages fra 4 wpi (Figur 4 d).

Figure 1
Figur 1: injeksjon ruter. (1A) skjematisk av klassisk IP injeksjon (b) og alternativ IP injeksjon (a) metoder. Den røde sirkelen angir det vanlige DOX slippe nettsted for to injection metoder. Grønne sirkler indikere nålen penetrasjon nettsteder. Avstanden er beregnet basert på en voksen WIK fisk veier ca 0,3 g. (1B, 1 C) representant resultater indikerer en vellykket DOX levering bruker to intraperitoneal injection metoder. Rødhet i voksen fisk magen kan noteres umiddelbart etter injeksjon. Injisert fisk ble sjekket igjen etter 5 min utvinning i en frisk system vann. HBSS: 1 x Hanks balansert salt løsning. WT WIK sebrafisk var ansatt. Skala bar: 5 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: representant overlevelse kurver av voksen sebrafisk etter DOX stress med 50 mg/kg DOX injeksjon. Vises 3 sett med DOX injeksjoner i forskjellige grupper av WT voksne fisk på 3-6 måneder av alderen. I totalt, n = 24 fisk var ansatt i 1 x HBSS kontroll grupper og n = 8 fisk var ansatt i hver gruppe injisert med DOX. Ingen forskjell i fisk overlevelse var registrert mellom to injection metoder. WT WIK sebrafisk var ansatt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: representant overlevelse kurver av voksen sebrafisk etter DOX stress med 20 mg/kg DOX injeksjon og sammenligningen mellom to intraperitoneal injection metoder. (3A) fisk overlevelse i 0-4 uker etter DOX levering av klassiske intraperitoneal injeksjon. Prosent fisk nummeret på week 0 ble ansett som 100%. (3B) fisk overlevelse etter 4 uker post DOX levering av klassiske intraperitoneal injeksjon. Prosent fisk nummeret på uke 4 ble ansett som 100%. (3 C) fisk overlevelse i 0-4 uker etter DOX levering av alternativ intraperitoneal injeksjon. Prosent fisk nummeret på week 0 ble ansett som 100%. (3D) fisk overlevelse etter 4 uker etter DOX levering av alternativ intraperitoneal injeksjon. Prosent fisk nummeret på uke 4 ble ansett som 100%. Dataene som vises i (3A) og (3B) er 9 forskjellige grupper av DOX injeksjon fra en total 223 injisert fisk på 3-6 måneder av alderen. Dataene som vises i (3 C) og (3D) er 14 forskjellige grupper av DOX injeksjon fra en total 335 injisert fisk på 2-6 måneder av alderen. Antall levende fisk registreres ukentlig. Feilfelt representerer standardavviket i prosent av overlevelse blant forskjellige bunker på hver uke. WT WIK sebrafisk var ansatt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Representant hjertefunksjon vurdering etter DOX stress med casper; TG(cmlc2:nusDsRed) fisk. (4A) et bilde av en voksen casper; TG(cmlc2:nusDsRed) fisk. Skala bar = 1 cm. (4B) representativt bilde av en rød ventrikkel på slutten systolisk scenen for en modnet casper; TG(cmlc2:nusDsRed) fisk. Linje av streker representerer slutten systolisk diameter (ESD). (4 C) representant bildet av en rød ventrikkel på slutten diastolisk scenen for en modnet casper; TG(cmlc2:nusDsRed) fisk. Bilder i (4B) og (4 C) var Hentet fra filmer av en bankende hjerte tatt med fluorescerende disseksjon mikroskop med 6,3 x forstørrelse. Linje av streker representerer slutten diastolisk diameter (EDD). Skala bar = 1 mm. (4 D) representant hjertefunksjon målt ved hjelp av casper; TG(cmlc2:nuDsRed) voksen sebrafisk etter 20 mg/kg DOX injeksjon. EDD og ESD ble målt som vist i (4B) og (4 C) for individuelle fisk, og ventrikkel brøkdel forkorte beregnes formelen (EDD − ESD) / EDD. Betydelig ble redusert ventrikkel brøkdel forkorte oppdaget på fire uker og deretter. Bruk av alternative intraperitoneal metoden. Vises som gjennomsnittlig ± standardfeilen. n ≥ 3 i hver gruppe. Student t test ble brukt for sammenligning av to grupper. p < 0,05. Disse tallene har blitt endret fra Ding et al. 23 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

For å modellere en progressiv DIC, identifiserte dosen av 20 mg/kg DOX eksperimentelt som høyeste dosen som ikke forårsaker betydelig fisk død under 1 wpi men fortsatt resultater i fisk død og reduksjon av hjertefunksjon etter 4 wpi (Figur 3 og Figur 4C). Denne dose sammenlignes de brukte i gnager DIC modeller (15-25 mg/kg) og grense kumulative dosen hos mennesker (550 mg/m2, noe som tilsvarer 15 mg/kg)4,7,31,32 , 33. høyere doser av DOX, som 50 mg/kg, viser betydelig fisk død under 1 wpi, så de kan brukes til å studere bare akutte hjerte giftig svar til DOX23,28.

Under implementeringen av denne DIC modellen merket vi at det var vanskelig for nye etterforskere til å reprodusere de samme resultatene først. Selv for erfarne etterforskere, om 20% finnes variant av dødelighet i kronisk fase fortsatt blant annet injeksjoner (Figur 3), som angir uncharacterized biologiske forvirrende faktorer i gjeldende modell. Til tross for en mindre enn perfekt modell tror vi fortsatt at denne gjeldende DIC-modellen er nok å lage lyd-funnet på grunn av følgende bevis. Først etter flere praksis registreres resultatene fra DIC modellen senere blant de fleste, om ikke alle, etterforskere. Andre, basert på denne DIC modellen, vi identifisert 4 meningsfull genetisk modifikatorer. Eksisterende bevis fra litteratur rapporter støttes 3 av dem som kardiomyopati gener34,35,36,37. 4th en er DnaJ homolog gruppe B-medlem 6 (DNAJB6), som har vist seg for å være en ny kardiomyopati genetisk støttes av en menneskelig genetisk studie28. Derfor konkluderer vi at resultater basert på intra eksperimentelle grupper strengt alder-matchet kontroller er fortsatt svært gjentas, men DIC modellen i sin nåværende form ikke er pålitelig for Inter eksperimentelle sammenligning.

De forvirrende faktorene som bidrar til inkonsekvensen observert i vår nåværende DIC modell sannsynlig inkluderer følgende: (1) aldring og kjønnsforskjeller har vært betraktet som avgjørende risikofaktorer for kardiovaskulære sykdommer, inkludert DIC38, 39,40. Mens begge hypotetisk gjennomsnitt cofounders gjenstår å bli testet i vår modell spesielt, la vi merke til at alderen fisk pleier å være mer følsomme for DOX toksisitet (data ikke vist). Mellom satsvise variasjonene observert med både IP metoder (Figur 3) er også trolig bidratt til disse to cofounders. (2) forskjellig fra dyr modeller: størrelsen på en voksen sebrafisk er liten. Dermed kan være lokale skader forårsaket av DOX injeksjon mer alvorlige og variabel. (3) død injisert fisk kan skyldes DOX toksisitet i andre organer (f.eks, nyre toksisitet) i tillegg til hjertet. Mens mer nøye utformet eksperimenter er nødvendig å ta opp hver av de nevnte forvirrende faktorene, tidligere arbeid antyder at følgende advarsler vil bidra til å redusere fenotypiske variasjoner: først, er det avgjørende å garantere effekten av DOX. DOX pulver bør alltid oppbevares i et tørt og mørkt område, og løsninger bør håndteres med forsiktighet for å redusere eksponering for lys. Det anbefales at DOX arbeider løsninger tilberedes ferskt før fisk injeksjon. Vi vanligvis bruker ikke lager DOX løsninger etter 4 uker i lagring. Når det er tvil, utføre valgfri del 3 i denne protokollen ved hjelp av rask embryonale DIC modellen for å kalibrere narkotika effekten av hver DOX satsvis. Andre voksne fisk synkroniseringen er avgjørende. Den samme fisk stammen må heves på samme tetthet, slik lignende kroppsstørrelse. Vi deretter forhåndsvelge fisk med lignende BWs dose beregningen. Det anbefales å opprettholde minst dobbelt så mange fisk i totalt for pre-utvalget prosessen. Alle fisken er fastet for 24 timer før før valget. Tredje anbefales det å alltid bruke fisk av samme alder og kjønn fisken før DOX injeksjon på grunn av deres forskjellige vekst og potensielt forskjellige cardiac svar til DOX.

Vi la merke til at flertallet av inkonsekvent konklusjoner kan tilskrives en tvilsom kontrollgruppe. Derfor anbefaler vi etterforskere nye DIC modellen til praksis DOX injeksjoner før gjennomfører virkelige eksperimenter. Når 20 mg/kg DOX injiseres med metoden for alternative IP-injeksjon, kan en god injeksjon teknikk angis med en nesten null fisk død under 1 wpi DOX og en relativt konsistent dødelighet på 2-3 måneder innlegg-DOX injeksjon. Det ultimate beviset for vellykket modellering er reduksjon av hjerte-fungerende indeksen, som kan kvantifiseres via echocardiography25,30, ved hjelp av en casper; TG(cmlc2:nusDsRed) transgene linje, eller ved hjelp av et nyutviklet ex vivo-basert hjertefunksjon analysen (data ikke vist).

I tillegg til IP injeksjon, andre stoffet levering ruter som retro-orbital innsetting41, er oral fôring42og vann inkubasjon også ofte brukt i voksen sebrafisk. Vi ikke vedta retro-orbital innsetting tilnærming, til tross for sin direkte narkotika ut i sirkulasjon systemet, på grunn av mangel på en metode for å validere vellykket levering, som rødhet i DOX kan lett bli maskert av potensielle blødning. Vi prøvde en muntlig levering protokoll gjennom embedding DOX med absorberbare gluten42, som ble blandet med mat å mate voksne fisk. Dessverre, med opptil akkumulative dosen av 150 mg/kg brukes innenfor en 4 ukers perioden, vi ikke observerer noen alvorlig Kardiotoksisitet, foreslå ineffectiveness av muntlig DOX levering. Alternativt kan en muntlig gavage teknikk være ytterligere utforsket43. Videre er inkubasjon protokollen for soaking fisk i en løsning som inneholder DOX også en potensiell levering-rute som kunne bli testet i fremtiden.

Vi erkjenner at en av viktigste begrensningene for gjeldende DIC modell er enkel bolusdose injeksjon metoden, som kan resultere i høy giftighet og lokale skader til indre organer. Denne tilnærmingen ble utviklet å redusere arbeidsbelastningen og øke gjennomstrømmingen, slik at genetisk screening kan gjennomføres på en høy gjennomstrømning i voksen fisk28. I fremtiden, kompetansesentre modeller med flere injeksjoner av DOX ved lavere doser, som vil bedre recapitulate DIC observert i cancer pasienter behandlet med kjemoterapi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ikke interessekonflikter.

Acknowledgments

Dette arbeidet var støttes delvis av en forsker Development Grant fra American Heart Association (14SDG18160021 til YD), amerikanske NIH R01 gir HL 81753 og HL 107304 til XX, og Mayo grunnlaget til XX.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Crossing tank Aquaneering ZHCT100 Fish breeding
Incubator ThermoFisher Maintaining embryo
3 L medium tank Aquaneering ZT280 Maintaining fish
Paramecia Carolina 131560 Food for juvenile fish
Live hatched brine shrimp in house Food for adult fish
Doxorubicin hydrochloride Sigma D1515-10MG
1.5 ml safe-lock tube Eppendorf No. 022363204 For drug storage
Aluminum foil paper Fisher 1213104 For preventing light exposure
Proteinase K Roche No. 03115887001 For dechorionating embryo
Hank's balanced salt solution (HBBS) ThermoFisher 14025076 Vehicle for DOX
100 mm petri dish Falcon 431741
10 μL NanoFil micro-syringe WPI NANOFIL For injection
34 gauge needle WPI NF34BV-2 For injection
Tricaine Argent MS-222 Anesthetizing fish
96 well plate Costar 3539 For embryo drug treatment
Transfer pipette Bel-art product F37898 For transfering embryo

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Octavia, Y., et al. Doxorubicin-induced cardiomyopathy: from molecular mechanisms to therapeutic strategies. J Mol Cell Cardiol. 52 (6), 1213-1225 (2012).
  2. Singal, P. K., Iliskovic, N. Doxorubicin-induced cardiomyopathy. N Engl J Med. 339 (13), 900-905 (1998).
  3. Angsutararux, P., Luanpitpong, S., Issaragrisil, S. Chemotherapy-Induced Cardiotoxicity: Overview of the Roles of Oxidative Stress. Oxid Med Cell Longev. , 795602 (2015).
  4. Ichikawa, Y., et al. Cardiotoxicity of doxorubicin is mediated through mitochondrial iron accumulation. J Clin Invest. 124 (2), 617-630 (2014).
  5. Zhang, Y. W., Shi, J., Li, Y. J., Wei, L. Cardiomyocyte death in doxorubicin-induced cardiotoxicity. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 57 (6), 435-445 (2009).
  6. Sawyer, D. B. Anthracyclines and heart failure. N Engl J Med. 368 (12), 1154-1156 (2013).
  7. Zhang, S., et al. Identification of the molecular basis of doxorubicin-induced cardiotoxicity. Nat Med. 18 (11), 1639-1642 (2012).
  8. Dodd, D. A., et al. Doxorubicin cardiomyopathy is associated with a decrease in calcium release channel of the sarcoplasmic reticulum in a chronic rabbit model. J Clin Invest. 91 (4), 1697-1705 (1993).
  9. Mitry, M. A., Edwards, J. G. Doxorubicin induced heart failure: Phenotype and molecular mechanisms. Int J Cardiol Heart Vasc. 10, 17-24 (2016).
  10. Aminkeng, F., et al. A coding variant in RARG confers susceptibility to anthracycline-induced cardiotoxicity in childhood cancer. Nat Genet. 47 (9), 1079-1084 (2015).
  11. Deng, S., et al. Dystrophin-deficiency increases the susceptibility to doxorubicin-induced cardiotoxicity. Eur J Heart Fail. 9 (10), 986-994 (2007).
  12. Leong, S. L., Chaiyakunapruk, N., Lee, S. W. Candidate Gene Association Studies of Anthracycline-induced Cardiotoxicity: A Systematic Review and Meta-analysis. Sci Rep. 7 (1), 39 (2017).
  13. Wasielewski, M., et al. Potential genetic predisposition for anthracycline-associated cardiomyopathy in families with dilated cardiomyopathy. Open Heart. 1 (1), e000116 (2014).
  14. Lebrecht, D., et al. Dexrazoxane prevents doxorubicin-induced long-term cardiotoxicity and protects myocardial mitochondria from genetic and functional lesions in rats. Br J Pharmacol. 151 (6), 771-778 (2007).
  15. QuanJun, Y., et al. Protective Effects of Dexrazoxane against Doxorubicin-Induced Cardiotoxicity: A Metabolomic Study. PLoS One. 12 (1), e0169567 (2017).
  16. Seifert, C. F., Nesser, M. E., Thompson, D. F. Dexrazoxane in the prevention of doxorubicin-induced cardiotoxicity. Ann Pharmacother. 28 (9), 1063-1072 (1994).
  17. Adams, J. W., et al. Enhanced Galphaq signaling: a common pathway mediates cardiac hypertrophy and apoptotic heart failure. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (17), 10140-10145 (1998).
  18. Bowles, N. E., Bowles, K. R., Towbin, J. A. The "final common pathway" hypothesis and inherited cardiovascular disease. The role of cytoskeletal proteins in dilated cardiomyopathy. Herz. 25 (3), 168-175 (2000).
  19. Kroumpouzou, E., et al. Common pathways for primary hypertrophic and dilated cardiomyopathy. Hybrid Hybridomics. 22 (1), 41-45 (2003).
  20. Towbin, J. A., Bowles, K. R., Bowles, N. E. Etiologies of cardiomyopathy and heart failure. Nat Med. 5 (3), 266-267 (1999).
  21. Liu, Y., et al. Visnagin protects against doxorubicin-induced cardiomyopathy through modulation of mitochondrial malate dehydrogenase. Sci Transl Med. 6 (266), 266ra170 (2014).
  22. Asimaki, A., et al. Identification of a new modulator of the intercalated disc in a zebrafish model of arrhythmogenic cardiomyopathy. Sci Transl Med. 6 (240), 240ra274 (2014).
  23. Ding, Y., et al. Haploinsufficiency of target of rapamycin attenuates cardiomyopathies in adult zebrafish. Circ Res. 109 (6), 658-669 (2011).
  24. Sun, X., et al. Cardiac hypertrophy involves both myocyte hypertrophy and hyperplasia in anemic zebrafish. PLoS One. 4 (8), e6596 (2009).
  25. Sun, Y., et al. Activation of the Nkx2.5-Calr-p53 signaling pathway by hyperglycemia induces cardiac remodeling and dysfunction in adult zebrafish. Dis Model Mech. 10 (10), 1217-1227 (2017).
  26. Yang, J., Shah, S., Olson, T. M., Xu, X. Modeling GATAD1-Associated Dilated Cardiomyopathy in Adult Zebrafish. J Cardiovasc Dev Dis. 3 (1), (2016).
  27. Ding, Y., et al. Trapping cardiac recessive mutants via expression-based insertional mutagenesis screening. Circ Res. 112 (4), 606-617 (2013).
  28. Ding, Y., et al. A modifier screen identifies DNAJB6 as a cardiomyopathy susceptibility gene. JCI Insight. 2 (8), (2017).
  29. Kinkel, M. D., Eames, S. C., Philipson, L. H., Prince, V. E. Intraperitoneal injection into adult zebrafish. J Vis Exp. (42), (2010).
  30. Wang, L. W., et al. Standardized echocardiographic assessment of cardiac function in normal adult zebrafish and heart disease models. Dis Model Mech. 10 (1), 63-76 (2017).
  31. Desai, V. G., et al. Development of doxorubicin-induced chronic cardiotoxicity in the B6C3F1 mouse model. Toxicol Appl Pharmacol. 266 (1), 109-121 (2013).
  32. Zhu, W., Shou, W., Payne, R. M., Caldwell, R., Field, L. J. A mouse model for juvenile doxorubicin-induced cardiac dysfunction. Pediatr Res. 64 (5), 488-494 (2008).
  33. Chatterjee, K., Zhang, J., Honbo, N., Karliner, J. S. Doxorubicin cardiomyopathy. Cardiology. 115 (2), 155-162 (2010).
  34. Bang, C., et al. Cardiac fibroblast-derived microRNA passenger strand-enriched exosomes mediate cardiomyocyte hypertrophy. J Clin Invest. 124 (5), 2136-2146 (2014).
  35. Rassaf, T., Kelm, M. Protection from diabetic cardiomyopathy - putative role of the retinoid receptor-mediated signaling. J Mol Cell Cardiol. 59, 179-180 (2013).
  36. Wahbi, K., et al. Dilated cardiomyopathy in patients with mutations in anoctamin 5. Int J Cardiol. 168 (1), 76-79 (2013).
  37. Zhou, M. D., Sucov, H. M., Evans, R. M., Chien, K. R. Retinoid-dependent pathways suppress myocardial cell hypertrophy. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (16), 7391-7395 (1995).
  38. Hershman, D. L., et al. Doxorubicin, cardiac risk factors, and cardiac toxicity in elderly patients with diffuse B-cell non-Hodgkin's lymphoma. J Clin Oncol. 26 (19), 3159-3165 (2008).
  39. Silber, J. H., Barber, G. Doxorubicin-induced cardiotoxicity. N Engl J Med. 333 (20), 1359-1360 (1995).
  40. Von Hoff, D. D., et al. Risk factors for doxorubicin-induced congestive heart failure. Ann Intern Med. 91 (5), 710-717 (1979).
  41. Pugach, E. K., Li, P., White, R., Zon, L. Retro-orbital injection in adult zebrafish. J Vis Exp. (34), (2009).
  42. Zang, L., Morikane, D., Shimada, Y., Tanaka, T., Nishimura, N. A novel protocol for the oral administration of test chemicals to adult zebrafish. Zebrafish. 8 (4), 203-210 (2011).
  43. Collymore, C., Rasmussen, S., Tolwani, R. J. Gavaging adult zebrafish. J Vis Exp. (78), (2013).

Tags

Medisin problemet 136 doksorubicin kardiomyopati akutt fase kronisk fase sebrafisk intraperitoneal injeksjon sykdom modell
En doksorubicin-indusert kardiomyopati modell i voksen sebrafisk
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ma, X., Ding, Y., Wang, Y., Xu, X. A … More

Ma, X., Ding, Y., Wang, Y., Xu, X. A Doxorubicin-induced Cardiomyopathy Model in Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (136), e57567, doi:10.3791/57567 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter