Summary
Um método para gerar um modelo de cardiomiopatia induzida pela doxorrubicina em adulto peixe-zebra (Danio rerio) é descrito aqui. Apresentam-se duas formas alternativas de injeção intraperitoneal e condições para reduzir as variações entre diferentes grupos experimentais são discutidas.
Abstract
O geneticamente acessível adulto peixe-zebra (Danio rerio) tem sido cada vez mais usado como um modelo de vertebrados para a compreensão de doenças humanas, tais como cardiomiopatia. Devido à sua conveniência e acessibilidade para manipulações genéticas de alta produtividade, a geração de modelos de cardiomiopatia adquirida, como o modelo de cardiomiopatia induzida por doxorrubicina (DIC) no zebrafish adulto, está abrindo as portas para novos caminhos de pesquisa, inclusive descobrindo modificadores de cardiomiopatia através de rastreamento genético para a frente. Diferente do modelo embrionário zebrafish DIC, tanto inicial aguda e posteriormente crônicas fases de cardiomiopatia podem ser determinadas no modelo adulto zebrafish DIC, permitindo o estudo dos mecanismos de sinalização dependente de palco e estratégias terapêuticas. No entanto, a variáveis resultados podem ser obtidos com o modelo atual, mesmo nas mãos de investigadores experientes. Para facilitar a futura implementação do modelo de DIC, apresentamos um protocolo detalhado sobre como gerar este modelo DIC no zebrafish adulto e descrever duas maneiras alternativas de injeção intraperitoneal (IP). Vamos voltar a discutir opções sobre como reduzir variações para obter resultados fiáveis e fornece sugestões sobre como interpretar adequadamente os resultados.
Introduction
Doxorrubicina (DOX), também chamada Adriamicina, foi desenvolvida como uma droga anti-neoplásicos desde a década de 1960,1,2. Agora é ainda ativamente utilizado como uma droga de quimioterápico importante para um amplo espectro de tumores. No entanto, aplicação clínica da DOX foi prejudicada por sua toxicidade dose-dependente, especialmente a cardiotoxicidade caracterizada por sintomas variáveis, variando de alterações eletrocardiográficas assintomáticas a pericardite e descompensada cardiomiopatia 1 , 2. até à data, pelo menos, três grandes hipóteses têm sido levantadas para explicar a DIC, incluindo registrados reativas de oxigênio (ROS) de espécies1,3,4,5, inibição da topoisomerase II-β ( TOP2β)6,7e modulação de cálcio intracelular release1,8,9. Acumular evidência também sugere predisposição genética como fator de risco importante para DIC10,11,12,13. Identidades de gene relacionado com estas predisposições DIC, no entanto, permanecem em grande parte desconhecidos. Dexrazoxane é o único agente adjuvante aprovado pelo Food and Drug Administration (FDA) para tratar o DIC, mas com aplicação limitada14,15,16, ressaltando a necessidade de identificar adicionais estratégias terapêuticas. Modelos animais de DIC, portanto, são explorados para estes fins. Devido à sua acessibilidade e simplicidade, mecanicistas estudos sobre modelos DIC potencialmente poderiam ter impactos mais amplos em outros tipos de cardiomiopatias: patogênese comum pode ser compartilhado entre cardiomiopatias de diferentes etiologias, especialmente à tarde estágios patológicos17,18,19,20.
Além de modelos de roedores de DIC, modelos DIC zebrafish com uma taxa de transferência foram desenvolvidos para facilitar a descoberta de novos fatores genéticos e terapêutica. Um modelo DIC embrionário foi estabelecido nos embriões de peixe-zebra transparente para a seleção de compostos terapêuticos21. Dado que as miocardiopatias são doenças de início adulto com uma patogênese progressiva, cardiomiopatia zebrafish adulto modelos têm sido desenvolvidos22,23,24,25,26. Geramos o primeiro modelo adquirido para cardiomiopatia resultante da anemia crônica24, seguido por DIC como o segundo modelo de cardiomiopatia adquirida no zebrafish adultos23. Nós achamos que a injeção de um único bolus de DOX em zebrafish adulto induz cardiotoxicidade que consiste de uma fase aguda, mais ou menos dentro de injeção de pós de 1 semana (wpi), seguida por uma fase crônica de cardiomiopatia de injeção após 6 meses. Enquanto haploinsuficiência do alvo da rapamicina mecanicista(mtor) melhora a cardiomiopatia na fase crônica, ele exagera peixe mortalidade na fase aguda, ressaltando o valor do modelo adulto DIC para discernir a fase dependente mecanismos de23. Mais demonstrámos que o modelo DIC adulto pode ser usado para salientar uma coleção de zebrafish insercional cardíaca (ZIC) mutantes que estão sendo gerados através de uma abordagem de mutagênese insercional baseados em transposon27. Uma tela piloto identificado 3 genes de cardiomiopatia conhecida bem como DnaJ (Hsp40) homólogo, subfamília B e membro 6b (dnajb6b) como novo DIC genes de suscetibilidade28. Portanto, a geração do modelo adulto DIC no zebrafish levou a uma nova metodologia que permite a identificação de modificadores genéticos para DIC, que complementa o estudo de associação de genoma-largo existente (GWAS) e locus traço quantitativos (QTL sistematicamente ) análise.
Durante a geração e implementação do modelo adulto zebrafish DIC, notamos variações significativas entre os diferentes pesquisadores e/ou mesmo entre diferentes injecções realizadas pelo mesmo investigador. A natureza longitudinal do modelo impõe desafios para registrar os resultados de diferentes investigadores e ao processo de solução de problemas sequencial. Para facilitar o uso desse método simples stress induzindo cardiomiopatia pela comunidade de pesquisa, descrevemos nosso protocolo detalhadamente, presentes dois tipos de injeção do IP e discutir considerações para reduzir as variações entre diferentes pesquisadores.
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Protocol
Todos os procedimentos descritos aqui foram realizados de acordo com o guia para o cuidado e o uso de animais de laboratório (academias nacionais imprensa. 2011), e foram aprovados pelo Comitê de uso e Mayo Clinic institucional Cuidado Animal.
1. adultos Zebrafish preparação
- Configure o suficiente casais reprodutores cruzando tanques para adquirir pelo menos duas vezes como muitos como o peixe total necessário para a injeção de DOX. Se comparando peixes com diferentes origens genéticas, todos os peixes se reproduzem dentro da mesma semana para assegurar controles idade.
- Recolher os embriões de peixe na manhã seguinte, transferi-los para pratos de Petri de 100mm e mantê-los em uma incubadora de 28,5 ° C. Manter os embriões em uma densidade baixa (< 100 embriões/placa de Petri).
- Atualizar o diário da água do embrião para evitar desequilíbrios de sexo e remover manualmente os ovos mortos em tempo hábil com uma pipeta de transferência.
- Colocar o mesmo número de embriões em cada tanque (por exemplo, 60 embriões/3 L de meio tanque inicialmente) para assegurar a densidade-controles.
- Comece paramécios alimentando na fertilização de pós 4 dias (dpf).
- Inspecione o peixe diariamente durante a fase juvenil. Ajustar o número de peixes conforme necessário para garantir o peixe similar densidade.
- Quando o peixe atingir 4 semanas de idade, transferi até 20 peixes para cada novo tanque médio de 3L para subsequente crescimento. Começa a alimentar o peixe com artêmias. hachuradas ao vivo.
2. preparação e armazenamento da solução-mãe DOX
Nota: DOX pode ser comprado de várias empresas-bio. O composto é geralmente adquirido como um pó em recipientes de marrons escuros.
- Dissolva completamente o pó DOX em água deionizada para assegurar que não aglomerados são visíveis, com uma concentração final de 5 mg/mL como solução-mãe. Alíquotas de 1ml de estoque DOX em cada tubo de segurança-bloqueio de 1,5 mL. Envolva os tubos de 1,5 mL com papel da folha de alumínio para proteger o DOX da exposição à luz.
Nota: Execute esta etapa em uma capa de química. - Manter a solução estoque de DOX a 4 ° C para armazenamento. Para armazenamento a longo prazo (> 4 semanas) de solução-mãe de DOX, executar a seção opcional 3 descrito abaixo.
3. controle de qualidade da DOX utilizando embriões de peixe-zebra (opcionais)
Nota: DOX é ambos e luz-sensíveis à umidade, assim ele pode perder sua eficácia de drogas para modelagem DIC após armazenamento prolongado. Para DOX comprado de empresas diferentes, ou mesmo diferentes lotes da mesma empresa, é útil calibrar sua eficácia de drogas usando embriões de zebrafish do selvagem-tipo (WT) antes de realizar os experimentos no peixe adulto. Este método é derivado de um zebrafish relatado embrionárias DIC modelo21.
- Colete embriões de zebrafish WT de pelo menos 2 pares de peixes. Dechorionate de embriões na pós-fertilização 24h (hpf) manualmente usando uma seringa com uma agulha de micro. Alternativamente, trate o embrião com proteinase K em concentração final de 10 µ g/mL por 10-15 min em uma incubadora de 30 ° C. Atualize a água do embrião após a dechorionation. Remover os embriões mortos e manter pelo menos 36 embriões de cada lote.
- Dilua a solução-estoque DOX em água fresca embrião para uma concentração final de 100 µM. O volume da solução é de 100 µ l de cada 3 embriões. Misture a solução diluída de DOX pelo vórtice. A solução diluída final deve ser uma luz, a cor vermelha.
- Adicione 100 µ l/poço de solução diluída de DOX de uma placa de 96 poços limpa transparente.
- Leve 3 embriões de dechorionated com uma pipeta de transferência de plástico e mantenha os embriões perto do fim da ponta da pipeta. Colocar a ponta da pipeta para cada poço com solução DOX. Deixe a extremidade da ponta toque a solução e permitir que os embriões a nadar dentro do poço.
Nota: Evite manualmente empurrando os embriões, que irão adicionar mais água no poço e diluir a solução DOX. - Atualizar a solução DOX em 48 hpf. Por esta altura, observe os poços sob um microscópio com ampliação de 10x para identificar embriões mortos (cessação dos batimentos cardíacos) ou embriões com edema. Conte e remover qualquer embriões mortos em tempo hábil, caso contrário os restantes embriões expostos à solução com embriões mortos podem morrer rapidamente também.
- Verifique os embriões em 72 hpf e contá-los. O tratamento de DOX é considerado "eficácia boa droga" se > 25% morte (cessação dos batimentos cardíacos) pode ser observado em ambos os lotes de embriões.
4. pré-injeção preparação
Nota: O peixe de 8 semanas a 6 meses de idade é utilizados para injeção de DOX. Os pesos de corpo (BWs) de um peixe selvagem Indian cariótipo (WIK) amadurecido para ser injetado podem variar de 0,2-0,5 g.
- Rapidamente o peixe para 24 h antes da injeção.
- Anestesia o peixe com água do embrião que contém metanosulfonato de 0,16 mg/mL. Use um papel de filtro limpo para secar a água de ambos os lados do corpo. Medir o BW de cada peixe em escala. Grupo peixe dentro de 10% de diferença em BW juntos para posterior injeção.
Nota: Para minimizar a carga de trabalho a este passo, peixe dentro de 10% de diferença em BW é considerados o mesmo tamanho; Portanto, prepare uma solução de trabalho de DOX, de acordo com sua média de BW. - Plano para injetar cada peixe adulto com 5 µ l de solução. Calcule a concentração de trabalho DOX de acordo com o número de peixes e BWs.
Nota: Para estudar a cardiotoxicidade crônica acima de 6 meses, use DOX na dose de 20 mg/kg. Para estudar a cardiotoxicidade aguda de DOX, a dose DOX pode ser aumentada até 50 mg/kg de BW. - Dilua o estoque DOX em 1 x solução salina equilibrada de Hank (HBSS) para as concentrações de trabalho correspondente. Vórtice para misturar a solução. Brevemente spin para baixo, para recolher a solução.
5. DOX injeção no peixe adulto
- Lugar uma limpa 100 mm placa de Petri com uma esponja dentro dela, sob um microscópio de dissecação, então ajuste o foco. Corte a esponja para fazer uma cavidade de cerca de 4 cm de comprimento para segurar um peixe. Fazer uma cavidade mais para um peixe maior.
- Prepare uma agulha 34g com um microseringa de 10 µ l. Enxague a agulha com 1 x HBSS buffer para remover quaisquer bolhas e blocos dos tubos e de seringa.
- Anestesia o peixe adulto na água do embrião que contém metanosulfonato de 0,16 mg/mL por 2 min.
Nota: Anesthetization prolongada mais de 5 min, seguido por injeção DOX pode facilmente causar peixes morte. - Mergulhe a esponja na água de embrião com metanosulfonato e transfira o peixe sobre a esponja para injeção.
-
Injeção de IP DOX execute qualquer um dos dois métodos descritos abaixo.
- Clássico de injeção IP29
- Posicione o peixe com o abdômen acima na cavidade da esponja. Inserir a agulha, com uma 45° ângulo para o corpo do peixe em relação à linha mediana entre as nadadeiras pélvicas e penetrar cerca de 1-2 mm. libere rapidamente toda solução DOX lentamente. Aguardar 5 s antes de retirar a agulha. Verificar a entrega DOX, uma cor vermelha visível na barriga do peixe.
- Injeção de IP alternativa
- Coloque o peixe lateralmente sobre a esponja com o anterior para a direita. Delicadamente estabilizar o peixe usando um fórceps fim brusco com a mão esquerda e segure a seringa com a mão direita.
- Posicione a agulha abaixo da linha lateral, acima da nadadeira pélvica, com o bisel voltado para cima. Apontando para a posição de 07:00 em um ângulo de 45 °, introduza a agulha 3 a 4 mm para a cavidade de peixe, localizada entre a pélvica e as barbatanas anais e em seguida, pressione lentamente o êmbolo. Verificar a entrega DOX, uma cor vermelha visível na barriga do peixe.
- Clássico de injeção IP29
- Rapidamente transferi os peixes injetados para um tanque limpo cruzamento cheio de água fresca do sistema para permitir que o peixe se recuperar. Enxague a agulha uma vez com 1 buffer de x HBSS entre as injeções.
6. pós-injeção peixe gestão
- Após a injeção, retorne o peixe para o sistema com circulação em execução. Se possível, manter o peixe DOX-tratados separadamente do sistema principal para evitar a contaminação cruzada entre tanques diferentes que compartilham a circulação.
- Rapidamente o peixe injetado para outro 24h para recuperação. Observe os peixes diariamente durante a primeira semana. Remova os peixes mortos em tempo hábil para evitar a infecção para os outros peixes.
Nota: Mortes de peixes dentro as primeiras 24 horas são provavelmente devido a lesões físicas causadas por injeção. - Mais manter o peixe DOX-estressado para observações longitudinais. Remova o peixe morto no tempo para evitar infecções de outros peixes do aquário.
Nota: Os números de peixes estão documentados para gerar uma curva de sobrevivência. - Usar diferentes ensaios experimentais de fenótipo o peixe DOX-forçado, tais como a Ecocardiografia30, função cardíaca repórter transgénicos linha23, natação desafio26e quantificação de outros remodelamento patológico marcadores de23.
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Representative Results
Aqui, apresentam-se dois métodos para executar a injeção de IP para modelo DIC no zebrafish adulto. Enquanto estiver usando o clássico, estabeleceu IP injeção método29, verificou-se que a solução DOX injetada (cor vermelha) às vezes pode escorrer para fora do local onde a agulha penetrou. A injeção de IP alternativa usa um local diferente para a penetração da agulha é de 3-4 mm longe o peritônio onde o DOX é liberado (figura 1A), que efetivamente impede o escapamento (figura 1B, 1C). Entrega bem sucedida de DOX no peritônio para ambos os métodos é evidenciada pela rápida distribuição da cor vermelha ao longo da barriga do peixe, que é visível no lado oposto do locus a injeção.
Injeção de DOX dosado em 50 mg/kg, usando o método alternativo de IP leva a toxicidade severa, onde a maioria dos peixes morre dentro de uma semana (Figura 2). Por outro lado, a injeção de DOX dosado em 20 mg/kg usando as causas de método alternativas IP quase nenhuma morte de peixes durante as primeiras 2 semanas e a morte de peixes de ~ 10% em 4 wpi (Figura 3A). Injeção de DOX dosado em 20 mg/kg, usando o método clássico de IP exibe morte de peixes ~ 30% em 4 wpi (Figura 3). Peixes injetados com ambos os métodos apresentam uma morte semelhante de ~ 20% de peixes de wpi 4 para 10 wpi (Figura 3B, D).
Podemos ter aproveitado o casper ; TG(cmlc2:nusDsRed) peixes para avaliar a progressão da disfunção cardíaca no DIC modelo (Figura 4A)23. O corpo transparente permite a documentação de um coração vermelho na sistólica (Figura 4B) e diastólica (Figura 4) estágios sob um microscópio fluorescente. Após a injeção de 20 mg/kg DOX usando o método alternativo de IP, declínio da função ventricular pode ser detectado a partir de 4 wpi (Figura 4).
Figura 1: rotas injeção. Injeção (1A) IP alternativo e esquemas da injeção IP clássico (b) (a) métodos. O círculo vermelho indica o DOX comum, liberando o local para os métodos de injeção de dois. Círculos verdes indicam os locais de penetração de agulha. As distâncias são estimadas com base em um peixe WIK adulto pesando aproximadamente 0,3 resultados representativos de g. (1B, 1C) indicando uma entrega bem sucedida de DOX usando dois métodos de injeção intraperitoneal. Vermelhidão dentro da barriga de peixe adulto pode notar-se imediatamente após a injeção. Peixes injetados foram verificadas novamente após 5 min de recuperação em uma água fresca do sistema. HBSS: 1 x Hank está equilibrado de solução salina. Zebrafish WT WIK foram empregados. Barra de escala: 5 mm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: curvas de sobrevivência representativa de zebrafish adulto após estresse DOX com injeção de 50 mg/kg DOX. 3 conjuntos de injeções de DOX em diferentes lotes de peixes adultos WT em 3-6 meses de idade são mostrados. No total, n = 24 peixes foram empregados no 1 grupo de controle de x HBSS e n = 8 peixes foram empregados em cada lote injetado com DOX. Nenhuma diferença no peixe sobrevivências foram observadas entre os métodos de injeção de dois. Zebrafish WT WIK foram empregados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: curvas de sobrevivência representativa de zebrafish adulto após estresse DOX com injeção de DOX 20 mg/kg e a comparação entre dois métodos de injeção intraperitoneal. (3A), peixe de sobrevivência dentro de 0-4 semanas após o parto DOX por injeção intraperitoneal de clássica. Número de peixe por cento na semana 0 foi considerada como 100%. (3B) sobrevivência de peixes após 4 semanas de pós entrega DOX por injeção intraperitoneal de clássica. Número de peixe por cento na semana 4 foi considerada como 100%. Sobrevivência (3C), peixe dentro de 0-4 semanas após o parto DOX por injeção intraperitoneal de alternativa. Número de peixe por cento na semana 0 foi considerada como 100%. (3D) peixe sobrevivência após 4 semanas após o parto DOX por injeção intraperitoneal de alternativa. Número de peixe por cento na semana 4 foi considerada como 100%. Dados mostrados em (3A) e (3B) são 9 lotes diferentes de injeção DOX de um peixe injetado 223 total em 3-6 meses de idade. Dados mostrados em (3C) e (3D) são 14 diferentes lotes de injeção DOX de um peixe injetado 335 total em 2-6 meses de idade. Os números de peixes vivos são registrados semanalmente. Barras de erro representam o desvio padrão em porcentagem de sobrevida em lotes diferentes em cada semana. Zebrafish WT WIK foram empregados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Avaliação de função cardíaca representativa após estresse DOX usando casper ; TG(cmlc2:nusDsRed) peixe. Casper (4A), uma fotografia de um adulto, ; TG(cmlc2:nusDsRed) peixe. Barra de escala = 1 cm. (4B) imagem representativa de um ventrículo vermelho na fase sistólica final de um amadurecido casper ; TG(cmlc2:nusDsRed) peixe. Linha de traço representa fim sistólica de diâmetro (ESD). Imagem (4C), representante de um ventrículo vermelho na fase diastólica final de um amadurecido casper ; TG(cmlc2:nusDsRed) peixe. Imagens em (4B) e (4C) foram extraídos de filmes de um coração batendo, capturadas com um microscópio fluorescente dissecação usando 6,3 ampliação de x. Linha de traço representa o diâmetro de diastólica final (EDD). Barra de escala = 1 mm. (4D) representante função cardíaca medida usando casper ; TG(cmlc2:nuDsRed) zebrafish adulto após a injeção de DOX 20 mg/kg. EDD e ESD foram medidos como mostrado em (4B) e (4C) para peixes individuais e ventricular encurtamento de fração é calculado pela fórmula (EDD − ESD) / EDD. Significativamente, diminuição da fração ventricular encurtamento foi detectada em 4 semanas e depois disso. Foi utilizado o método alternativo intraperitoneal. Valores são mostrados como média ± erro padrão. n ≥ 3 em cada grupo. O teste t de Student foi utilizado para comparação de dois grupos. p < 0,05. Estes números foram modificados de Ding et al . 23 Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Para modelar uma DIC progressiva, a dose de 20 mg/kg DOX foi determinada experimentalmente como a dose mais elevada que não causa morte de peixes significativo durante 1 wpi mas ainda resultados na morte de peixes e a redução da função cardíaca após 4 wpi (Figura 3 e Figura 4). Esta dose é comparável aos frequentemente usados em modelos de roedores DIC (15-25 mg/kg) e para a dose cumulativa de limite em humanos (550 mg/m2, que é equivalente a 15 mg/kg)4,7,31,32 , 33. doses mais elevadas de DOX, tais como de 50 mg/kg, mostram a morte de peixes significativo durante 1 wpi, então eles podem ser usados para estudar apenas agudas cardíacas respostas tóxicas a DOX23,28.
Durante a implementação deste modelo de DIC, percebemos que era difícil para novos investigadores reproduzir os mesmos resultados inicialmente. Mesmo para investigadores experientes, sobre um 20% variação de mortalidade na fase crônica ainda pode ser encontrada entre injeções diferentes (Figura 3), indicando os fatores de confundimento biológicos descaracterizados no modelo atual. Apesar de um menor que o modelo perfeito, ainda acreditamos que este modelo atual do DIC é suficiente para fazer som descoberta devido as seguintes provas. Em primeiro lugar, depois de várias práticas, os resultados do modelo de DIC podem ser mais tarde registrados entre a maioria, se não todos, os investigadores. Em segundo lugar, com base neste modelo DIC, identificamos 4 modificadores genéticas significativas. Evidências de literatura relatórios suporte 3 deles como cardiomiopatia genes34,35,36,37. O 4th um é membro do DnaJ homólogo da subfamília B 6 (DNAJB6), que tem sido provado ser um novo gene de cardiomiopatia, apoiado por um estudo genético humano28. Assim, podemos concluir que os resultados com base em grupos intra experimentais usando rigorosamente idade-controles ainda são altamente repetitivo, embora o modelo DIC na sua forma actual não é fiável para comparação inter experimental.
Os fatores de confundimento que contribuem para a inconsistência observada em nosso modelo atual de DIC provável incluem o seguinte: (1) envelhecimento e diferença de gênero tem sido consideradas como cruciais fatores de risco para doenças cardiovasculares, incluindo DIC38, 39,40. Enquanto ambos co-fundadores hipotéticos continuam a ser testado em nosso modelo, especificamente, percebemos que o peixe envelhecidos tende a ser mais sensíveis à toxicidade DOX (dados não mostrados). As variações de lotes inter observadas usando ambos os métodos IP (Figura 3) são também provavelmente contribuiu para estes dois co-fundadores. (2) diferente de modelos animais maiores, do tamanho de um adulto zebrafish é pequena. Assim, o local danos causados pela injeção de DOX podem ser mais severo e variável. (3) morte de peixes injetados pode resultar de toxicidade DOX em outros órgãos (por exemplo, toxicidade renal), além do coração. Enquanto mais cuidadosamente concebidas experiências são necessárias para abordar cada um dos fatores de confundimento acima mencionados, trabalho anterior sugere que as seguintes precauções ajudará a reduzir as variações fenotípicas: em primeiro lugar, é fundamental para garantir a eficácia da DOX. Pó DOX sempre deve ser mantido em uma área seca e escura, e soluções devem ser manuseadas com cuidado para reduzir a exposição à luz. Recomenda-se que soluções de trabalho DOX preparada recentemente cada vez antes da injeção do peixe. Normalmente não usamos soluções estoque de DOX após 4 semanas no armazenamento. Quando há uma dúvida, realizar a secção 3 opcional neste protocolo usando o modelo DIC embrionário rápido para calibrar a eficácia de drogas de cada lote DOX. Segundo, sincronização de peixe adulto é fundamental. A mesma variação de peixe precisa ser aumentado com a mesma densidade, para garantir o tamanho de corpo semelhante. Então pre-selecionamos peixe com semelhantes BWs para cálculo de dose. Recomenda-se manter pelo menos duas vezes como muitos peixes no total para este processo de pré-seleção. Todos os peixes são jejum por 24 h antes do processo de pré-seleção. Em terceiro lugar, é aconselhável sempre usar peixe de idade semelhante e para o peixe antes da injeção de DOX do sexo por causa de suas taxas de crescimento diferentes e potencialmente diferentes respostas cardíacas para DOX.
Notamos que a maioria das conclusões inconsistentes poderia ser atribuída a um grupo de controle questionável. Portanto, recomendamos os investigadores de novos para o modelo DIC para injeções de DOX prática antes de conduzir experiências reais. Quando 20 mg/kg DOX é injetado usando o método de injeção de IP alternativo, uma técnica de injeção bom pode ser indicada por uma quase zero morte de peixes durante o 1 wpi de DOX e uma taxa de mortalidade relativamente consistente na injeção de post-DOX 2-3 meses. A prova final para modelagem bem sucedida é a redução do índice cardíaco-funcional, que pode ser quantificada através de ecocardiografia25,30, usando um casper ; TG(cmlc2:nusDsRed) linha transgénica, ou usando um recém-desenvolvido ex vivo-baseado a função cardíaca do ensaio (dados não mostrados).
Além da injeção do IP, outras rotas de entrega de drogas tais como a injeção retro-orbital41, oral,42e incubação de água de alimentação é também frequentemente usada em adultos do zebrafish. Nós não adoptou a abordagem retrô-orbital injeção, apesar de sua liberação de droga direta no sistema de circulação, devido à falta de um método para validar a entrega da droga de sucesso, como a vermelhidão da DOX pode ser facilmente mascarada pelo potencial de sangramento. Tentamos um protocolo de entrega oral através da incorporação de DOX com glúten absorvível,42, que envolveu-se com as refeições para alimentar os peixes adultos. Infelizmente, com até a dose acumulativa de 150 mg/kg, usado dentro de um período de alimentação de 4 semanas, nós não observaram qualquer cardiotoxicidade grave, sugerindo a ineficácia da entrega oral DOX. Alternativamente, uma técnica de gavagem oral pode ser mais explorada43. Além disso, o protocolo de incubação de peixe de molho numa solução contendo DOX é também uma potencial rota de entrega que poderia ser testada no futuro.
Reconhecemos que uma das principais limitações do modelo atual de DIC é o método de injeção em bolus único, que pode resultar em danos locais e alta toxicidade nos órgãos internos. Esta abordagem foi projetada para reduzir as cargas de trabalho e aumentar a taxa de transferência, para que o rastreio genético pode ser realizado com um alto rendimento em peixes adultos28. No futuro, modelos com múltiplas injeções de DOX em doses mais baixas devem ser prosseguidos, que será melhor recapitular o DIC observado em pacientes com câncer tratados com quimioterapia.
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Disclosures
Os autores declaram não há conflitos de interesses.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado em parte por uma concessão de desenvolvimento cientista da associação americana do coração (14SDG18160021 para YD), o US NIH R01 concede HL 81753 e HL 107304 para XX e a Fundação de Mayo para XX.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Crossing tank | Aquaneering | ZHCT100 | Fish breeding |
| Incubator | ThermoFisher | Maintaining embryo | |
| 3 L medium tank | Aquaneering | ZT280 | Maintaining fish |
| Paramecia | Carolina | 131560 | Food for juvenile fish |
| Live hatched brine shrimp | in house | Food for adult fish | |
| Doxorubicin hydrochloride | Sigma | D1515-10MG | |
| 1.5 ml safe-lock tube | Eppendorf | No. 022363204 | For drug storage |
| Aluminum foil paper | Fisher | 1213104 | For preventing light exposure |
| Proteinase K | Roche | No. 03115887001 | For dechorionating embryo |
| Hank's balanced salt solution (HBBS) | ThermoFisher | 14025076 | Vehicle for DOX |
| 100 mm petri dish | Falcon | 431741 | |
| 10 μL NanoFil micro-syringe | WPI | NANOFIL | For injection |
| 34 gauge needle | WPI | NF34BV-2 | For injection |
| Tricaine | Argent | MS-222 | Anesthetizing fish |
| 96 well plate | Costar | 3539 | For embryo drug treatment |
| Transfer pipette | Bel-art product | F37898 | For transfering embryo |
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