Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Доксорубицин индуцированной кардиомиопатия модель в взрослых рыбок данио

Published: June 7, 2018 doi: 10.3791/57567
Automatic Translation
*1,2,3, *2,3, 2,3,4, 1,2,3
1Clinical and Translational Sciences Track, Mayo Clinic Graduate School of Biomedical Sciences, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Mayo Clinic, 3Division of Cardiovascular Diseases, Mayo Clinic, 4Institute of Life Science, Beijing University of Chinese Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Здесь описан метод для создания модели доксорубицин индуцированной кардиомиопатия в взрослых рыбок данио (Danio рерио). Два альтернативных способа внутрибрюшинной инъекции представлены и обсуждаются условия уменьшить различия между различных экспериментальных групп.

Abstract

Генетически доступной взрослых рыбок данио (Danio рерио) все шире используется как позвоночных модель для понимания человеческих заболеваний, таких как кардиомиопатии. Из-за его удобства и ответственностью для высокой пропускной способности генетических манипуляций поколения модели приобретенных кардиомиопатия, например доксорубицин индуцированной кардиомиопатия (DIC) модель в взрослых рыбок данио, открывает двери для новых исследований проспектов, в том числе открытие кардиомиопатия модификаторы через вперед генетический скрининг. Отличается от модели DIC эмбриональных данио рерио, первоначальный острый и позднее хронической фазы кардиомиопатия может определяться в модели DIC взрослых рыбок данио, позволяя изучения сигнальных механизмов зависят от стадии и терапевтических стратегий. Однако переменная результаты могут быть получены с текущей моделью, даже в руках опытных следователей. Для облегчения будущей реализации модели DIC, мы представляем подробный протокол о том, как создавать эту модель ДВС в взрослых рыбок данио и описать два альтернативных способа внутрибрюшинной инъекции (IP). Мы далее обсудить варианты о том, как уменьшить вариации для получения надежных результатов и представить предложения о том, как надлежащим образом интерпретировать результаты.

Introduction

Доксорубицин (DOX), также названный адриамицин, был разработан как Антинеопластические препарат начиная с 1960-х1,2. Это сейчас все еще активно используется как важный химиотерапевтический препарат для широкого спектра опухоли. Однако клиническое применение DOX затрудняется его дозозависимый токсичность, особенно кардиотоксичности характеризуется переменной симптомы, начиная от бессимптомного электрокардиографических изменений перикардита и декомпенсированной кардиомиопатия 1 , 2. на сегодняшний день, по крайней мере три основных гипотезы были подняты объяснить DIC, включая активированные реактивнооксигенных видов (ров)1,3,4,5, ингибирование топоизомеразы II-β () 1,8,9выпуск TOP2β)6,7и модуляция внутриклеточного кальция. Накапливая доказательства также предлагает генетической предрасположенности, как ключевой фактор риска для ДВС10,11,12,13. Джин тождества, относящиеся к этим DIC предрасположенности, однако, остаются во многом неизвестным. Дексразоксан является только агентом адъювантной одобрено США продуктов питания и медикаментов (FDA) для лечения DIC, но с ограниченным осуществлением14,,1516, подчеркнув необходимость выявления дополнительных терапевтические стратегии. Поэтому Животные модели DIC изучаются для этих целей. Благодаря их доступности и простоты, механистических исследования на моделях DIC потенциально может иметь более широкие последствия на других типах кардиомиопатии: общий патогенез может распределяться среди кардиомиопатии различной этиологии, особенно на позднее патологических этапов17,18,19,20.

Помимо грызунов модели DIC данио рерио DIC модели с более высокой пропускной способности были разработаны для облегчения обнаружения новых генетических факторов и терапии. В прозрачной данио рерио эмбрионов для скрининга терапевтических соединений21была создана модель эмбриональных DIC. Учитывая, что кардиомиопатии являются заболевания onset взрослого с прогрессивной патогенеза, взрослых рыбок данио кардиомиопатия, модели были разработаны22,-23,-24,-25,-26. Мы создали первый приобретенных модель кардиомиопатия вследствие хронической анемии24, следуют DIC как вторая модель приобретенных кардиомиопатия в взрослых рыбок данио23. Мы обнаружили, что введения единого болюс DOX в взрослых рыбок данио индуцирует кардиотоксичность, состоящий из острой фазы примерно в течение 1 недели после инъекции (ИЗВ), а затем хроническая фаза кардиомиопатия 6 месяцев впрыск. Во время haploinsufficiency механистический цель rapamycin(mtor) улучшает кардиомиопатия в хронической фазе, он преувеличивает смертности рыб в острой фазе, подчеркнув значение Взрослый модели DIC различать этап зависимых механизмов23. Мы далее показал, что взрослый DIC модель может использоваться для подчеркнуть коллекцию данио рерио инсерционному сердца (ZIC) мутантов, которые создаются с помощью подхода на основе transposon инсерционному мутагенезу27. Экспериментальный экран определены 3 известных кардиомиопатия генов, а также DnaJ (Hsp40) гомолога, подсемейство B и член 6b (dnajb6b) как генов восприимчивости новый DIC28. Таким образом поколения взрослых DIC модели в zebrafish привели к новой методологии, которая систематически позволяет идентифицировать генетические модификаторов для ДВС, которая дополняет существующие исследования генома всей ассоциации (GWAS) и количественный признак локус (QTL ) анализа.

Во время генерации и реализации модели DIC взрослых рыбок данио мы заметили значительные различия среди различных исследователей и/или даже среди различных инъекций, выполняемых же следователь. Продольные характер модели налагает проблемы для регистрации результатов от разных исследователей и последовательный процесс устранения неполадок. Для облегчения использования этой простой кардиомиопатия вызывая стресс методом исследовательского сообщества, мы описать наш протокол в деталях, настоящее два вида IP инъекции и обсудить соображения для уменьшения различий между разными исследователями.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все описанные здесь процедуры выполнялись в соответствии с руководство по уходу и использованию лабораторных животных (национальных академий пресса. 2011), и они были одобрены Mayo Клинике институциональных животное уход и использование Комитетом.

1. Взрослый данио рерио подготовка

  1. Настройка достаточно разведения пары в пересечении танки приобрести по крайней мере вдвое больше, чем общая рыбы, необходимые для инъекций DOX. Если сравнение рыбы с генетическими различиями, породы все рыбы в течение той же недели для обеспечения контроля за соответствием возраста.
  2. Собирать эмбрионов рыб утром следующего дня, передавать их на чашки Петри 100 мм и держать их в инкубаторе 28,5 ° C. Держите эмбрионов на низкой плотности (< 100 эмбрионов/Петри).
  3. Обновите эмбриона воды ежедневно, чтобы избежать дисбаланса секс и вручную удалять мертвые яйца своевременно с помощью пипетки передачи.
  4. Поместить то же количество эмбрионов в каждой цистерне (например, 60 эмбрионов/3 L средний танк первоначально) для обеспечения контроля за соответствием плотности.
  5. Начните paramecia, питание на 4 дня после оплодотворения (dpf).
  6. Осмотрите рыбы ежедневно в ювенильной стадии. Регулировать количество рыбы, необходимых для обеспечения аналогичных рыбы плотности.
  7. Когда рыбы достигают 4-недельного возраста, передачи до 20 рыб в каждой новой 3 Л средний танк для дальнейшего роста. Начинают кормить рыб с живой насиженным артемии.

2. Подготовка и хранение DOX Стоковый раствор

Примечание: DOX можно приобрести у различных компаний био. Соединения обычно приобретается как порошок в темно коричневый контейнерах.

  1. Тщательно Растворите порошок DOX в деионизированной воде, чтобы убедиться, что нет сгустки являются видимыми, с окончательной концентрацией 5 мг/мл как Стоковый раствор. Аликвота 1 мл DOX акций в каждую пробирку Сейф lock 1,5 мл. Оберните 1.5 мл пробирок с алюминиевой фольги бумаги для защиты DOX от воздействия света.
    Примечание: Выполните этот шаг в химические вытяжки.
  2. Держите DOX Стоковый раствор при температуре 4 ° C для хранения. Для длительного хранения (> 4 недель) от DOX Стоковый раствор, выполнить дополнительный раздел 3, описанные ниже.

3. контроль качества DOX, используя Zebrafish эмбриона (опционально)

Примечание: DOX-оба влаги и света чувствительных, поэтому он может потерять свою эффективность препарата для моделирования ДВС после длительного хранения. Для DOX приобретены из различных компаний, или даже различные пакеты из той же компании это полезно для калибровки ее эффективность препарата с помощью одичал тип (WT) zebrafish эмбриона перед проведением экспериментов на взрослых рыб. Этот метод является производным от эмбриональных модель DIC сообщил данио рерио21.

  1. Соберите WT zebrafish эмбриона от по крайней мере 2 пар рыб. Dechorionate эмбрионы на 24 ч после оплодотворения (hpf) вручную с помощью шприца с иглой микро. В качестве альтернативы лечения эмбриона с протеиназы K в конечной концентрации 10 мкг/мл в течение 10-15 мин в инкубаторе 30 ° C. Обновите эмбриона воды после dechorionation. Удаление мертвых зародышей и поддерживать по крайней мере 36 эмбрионов каждой партии.
  2. Разбавьте DOX Стоковый раствор в воде свежих эмбрионов до конечной концентрации 100 мкм. Объем раствора-100 мкл каждые 3 эмбрионов. Смешайте разбавленный раствор DOX по вихря. Окончательный разбавленный раствор должен быть свет, красный цвет.
  3. Добавьте 100 мкл/хорошо разбавленного раствора DOX чистой 96-луночных Прозрачные пластины.
  4. Возьмите 3 dechorionated эмбрионов с пипетки пластиковые передачи и держать эмбрионов ближе к концу кончика пипетки. Поместите наконечник пипетки в каждой скважине с DOX решения. Пусть конце кончика коснуться решение и позволить эмбрионов плавать в колодец.
    Примечание: Избегайте вручную нажатием эмбрионов, которые будут добавлять больше воды в колодец и разбавить раствор DOX.
  5. Обновите решение DOX 48 hpf. К этому времени наблюдать скважин под микроскопом с десятикратным увеличением для идентификации мертвых эмбрионов (прекращение сердцебиение) или эмбрионов с отеком. Граф и удалите любые мертвых зародышей своевременно, в противном случае оставшиеся эмбрионы воздействию решение с мертвых эмбрионов может умереть быстро также.
  6. Проверьте эмбрионов в 72 hpf и подсчитать их. DOX лечение считается «хороший препарат эффективность» если > 25% смерти (прекращение сердцебиение) может наблюдаться в обоих пакетах эмбрионов.

4. Предварительный впрыск подготовка

Примечание: Для инъекций DOX используются рыбы 8 недель до 6 месяцев. Веса тела (BWs) созрел рыбы дикие индийские кариотип (Вик) для инъекций может варьироваться от 0,2-0,5 г.

  1. Быстро рыбы за 24 часа перед инъекцией.
  2. Анестезировать рыбы эмбриона водой, содержащей 0,16 мг/мл tricaine. Использование чистой фильтровальной бумаги для просушки воды с обеих сторон тела. Измерьте BW каждой рыбы в масштабе. Группа рыбы в пределах 10% разницы в BW вместе для более поздних инъекций.
    Примечание: Для сведения к минимуму нагрузки на этот шаг, рыбы в пределах 10% разницы в BW считаются того же размера; Таким образом подготовьте один рабочий раствор DOX согласно их виду BW.
  3. План придать каждой взрослых рыб с 5 мкл раствора. Вычислите DOX рабочие концентрации согласно количества рыбы и BWs.
    Примечание: Для изучения хронической кардиотоксичности до 6 месяцев, используйте DOX в дозе 20 мг/кг. Изучение острых кардиотоксичности DOX, DOX дозу можно увеличить до 50 мг/кг М.Т.
  4. Разбавьте DOX складе 1 x Хэнка сбалансированного солевого раствора (HBSS) для соответствующей рабочей концентрации. Вихрь mix решение. Кратко вращаться вниз собрать решение.

5. DOX инъекций в взрослых рыб

  1. Место чистой 100 мм Петри с губкой внутри него, под микроскопом, рассечение, затем настроить фокус. Вырежьте Губке Бобу сделать полости около 4 см в длину для хранения рыбы. Сделайте больше полость для крупной рыбы.
  2. Подготовьте иглой 34 G с 10 мкл микро шприц. Промойте иглой с 1 x HBSS буфер, чтобы удалить любые пузыри и блоков из шприца и труб.
  3. Анестезировать взрослых рыб в воде эмбриона, содержащей 0,16 мг/мл tricaine на 2 мин.
    Примечание: Длительное анестезии более 5 мин после инъекции DOX может легко привести к рыбы смерти.
  4. Замочите губки в воде эмбриона с tricaine и передача рыбы на губку для инъекций.
  5. Выполните IP DOX инъекций, любой из двух методов, описанных ниже.
    1. Классический IP инъекции29
      1. Поместите рыбу с живота вверх в полости Губка. Быстро вставить иглу, с 45° под углом к телу рыбы в средней линии между брюшные плавники и проникнуть примерно 1-2 мм. освободить всех DOX раствор медленно. Подождите 5 s перед выниманием иглы. Проверка доставки DOX отображается красным цветом в чреве рыбы.
    2. Альтернативные IP инъекций
      1. Место рыбы боково на губку с передней справа. Аккуратно стабилизировать рыбы с помощью щипцов тупой конец левой рукой и удерживайте микро шприц с правой рукой.
      2. Положение иглы под боковой линии выше брюшных плавников, с наклонной вверх. Указывая на 7 часов позиции под углом в 45°, Вставьте иглу 3-4 мм в полость рыб, расположенный между таза и анальный плавники, а затем медленно отпустите поршень. Проверка доставки DOX отображается красным цветом в чреве рыбы.
  6. Быстро передавать вводят рыбы танк чистого пересечения с система пресной водой разрешить рыбу, чтобы восстановить. Промойте иглы с 1 x HBSS буфера между инъекциями.

6. впрыск рыбы управления

  1. После инъекции вернуть рыбу к системе с запуском циркуляции. Если это возможно поддерживать DOX-лечение рыб отдельно от основной системы, чтобы избежать перекрестного загрязнения среди различных танков, которые разделяем циркуляция.
  2. Быстро вводят рыбы еще 24 часа для восстановления. Наблюдать за рыбы ежедневно в течение первой недели. Удаление мертвых рыб своевременно, чтобы избежать инфекции другой рыбы.
    Примечание: Гибель рыбы в течение первых 24 ч, вероятно, из-за физических повреждений, вызванных инъекции.
  3. Далее сохранить DOX-подчеркнул рыбы для продольной наблюдений. Удаление мертвых рыб в время, чтобы избежать инфекции для других рыб в аквариуме.
    Примечание: Рыба чисел задокументированы для создания кривых выживания.
  4. Использование различных экспериментальных анализов на фенотип DOX-подчеркнул рыб, таких как эхокардиография30, сердечной функции репортер трансгенные линии23, плавание вызов26и количественной оценки других патологических Ремоделирование маркеры23.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Здесь представлены два метода для выполнения инъекции IP модель ДВС в взрослых рыбок данио. При использовании классика, установленных IP инъекционного метода29, было отмечено, что вводили раствор DOX (красный цвет) может иногда сочиться из места, где иглой проникли. Альтернативные инъекции IP использует другое местоположение для проникновения иглы, это 3-4 мм от брюшины, где выпускается DOX (рис. 1а), который эффективно предотвращает утечки (рис. 1B, 1 C). Успешной доставке DOX в брюшину для обоих методов свидетельствует быстрое распространение красный цвет всей рыбы живота, которая видна на противоположной стороне инъекции локуса.

Инъекции DOX дозированной на 50 мг/кг, с помощью альтернативного метода IP приводит к тяжелой токсичность, где большинство рыб умирают в течение одной недели (рис. 2). Напротив инъекции DOX дозированной на 20 мг/кг, с помощью альтернативного метода заставляет IP ~ 10% рыбы и почти не рыбы смертью в течение первых 2 недель в 4 ИЗВ (Рисунок 3А). Инъекции DOX дозированной на 20 мг/кг, с помощью метода классический IP экспонатов смерть рыб ~ 30% на 4 ИЗВ (рис. 3 c). Рыбы, вводится с помощью либо метода демонстрируют аналогичные ~ 20% рыбы смерть от 4 ИЗВ 10 ИЗВ (рис. 3B, D).

Мы использовали Каспер ; TG(cmlc2:nusDsRed) рыбы, чтобы оценить прогрессирование сердечной дисфункции в DIC модель (рис. 4A)23. Прозрачный корпус позволяет документации красные сердца на как систолическое (рис. 4B), так и диастолического (рис. 4 c) этапов под микроскопом флуоресцентных. После инъекций 20 мг/кг DOX, с помощью альтернативного метода IP снижение функции желудочка может быть обнаружен, начиная с 4 ИЗВ (рис. 4 d).

Figure 1
Рисунок 1: инъекции маршруты. Инъекции (.1A) схемы классических IP инъекции (b) и альтернативные IP (a) методы. Красный круг указывает общие DOX, выпуская сайт для двух инъекций методы. Зеленые круги показывают места проникновения иглы. Расстояния оцениваются основе взрослых рыб WIK, весом примерно 0,3 г (1B, 1 C) представитель результаты указанием успешной доставки DOX, с использованием двух методов внутрибрюшинной инъекции. Покраснение внутри живота взрослых рыб можно отметить сразу после инъекции. Вводят рыбы были проверены снова после восстановления 5 мин в Система пресной воды. HBSS: 1 x Хэнк сбалансированного солевого раствора. Данио рерио WT WIK были заняты. Линейки: 5 mm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: кривые представитель выживания взрослых рыбок данио, после DOX стресс с помощью инъекций 50 мг/кг DOX. Изображены 3 комплекта DOX инъекции в различных пакетах WT взрослых рыб в возрасте 3-6 месяцев. В целом, n = 24 рыбы были заняты в 1 группе управления x HBSS, а n = 8 рыбы были заняты в каждом пакете вводится с DOX. Никакой разницы в рыбы пережитки были отмечены между двух инъекций методы. Данио рерио WT WIK были заняты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: кривые представитель выживания взрослых рыбок данио, после DOX стресс с DOX инъекций 20 мг/кг и сравнение между двумя методами внутрибрюшинной инъекции. Выживание (3A) рыбы в пределах 0-4 недель после доставки DOX классические внутрибрюшинной инъекцией. Процентов рыбы номер на неделю, 0 была расценена как 100%. (3B) выживание рыбы после 4 недель после доставки DOX классические внутрибрюшинной инъекцией. Процентов рыбы номер на неделю, 4 была расценена как 100%. Выживание (3 C) рыбы в пределах 0-4 недель после доставки DOX альтернативных внутрибрюшинной инъекцией. Процентов рыбы номер на неделю, 0 была расценена как 100%. (3D) рыба выживание после 4 недель после доставки DOX альтернативных внутрибрюшинной инъекции. Процентов рыбы номер на неделю, 4 была расценена как 100%. Данные, отображаемые в (3А) и (3B) являются 9 различных серий DOX инъекции из всего 223 вводят рыбы в возрасте 3-6 месяцев. Данные, отображаемые в (3 C) и (3D) являются 14 различных партий DOX инъекции из всего 335 вводят рыбы в возрасте 2-6 месяцев. Количество живой рыбы записываются за неделю. Планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение в процентах выживание среди различных пакетов на каждую неделю. Данио рерио WT WIK были заняты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: Представитель сердечной функции оценки после DOX стресс с помощью Каспер ; TG(cmlc2:nusDsRed) рыбы. (4A) фотография взрослого Каспер; TG(cmlc2:nusDsRed) рыбы. Шкалы бар = 1 cm. (4В) представитель изображение красной желудочка в конце систолы стадии созрели Каспер ; TG(cmlc2:nusDsRed) рыбы. Прерывистая линия представляет собой диаметр конца систолического (ESD). Изображение (4 C) представитель красной желудочка на конце диастолического стадии зрелости Каспер ; TG(cmlc2:nusDsRed) рыбы. Изображения (4B) и (4 C) были извлечены из фильмов биение сердца, захватил с микроскопом флуоресцентные рассечение, используя 6.3 x увеличение. Прерывистая линия представляет собой диаметр конца диастолического (ЭДД). Шкалы бар = 1 mm. (4 D) представитель сердечной функции измеряется с помощью Каспер ; TG(cmlc2:nuDsRed) взрослых рыбок данио после инъекции DOX 20 мг/кг. Измерялись Эдд и ОУР, как показано на (4B) и (4 C) для отдельных рыб и желудочковая фракция укорочение рассчитывается по формуле (EDD − ESD) / ЭДД. Значительно снижение желудочков фракция сокращения был обнаружен на 4 недели и в дальнейшем. Был использован альтернативный внутрибрюшной метод. Значения отображаются как среднее ± стандартная ошибка. n ≥ 3 в каждой группе. T -тест студент был использован для сравнения двух групп. p < 0,05. Эти цифры были изменены от Дин и др. 23 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Для моделирования прогрессивного DIC, в дозе 20 мг/кг DOX определяли экспериментально, как самая высокая доза, которая не вызывает значительных рыбы смерть во время 1 wpi, но до сих пор результаты в смерти рыбы и сокращение сердечной функции после 4 ИЗВ (рис. 3 и Рисунок 4 c). Эта доза сопоставима, для тех, кто часто используется в моделях грызунов ДВС (15-25 мг/кг) и ограничение суммарной дозы в организме человека (550 мг/м2, что соответствует 15 мг/кг)4,7,,3132 , 33. более высокие дозы DOX, например 50 мг/кг, показывают значительную рыбы смерть во время 1 wpi, поэтому они могут быть использованы для изучения только острой сердечной токсичных ответы на DOX23,28.

В ходе реализации этой модели DIC мы заметили, что это было трудно для новых следователей первоначально воспроизвести те же результаты. Даже для опытных следователей около 20% вариации смертности в хронической фазе можно все еще найти среди различных инъекции (рис. 3), указывающее uncharacterized биологических отягощающих факторов в текущей модели. Несмотря на менее чем идеальной моделью мы по-прежнему считаем, что достаточно, чтобы сделать звук открытия из-за следующие доказательства этой текущей модели DIC. Во-первых после нескольких практики, результаты от DIC модели могут быть позже зарегистрированы среди большинства, если не все, следователи. Во-вторых основанная на этой модели DIC, мы определили 4 значимых генетических модификаторы. Имеющиеся данные из докладов литературы поддерживает 3 из них как кардиомиопатия гены34,35,,3637. 4й один это член B subfamily гомолога DnaJ 6 (DNAJB6), который был доказан быть новый ген кардиомиопатия, поддерживаемых человеческие генетические исследования28. Таким образом мы заключаем, что результаты, основанные на взаимной экспериментальных групп с использованием элементов управления строго соответствует возрасту по-прежнему высокой повторяемости, хотя модель ДВС в его нынешнем виде не является надежным для сравнения между экспериментальной.

Смешанные факторы, влияющие на непоследовательность, наблюдаются в нашей текущей модели DIC вероятно включают следующее: (1) старения и гендерные различия рассматриваются как важнейших факторов риска сердечно-сосудистых заболеваний, включая DIC38, , 39-40. Хотя оба гипотетическая соучредителями по-прежнему быть проверены в нашей модели специально, мы заметили, что возрасте рыбы, как правило, более чувствительны к DOX токсичности (данные не показаны). Вариации между партии, наблюдается использование обоих методов IP (рис. 3) вероятно, также способствовали этими двумя соучредителями. (2) отличается от более крупных животных моделей, размер взрослых рыбок данио мал. Таким образом местные ущерб, причиненный DOX инъекции может быть более серьезными и переменных. (3) смерть вводят рыбы может привести от DOX токсичности в других органах (например, почечной токсичности), помимо сердце. Хотя для решения каждой из вышеупомянутых отягощающих факторов необходимы более тщательно продуманных экспериментов, Предыдущая работа свидетельствует о том, что следующие меры предосторожности поможет уменьшить фенотипические различия: во-первых, важно, чтобы гарантировать эффективность DOX. DOX порошок всегда должны храниться в сухом и темном области, и решения должны быть обработаны с осторожностью, чтобы уменьшить воздействие света. Рекомендуется, что DOX рабочие решения подготовлен свежезаваренным каждый раз перед инъекцией рыбы. Мы обычно не использовать фондовых DOX решения после 4 недель в хранилище. Когда есть сомнения, выполните дополнительный раздел 3 в настоящем Протоколе, используя быстрый эмбриональных DIC модель для калибровки эффективность препарата каждой партии DOX. Во-вторых, взрослых рыб синхронизации имеет решающее значение. Же сорт рыбы должен быть поднят на такой же плотности, для обеспечения аналогичного размера тела. Затем мы заранее выбрать рыбу с аналогичными BWs для расчета дозы. Рекомендуется поддерживать по крайней мере в два раза больше рыбы в общей сложности этого процесса предварительного отбора. Рыб всех постились за 24 часа до начала процесса предварительного отбора. В-третьих рекомендуется всегда с помощью того же возраста и секс рыбы перед DOX впрыска из-за их разные темпы роста и потенциально различные сердца ответы на DOX рыбы.

Мы заметили, что большинство несовместимым выводы можно было приписывают сомнительной контрольную группу. Поэтому мы рекомендуем следователи новой модели DIC практике DOX инъекции до проведения реальных экспериментов. Когда 20 мг/кг DOX вводится с использованием альтернативного метода впрыска IP, техника хорошая инъекция может индицироваться почти нулевой смерти рыбы во время 1 ИЗВ DOX и относительно постоянной смертности на 2-3 месяца поста DOX инъекций. Конечная свидетельство для успешного моделирования является сокращение сердца функционального индекса, которые могут быть количественно через эхокардиография25,30, при помощи Каспера ; TG(cmlc2:nusDsRed) трансгенные линии, или с помощью недавно разработанных ex vivo-на основе сердечной функции анализа (данные не показаны).

В дополнение к IP инъекций, других маршрутов доставки наркотиков как ретро орбиталь инъекций41, Оральный кормления42и вода инкубации также часто используются в взрослых рыбок данио. Мы не принимать инъекции ретро орбиталь подход, несмотря на его прямой наркотиков, выпуская в циркуляционной системы, из-за отсутствия метода для проверки успешного лекарств, как покраснение DOX можно легко маскируются потенциальных кровотечения. Мы стараемся протокол устные доставки через встраивание DOX с рассасывающиеся клейковины42, которая была смешанной с питанием кормить взрослых рыб. К сожалению с до накопительный доза 150 мг/кг в 4-недельный период кормления, мы не наблюдали любой тяжелой кардиотоксичность, предполагая неэффективность перорального DOX. Кроме того метод пероральная затравка может быть далее изучены43. Кроме того протокол инкубации замачивания рыбы в раствор, содержащий DOX является также потенциальным маршрут доставки, которые могут быть опробованы в будущем.

Мы признаем, что одним из основных ограничений в текущей модели DIC является одной болюс инъекционный метод, который может привести к высокой токсичности и местные повреждения внутренних органов. Этот подход был разработан для уменьшения рабочей нагрузки и для увеличения пропускной способности, так что генетический скрининг может проводиться с высокой пропускной способностью в взрослых рыб28. В будущем следует модели с несколькими инъекции DOX при более низких дозах, которая будет лучше пилки DIC, наблюдаются в раковых больных, получавших химиотерапию.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют не конфликты интересов.

Acknowledgments

Эта работа частично поддержали ученый развития грант от Американской ассоциации сердца (14SDG18160021 м), R01 низ США предоставляет HL 81753 и 107304 HL-XX и Фонд Майо-XX.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Crossing tank Aquaneering ZHCT100 Fish breeding
Incubator ThermoFisher Maintaining embryo
3 L medium tank Aquaneering ZT280 Maintaining fish
Paramecia Carolina 131560 Food for juvenile fish
Live hatched brine shrimp in house Food for adult fish
Doxorubicin hydrochloride Sigma D1515-10MG
1.5 ml safe-lock tube Eppendorf No. 022363204 For drug storage
Aluminum foil paper Fisher 1213104 For preventing light exposure
Proteinase K Roche No. 03115887001 For dechorionating embryo
Hank's balanced salt solution (HBBS) ThermoFisher 14025076 Vehicle for DOX
100 mm petri dish Falcon 431741
10 μL NanoFil micro-syringe WPI NANOFIL For injection
34 gauge needle WPI NF34BV-2 For injection
Tricaine Argent MS-222 Anesthetizing fish
96 well plate Costar 3539 For embryo drug treatment
Transfer pipette Bel-art product F37898 For transfering embryo

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Octavia, Y., et al. Doxorubicin-induced cardiomyopathy: from molecular mechanisms to therapeutic strategies. J Mol Cell Cardiol. 52 (6), 1213-1225 (2012).
  2. Singal, P. K., Iliskovic, N. Doxorubicin-induced cardiomyopathy. N Engl J Med. 339 (13), 900-905 (1998).
  3. Angsutararux, P., Luanpitpong, S., Issaragrisil, S. Chemotherapy-Induced Cardiotoxicity: Overview of the Roles of Oxidative Stress. Oxid Med Cell Longev. , 795602 (2015).
  4. Ichikawa, Y., et al. Cardiotoxicity of doxorubicin is mediated through mitochondrial iron accumulation. J Clin Invest. 124 (2), 617-630 (2014).
  5. Zhang, Y. W., Shi, J., Li, Y. J., Wei, L. Cardiomyocyte death in doxorubicin-induced cardiotoxicity. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 57 (6), 435-445 (2009).
  6. Sawyer, D. B. Anthracyclines and heart failure. N Engl J Med. 368 (12), 1154-1156 (2013).
  7. Zhang, S., et al. Identification of the molecular basis of doxorubicin-induced cardiotoxicity. Nat Med. 18 (11), 1639-1642 (2012).
  8. Dodd, D. A., et al. Doxorubicin cardiomyopathy is associated with a decrease in calcium release channel of the sarcoplasmic reticulum in a chronic rabbit model. J Clin Invest. 91 (4), 1697-1705 (1993).
  9. Mitry, M. A., Edwards, J. G. Doxorubicin induced heart failure: Phenotype and molecular mechanisms. Int J Cardiol Heart Vasc. 10, 17-24 (2016).
  10. Aminkeng, F., et al. A coding variant in RARG confers susceptibility to anthracycline-induced cardiotoxicity in childhood cancer. Nat Genet. 47 (9), 1079-1084 (2015).
  11. Deng, S., et al. Dystrophin-deficiency increases the susceptibility to doxorubicin-induced cardiotoxicity. Eur J Heart Fail. 9 (10), 986-994 (2007).
  12. Leong, S. L., Chaiyakunapruk, N., Lee, S. W. Candidate Gene Association Studies of Anthracycline-induced Cardiotoxicity: A Systematic Review and Meta-analysis. Sci Rep. 7 (1), 39 (2017).
  13. Wasielewski, M., et al. Potential genetic predisposition for anthracycline-associated cardiomyopathy in families with dilated cardiomyopathy. Open Heart. 1 (1), e000116 (2014).
  14. Lebrecht, D., et al. Dexrazoxane prevents doxorubicin-induced long-term cardiotoxicity and protects myocardial mitochondria from genetic and functional lesions in rats. Br J Pharmacol. 151 (6), 771-778 (2007).
  15. QuanJun, Y., et al. Protective Effects of Dexrazoxane against Doxorubicin-Induced Cardiotoxicity: A Metabolomic Study. PLoS One. 12 (1), e0169567 (2017).
  16. Seifert, C. F., Nesser, M. E., Thompson, D. F. Dexrazoxane in the prevention of doxorubicin-induced cardiotoxicity. Ann Pharmacother. 28 (9), 1063-1072 (1994).
  17. Adams, J. W., et al. Enhanced Galphaq signaling: a common pathway mediates cardiac hypertrophy and apoptotic heart failure. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (17), 10140-10145 (1998).
  18. Bowles, N. E., Bowles, K. R., Towbin, J. A. The "final common pathway" hypothesis and inherited cardiovascular disease. The role of cytoskeletal proteins in dilated cardiomyopathy. Herz. 25 (3), 168-175 (2000).
  19. Kroumpouzou, E., et al. Common pathways for primary hypertrophic and dilated cardiomyopathy. Hybrid Hybridomics. 22 (1), 41-45 (2003).
  20. Towbin, J. A., Bowles, K. R., Bowles, N. E. Etiologies of cardiomyopathy and heart failure. Nat Med. 5 (3), 266-267 (1999).
  21. Liu, Y., et al. Visnagin protects against doxorubicin-induced cardiomyopathy through modulation of mitochondrial malate dehydrogenase. Sci Transl Med. 6 (266), 266ra170 (2014).
  22. Asimaki, A., et al. Identification of a new modulator of the intercalated disc in a zebrafish model of arrhythmogenic cardiomyopathy. Sci Transl Med. 6 (240), 240ra274 (2014).
  23. Ding, Y., et al. Haploinsufficiency of target of rapamycin attenuates cardiomyopathies in adult zebrafish. Circ Res. 109 (6), 658-669 (2011).
  24. Sun, X., et al. Cardiac hypertrophy involves both myocyte hypertrophy and hyperplasia in anemic zebrafish. PLoS One. 4 (8), e6596 (2009).
  25. Sun, Y., et al. Activation of the Nkx2.5-Calr-p53 signaling pathway by hyperglycemia induces cardiac remodeling and dysfunction in adult zebrafish. Dis Model Mech. 10 (10), 1217-1227 (2017).
  26. Yang, J., Shah, S., Olson, T. M., Xu, X. Modeling GATAD1-Associated Dilated Cardiomyopathy in Adult Zebrafish. J Cardiovasc Dev Dis. 3 (1), (2016).
  27. Ding, Y., et al. Trapping cardiac recessive mutants via expression-based insertional mutagenesis screening. Circ Res. 112 (4), 606-617 (2013).
  28. Ding, Y., et al. A modifier screen identifies DNAJB6 as a cardiomyopathy susceptibility gene. JCI Insight. 2 (8), (2017).
  29. Kinkel, M. D., Eames, S. C., Philipson, L. H., Prince, V. E. Intraperitoneal injection into adult zebrafish. J Vis Exp. (42), (2010).
  30. Wang, L. W., et al. Standardized echocardiographic assessment of cardiac function in normal adult zebrafish and heart disease models. Dis Model Mech. 10 (1), 63-76 (2017).
  31. Desai, V. G., et al. Development of doxorubicin-induced chronic cardiotoxicity in the B6C3F1 mouse model. Toxicol Appl Pharmacol. 266 (1), 109-121 (2013).
  32. Zhu, W., Shou, W., Payne, R. M., Caldwell, R., Field, L. J. A mouse model for juvenile doxorubicin-induced cardiac dysfunction. Pediatr Res. 64 (5), 488-494 (2008).
  33. Chatterjee, K., Zhang, J., Honbo, N., Karliner, J. S. Doxorubicin cardiomyopathy. Cardiology. 115 (2), 155-162 (2010).
  34. Bang, C., et al. Cardiac fibroblast-derived microRNA passenger strand-enriched exosomes mediate cardiomyocyte hypertrophy. J Clin Invest. 124 (5), 2136-2146 (2014).
  35. Rassaf, T., Kelm, M. Protection from diabetic cardiomyopathy - putative role of the retinoid receptor-mediated signaling. J Mol Cell Cardiol. 59, 179-180 (2013).
  36. Wahbi, K., et al. Dilated cardiomyopathy in patients with mutations in anoctamin 5. Int J Cardiol. 168 (1), 76-79 (2013).
  37. Zhou, M. D., Sucov, H. M., Evans, R. M., Chien, K. R. Retinoid-dependent pathways suppress myocardial cell hypertrophy. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (16), 7391-7395 (1995).
  38. Hershman, D. L., et al. Doxorubicin, cardiac risk factors, and cardiac toxicity in elderly patients with diffuse B-cell non-Hodgkin's lymphoma. J Clin Oncol. 26 (19), 3159-3165 (2008).
  39. Silber, J. H., Barber, G. Doxorubicin-induced cardiotoxicity. N Engl J Med. 333 (20), 1359-1360 (1995).
  40. Von Hoff, D. D., et al. Risk factors for doxorubicin-induced congestive heart failure. Ann Intern Med. 91 (5), 710-717 (1979).
  41. Pugach, E. K., Li, P., White, R., Zon, L. Retro-orbital injection in adult zebrafish. J Vis Exp. (34), (2009).
  42. Zang, L., Morikane, D., Shimada, Y., Tanaka, T., Nishimura, N. A novel protocol for the oral administration of test chemicals to adult zebrafish. Zebrafish. 8 (4), 203-210 (2011).
  43. Collymore, C., Rasmussen, S., Tolwani, R. J. Gavaging adult zebrafish. J Vis Exp. (78), (2013).

Tags

Медицина выпуск 136 доксорубицин кардиомиопатия острой фазы хронической фазы данио рерио внутрибрюшной инъекции болезни модель
Доксорубицин индуцированной кардиомиопатия модель в взрослых рыбок данио
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ma, X., Ding, Y., Wang, Y., Xu, X. A … More

Ma, X., Ding, Y., Wang, Y., Xu, X. A Doxorubicin-induced Cardiomyopathy Model in Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (136), e57567, doi:10.3791/57567 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter