Summary
Aquí se describe un método para generar un modelo de cardiomiopatía inducida por la doxorrubicina en adultos pez cebra (Danio rerio). Dos formas alternativas de la inyección intraperitoneal se presentan y se discuten las condiciones para reducir las variaciones entre los diferentes grupos experimentales.
Abstract
El pez cebra adulto genéticamente accesible (Danio rerio) se ha utilizado cada vez más como un modelo vertebrado para la comprensión de enfermedades humanas como la cardiomiopatía. Debido a su conveniencia y receptividad a la manipulación genética de alto rendimiento, la generación de modelos de cardiomiopatía adquirida, tales como el modelo de miocardiopatía inducida por la doxorrubicina (DIC) en pez cebra adulto, está abriendo las puertas a nuevas vías de investigación, como descubrir modificadores de cardiomiopatía por cribado genético hacia adelante. A diferencia del modelo de embrión de pez cebra DIC, inicial aguda y posteriormente crónica fases de miocardiopatía pueden determinarse en el modelo de pez cebra adulto DIC, lo que permite el estudio de mecanismos de señalización dependiente del escenario y estrategias terapéuticas. Sin embargo, pueden obtenerse resultados variables con el modelo actual, incluso en manos de investigadores experimentados. Para facilitar la futura implementación del modelo de Cid, se presenta un protocolo detallado sobre cómo generar este modelo DIC en pez cebra adulto y describir dos formas alternativas de inyección intraperitoneal (IP). Discutimos más opciones reducir las variaciones para obtener resultados fiables y ofrecen sugerencias sobre cómo interpretar correctamente los resultados.
Introduction
Doxorrubicina (DOX), también llamada Adriamycin, ha sido desarrollada como un medicamento antineoplásico desde la década de 19601,2. Ahora es todavía activamente usado como un medicamento quimioterapéutico importante para un amplio espectro de tumores. Sin embargo, aplicación clínica de DOX se vio obstaculizada por su toxicidad dependiente de la dosis, especialmente cardiotoxicidad caracterizada por síntomas variables que van desde cambios electrocardiográficos asintomáticos a pericarditis y descompensada la miocardiopatía 1 , 2. hasta la fecha, por lo menos tres hipótesis principales se han planteado para explicar la DIC, incluyendo activadas de oxígeno reactivo (ROS) las especies1,3,4,5, inhibición de la topoisomerasa II-β ( TOP2β)6,7y modulación del calcio intracelular de liberación de8,1,9. La acumulación de pruebas también sugiere predisposición genética como factor de riesgo fundamental para DIC10,11,12,13. Identidades de genes relacionados con estas predisposiciones DIC, sin embargo, siguen siendo en gran parte desconocidos. El dexrazoxano es el único agente adyuvante aprobado por la US Food y Drug Administration (FDA) para tratar Cid, pero con limitada aplicación14,15,16, subrayando la necesidad de identificar más estrategias terapéuticas. Modelos animales de DIC se exploran, por tanto, para estos fines. Debido a su accesibilidad y sencillez, estudios mecanísticos de modelos DIC potencialmente podrían tener impactos más amplios en otros tipos de miocardiopatías: patogenesia común podría ser compartido entre miocardiopatías de diversas etiologías, especialmente en más adelante las etapas patológicas17,18,19,20.
Además de modelos de roedores de la Cid, modelos DIC de pez cebra con un mayor rendimiento se han desarrollado para facilitar el descubrimiento de nuevos factores genéticos y terapéuticos. Se ha establecido un modelo embrionario de DIC en los embriones de pez cebra transparente para la detección de compuestos terapéuticos21. Dado que las miocardiopatías son enfermedades de inicio adulto con una patogenesia progresiva, cardiomiopatía del pez cebra adulto modelos han sido desarrollados22,23,24,25,26. Generamos el primer modelo adquirido para la cardiomiopatía resultante de la anemia crónica24, seguido por el Cid como el segundo modelo de cardiomiopatía adquirida en pez cebra adulto23. Hemos encontrado que la inyección de un bolo único de DOX en pez cebra adulto induce la cardiotoxicidad que consiste en una fase aguda más o menos dentro de 1 semana posterior a la inyección (wpi), seguida por una fase crónica de la cardiomiopatía para después de la inyección 6 meses. Mientras que el haploinsufficiency de la mecanicista Diana de la rapamicina(mtor) mejora la cardiomiopatía en la fase crónica, exagera la mortalidad de peces en la fase aguda, subrayando el valor del modelo DIC adulto discernir dependiente de la etapa mecanismos23. Hemos demostrado además que el modelo adulto de DIC puede utilizarse para destacar una colección de pez cebra insertional cardiaca (ZIC) mutantes que se están generando a través de un enfoque basado en el transposon mutagénesis de insertional del27. Una pantalla piloto identificado 3 genes cardiomiopatía conocido como DnaJ (Hsp40) homólogo, subfamilia B y miembro 6b (dnajb6b) como nuevo DIC susceptibilidad genes28. Por lo tanto, la generación del modelo adulto de DIC en el pez cebra condujo a una nueva metodología que permite sistemáticamente identificación de modificadores genéticos de la DIC, que complementa la existente estudio de asociación del genoma completo (GWAS) y locus de carácter cuantitativo (QTL ) análisis.
Durante la generación y aplicación del modelo DIC pez cebra adulto, hemos observado variaciones significativas entre los diferentes investigadores o incluso entre diferentes inyecciones realizadas por el investigador mismo. La naturaleza longitudinal del modelo impone retos para registrar los resultados de diferentes investigadores y al proceso secuencial de solución de problemas. Para facilitar el uso de este sencillo método de estrés inducen cardiomiopatía por la comunidad de investigación, describimos nuestro protocolo en detalle, presente dos tipos de inyección de la IP y discutir consideraciones para reducir las variaciones entre los diferentes investigadores.
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Protocol
Todos los procedimientos aquí descritos se realizaron conforme a la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio (nacional academias prensa. 2011), y fueron aprobadas por la Comisión de uso y de Mayo clínica institucional Animal Care.
1. preparación de pez cebra adulto
- Establecer suficientes pares de crianza en tanques de la travesía para adquirir al menos dos veces tantos como el total de pescado necesario para la inyección de DOX. Si comparar pescado con diferentes fondos genéticos, raza todos los peces dentro de la misma semana para controles de edad comparable.
- Recoger los embriones de peces a la mañana siguiente, transferencia a cajas Petri de 100 mm y mantenerlos en un incubador de 28,5 ° C. Mantener los embriones a una densidad baja (< 100 de embriones/Petri).
- Renovar diariamente el agua de embrión para evitar desequilibrios de sexo y eliminar manualmente los huevos muertos de manera oportuna con una pipeta de transferencia.
- Ponga el mismo número de embriones en cada depósito (por ejemplo, 60 de embriones/3 L de medio tanque inicialmente) para controles de densidad comparable.
- Iniciar el paramecio la alimentación en la fertilización después de 4 días (PD).
- Inspeccione los peces todos los días durante la etapa juvenil. Ajustar el número de peces según sea necesario para peces similar densidad.
- Cuando los peces alcanzan 4 semanas de edad, traslado hasta 20 peces en cada nuevo tanque medio de 3 L para mayor crecimiento. Comenzar a alimentar a los peces con Artemia eclosionada vivo.
2. preparación y almacenamiento de la solución madre de DOX
Nota: DOX puede adquirirse diferentes bio-empresas. El compuesto generalmente se adquiere en polvo en envases de color marrón oscuros.
- Disolver completamente el polvo DOX en agua desionizada para que no matas son visibles, con una concentración final de 5 mg/mL como la solución. Alícuota 1 mL de caldo DOX en cada tubo de safe-lock de 1,5 mL. Envuelva los tubos de 1,5 mL con papel de aluminio para proteger el DOX de exposición a la luz.
Nota: Realice este paso en una campana química. - Mantener la solución DOX a 4 ° C para el almacenamiento. Para almacenamiento a largo plazo (> 4 semanas) de la solución madre de DOX, realizar el opcional sección 3 se describe a continuación.
3. Control de calidad de DOX con embriones de pez cebra (opcionales)
Nota: DOX es ambos y luz-sensibles a la humedad, por lo que puede perder su eficacia de la droga para el modelado de DIC después de almacenamiento prolongado. Para DOX de diferentes empresas, o incluso diferentes lotes de la misma empresa, es útil calibrar la eficacia de los medicamentos utilizando embriones de pez cebra de tipo salvaje (WT) antes de llevar a cabo los experimentos en peces adultos. Este método se deriva de un pez cebra divulgado embrionario DIC modelo21.
- Recolectar embriones de pez cebra de peso de al menos 2 pares de peces. Dechorionate embriones en fertilización después de 24 h (hpf) manualmente mediante el uso de una jeringa con un micro de la aguja. Alternativamente, tratar al embrión con proteinasa K a una concentración final de 10 μg/mL para 10-15 minutos en una incubadora de 30 ° C. Renovar el agua del embrión después de dechorionation. Eliminar embriones muertos y mantener por lo menos 36 embriones de cada lote.
- Diluir la solución madre de DOX en agua de embriones frescos a una concentración final de 100 μm. El volumen de solución es de 100 μl de cada 3 embriones. Mezcle la solución diluida de DOX en el vórtex. La solución diluida final debe ser una luz, de color rojo.
- Añadir 100 μL/pocillo de solución diluida de DOX de una placa de 96 pocillos limpia transparente.
- 3 embriones de dechorionated con una pipeta de plástico y mantenga los embriones cerca del extremo de la pipeta. Ponga la punta de la pipeta en cada pozo con solución DOX. Deje que el extremo de la punta toque la solución y permitir que los embriones destinados a nadar en el pozo.
Nota: Evite empujar manualmente los embriones, que añadir más agua en el pozo y diluir la solución de DOX. - Actualizar la solución DOX en 48 hpf. Por este tiempo, observe los pozos bajo un microscopio con aumento de 10 X para identificar embriones muertos (cese del latido del corazón) o embriones con edema. Cuenta y eliminar así cualquier embriones muertos de manera oportuna, caso contrario los restantes embriones expuestos a la solución con embriones muertos pueden morir rápidamente.
- Compruebe los embriones en 72 hpf y contarlos. El tratamiento de DOX se considera "eficacia de la droga buena" si > 25% muerte (cese del latido del corazón) puede observarse en ambos lotes de embriones.
4. preparación de la inyección de
Nota: Peces de 8 semanas a 6 meses de edad se utilizan para la inyección de DOX. Pesos corporales (BWs) de un pez salvaje indio Karyotype (WIK) madurado que se inyecta pueden variar entre 0.2-0.5 g.
- Rápido el pescado durante 24 h antes de la inyección.
- Anestesiar el pez con agua embrión Metanosulfonato de 0,16 mg/mL. Utilice un papel de filtro limpio para secar el agua de ambos lados del cuerpo. Medir el PN de cada pescado sobre una escala. Agrupar peces dentro de 10% de diferencia en BW para la inyección posterior.
Nota: Para minimizar la carga de trabajo en este paso, pescado en el 10% de diferencia en BW se considera del mismo tamaño; por lo tanto, prepare una solución de trabajo de DOX según su media BW. - Plan para inyectar cada pez adulto con 5 μl de la solución. Calcular la concentración de DOX trabajo según el número de peces y la BWs.
Nota: Para estudiar la cardiotoxicidad crónica hasta 6 meses, use DOX en una dosis de 20 mg/kg. Para estudiar la cardiotoxicidad aguda de DOX, la dosis DOX puede aumentarse hasta 50 mg/kg de BW. - Diluir el caldo DOX en 1 x una solución salina equilibrada de Hank (HBSS) para concentraciones de trabajo correspondientes. Vortex para mezclar la solución. Brevemente girar hacia abajo para recoger la solución.
5. DOX inyección en peces adultos
- Lugar un limpio 100 mm plato de Petri con una esponja en su interior, debajo de un microscopio de disección, luego ajuste el enfoque. Cortar la esponja para hacer una cavidad de unos 4 cm de longitud para sujetar un pez. Hacer una cavidad más largo para un pez más grande.
- Preparar una aguja 34 G con una micro-jeringa de 10 μl. Enjuague la aguja con 1 x HBSS tampón para eliminar cualquier burbujas y bloques de la jeringa y el tubo.
- Anestesiar a los peces adultos en agua de embrión con Metanosulfonato de 0,16 mg/mL por 2 min.
Nota: Anestesia prolongada durante 5 min seguido de inyección DOX puede causar fácilmente peces muerte. - Sumerja la esponja en agua de embrión con Metanosulfonato y transferir el pescado a la esponja para la inyección.
-
Realizar la inyección IP DOX por cualquiera de los dos métodos descritos a continuación.
- Clásico de inyección IP29
- Coloque el pescado con el abdomen hacia arriba en la cavidad de la esponja. Insertar la aguja, con un 45° ángulo al cuerpo de los pescados en la línea media entre las aletas pélvicas y penetrar aproximadamente 1-2 mm. lanza rápidamente toda la solución DOX lentamente. Esperar 5 s antes de sacar la aguja. Compruebe la entrega DOX por un visible color rojo en el vientre del pez.
- Inyección alternativa de IP
- Coloque el pescado lateralmente sobre la esponja con la parte anterior hacia la derecha. Suavemente estabilizar los pescados usando un fórceps de extremo romo con la mano izquierda y sostenga la jeringa micro con la mano derecha.
- Posición de la aguja por debajo de la línea lateral por encima de la aleta pélvica, con el bisel hacia arriba. Apuntando a la posición de 7:00 a un ángulo de 45 °, inserte la aguja de 3-4 mm en la cavidad de pescado situada entre la pelvis y las aletas anales y luego presione lentamente el émbolo. Compruebe la entrega DOX por un visible color rojo en el vientre del pez.
- Clásico de inyección IP29
- Transferir rápidamente los peces inyectados a un tanque de paso limpio llenado de agua fresca del sistema para permitir que los peces a recuperar. Enjuague la aguja una vez con 1 amortiguador de x HBSS entre las inyecciones.
6. después de la inyección de peces gestión
- Después de la inyección, devolver los peces al sistema con circulación de corriente. Si es posible, mantener peces tratados con DOX por separado del sistema principal para evitar la contaminación cruzada entre los diferentes depósitos que comparten la circulación.
- Rápido el pescado inyectado por otro 24 h de recuperación. Observar los peces diariamente durante la primera semana. Retirar los peces muertos de manera oportuna para evitar la infección a los otros peces.
Nota: Las muertes de peces dentro de las primeras 24 h son probablemente debido a las lesiones físicas causadas por la inyección. - Además mantener los peces DOX-tensionado para observaciones longitudinales. Eliminar peces muertos a tiempo para evitar infecciones a otros peces en el tanque.
Nota: Números de peces están documentados para generar una curva de supervivencia. - Utilizar diferentes ensayos experimentales al fenotipo el pescado DOX-tensionada, como ecocardiografía30, función cardiaca reportero línea transgénica23, natación desafío26y cuantificación de otros remodelación patológica marcadores23.
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Representative Results
Aquí, se presentan dos métodos para realizar la inyección del IP modelo DIC en pez cebra adulto. Cuando se utiliza el clásico, establecido IP inyección método29, se observó que la solución inyectada de DOX (color rojo) a veces puede exudar hacia fuera desde el lugar donde la aguja penetró. La inyección IP alternativa utiliza una ubicación diferente para la penetración de la aguja que es 3-4 mm del peritoneo donde se libera el DOX (figura 1A), que previene con eficacia la salida (figura 1B, 1C). Entrega exitosa de DOX en el peritoneo para ambos métodos se evidencia por la rápida distribución del color rojo en el vientre del pez, que es visible en el lado opuesto del lugar de inyección.
Inyección de DOX administrado a dosis de 50 mg/kg mediante el método IP alternativa conduce a toxicidad severa, donde la mayoría de los peces muere dentro de una semana (figura 2). Por el contrario, la inyección de DOX administrado a dosis de 20 mg/kg utilizando las IP método causas alternativas casi ninguna muerte de peces durante las primeras 2 semanas y la muerte de peces ~ 10% en 4 wpi (Figura 3A). Inyección de DOX administrado a dosis de 20 mg/kg mediante el método IP clásico exhibe ~ 30% muerte de peces en 4 wpi (figura 3). Peces inyectados con cualquiera de los métodos exhiben una muerte similar de ~ 20% peces de wpi 4 a 10 wpi (figura 3B, D).
Hemos aprovechado el casper ; TG(cmlc2:nusDsRed) peces para evaluar la progresión de la disfunción cardiaca en el DIC del modelo (Figura 4A)23. El cuerpo transparente permite la documentación de un corazón rojo en sistólica (Figura 4B) y diastólica (figura 4) etapas bajo un microscopio fluorescente. Después de la inyección de 20 mg/kg DOX usando el método alternativo de IP, disminución de la función ventricular puede ser detectado a partir de 4 wpi (figura 4).
Figura 1: rutas de inyección. Inyección (1A) IP alternativa y esquemas de la inyección de IP clásico (b) (a) métodos. El círculo rojo indica el DOX común lanza sitio para los métodos de inyección de dos. Círculos verdes indican los sitios de penetración de la aguja. Las distancias se calculan en base a un pez WIK adulto pesa aproximadamente 0,3 resultados representativos de g. (1B, 1C) indicando una exitosa entrega DOX mediante dos métodos de inyección intraperitoneal. Enrojecimiento dentro del vientre de los peces adultos puede señalarse inmediatamente después de la inyección. Peces inyectados se revisaron otra vez después de 5 minutos de recuperación en un sistema fresco de agua. HBSS: 1 x Hank había equilibrada solución de sal. Pez cebra WT WIK fueron empleados. Barra de escala: 5 mm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: curvas de supervivencia representativas del pez cebra adulto tras estrés DOX con inyección de DOX de 50 mg/kg. Se muestran 3 conjuntos de inyecciones de DOX en distintos lotes de peces adultos de peso en 3-6 meses de edad. En total, n = 24 peces fueron empleados en el grupo de control de x HBSS 1 y n = 8 peces fueron empleados en cada lote inyectado con DOX. Ninguna diferencia en la supervivencia de peces fueron observadas entre los métodos de inyección de dos. Pez cebra WT WIK fueron empleados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: curvas de supervivencia representativas del pez cebra adulto tras estrés DOX con inyección de DOX de 20 mg/kg y la comparación entre dos métodos de inyección intraperitoneal. Supervivencia (3A) peces dentro de 0-4 semanas después del nacimiento DOX por inyección intraperitoneal clásico. Por ciento de pescado número en la semana 0 fue considerado como 100%. (3B) supervivencia de peces después de 4 semanas post parto DOX por inyección intraperitoneal clásico. Por ciento de pescado número en la semana 4 fue considerado como 100%. Supervivencia (3 C) pescado dentro de 0-4 semanas después del nacimiento DOX por inyección intraperitoneal alternativa. Por ciento de pescado número en la semana 0 fue considerado como 100%. (3D) supervivencia después de 4 semanas después del nacimiento DOX por inyección intraperitoneal alternativa de pescado. Por ciento de pescado número en la semana 4 fue considerado como 100%. Datos que se muestra en (3A) y (3B) son 9 diferentes lotes de inyección de DOX de un total de 223 peces inyectados a los 3-6 meses de edad. Datos que se muestra en (3 C) y (3D) son 14 diferentes lotes de inyección de DOX de un total de 335 peces inyectados en 2-6 meses de edad. Los números de peces vivos se registran semanalmente. Barras de error representan desviación en porcentaje de supervivencia entre los diferentes lotes a cada semana. Pez cebra WT WIK fueron empleados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Evaluación de la función cardiaca representativo tras estrés DOX con casper ; TG(cmlc2:nusDsRed) peces. (4A) una fotografía de un adulto casper; TG(cmlc2:nusDsRed) peces. Barra de escala = 1 cm. (4B) imagen representativa de un ventrículo rojo en la fase sistólica final de un madurado casper ; TG(cmlc2:nusDsRed) peces. El tablero representa diámetro sistólico final (ESD). Imagen (4 C) representante de un ventrículo rojo en la fase diastólica final de un madurado casper ; TG(cmlc2:nusDsRed) peces. Las imágenes de (4B) y (4 C) fueron extraídos de películas de un corazón que late capturadas con un microscopio de disección fluorescente de 6,3 aumentos. El tablero representa diámetro diastólico final (EDD). Barra de escala = 1 mm. (4D) representativa la función cardiaca con casper ; TG(cmlc2:nuDsRed) pez cebra adulto después de la inyección de 20 mg/kg DOX. EDD y ESD se midieron como se indica en (4B) y (4C) para cada pez, ventricular y acortamiento de la fracción se calcula por la fórmula (EDD − ESD) / EDD. Significativamente disminuida fracción ventricular acortamiento fue detectado en 4 semanas y después de eso. Se utilizó el método alternativo intraperitoneal. Valores se muestran como el media ± error de estándar. n ≥ 3 en cada grupo. Se utilizó la prueba t de Student para la comparación de dos grupos. p < 0.05. Estas cifras se han modificado de Ding et al. 23 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Para modelar un DIC progresiva, la dosis de 20 mg/kg DOX se determinó experimentalmente como la dosis más alta que no causa muerte de peces importantes durante 1 wpi pero aún resultados en la muerte de peces y la reducción de la función cardiaca después de wpi 4 (figura 3 y Figura 4). Esta dosis es comparable a los que se utilizan con frecuencia en modelos de roedores DIC (15-25 mg/kg) y la dosis acumulativa de límite en los seres humanos (550 mg/m2, que es equivalente a 15 mg/kg)4,7,31,32 , 33. dosis más altas de DOX, como 50 mg/kg, muestran muerte ictícola considerable durante 1 wpi, así que pueden ser utilizados para estudiar solamente agudas cardiacas respuestas tóxicas a DOX23,28.
Durante la implementación de este modelo de Cid, nos dimos cuenta de que era difícil para los nuevos investigadores reproducir los mismos resultados al principio. Incluso para los experimentados investigadores, sobre un 20% variación de la mortalidad en la fase crónica puede todavía encontrarse entre las inyecciones diferentes (figura 3), indicando los factores de confusión biológicas no caracterizados en el modelo actual. A pesar de una menos que el modelo perfecto, creemos todavía que este modelo actual de DIC es suficiente para que sonora descubrimiento debido a las siguientes pruebas. En primer lugar, después de varias prácticas, los resultados del modelo DIC pueden ser más adelante registrados entre la mayoría, si no todos los investigadores. Basado en este modelo de Cid, en segundo lugar, se identificaron 4 modificadores genéticos significativos. Evidencia de informes de la literatura había apoyado 3 de ellos como cardiomiopatía genes34,35,36,37. El 4th uno es DnaJ homólogo subfamilia B miembro 6 (DNAJB6), que ha demostrado ser un nuevo gen de cardiomiopatía, apoyado por un estudio genético humano28. Por lo tanto, concluimos que los resultados basados en grupos el experimentales con controles de edad comparable estrictamente siguen siendo altamente repetibles, aunque el modelo DIC en su forma actual no es confiable para la comparación inter-experimental.
Los factores de confusión que contribuyen a la inconsistencia observada en nuestro actual modelo DIC probable incluyen los siguientes: (1) envejecimiento y diferencia de género se han considerado como factores cruciales de riesgo para enfermedades cardiovasculares incluyendo DIC38, 39,40. Ambos cofundadores hipotéticas quedan a prueba en nuestro modelo concreto, notó que de peces tienden a ser más sensibles a la toxicidad de DOX (datos no mostrados). Las variaciones entre lotes observadas usando ambos métodos IP (figura 3) son también probablemente contribuyó a estos dos cofundadores. (2) a diferencia de los modelos animales más grandes, del tamaño de un pez cebra adulto es pequeño. Por lo tanto, daños locales por inyección DOX pueden ser más severo y variable. (3) muerte de peces inyectados pudiera derivarse de la toxicidad DOX en otros órganos (p. ej., toxicidad renal), además el corazón. Mientras que experimentos cuidadosamente diseñados son necesarios para abordar cada uno de los factores de confusión mencionados, trabajo anterior sugiere que las siguientes precauciones ayudarán a reducir las variaciones fenotípicas: en primer lugar, es fundamental para garantizar la eficacia de DOX. Polvo DOX siempre debe mantenerse en un área secado y oscuro, y las soluciones deben ser manejadas con cuidado para reducir la exposición a la luz. Es aconsejable que DOX trabajo se prepararon soluciones recién cada vez antes de la inyección de peces. Normalmente no utilizamos soluciones DOX después de 4 semanas en almacenamiento de información. Cuando hay duda, realizar la sección opcional 3 en este protocolo utilizando el modelo DIC embrionario rápido para calibrar la eficacia de los medicamentos de cada lote DOX. En segundo lugar, la sincronización de peces adultos es fundamental. La misma cepa de pescado debe plantearse en la misma densidad, para asegurar el tamaño corporal similar. Luego seleccionamos los peces con similares BWs para cálculo de dosis. Se recomienda mantener al menos dos veces tantos peces en total para este proceso de preselección. Todos los peces se ayunaban durante 24 h antes del proceso de preselección. En tercer lugar, se recomienda siempre utilizar peces de similar edad y sexo de los peces antes de la inyección de DOX debido a sus tasas de crecimiento diferentes y potencialmente diferentes respuestas cardiacas a DOX.
Nos dimos cuenta que la mayoría de conclusiones inconsistentes podría atribuirse a un grupo control cuestionable. Por lo tanto, recomendamos los investigadores nuevos al modelo DIC inyecciones de DOX de práctica antes de llevar a cabo experimentos reales. Cuando DOX de 20 mg/kg se inyecta usando el método de inyección IP alternativo, una técnica de inyección buena puede ser indicada por una casi cero muerte de peces durante 1 wpi de DOX y una tasa de mortalidad relativamente consistente en la inyección de 2-3 meses post-DOX. La última evidencia de modelación exitosa es la reducción del índice cardíaco funcional, que puede cuantificarse mediante ecocardiografía25,30, utilizando un casper ; TG(cmlc2:nusDsRed) línea transgénica, o mediante un nuevo ex vivo-base análisis de la función cardiaca (datos no mostrados).
Además de la inyección del IP, otras rutas de entrega de drogas tales como inyección retro-orbitales41,42y la incubación del agua de alimentación oral se utiliza también con frecuencia en pez cebra adulto. No adoptamos el enfoque de inyección retro orbital, a pesar de su liberación de droga directa en el sistema circulatorio, debido a la falta de un método para validar la entrega de drogas exitosa, como la rojez de DOX puede fácilmente enmascarar por el potencial sangrado. Trató de un protocolo de administración oral a través de la incrustación de DOX con gluten absorbible42, que fue mezclado con las comidas para alimentar peces adultos. Por desgracia, con hasta la dosis acumulativa de 150 mg/kg utilizado dentro de un período de 4 semanas de alimentación, no observamos ningún cardiotoxicidad severa, sugiriendo la ineficacia de la administración oral de DOX. Alternativamente, una técnica de alimentación oral forzada podría ser más explorados43. Además, el protocolo de incubación de remojo el pescado en una solución que contiene DOX es una potencial ruta de entrega que podría probarse en el futuro.
Reconocemos que una de las principales limitaciones del actual modelo de DIC es el método de inyección de bolo único, que podría causar daño local y alta toxicidad a los órganos internos. Este enfoque fue diseñado para reducir las cargas de trabajo y aumentar el rendimiento, para que la investigación genética puede llevarse a cabo en un alto rendimiento en peces adultos28. En el futuro, deberían continuarse los modelos con múltiples inyecciones de DOX en dosis más bajas, que serán mejor recapitular el DIC observado en pacientes con cáncer tratados con quimioterapia.
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Disclosures
Los autores declaran no hay conflictos de intereses.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado en parte por una subvención de desarrollo científico de la Asociación Americana del corazón (14SDG18160021 a YD), la US NIH R01 otorga HL 81753 y HL 107304 al XX y la Fundación de Mayo para XX.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Crossing tank | Aquaneering | ZHCT100 | Fish breeding |
| Incubator | ThermoFisher | Maintaining embryo | |
| 3 L medium tank | Aquaneering | ZT280 | Maintaining fish |
| Paramecia | Carolina | 131560 | Food for juvenile fish |
| Live hatched brine shrimp | in house | Food for adult fish | |
| Doxorubicin hydrochloride | Sigma | D1515-10MG | |
| 1.5 ml safe-lock tube | Eppendorf | No. 022363204 | For drug storage |
| Aluminum foil paper | Fisher | 1213104 | For preventing light exposure |
| Proteinase K | Roche | No. 03115887001 | For dechorionating embryo |
| Hank's balanced salt solution (HBBS) | ThermoFisher | 14025076 | Vehicle for DOX |
| 100 mm petri dish | Falcon | 431741 | |
| 10 μL NanoFil micro-syringe | WPI | NANOFIL | For injection |
| 34 gauge needle | WPI | NF34BV-2 | For injection |
| Tricaine | Argent | MS-222 | Anesthetizing fish |
| 96 well plate | Costar | 3539 | For embryo drug treatment |
| Transfer pipette | Bel-art product | F37898 | For transfering embryo |
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