Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Doxorubicin-inducerad kardiomyopati modell i vuxen zebrafiskar

Published: June 7, 2018 doi: 10.3791/57567
Automatic Translation
*1,2,3, *2,3, 2,3,4, 1,2,3
1Clinical and Translational Sciences Track, Mayo Clinic Graduate School of Biomedical Sciences, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Mayo Clinic, 3Division of Cardiovascular Diseases, Mayo Clinic, 4Institute of Life Science, Beijing University of Chinese Medicine
* These authors contributed equally

Summary

En metod för att generera en doxorubicin-inducerad kardiomyopati modell i vuxen zebrafiskar (Danio rerio) beskrivs här. Två alternativa sätt att intraperitoneal injektion presenteras och villkor att minska variationer bland olika experimentella grupper diskuteras.

Abstract

Den genetiskt tillgänglig vuxen zebrafiskar (Danio rerio) har använts alltmer som en vertebrate modell för att förstå mänskliga sjukdomar såsom kardiomyopati. På grund av dess bekvämlighet och föredragandens till hög genomströmning genetiska manipulationer, öppnar generering av förvärvade kardiomyopati modeller, såsom doxorubicin-inducerad kardiomyopati (DIC) modellen i vuxen zebrafiskar, dörrar till nya forskning avenyer, inklusive att upptäcka kardiomyopati modifierare via framåt genetisk screening. Skiljer sig från den embryonala zebrafiskar DIC modellen, både initial akut och senare kroniska faser av kardiomyopati kan bestämmas i vuxen zebrafiskar DIC modellen möjliggör studier av scenen-beroende signalering mekanismer och terapeutiska strategier. Dock kan varierande resultat erhållas med den nuvarande modellen, även i händerna på erfarna utredare. För att underlätta framtida genomförande av DIC modellen, presenterar vi ett detaljerat protokoll på hur till generera DIC modellen adult zebrafiskar och beskriva två alternativa sätt att intraperitoneal (IP) injektion. Vi diskutera ytterligare alternativ att minska variationer för att få tillförlitliga resultat och ge förslag på hur man på lämpligt sätt tolka resultaten.

Introduction

Doxorubicin (DOX), Adriamycin, som också heter har utvecklats som en antineoplastiska läkemedel sedan 1960-talet1,2. Nu är det fortfarande används aktivt som en viktig kemoterapeutiska läkemedel för ett brett spektrum av tumörer. Dock klinisk tillämpning av DOX hämmades av dess dosberoende toxiciteter, särskilt kardiotoxicitet kännetecknas av varierande symtom från asymtomatiska elektrokardiografiska förändringar till perikardit och dekompenserad kardiomyopati 1 , 2. hittills har minst tre stora hypoteser har framförts för att förklara DIC, inklusive aktiverat reaktivt syre arter (ROS)1,3,4,5, hämning av topoisomeras II-β ( TOP2β)6,7, och modulering av intracellulära kalcium release1,8,9. Ackumulerande bevis föreslår också genetiska anlag som en central riskfaktor för DIC10,11,12,13. Gen identiteter relaterade till dessa DIC anlag, kvarstår dock till stor del okända. Dexrazoxan är den enda adjuvant agent godkänd av oss Food and Drug Administration (FDA) att behandla DIC, men med begränsad genomförande14,15,16, vilket understryker behovet av att identifiera ytterligare terapeutiska strategier. Djurmodeller av DIC utforskas därför för dessa ändamål. På grund av deras tillgänglighet och enkelhet, mekanistiska studier på DIC modeller kan potentiellt ha bredare effekter på andra typer av kardiomyopatier: gemensam patogenes kan delas mellan kardiomyopatier av olika etiologier, särskilt på senare patologiska stadier17,18,19,20.

Förutom gnagare modeller av DIC, har zebrafiskar DIC modeller med högre genomströmning utvecklats för att underlätta upptäckten av nya genetiska faktorer såväl therapeutics. En embryonala DIC-modell har fastställts i genomskinliga zebrafiskar embryon för screening terapeutiska föreningar21. Med tanke på att kardiomyopatier är vuxen debut sjukdomar med en progressiv patogenes, utvecklat vuxen zebrafiskar kardiomyopati modeller har22,23,24,25,26. Vi skapade den första förvärvade modellen för kardiomyopati som följd av kronisk anemi24, följt av DIC som den andra förvärvade kardiomyopati modellen adult zebrafiskar23. Vi hittade att injektion av en engångsbolus av DOX i vuxen zebrafiskar inducerar kardiotoxicitet som består av en akut fas ungefär inom 1 vecka efter injektion (wpi), följt av en kronisk fas av kardiomyopati till 6 månader efter injektionen. Medan haploinsufficiency mekanistiska målet på rapamycin(mtor) ameliorates kardiomyopati vid kronisk fas, överdriver det fisk dödlighet på den akuta fasen, betonar värdet av vuxen DIC modellen att urskilja scenen-beroende mekanismer23. Vi visade vidare att den vuxna DIC-modellen kan användas att betona en samling av zebrafisk insertional hjärt (ZIC) mutanter som skapas via en transposon-baserade insertionsmutationer tillvägagångssätt27. En pilot skärm identifierade 3 kända kardiomyopati gener samt DnaJ (Hsp40) homolog, underfamilj B och medlemmen 6b (dnajb6b) som nya DIC känslighet gener28. Därför generationen av vuxen DIC modellen i zebrafiskar ledde till en ny metod som systematiskt möjliggör identifiering av genetiska modifierare för DIC, som kompletterar befintliga genome-wide association-studier (GWAS) och kvantitativa locus (QTL ) analys.

Under generering och genomförandet av modellen adult zebrafiskar DIC märkte vi betydande variationer mellan olika forskare och/eller även bland olika injektioner utförs av samma prövaren. Den längsgående naturen av modellen medför utmaningar att registrera resultat från olika undersökare och sekventiell felsökningsprocessen. För att underlätta användningen av denna enkla kardiomyopati-inducerande stress metod av gemenskapens forskning, vi beskriva våra protokoll i detalj, finns två typer av IP-injektion, och diskutera överväganden för att minska variationer mellan olika forskare.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla förfaranden beskrivs här utfördes enligt guiden för skötsel och användning av försöksdjur (nationella akademier Press. 2011), och de godkändes av Mayo Clinic institutionella djur vård och användning kommittén.

1. vuxen zebrafiskar förberedelse

  1. Ställa in tillräckligt häckande par i crossing tankar att förvärva minst dubbelt så många som de totala fisk behövs DOX injektionsvätska. Om man jämför fisk med olika genetiska bakgrunder, odla alla fisk inom samma vecka för att säkerställa åldersmatchade kontroller.
  2. Samla fisk embryona nästa morgon, överföra dem till 100 mm petriskålar och hålla dem i en 28,5 ° C inkubator. Hålla embryon med en låg täthet (< 100 embryon/petriskål).
  3. Uppdatera embryo vattnet dagligen för att undvika sex obalans, och manuellt ta bort döda ägg i tid med överföring pipett.
  4. Sätta samma antal embryon i varje tank (exempelvis 60 embryon/3 L medellång tank initialt) för att säkerställa täthet-matchade kontroller.
  5. Starta paramecia utfodring på 4 dagar efter befruktning (dpf).
  6. Inspektera fisken varje dag under den juvenila fasen. Justera antalet fiskar som behövs för att säkerställa att liknande fisk densitet.
  7. När fisken når 4 veckors ålder, över upp till 20 fisk till varje ny 3 L medellång tank för ytterligare tillväxt. Börja med att mata fiskarna med levande kläckt Artemia.

2. beredning och förvaring av DOX stamlösning

Obs: DOX kan köpas från olika bio-företag. Föreningen förvärvas vanligtvis som ett pulver i mörk brun behållare.

  1. Grundligt lös DOX pulvret i avjoniserat vatten för att säkerställa att inga klumpar syns, med en slutkoncentration på 5 mg/mL som stamlösning. Alikvotens 1 mL DOX lager i varje 1,5 mL säker-lås röret. Wrap 1,5 mL tuberna med aluminiumfolie papper att skydda DOX från ljusexponering.
    Obs: Utföra det här steget i en kemisk huva.
  2. Hålla DOX stamlösning vid 4 ° C för lagring. För långsiktig lagring (> 4 veckor) av DOX stamlösning, utföra den valfria avsnitt 3 beskrivs nedan.

3. kvalitetskontroll av DOX zebrafiskar embryon (tillval)

Obs: DOX är både fukt - och ljuskänsligt, så det kan förlora sin drogen effekt för modellering DIC efter utökad lagring. DOX köps från olika företag, eller ens olika partier från samma företag, är det användbart att kalibrera sin drogen effekt med vildtyp (WT) zebrafiskar embryon innan du utför experiment på vuxen fisk. Denna metod härstammar från en rapporterade zebrafiskar embryonala DIC modell21.

  1. Samla in WT zebrafiskar embryon från minst 2 par av fisk. Dechorionate embryon på 24 h efter befruktning (hpf) manuellt med hjälp av en spruta med en micro nål. Alternativt kan behandla embryot med proteinas K med slutlig koncentration på 10 µg/mL för 10-15 min i en 30 ° C inkubator. Uppdatera embryo vattnet efter dechorionation. Avlägsna döda embryon och bibehålla minst 36 embryon från varje parti.
  2. Späd stamlösningen DOX i färska embryo vatten till en slutlig koncentration på 100 µM. Volymen av lösningen är 100 µL för varje 3 embryon. Blanda den utspädda DOX lösningen av virvel. Den slutliga utspädda lösningen bör vara ett ljus, röd färg.
  3. Tillsätt 100 µL per brunn av utspädda DOX lösning av en ren 96-väl genomskinlig platta.
  4. Ta 3 dechorionated embryon med en plast överföring pipett, och hålla embryona nära slutet av pipettspetsen. Placera pipettspetsen i varje brunn med DOX lösning. Låt slutet av spetsen touch lösningen och de embryon som simmar in i brunnen.
    Obs: Undvik att manuellt trycka embryon, som kommer att lägga till mer vatten i brunnen och späd DOX lösningen.
  5. Uppdatera DOX lösningen på 48 hpf. Vid denna tidpunkt iaktta brunnarna under ett Mikroskop med 10 X förstoring att identifiera döda embryon (upphörande av hjärtslag) eller embryon med ödem. Räkna och ta bort eventuella döda embryon i tid, annars återstående embryona utsätts för lösningen med döda embryon kan dö snabbt också.
  6. Kontrollera att embryon vid 72 hpf och räkna dem. DOX behandling anses ”bra läkemedel effekt” om > 25% död (upphörande av hjärtslag) kan observeras i båda partier av embryon.

4. före injektion förberedelse

Obs: Fisk 8 veckors till 6 månaders ålder används DOX injektionsvätska. Den kropp vikten (BWs) en mognade vilda indiska karyotyp (WIK) fisk ska injiceras kan variera från 0,2-0,5 g.

  1. Snabb fisk för 24 h före injektion.
  2. Söva fisken med embryo vatten som innehåller 0,16 mg/mL tricaine. Använd en ren filterpapper torka vatten från båda sidor av kroppen. Mäta BW varje fisk på en skala. Gruppera fisk inom 10% skillnad i BW senare injektionsvätska.
    Obs: För att minimera arbetsbördan vid detta steg, fisk inom 10% skillnad i BW anses samma storlek. Därför förbereda en DOX fungerande lösning enligt deras medelvärde BW.
  3. Planera att injicera varje vuxen fisk med 5 µL lösning. Beräkna DOX arbetande koncentrationen enligt fisk nummer och BWs.
    Obs: För att studera kronisk kardiotoxicitet upp till 6 månader, använda DOX vid en dos på 20 mg/kg. För att studera akut kardiotoxicitet av DOX, kan DOX dosen ökas till 50 mg/kg bw.
  4. Späd DOX beståndet i 1 x Hanks balanserad saltlösning (HBSS) för motsvarande arbetande koncentrationer. Vortex att blanda lösningen. Kort snurra ner samla lösningen.

5. DOX injektion i vuxen fisk

  1. Plats en ren 100 mm petriskål med en svamp inuti, i dissektion Mikroskop, sedan justera fokus. Skär svampen för att göra en hålighet i ca 4 cm i längd att hålla en fisk. Gör en längre hålighet för en större fisk.
  2. Förbereda en 34 G nål med en 10 µL mikro-spruta. Skölj nålen med 1 x HBSS buffert att ta bort eventuella bubblor och block från sprutan och slangar.
  3. Söva den vuxen fisken i embryo vatten innehållande 0,16 mg/mL tricaine i 2 min.
    Obs: Långvarig anesthetization över 5 min följt av DOX injektion kan lätt orsaka fisk död.
  4. Blötlägg svampen i embryo vatten med tricaine och överföra fisken på svampen för injektion.
  5. Utföra IP DOX injektion med endera av de två metoder som beskrivs nedan.
    1. Klassisk IP-injektion29
      1. Placera fisken med buken upp i håligheten i svampen. Infoga nålen, med en 45° vinkel till fisk kroppen till mittlinjen mellan bukfena och tränga cirka 1-2 mm. släpper snabbt långsamt alla DOX lösning. Vänta 5 s innan du drar ut nålen. Kontrollera DOX leverans genom en synlig röd färg i fisk magen.
    2. Alternativ IP-injektion
      1. Placera fisken sido på svampen med den främre till höger. Försiktigt stabilisera fisken med hjälp av en trubbiga änden pincett med vänster hand och håll mikro-sprutan med höger hand.
      2. Placera nålen under den laterala linjen ovanför den bäcken fenan, med den fasade kanten uppåt. Pekar på klockan 7 position i 45° vinkel, stick in nålen 3-4 mm till fisk hålrummet mellan bäcken och anal fenorna och sedan långsamt trycka ned kolven. Kontrollera DOX leverans genom en synlig röd färg i fisk magen.
  6. Snabbt överföra injiceras fisken till en ren korsning tank fylld med färsk system vatten att låta fisken att återvinna. Skölj nålen en gång med 1 x HBSS buffert mellan injektionerna.

6. efter injektion fisken förvaltning

  1. Efter injektionen, tillbaka fisken systemet med rinnande cirkulation. Om möjligt, bibehålla DOX-behandlade fisk separat från det huvudsakliga systemet för att undvika korskontaminering mellan olika tankar som delar cirkulationen.
  2. Snabbt de injicerade fiskarna för en annan 24 h för återvinning. Iaktta fisk dagligen under första veckan. Ta bort den döda fisken i tid till undvika infektion till den andra fisken.
    Obs: Fisk dödsfall inom de första 24 h är sannolikt på grund av fysiska skador orsakade av injektionen.
  3. Ytterligare underhåll DOX-stressade fisken för longitudinella observationer. Ta bort döda fiskar i tid för att undvika infektioner till andra fiskar i tanken.
    Obs: Fisk nummer dokumenteras för att generera en överlevnad kurva.
  4. Använda olika experimentella analyser till fenotypen DOX-stressade fisken, såsom ekokardiografi30, hjärtfunktion reporter transgena linje23, simning utmaning26och kvantifiering av andra patologiska remodeling markörer23.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Här presenteras två metoder att utföra IP-injektion till modell DIC i vuxen zebrafiskar. När du använder den klassiska, etablerade IP-injektion metod29, noteras att den injicerade DOX lösningen (röd färg) ibland kunde sippra ut från den plats där nålen trängde. Alternativ IP-injektionen använder en annan plats för nål penetration som är 3-4 mm från bukhinnan där DOX släpps (figur 1A), som effektivt förhindrar läckage (figur 1B, 1 C). Framgångsrik leverans av DOX i bukhinnan för båda metoderna framgår av snabb distribution av röd färg i hela magen fisk, vilken syns på motsatt sida av den injektion locus.

Injektion av DOX doserat 50 mg/kg alternativt IP-metoden leder till allvarlig toxicitet, där majoriteten av fisk dör inom en vecka (figur 2). Injektion av DOX doserat däremot 20 mg/kg med hjälp av alternativa IP metod orsakar nästan ingen fisk död under de första 2 veckorna och ~ 10% fisk död på 4 wpi (figur 3A). Injektion av DOX doserat 20 mg/kg med klassisk IP-metoden uppvisar ~ 30% fisk död på 4 wpi (figur 3 c). Fisk injiceras med endera metoden uppvisar en liknande ~ 20% fisk död från 4 wpi till 10 wpi (figur 3B, D).

Vi har lånefinansierade den casper; TG(cmlc2:nusDsRed) fisk att bedöma utvecklingen av hjärtdysfunktion vid DIC modell (figur 4A)23. Den genomskinliga kroppen kan dokumentation av ett rött hjärta på både systoliskt (figur 4B) och diastoliskt (figur 4 c) stadier under en fluorescerande Mikroskop. Efter injektion av 20 mg/kg DOX alternativa IP-metoden, kan kammarfunktion nedgång upptäckas från 4 wpi (figur 4 d).

Figure 1
Figur 1: injektion rutter. (1A) scheman över klassiska IP injektionen (b) och alternativa IP injektion (a) metoder. Den röda cirkeln anger den gemensamma DOX släppa webbplats för två injektion metoder. Gröna cirklar indikerar nål penetration webbplatser. Avstånden beräknas utifrån en vuxen WIK fisk väger cirka 0.3 g. (1B, 1 C) representativa resultat som visar en framgångsrik DOX leverans med två intraperitoneal injektion metoder. Rodnad inuti vuxen fisk magen kan noteras omedelbart efter injektionen. Injicerade fisk kontrollerades igen efter 5 min återhämtning i en färsk system vatten. HBSS: 1 x Hanks balanserad saltlösning. WT WIK zebrafiskar var anställda. Skalstapeln: 5 mm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: representativa överlevnadskurvor för vuxna zebrafiskar efter DOX stress med 50 mg/kg DOX injektion. Visas 3 uppsättningar av DOX injektioner i olika partier av WT vuxna fiskar på 3-6 månaders ålder. I totala, n = 24 fisk var anställda i 1 x HBSS kontrollgrupp och n = 8 fisk var anställda i varje batch som injiceras med DOX. Ingen skillnad i fisk kvarlevor noterades mellan de två injektion metoderna. WT WIK zebrafiskar var anställda. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: representativa överlevnadskurvor för vuxna zebrafiskar efter DOX stress med 20 mg/kg DOX injektion och jämförelsen mellan två intraperitoneal injektion metoder. (3A), fisk överlevnad inom 0-4 veckor efter DOX leverans av klassiska intraperitoneal injektion. Procent fisk nummer vid vecka 0 betraktades som 100%. (3B) fisk överlevnad efter 4 veckor efter DOX leverans av klassiska intraperitoneal injektion. Procent fisk nummer vid vecka 4 betraktades som 100%. (3 C) fisk överlevnad inom 0-4 veckor efter DOX leverans av alternativa intraperitoneal injektion. Procent fisk nummer vid vecka 0 betraktades som 100%. (3D) fiska överlevnad efter 4 veckor efter DOX leverans av alternativa intraperitoneal injektion. Procent fisk nummer vid vecka 4 betraktades som 100%. Data som visas i (3A) och (3B) är 9 olika partier av DOX injektion från en totalt 223 injicerade fisk på 3-6 månaders ålder. Data som visas i (3 C) och (3D) är 14 olika partier av DOX injektion från en totalt 335 injicerade fisk vid 2-6 månaders ålder. Antalet levande fiskar registreras varje vecka. Felstaplar representera standardavvikelsen i andelen överlevnad bland olika partier på varje vecka. WT WIK zebrafiskar var anställda. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Representativa hjärtfunktion bedömning efter DOX stress använder casper; TG(cmlc2:nusDsRed) fisk. (4A), ett fotografi av en vuxen casper; TG(cmlc2:nusDsRed) fisk. Skalstapeln = 1 cm. (4B) representativ bild av en röd ventrikeln systoliskt skede slutet för en mognade casper; TG(cmlc2:nusDsRed) fisk. Streckad linje representerar slutet systolisk diameter (ESD). (4 C) representant bilden av en röd ventrikeln diastoliskt skede slutet för en mognade casper; TG(cmlc2:nusDsRed) fisk. Bilder i (4B) och (4 C) utvanns från filmer av en hjärta som fångas med ett fluorescerande dissektion Mikroskop med 6,3 x förstoring. Streckad linje representerar slutet diastoliskt diameter (EDD). Skalstapeln = 1 mm. (4 D) representativa hjärtfunktion mätt med casper; TG(cmlc2:nuDsRed) vuxen zebrafiskar efter 20 mg/kg DOX injektion. EDD och ESD mättes som visas i (4B) och (4 C) för individuella fiskar, och ventrikulära bråkdel förkortning beräknas genom formeln (EDD − ESD) / EDD. Betydligt upptäcktes minskad ventrikulär bråk förkorta på 4 veckor och därefter. Den alternativa intraperitoneal metoden användes. Värden visas som medelvärde ± medelfel. n ≥ 3 i varje grupp. Student t -test användes för jämförelse av två grupper. p < 0,05. Dessa siffror har ändrats från Ding o.a. 23 Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

För att modellera en progressiv DIC, bestämdes dosen 20 mg/kg DOX experimentellt som den högsta dos som inte orsakar betydande fisk dödsfall under 1 wpi men ändå resultat i fisk död och minskning av hjärtfunktion efter 4 wpi (figur 3 och Figur 4 c). Denna dos är jämförbara som ofta används i gnagare DIC modeller (15-25 mg/kg) och att den gräns kumulativa dosen för människor (550 mg/m2, vilket motsvarar 15 mg/kg)4,7,31,32 , 33. högre doser av DOX, såsom 50 mg/kg, visar betydande fisk dödsfall under 1 wpi, så de kan användas för att studera endast akut hjärt toxiska reaktioner till DOX23,28.

Under genomförandet av denna DIC modell märkte vi att det var svårt för nya utredare att reproducera samma resultat initialt. Även för erfarna utredare, ca 20% finns variant av dödlighet i kronisk fas fortfarande bland olika injektioner (figur 3), som anger uncharacterized biologiska störfaktorer i den nuvarande modellen. Trots en mindre än perfekt modell tror vi fortfarande att denna nuvarande DIC-modell är tillräcklig för att göra ljud upptäckt på grund av följande bevis. Först efter flera metoder, kan resultaten från DIC modellen senare registreras bland de flesta, om inte alla, utredare. För det andra, utifrån denna DIC modell, vi identifierat 4 meningsfull genetiska modifierare. Befintliga bevis från litteraturrapporter stöds 3 av dem som kardiomyopati gener34,35,36,37. 4th en är DnaJ homolog underfamilj B medlem 6 (DNAJB6), som har visat sig vara en ny kardiomyopati gen stöds av en mänsklig genetisk studie28. Således sluta vi att resultat baserat på Intra experimentella grupper med hjälp av strikt åldersmatchade kontroller är fortfarande mycket repeterbara, om än DIC modellen i sin nuvarande form inte är tillförlitliga för mellan experimentell jämförelse.

De störande faktorer som bidrar till den inkonsekvens som observerats i vår nuvarande DIC modell sannolikt inkluderar följande: (1) åldrande och könsskillnad har ansetts avgörande riskfaktorer för hjärt-kärlsjukdomar inklusive DIC38, 39,40. Medan båda hypotetisk grundarna återstår för att testas i vår modell specifikt, märkte vi att åldern fisk tenderar att vara mer känsliga för DOX toxicitet (inga data anges). Inter batch variationer observerats med både IP-metoder (figur 3) är sannolikt också bidragit till dessa två grundarna. (2) skiljer sig från större djurmodeller, storleken på en vuxen zebrafiskar är liten. Lokala skador som orsakats av DOX injektion kan således vara svårare och variabel. (3) döden av injicerade fisk kan resultera från DOX toxicitet i andra organ (t.ex., renal toxicitet), förutom hjärtat. Medan mer noggrant designad experiment behövs för att ta upp alla de ovannämnda störfaktorer, tidigare arbete föreslår att följande varningarna kommer att bidra till att minska fenotypiska variationer: det första är det viktigt att garantera effekten av DOX. DOX pulver bör alltid förvaras i ett torrt och mörkt område och lösningar ska hanteras med omsorg för att minska exponering för ljus. Det rekommenderas att DOX fungerande lösningar beredas på nytt varje gång innan fisk injektion. Vanligtvis använder vi inte lagerför DOX lösningar efter 4 veckor i lagring. När det finns tvivel, utföra den valfria avsnitt 3 i detta protokoll med snabb embryonala DIC modell för att kalibrera drog effekten av varje DOX batch. Andra, vuxna fiskar synkronisering är avgörande. Samma fisk stam behöver lyftas på samma densitet, att säkerställa att liknande kroppsstorlek. Vi väljer sedan pre fisk med liknande BWs för beräkning av dos. Det rekommenderas att behålla minst dubbelt så många fiskar totalt för denna före urvalsprocess. All fisk fastar 24 h innan före urvalsprocessen. För det tredje, det rekommenderas att alltid använda fisk av samma ålder och kön fisken före DOX injektion på grund av deras olika tillväxttakt och potentiellt olika hjärt svar på DOX.

Vi märkte att majoriteten av inkonsekvent slutsatser kunde hänföras till en tvivelaktig kontrollgrupp. Därför rekommenderar vi utredare nya DIC modellen till praktiken DOX injektioner innan du utför verkliga experiment. När 20 mg/kg DOX injiceras med alternativa IP-injektion metod, kan en bra injektionsteknik indikeras av en nästan noll fisk död under 1 wpi DOX och en relativt konsekvent dödlighet vid 2-3 månader post-DOX injektion. Det ultimata beviset för framgångsrika modellering är minskningen av den hjärt-funktionella index, som kunde kvantifieras via ekokardiografi25,30, med hjälp av en casper; TG(cmlc2:nusDsRed) transgena linje, eller med hjälp av en nyutvecklad ex vivo-baserat hjärtfunktion assay (inga data anges).

Förutom IP-injektion, andra drog leveransvägar såsom retro-orbital injektion41, används oral utfodring42, och vatten inkubation också ofta i vuxen zebrafiskar. Vi inte anta metoden retro-orbital injektion, trots dess direkta drog släppa i cirkulationssystemet, på grund av en metod för att verifiera framgångsrik drug delivery, rodnad av DOX enkelt kan maskeras av potentiella blödning. Vi försökte en muntliga leverans protokoll genom inbäddning DOX med resorberbara gluten42, som var blandad med måltider att mata vuxen fisk. Tyvärr, med upp till den ackumulerande dosen på 150 mg/kg använts inom en 4-veckors utfodring period, vi inte iakttog någon svår kardiotoxicitet, tyder på hur ineffektiva muntliga DOX leverans. Alternativt kunde en oral sondmatning teknik vara ytterligare utforskas43. Dessutom är protokollet inkubation av blötläggning fisk en lösning innehållande DOX också en potentiell leveransväg som kunde testas i framtiden.

Vi bekräftar att en av de stora begränsningarna av den nuvarande DIC-modellen är den enda bolus injektion metoden, vilket kan resultera i hög toxicitet och lokala skador på inre organ. Detta tillvägagångssätt var avsedd att minska arbetsbelastningar och öka genomflödet, så att genetisk screening kan genomföras med ett högt dataflöde i vuxen fisk28. I framtiden, bör modeller med flera injektioner av DOX vid lägre doser eftersträvas, vilket kommer att bättre sammanfatta den DIC hos cancerpatienter som behandlas med kemoterapi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar inga intressekonflikter.

Acknowledgments

Detta arbete stöds delvis av en vetenskapsman utveckling bidrag från American Heart Association (14SDG18160021 till YD), den amerikanska NIH R01 beviljar HL 81753 och HL 107304 till XX och XX Mayo stiftelsen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Crossing tank Aquaneering ZHCT100 Fish breeding
Incubator ThermoFisher Maintaining embryo
3 L medium tank Aquaneering ZT280 Maintaining fish
Paramecia Carolina 131560 Food for juvenile fish
Live hatched brine shrimp in house Food for adult fish
Doxorubicin hydrochloride Sigma D1515-10MG
1.5 ml safe-lock tube Eppendorf No. 022363204 For drug storage
Aluminum foil paper Fisher 1213104 For preventing light exposure
Proteinase K Roche No. 03115887001 For dechorionating embryo
Hank's balanced salt solution (HBBS) ThermoFisher 14025076 Vehicle for DOX
100 mm petri dish Falcon 431741
10 μL NanoFil micro-syringe WPI NANOFIL For injection
34 gauge needle WPI NF34BV-2 For injection
Tricaine Argent MS-222 Anesthetizing fish
96 well plate Costar 3539 For embryo drug treatment
Transfer pipette Bel-art product F37898 For transfering embryo

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Octavia, Y., et al. Doxorubicin-induced cardiomyopathy: from molecular mechanisms to therapeutic strategies. J Mol Cell Cardiol. 52 (6), 1213-1225 (2012).
  2. Singal, P. K., Iliskovic, N. Doxorubicin-induced cardiomyopathy. N Engl J Med. 339 (13), 900-905 (1998).
  3. Angsutararux, P., Luanpitpong, S., Issaragrisil, S. Chemotherapy-Induced Cardiotoxicity: Overview of the Roles of Oxidative Stress. Oxid Med Cell Longev. , 795602 (2015).
  4. Ichikawa, Y., et al. Cardiotoxicity of doxorubicin is mediated through mitochondrial iron accumulation. J Clin Invest. 124 (2), 617-630 (2014).
  5. Zhang, Y. W., Shi, J., Li, Y. J., Wei, L. Cardiomyocyte death in doxorubicin-induced cardiotoxicity. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 57 (6), 435-445 (2009).
  6. Sawyer, D. B. Anthracyclines and heart failure. N Engl J Med. 368 (12), 1154-1156 (2013).
  7. Zhang, S., et al. Identification of the molecular basis of doxorubicin-induced cardiotoxicity. Nat Med. 18 (11), 1639-1642 (2012).
  8. Dodd, D. A., et al. Doxorubicin cardiomyopathy is associated with a decrease in calcium release channel of the sarcoplasmic reticulum in a chronic rabbit model. J Clin Invest. 91 (4), 1697-1705 (1993).
  9. Mitry, M. A., Edwards, J. G. Doxorubicin induced heart failure: Phenotype and molecular mechanisms. Int J Cardiol Heart Vasc. 10, 17-24 (2016).
  10. Aminkeng, F., et al. A coding variant in RARG confers susceptibility to anthracycline-induced cardiotoxicity in childhood cancer. Nat Genet. 47 (9), 1079-1084 (2015).
  11. Deng, S., et al. Dystrophin-deficiency increases the susceptibility to doxorubicin-induced cardiotoxicity. Eur J Heart Fail. 9 (10), 986-994 (2007).
  12. Leong, S. L., Chaiyakunapruk, N., Lee, S. W. Candidate Gene Association Studies of Anthracycline-induced Cardiotoxicity: A Systematic Review and Meta-analysis. Sci Rep. 7 (1), 39 (2017).
  13. Wasielewski, M., et al. Potential genetic predisposition for anthracycline-associated cardiomyopathy in families with dilated cardiomyopathy. Open Heart. 1 (1), e000116 (2014).
  14. Lebrecht, D., et al. Dexrazoxane prevents doxorubicin-induced long-term cardiotoxicity and protects myocardial mitochondria from genetic and functional lesions in rats. Br J Pharmacol. 151 (6), 771-778 (2007).
  15. QuanJun, Y., et al. Protective Effects of Dexrazoxane against Doxorubicin-Induced Cardiotoxicity: A Metabolomic Study. PLoS One. 12 (1), e0169567 (2017).
  16. Seifert, C. F., Nesser, M. E., Thompson, D. F. Dexrazoxane in the prevention of doxorubicin-induced cardiotoxicity. Ann Pharmacother. 28 (9), 1063-1072 (1994).
  17. Adams, J. W., et al. Enhanced Galphaq signaling: a common pathway mediates cardiac hypertrophy and apoptotic heart failure. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (17), 10140-10145 (1998).
  18. Bowles, N. E., Bowles, K. R., Towbin, J. A. The "final common pathway" hypothesis and inherited cardiovascular disease. The role of cytoskeletal proteins in dilated cardiomyopathy. Herz. 25 (3), 168-175 (2000).
  19. Kroumpouzou, E., et al. Common pathways for primary hypertrophic and dilated cardiomyopathy. Hybrid Hybridomics. 22 (1), 41-45 (2003).
  20. Towbin, J. A., Bowles, K. R., Bowles, N. E. Etiologies of cardiomyopathy and heart failure. Nat Med. 5 (3), 266-267 (1999).
  21. Liu, Y., et al. Visnagin protects against doxorubicin-induced cardiomyopathy through modulation of mitochondrial malate dehydrogenase. Sci Transl Med. 6 (266), 266ra170 (2014).
  22. Asimaki, A., et al. Identification of a new modulator of the intercalated disc in a zebrafish model of arrhythmogenic cardiomyopathy. Sci Transl Med. 6 (240), 240ra274 (2014).
  23. Ding, Y., et al. Haploinsufficiency of target of rapamycin attenuates cardiomyopathies in adult zebrafish. Circ Res. 109 (6), 658-669 (2011).
  24. Sun, X., et al. Cardiac hypertrophy involves both myocyte hypertrophy and hyperplasia in anemic zebrafish. PLoS One. 4 (8), e6596 (2009).
  25. Sun, Y., et al. Activation of the Nkx2.5-Calr-p53 signaling pathway by hyperglycemia induces cardiac remodeling and dysfunction in adult zebrafish. Dis Model Mech. 10 (10), 1217-1227 (2017).
  26. Yang, J., Shah, S., Olson, T. M., Xu, X. Modeling GATAD1-Associated Dilated Cardiomyopathy in Adult Zebrafish. J Cardiovasc Dev Dis. 3 (1), (2016).
  27. Ding, Y., et al. Trapping cardiac recessive mutants via expression-based insertional mutagenesis screening. Circ Res. 112 (4), 606-617 (2013).
  28. Ding, Y., et al. A modifier screen identifies DNAJB6 as a cardiomyopathy susceptibility gene. JCI Insight. 2 (8), (2017).
  29. Kinkel, M. D., Eames, S. C., Philipson, L. H., Prince, V. E. Intraperitoneal injection into adult zebrafish. J Vis Exp. (42), (2010).
  30. Wang, L. W., et al. Standardized echocardiographic assessment of cardiac function in normal adult zebrafish and heart disease models. Dis Model Mech. 10 (1), 63-76 (2017).
  31. Desai, V. G., et al. Development of doxorubicin-induced chronic cardiotoxicity in the B6C3F1 mouse model. Toxicol Appl Pharmacol. 266 (1), 109-121 (2013).
  32. Zhu, W., Shou, W., Payne, R. M., Caldwell, R., Field, L. J. A mouse model for juvenile doxorubicin-induced cardiac dysfunction. Pediatr Res. 64 (5), 488-494 (2008).
  33. Chatterjee, K., Zhang, J., Honbo, N., Karliner, J. S. Doxorubicin cardiomyopathy. Cardiology. 115 (2), 155-162 (2010).
  34. Bang, C., et al. Cardiac fibroblast-derived microRNA passenger strand-enriched exosomes mediate cardiomyocyte hypertrophy. J Clin Invest. 124 (5), 2136-2146 (2014).
  35. Rassaf, T., Kelm, M. Protection from diabetic cardiomyopathy - putative role of the retinoid receptor-mediated signaling. J Mol Cell Cardiol. 59, 179-180 (2013).
  36. Wahbi, K., et al. Dilated cardiomyopathy in patients with mutations in anoctamin 5. Int J Cardiol. 168 (1), 76-79 (2013).
  37. Zhou, M. D., Sucov, H. M., Evans, R. M., Chien, K. R. Retinoid-dependent pathways suppress myocardial cell hypertrophy. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (16), 7391-7395 (1995).
  38. Hershman, D. L., et al. Doxorubicin, cardiac risk factors, and cardiac toxicity in elderly patients with diffuse B-cell non-Hodgkin's lymphoma. J Clin Oncol. 26 (19), 3159-3165 (2008).
  39. Silber, J. H., Barber, G. Doxorubicin-induced cardiotoxicity. N Engl J Med. 333 (20), 1359-1360 (1995).
  40. Von Hoff, D. D., et al. Risk factors for doxorubicin-induced congestive heart failure. Ann Intern Med. 91 (5), 710-717 (1979).
  41. Pugach, E. K., Li, P., White, R., Zon, L. Retro-orbital injection in adult zebrafish. J Vis Exp. (34), (2009).
  42. Zang, L., Morikane, D., Shimada, Y., Tanaka, T., Nishimura, N. A novel protocol for the oral administration of test chemicals to adult zebrafish. Zebrafish. 8 (4), 203-210 (2011).
  43. Collymore, C., Rasmussen, S., Tolwani, R. J. Gavaging adult zebrafish. J Vis Exp. (78), (2013).

Tags

Medicin fråga 136 Doxorubicin kardiomyopati akut fas kronisk fas zebrafiskar intraperitoneal injektion sjukdom modell
Doxorubicin-inducerad kardiomyopati modell i vuxen zebrafiskar
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ma, X., Ding, Y., Wang, Y., Xu, X. A … More

Ma, X., Ding, Y., Wang, Y., Xu, X. A Doxorubicin-induced Cardiomyopathy Model in Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (136), e57567, doi:10.3791/57567 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter