Summary
Doksorubisin kaynaklı kardiyomiyopati modeli yetişkin zebra balığı (Danio rerio) oluşturmak için bir yöntem burada açıklanmıştır. Mayi enjeksiyon iki alternatif yollar sunulmaktadır ve varyasyonları deneysel farklı gruplar arasında azaltmak için koşullar ele alınmıştır.
Abstract
Genetik olarak erişilebilir yetişkin zebra balığı (Danio rerio) giderek kardiyomiyopati gibi insan hastalıkları anlamak için omurgalı bir model olarak kullanılmıştır. Kolaylık ve amenability yüksek işlem hacmi genetik manipülasyonlar nedeniyle alınan kardiyomiyopati modellerin üretimi gibi yetişkin zebra balığı, doksorubisin kaynaklı kardiyomiyopati (DIC) modelinde yeni araştırma caddeleri kapılarını açıyor, kardiyomiyopati değiştiriciler ileri genetik tarama yoluyla keşfetmek de dahil olmak üzere. Embriyonik zebra balığı DIC modeli farklı, ilk akut ve daha sonra kronik aşamalarını kardiyomiyopati, sahne bağımlı sinyal mekanizmaları ve tedavi stratejileri etkinleştirme yetişkin zebra balığı DIC modelde belirlenebilir. Ancak, değişken sonuçları bile deneyimli müfettişler elinde geçerli modeli ile elde edilebilir. DIC modeli gelecekte uygulanması kolaylaştırmak için içinde yetişkin zebra balığı bu DIC modeli oluşturmak ve iki alternatif yollar mayi (IP) enjeksiyon açıklamak nasıl ayrıntılı bir protokol tanıtacağız. Biz daha güvenilir sonuçlar elde edilir ve uygun sonuçlar yorumlama hakkında öneriler sunmak varyasyonları azaltmak nasıl seçenekleri görüşmek.
Introduction
Adı da Adriamycin, doksorubisin (DOX), 1960'larda1,2beri anti-neoplastik bir uyuşturucu olarak geliştirmiştir. Şimdi hala aktif tümör geniş bir yelpazede için önemli bir kemoterapötik ilaç olarak kullanılır. Ancak, klinik uygulama DOX onun doz bağımlı toksisitesine tarafından engel oldu, özellikle rastlantısal değişken belirtiler arasında perikardit için asemptomatik Elektrokardiyografi değişiklikleri değişen karakterize ve kardiyomiyopati dekompanse 1 , 2. bugüne kadar en az üç büyük hipotezler DIC aktif reaktif oksijen türleri (ROS)1,3,4,5, topoizomeraz II-β (inhibisyonu dahil olmak üzere, açıklamak için yükseltilmiş olan TOP2β)6,7ile hücre içi kalsiyum modülasyon1,8,9serbest bırakın. Kanıt birikiyor da genetik yatkınlık DIC10,11,12,13için önemli bir risk faktörü olarak önerir. Gene kimlikleri bu DIC eğilimlerin ilgili ancak, büyük ölçüde bilinmeyen kalır. Dexrazoxane ek tanımlamak gerektiğini vurgulayan ABD Gıda ve İlaç Dairesi (FDA) DIC tedavi etmek için ancak sınırlı uygulama14,15,16, onaylı tek adjuvan ajan olduğunu tedavi stratejileri. DIC hayvan modelleri bu nedenle bu amaçlar için incelenmiştir. Erişilebilirlik ve kolaylık nedeniyle, DIC modellerde mekanik çalışmaları potansiyel olarak diğer kardiyomiyopatiler türlerinde daha geniş etkileri olabilirdi: ortak Patogenez paylaşılan farklı etiologies, kardiyomiyopatiler arasında özellikle, daha sonra patolojik aşamaları17,18,19,20.
DIC kemirgen modellerinin yanı sıra, zebra balığı DIC modelleri ile daha yüksek geçerek yeni genetik faktörlerin ve tedavi kolaylaştırmak için geliştirilmiştir. Bir embriyonik DIC modeli terapötik bileşiklerin21süzmek için şeffaf zebra balığı embriyo yılında kurulmuştur. Kardiyomiyopatiler erişkin başlangıçlı hastalık ilerici bir patogenezi ile olduğunu göz önüne alındığında, Yetişkin zebra balığı kardiyomiyopati modelleri olmuştur22,23,24,25,26geliştirdi. Biz ilk elde edilen modeli meydana gelen kronik anemi24yetişkin zebra balığı23yılında ikinci elde edilen kardiyomiyopati model olarak DIC tarafından takip, kardiyomiyopati için oluşturulan. Bulduk DOX bir tek bolus yetişkin zebra balığı içine enjeksiyon için 6 ay sonrası enjeksiyon kardiyomiyopati bir kronik faz tarafından takip bir akut faz kabaca 1 hafta sonrası enjeksiyon (TEFE), içinde oluşur rastlantısal neden olmaktadır. Haploinsufficiency rapamycin mekanik hedefinin ise(mtor) kardiyomiyopati matlaşmış kronik aşamasında bu balık ölümleri akut faz, sahne bağımlı ayırt etmek yetişkin DIC modeli değerini vurgulayan abartırlarsa mekanizmaları23. Biz daha fazla yetişkin DIC modeli bir insertional mutagenesis transposon tabanlı yaklaşım27oluşturulan zebra balığı insertional kardiyak (ZIC) mutantlar topluluğu stres için kullanılabilir gösterdi. Pilot bir ekran DnaJ (Hsp40) homolog, B Alt familya ve üye 6b yanı sıra 3 bilinen kardiyomiyopati genleri tespit (dnajb6b) yeni DIC yatkınlık genleri28olarak. Bu nedenle, zebra balığı yetişkin DIC modelinde nesil sistematik olarak genetik değiştiriciler tanımlanması için varolan genom çapında dernek çalışma (GWAS) ve nicel Özellik odağı (QTL tamamlayan DIC sağlar yeni bir metodoloji yol açtı ) analizi.
Üretimi ve yetişkin zebra balığı DIC modeli uygulanması sırasında farklı araştırmacılar arasında ve/veya hatta aynı araştırmacı tarafından gerçekleştirilen farklı iğneleri arasında önemli varyasyonlar fark ettim. Model boyuna doğası zorluklar farklı müfettişler sonuçlarından kayıt ve sıralı sorun giderme işlemi uygular. Bu basit kardiyomiyopati-inducing stres Yöntem Araştırma Topluluğu tarafından kullanımını kolaylaştırmak için biz bizim protokol ayrıntılı, IP enjeksiyon, mevcut iki tür tarif ve varyasyonları farklı araştırmacılar arasında azaltmak için dikkat edilmesi gereken noktalar tartışmak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Burada açıklanan tüm yordamları uygun olarak Kılavuzu bakım ve Laboratuvar hayvanlarının kullanımı (Ulusal Akademiler Press. 2011) için yapıldı ve Mayo Kliniği kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi tarafından kabul edildi.
1. yetişkin zebra balığı hazırlık
- Tankları geçerken içinde yeterli damızlık çiftler en az iki katını DOX enjeksiyon için gerekli toplam balık olarak elde etmek için ayarlayın. Balık farklı genetik arka planlar ile karşılaştırarak, Yaş eşlemeli denetimleri sağlamak için aynı hafta içinde tüm balık doğurmak.
- Ertesi sabah balık embriyo toplamak, onları 100 mm Petri yemekler için aktarmak ve 28.5 ° C kuluçka makinesine kalsınlar. Embriyo düşük yoğunluklu tutmak (< 100 embriyo/Petri kabına).
- Seks dengesizlik önlemek için embriyo su günlük yenileyin ve ölü yumurta transferi pipet kullanarak zamanında el ile kaldırın.
- Embriyo aynı sayıda her tankın içine koymak (60 embriyo/3 L orta Örneğin, tank başlangıçta) yoğunluk eşlemeli denetimleri emin olmak için.
- 4 gün sonrası döllenme (dpf) besleme paramecia başlayın.
- Balık her gün Juvenil aşamasında inceleyin. Benzer balık emin olmak için gerektiği gibi balık numarasını ayarlamak yoğunluğu.
- Ne zaman balık 4 hafta-in yaş ulaşmak, en çok 20 balık her yeni 3 L orta tank daha fazla büyüme için içine aktarın. Canlı taranmış tuzlu karides balık beslemeye başlayın.
2. hazırlık ve depolama DOX hisse senedi çözüm
Not: DOX çeşitli biyo-şirketlerden satın alınabilir. Bileşik genellikle koyu kahverengi kaplarda bir toz olarak kazanılır.
- İyice hiçbir kümeleri, 5 mg/mL nihai bir konsantrasyon hisse senedi çözüm olarak görülebilir emin olmak için de-iyonize su DOX toz geçiyoruz. Her 1,5 mL güvenli kilit tüpün içine DOX stokunun aliquot 1 mL. 1.5 mL tüpler DOX ışık pozlama korumak için alüminyum folyo kağıt ile sarın.
Not: kimyasal bir mahallede bu adımı gerçekleştirin. - Depolama için 4 ° C'de DOX hisse senedi çözüm tutmak. Uzun süreli depolama için (> 3 hafta) DOX hisse senedi çözümü, isteğe bağlı bölüm 3 aşağıda açıklanan gerçekleştirmek.
3. kalite kontrolünü DOX zebra balığı embriyo (isteğe bağlı) kullanarak
Not: genişletilmiş depolama sonra DIC modelleme için onun uyuşturucu etkinliği kaybedebilir DOX hem nem - ve ışığa duyarlı, bu yüzden. Farklı şirketler veya aynı şirketten bile farklı toplu işlemleri satın DOX için onun uyuşturucu etkinliği yetişkin balık üzerinde deneyler önce vahşi-tipi (WT) zebra balığı embriyo kullanarak ayarlamak yararlıdır. Bu yöntem bir bildirilen zebra balığı embriyonik DIC modeli21türetilmiştir.
- WT zebra balığı embriyo balık en az 2 çift toplamak. Dechorionate embriyo, el ile bir mikro iğne ile bir şırınga kullanarak 24 saat sonrası döllenme (hpf). Alternatif olarak, son 10-15 dk 30 ° C kuluçka için 10 µg/mL konsantrasyonu, İndinavir K ile embriyo tedavi. Embriyo su dechorionation sonra yenileyin. Ölü embriyo kaldırmak ve her yığında en az 36 embriyoların korumak.
- Taze embriyo su 100 µM son bir konsantrasyon için DOX hisse senedi çözümde sulandırmak. Çözüm her 3 embriyo için 100 µL birimdir. Girdap tarafından seyreltilmiş DOX çözüm mix. Nihai seyreltilmiş çözüm bir ışık, kırmızı renk olmalıdır.
- 100 µL/iyi temiz 96-şey şeffaf plaka seyreltilmiş DOX çözüm ekleyin.
- 3 dechorionated embriyo transferi plastik pipet ile alın ve embriyo pipet ucu sonuna yakın tutun. Pipet Ucu DOX çözümü ile her şey koymak. İpucu sonu çözüm dokunmatik ve kuyuya yüzmeyi embriyo izin ver.
Not: el ile kuyunun içine daha fazla su ekleyin ve DOX çözüm seyreltik embriyo iterek önlemek. - 48 DOX çözüm yenileme hpf. Bu zamana kadar ölü embriyo (kalp atışı kesilmesi) veya embriyo ödem ile tanımlamak için 10 X büyütme ile mikroskop altında kuyu gözlemlemek. Saymak ve herhangi bir ölü embriyo ölü embriyo çözümle maruz kalan embriyolar hızlı bir şekilde ölebilir zamanında, aksi takdirde de kaldırın.
- 72, embriyo kontrol hpf ve bunları kabul. DOX tedavi ise "iyi uyuşturucu etkinlik" olarak ele alınır > % 25 ölüm (kalp atışı kesilmesi) her iki embriyo toplu olarak görülebilir.
4. öncesi enjeksiyon hazırlık
Not: Balık yaş 6 ay için 8 haftalık DOX enjeksiyon için kullanılır. Enjekte edilir olgunlaştı vahşi Kızılderili karyotip (WIK) balık vücut ağırlıkları (BWs) 0,2-0,5 değişebilir g.
- Hızlı balık enjeksiyon önce 24 h için.
- Balık 0.16 mg/mL tricaine içeren embriyo su ile anestezi. Vücudun her iki taraftan su için temiz bir filtre kağıdı kullanın. Her balık bir ölçekte BW ölçmek. Balık BW % 10 fark içinde Grup birlikte sonra enjeksiyon için.
Not: Bu adımda iş yükünü en aza indirmek için balık BW % 10 fark içinde aynı boyutta kabul edilir; Bu nedenle, bir DOX çalışma çözüm ortalamasını BW göre hazırlayın. - Her yetişkin balık çözüm 5 µL ile enjekte edeceğim. Balık numaraları ve BWs göre DOX çalışma konsantrasyonu hesaplayın.
Not: DOX 20 mg/kg doz kronik rastlantısal için 6 ay çalışma için kullanın. Akut rastlantısal DOX çalışmaya DOX doz 50 mg/kg BW kadar artırılabilir. - 1 x Hank'in dengeli tuz solüsyonu (HBSS) karşılık gelen çalışma konsantrasyonları DOX stokta sulandırmak. Girdap çözüm karıştırmak için. Kısaca spin aşağı çözüm toplamak için.
5. DOX enjeksiyon yetişkin balık
- Yer temiz 100 mm Petri kabına bir diseksiyon mikroskop altında içinde bir sünger ile sonra odağı ayarlayın. Sünger bir kavite yaklaşık 4 cm uzunluğunda bir balık tutmak için yapmak için kesti. Daha büyük bir balık için daha uzun bir kavite olun.
- 34 G iğne bir 10 µL mikro şırınga ile hazırlayın. İğne şırınga ve boru herhangi bir kabarcıklar ve blokları kaldırmak için 1 x HBSS arabellek ile yıkayın.
- Embriyo su 0.16 mg/mL tricaine 2 min için içeren yetişkin balıkta anestezi.
Not: Uzun süreli anesthetization üzerinde 5 dk DOX enjeksiyonu ile takip kolayca balık neden olabilir ölüm. - Sünger tricaine ile embriyo suda ıslatın ve balık enjeksiyon için sünger üzerine aktarın.
-
IP DOX enjeksiyon aşağıda açıklanan iki yöntemden birini yerine getirilir.
- Klasik IP enjeksiyon29
- Karın balıkla kadar sünger boşluğunda getirin. Hızlı bir şekilde yerleştirin iğneyle 45 ° balık vücut orta hat pelvik yüzgeçleri açı ve yaklaşık 1-2 mm. nüfuz yavaş yavaş tüm DOX çözüm bırakın. Daha önce iğne çekerek bekle 5 s. DOX teslim balık karnında bir kırmızı renk ile kontrol edin.
- Alternatif IP enjeksiyon
- Balık sünger ile ön sağ yanal üzerine yerleştirin. Yavaşça sol elinle bir künt son forseps kullanarak balık stabilize ve mikro-şırınga sağ eli ile tutun.
- Yukarı dönük olacak şekilde eğim ile sonradan içini kaplamak yukarıda pelvik fin aşağıda iğne getirin. 45 ° açıyla 7'konumundaki işaret ederek, 3-4 mm pelvik ve anal yüzgeçleri arasında yer alan balık boşluğuna iğne yerleştirin ve yavaş yavaş pistonu bunalıma girmek. DOX teslim balık karnında bir kırmızı renk ile kontrol edin.
- Klasik IP enjeksiyon29
- Hızlı bir şekilde enjekte balık balık kurtarmak izin vermek için yeni sistem su temiz geçiş tank aktarın. İğneyi enjeksiyon arasında 1 x HBSS tampon ile yıkayın.
6. sonrası enjeksiyon balık yönetimi
- Enjeksiyon sonra balık dolaşım çalıştıran sistem geri dönün. Mümkünse, DOX tedavi balık dolaşımı paylaşmak farklı tanklar arasında çapraz bulaşma kaçınmak için ayrı ayrı ana sisteminden korumak.
- Hızlı enjekte balık için başka bir 24 saat kurtarma için. Balık her gün ilk haftasında gözlemlemek. Ölü balık zamanında diğer balık bulaşmasını önlemek için kaldırın.
Not: Balık ölümleri ilk 24 saat içinde fiziksel lezyonlar enjeksiyonu ile neden nedeniyle yüksektir. - Daha fazla DOX vurguladı balık boyuna gözlemler için korumak. Ölü balık tank diğer balık enfeksiyonlara önlemek için zaman kaldırın.
Not: Balık numaraları bir sağkalım eğrisi oluşturmak için belgelenmiştir. - Farklı deneysel deneyleri fenotip ekokardiyografi30, yüzme meydan26ve diğer patolojik yeniden miktar kardiyak fonksiyon muhabir transgenik satır23, gibi DOX vurguladı balık için kullanın işaretleyicileri23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada, IP enjeksiyon modeline DIC içinde yetişkin zebra balığı gerçekleştirmek için iki yöntem mevcuttur. Klasik, kurulan IP enjeksiyon yöntemi29kullanırken, enjekte DOX çözüm (kırmızı renk) bazen dışarı nerede iğne nüfuz konumdan sızmak ki belirtilmişti. Alternatif IP enjeksiyonu nerede DOX dağıtılan 3-4 mm Karın zarını uzak, İğne penetrasyon için farklı bir konuma kullanır (Şekil 1A), hangi etkili sızıntı (Şekil 1B, 1 C) engeller. DOX başarılı teslimat için her iki yöntem periton içine enjeksiyon locus karşı tarafta görünür balık göbek boyunca kırmızı renkteki hızlı dağıtım kanıtladığı.
Doz 50 mg/kg alternatif IP yöntemini kullanarak DOX enjeksiyonu nerede balık çoğunluğu (Şekil 2) bir hafta içinde öldü şiddetli toksisite için yol açar. Buna karşılık, enjeksiyon DOX 20 mg/kg alternatif IP Yöntemi nedenleri ilk 2 hafta boyunca neredeyse hiç balık ölüm ve % ~ 10 balık ölüm kullanarak 4 TEFE (Şekil 3A) ilaç. 20 mg/kg klasik IP yöntemini kullanarak ilaç DOX enjeksiyon 4 TEFE (Şekil 3 c) ~ %30 balık ölüm sergiler. Her iki yöntem ile enjekte balık bir benzer ~ % 20 balık ölümüne 4 TEFE üzerinden 10 TEFE (Şekil 3B, D) sergi.
Casper kaldıraçlı; TG(cmlc2:nusDsRed) balık DIC kardiyak disfonksiyonu ilerlemesini değerlendirmek için modeli (Şekil 4A)23. Şeffaf vücut Sistolik (Şekil 4B) ve diyastolik (Şekil 4 c) aşamalarında floresan mikroskop altında kırmızı bir kalp belgelenmesi sağlar. Sonra enjeksiyon 20 mg/kg alternatif IP yöntemini kullanarak DOX ventrikül fonksiyonları düşüş 4 TEFE (Şekil 4 d) başlayan tespit edilebilir.
Şekil 1: enjeksiyon yolları. (A) yöntemleri (1A) klasik IP enjeksiyon (b) şemaları ve alternatif IP enjeksiyon. Kırmızı daire site iki enjeksiyon yöntemleri için serbest ortak DOX gösterir. Yeşil daireler İğne penetrasyon siteleri gösterir. Mesafeler yaklaşık 0.3 g. (1B, 1 C) temsilcisi sonuçları iki mayi enjeksiyon yöntemleri kullanarak başarılı bir DOX teslim gösteren ağırlığında bir yetişkin WIK balık dayalı tahmin edilir. Kızarıklık yetişkin balık göbek içinde hemen enjeksiyon sonra görülebilir. Enjekte balık bir taze Sistemi suda 5 dk kurtarma sonra tekrar kontrol edildi. HBSS: 1 x Hank'in dengeli tuz solüsyonu. WT WIK zebra balığı istihdam. Ölçek çubuğu: 5 mm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: DOX stres 50 mg/kg DOX enjeksiyon ile takip yetişkin zebra balığı temsilcisi hayatta kalma eğrileri. DOX enjeksiyonları WT yetişkin balık farklı gruplar halinde 3 set 3-6 ay-in yaş, gösterilmiştir. Toplam, n = 24 balık istihdam 1 x HBSS kontrol grubu ve n = 8 balık DOX ile enjekte her toplu iş iş istihdam. Şekilleri iki enjeksiyon yöntemleri arasında kaydedilmiştir balık arasında fark yoktur. WT WIK zebra balığı istihdam. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 3: iki mayi enjeksiyon yöntemleri arasında DOX stres 20 mg/kg DOX enjeksiyon ve karşılaştırma ile takip yetişkin zebra balığı temsilcisi hayatta kalma eğrileri. 0-4 hafta DOX teslim klasik mayi enjeksiyonu ile takip içinde (3A) Balık hayatta kalma. Yüzde %0 100 olarak kabul edildi haftası numarası balık. (3B) 4 hafta DOX teslim klasik mayi enjeksiyonu ile deftere naklettikten sonra balık hayatta kalma. Yüzde %4 100 olarak kabul edildi haftası numarası balık. 0-4 hafta DOX teslim alternatif mayi enjeksiyonu ile takip içinde (3 C) Balık hayatta kalma. Yüzde %0 100 olarak kabul edildi haftası numarası balık. (3D) balık DOX teslim alternatif mayi enjeksiyonu ile takip 4 hafta sonra hayatta kalma. Yüzde %4 100 olarak kabul edildi haftası numarası balık. (3Aiçinde) gösterilen veriler ve (3B) 3-6 ay-in yaş 9 farklı toplu halde DOX enjeksiyon Toplam 223 enjekte balık vardır. (3 C) gösterilen veriler ve (3D) 2-6 ay-in yaş 14 farklı toplu halde DOX enjeksiyon Toplam 335 enjekte balık vardır. Canlı balık sayıda haftalık kaydedilir. Hata çubukları standart sapma olarak, her hafta farklı toplu işlemleri arasında yaşama ve yüzde temsil eder. WT WIK zebra balığı istihdam. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: DOX stres casper kullanarak takip temsilcisi kardiyak fonksiyon değerlendirmesi; TG(cmlc2:nusDsRed) balık. (4A) bir fotoğraf bir yetişkinin casper; TG(cmlc2:nusDsRed) balık. Ölçek çubuğu olgunlaştı casper; son sistolik aşamada = 1 cm. (4B) temsili resim kırmızı bir boşluk TG(cmlc2:nusDsRed) balık. Kesik çizgi son sistolik çapı (ESD) temsil eder. (4 C) temsilcisi görüntü kırmızı ventrikül olgunlaştı casper diyastolik son aşamasında; TG(cmlc2:nusDsRed) balık. (4B) Albümdeki ve (4 C) 6,3 x büyütme kullanarak floresan diseksiyon mikroskop ile yakalanan bir kalbi filmlerin elde. Kesik çizgi sonu diyastolik çap (EDD) temsil eder. Ölçek çubuğu casper; kullanarak ölçülen 1 mm. (4 D) temsilcisi kardiyak fonksiyon = TG(cmlc2:nuDsRed) sonra 20 mg/kg DOX enjeksiyon yetişkin zebra balığı. EDD ve ESD ölçülen (4B') gösterildiği gibi ve (4 C) için bireysel balık ve ventrikül kesir kısalma (EDD − ESD) formülüne göre hesaplanır / EDD. Önemli ölçüde azalmış ventriküler kesir kısalma 4 hafta ve bundan sonra tespit edildi. Alternatif mayi yöntemi kullanıldı. Değerleri ortalama ± standart hata gösterilir. Her grup n ≥ 3. Öğrenci t testi iki grup karşılaştırılması için kullanıldı. p < 0,05. Bu rakamlar Ding vd. modifiye edilmiş 23 Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
İlerici DIC modellemek için 20 mg/kg DOX doz 1 TEFE ama hala sonuçları sırasında önemli balık ölümde balık ölüm ve kardiyak fonksiyon azaltma 4 TEFE (Şekil 3 ve sonra neden olmaz en yüksek doz olarak deneysel olarak belirlendi Şekil 4 c). Bu doz karşılaştırılabilir sık kullanılan kemirgen DIC modelleri (15-25 mg/kg) ve sınırı toplu doza (15 mg/kg eşdeğeri olan 550 mg/m2) insanlarda ise4,7,31,32 , 33. DOX, daha yüksek doz 50 mg/kg gibi göstermek önemli balık ölüm sırasında 1 TEFE, böylece yalnızca akut kalp toksik yanıt DOX23,28eğitim için kullanılabilir.
Bu DIC model uygulama sırasında yeni müfettişler başlangıçta aynı sonuçları çoğaltmak zor olduğunu fark ettim. Hatta deneyimli müfettişler, hakkında %20 ölüm varyasyonu kronik faz hala farklı enjeksiyonları (Şekil 3), uncharacterized biyolojik karıştırıcı faktörlerin geçerli modelde gösteren arasında bulunur. Mükemmel modeli küçüktür rağmen hala bu geçerli DIC model ses keşif nedeniyle aşağıdaki kanıt yapmak için yeterli olduğunu düşünüyoruz. İlk olarak, birkaç uygulama sonra DIC modeli sonuçlarından daha sonra çoğu arasında Eğer tüm, müfettişler kaydedilebilir. İkinci olarak, bu DIC modeline bağlı olarak, biz 4 anlamlı genetik değiştiriciler tespit. Edebiyat raporlardan mevcut kanıt 3 tanesi kardiyomiyopati genler34,35,36,37olarak desteklenen. 4 bir insan genetik çalışma28tarafından desteklenen yeni bir kardiyomiyopati gen olduğu kanıtlanmış DnaJ homolog Alt familya B üye 6 (DNAJB6),inci bir tane var. Böylece, Şu anki haliyle DIC model arası deneysel karşılaştırma için güvenilir değil de olsa sıkı yaş eşlemeli denetimlerini kullanarak intra deneysel gruplarına göre sonuçları hala son derece tekrarlanabilir, sonuçlandırmak.
Bizim Şu anki DIC modelinde büyük olasılıkla gözlenen tutarsızlık katkıda karıştırıcı faktörler şunlardır: (1) yaşlanma ve cinsiyet farkı kabul edilmiştir DIC38, dahil olmak üzere kalp-damar hastalıkları için çok önemli risk faktörleri olarak 39,40. Her iki hypothesized nın bizim modelinde özellikle test edilecek kalırken, biz yaşlı balık DOX toksisite (veri gösterilmez) daha duyarlı olma eğilimi fark ettim. Her iki IP (Şekil 3) yöntemlerle gözlenen arası toplu çeşitleri de muhtemelen bu iki nın katkıda bulunmuştur. (2) farklı daha büyük hayvan modelleri, Yetişkin bir zebra balığı boyutu küçüktür. Böylece, yerel hasarları DOX enjeksiyonu ile daha şiddetli ve değişken olabilir. (3) enjekte balık ölümü DOX toksisite diğer organlarda (Örneğin, renal toksisite), yanı sıra kalp neden. Daha dikkatle tasarlanmış deney söz konusu karıştırıcı faktörlerin her biri adresine gerekli iken, önceki çalışma aşağıdaki uyarılar fenotipik farklılıklar azaltmaya yardımcı olacak öneriyor: ilk olarak, DOX etkinliğini garanti altına almak için önemlidir. DOX toz her zaman kuru ve karanlık bir alanda tutulmalıdır ve çözümleri ışığa maruz kalma azaltmak dikkatle ele alınmalıdır. Bu DOX çalışma çözümleri taze balık enjeksiyon önce her zaman hazırlıklı olmak tavsiye edilir. Biz genellikle hisse senedi DOX çözümler depolama 4 hafta sonra kullanmayın. Bir şüphe olduğunda, isteğe bağlı bölüm 3 hızlı embriyonik DIC modeli her DOX toplu ilaç etkinliğinin ayarlamak için bu iletişim kuralı'nı içinde gerçekleştirin. İkincisi, yetişkin balık eşitleme çok önemli. Aynı balık zorlanma benzer vücut büyüklüğü emin olmak için aynı yoğunluğu, yükseltilmiş olması gerekir. Daha sonra doz hesaplama için benzer BWs balıkla önceden seçin. Bu ön seçim süreci için toplamda en az iki katı kadar balık korumak için tavsiye edilir. Tüm balık ön seçim işlemden önce 24 h için oruç tuttum. Üçüncü olarak, her zaman balık benzer yaş ve onların farklı büyüme oranları ve potansiyel olarak farklı kalp yanıt DOX nedeniyle balık DOX enjeksiyon önce seks için kullanılması için önerilir.
Tutarsız sonuçlar çoğunluğu bir şüpheli kontrol grubu atfedilen fark ettik. Bu nedenle, müfettişler DIC modeli için yeni uygulama DOX enjeksiyonlar için gerçek deneyler önce önerilir. 20 mg/kg DOX alternatif IP enjeksiyon yöntemi kullanarak enjekte edildiğinde iyi enjeksiyon tekniği 1 TEFE DOX ve göreceli olarak tutarlı ölüm oranı, 2-3 ay sonrası-DOX enjeksiyon sırasında neredeyse sıfır bir balık ölümü ile belirtilebilir. Son başarılı modelleme için via ekokardiyografi25,30, casper kullanarak sayısal kalp işlevsel Dizin azalma delildir; TG(cmlc2:nusDsRed) transgenik çizgi veya yeni geliştirilen ex vivokullanarak-kardiyak fonksiyon tahlil (veri gösterilmez) dayalı.
Ek olarak IP enjeksiyon, retro-orbital enjeksiyon41gibi diğer uyuşturucu teslimat rotalarını42ve su kuluçka besleme oral da sık sık içinde yetişkin zebra balığı kullanılır. Biz onun doğrudan uyuşturucu dolaşım sistemine DOX kızarıklık kolayca potansiyel kanama tarafından maskelenebilir olarak başarılı ilaç dağıtım, doğrulamak için bir yöntem olmaması nedeniyle serbest rağmen retro-orbital enjeksiyon yaklaşım, kabul etmedi. Bir oral teslim iletişim kuralı ile absorbe gluten42yetişkin balık beslemek için yemek ile karışık oldu, DOX katıştırma üzerinden denedik. Ne yazık ki, ile birikmiş doz 150 mg/kg 4 haftalık beslenme süresi içinde kullanılan kadar biz herhangi bir ciddi rastlantısal sözlü DOX teslim etkisizliği düşündüren gözlemleme. Alternatif olarak, bir oral gavaj tekniği daha da keşfedilmeyi43olabilir. Ayrıca, balık DOX içeren bir çözüm iliklerine, kuluçka Ayrıca gelecekte test olabilir potansiyel bir teslim yolu iletişim kuralıdır.
Biz bir büyük sınırlamalar geçerli DIC modelinin yüksek toksisite ve yerel hasar için iç organları neden olabilir tek bolus enjeksiyon yöntemi olduğunu kabul eder. Böylece genetik tarama, yetişkin balık28' yüksek üretimi yapılan bu yaklaşım iş yükleri azaltmak ve trafiğini artırmak için tasarlanmıştır. Gelecekte, birden çok düşük dozda DOX enjeksiyonlari modelleriyle, hangi daha iyi kemoterapi ile tedavi kanser hastalarda gözlenen DIC özetlemek takip edilmelidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çakışma çıkarlarının bildirin.
Acknowledgments
Bu eser kısmen bir bilim adamı kalkınma hibe Amerikan Kalp Derneği tarafından desteklenmiştir (YD 14SDG18160021), ABD NIH R01 HL 81753 ve HL 107304 XX için ve Mayo Vakfı XX için verir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Crossing tank | Aquaneering | ZHCT100 | Fish breeding |
| Incubator | ThermoFisher | Maintaining embryo | |
| 3 L medium tank | Aquaneering | ZT280 | Maintaining fish |
| Paramecia | Carolina | 131560 | Food for juvenile fish |
| Live hatched brine shrimp | in house | Food for adult fish | |
| Doxorubicin hydrochloride | Sigma | D1515-10MG | |
| 1.5 ml safe-lock tube | Eppendorf | No. 022363204 | For drug storage |
| Aluminum foil paper | Fisher | 1213104 | For preventing light exposure |
| Proteinase K | Roche | No. 03115887001 | For dechorionating embryo |
| Hank's balanced salt solution (HBBS) | ThermoFisher | 14025076 | Vehicle for DOX |
| 100 mm petri dish | Falcon | 431741 | |
| 10 μL NanoFil micro-syringe | WPI | NANOFIL | For injection |
| 34 gauge needle | WPI | NF34BV-2 | For injection |
| Tricaine | Argent | MS-222 | Anesthetizing fish |
| 96 well plate | Costar | 3539 | For embryo drug treatment |
| Transfer pipette | Bel-art product | F37898 | For transfering embryo |
References
- Octavia, Y., et al. Doxorubicin-induced cardiomyopathy: from molecular mechanisms to therapeutic strategies. J Mol Cell Cardiol. 52 (6), 1213-1225 (2012).
- Singal, P. K., Iliskovic, N. Doxorubicin-induced cardiomyopathy. N Engl J Med. 339 (13), 900-905 (1998).
- Angsutararux, P., Luanpitpong, S., Issaragrisil, S. Chemotherapy-Induced Cardiotoxicity: Overview of the Roles of Oxidative Stress. Oxid Med Cell Longev. , 795602 (2015).
- Ichikawa, Y., et al. Cardiotoxicity of doxorubicin is mediated through mitochondrial iron accumulation. J Clin Invest. 124 (2), 617-630 (2014).
- Zhang, Y. W., Shi, J., Li, Y. J., Wei, L. Cardiomyocyte death in doxorubicin-induced cardiotoxicity. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 57 (6), 435-445 (2009).
- Sawyer, D. B. Anthracyclines and heart failure. N Engl J Med. 368 (12), 1154-1156 (2013).
- Zhang, S., et al. Identification of the molecular basis of doxorubicin-induced cardiotoxicity. Nat Med. 18 (11), 1639-1642 (2012).
- Dodd, D. A., et al. Doxorubicin cardiomyopathy is associated with a decrease in calcium release channel of the sarcoplasmic reticulum in a chronic rabbit model. J Clin Invest. 91 (4), 1697-1705 (1993).
- Mitry, M. A., Edwards, J. G. Doxorubicin induced heart failure: Phenotype and molecular mechanisms. Int J Cardiol Heart Vasc. 10, 17-24 (2016).
- Aminkeng, F., et al. A coding variant in RARG confers susceptibility to anthracycline-induced cardiotoxicity in childhood cancer. Nat Genet. 47 (9), 1079-1084 (2015).
- Deng, S., et al. Dystrophin-deficiency increases the susceptibility to doxorubicin-induced cardiotoxicity. Eur J Heart Fail. 9 (10), 986-994 (2007).
- Leong, S. L., Chaiyakunapruk, N., Lee, S. W. Candidate Gene Association Studies of Anthracycline-induced Cardiotoxicity: A Systematic Review and Meta-analysis. Sci Rep. 7 (1), 39 (2017).
- Wasielewski, M., et al. Potential genetic predisposition for anthracycline-associated cardiomyopathy in families with dilated cardiomyopathy. Open Heart. 1 (1), e000116 (2014).
- Lebrecht, D., et al. Dexrazoxane prevents doxorubicin-induced long-term cardiotoxicity and protects myocardial mitochondria from genetic and functional lesions in rats. Br J Pharmacol. 151 (6), 771-778 (2007).
- QuanJun, Y., et al. Protective Effects of Dexrazoxane against Doxorubicin-Induced Cardiotoxicity: A Metabolomic Study. PLoS One. 12 (1), e0169567 (2017).
- Seifert, C. F., Nesser, M. E., Thompson, D. F. Dexrazoxane in the prevention of doxorubicin-induced cardiotoxicity. Ann Pharmacother. 28 (9), 1063-1072 (1994).
- Adams, J. W., et al. Enhanced Galphaq signaling: a common pathway mediates cardiac hypertrophy and apoptotic heart failure. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (17), 10140-10145 (1998).
- Bowles, N. E., Bowles, K. R., Towbin, J. A. The "final common pathway" hypothesis and inherited cardiovascular disease. The role of cytoskeletal proteins in dilated cardiomyopathy. Herz. 25 (3), 168-175 (2000).
- Kroumpouzou, E., et al. Common pathways for primary hypertrophic and dilated cardiomyopathy. Hybrid Hybridomics. 22 (1), 41-45 (2003).
- Towbin, J. A., Bowles, K. R., Bowles, N. E. Etiologies of cardiomyopathy and heart failure. Nat Med. 5 (3), 266-267 (1999).
- Liu, Y., et al. Visnagin protects against doxorubicin-induced cardiomyopathy through modulation of mitochondrial malate dehydrogenase. Sci Transl Med. 6 (266), 266ra170 (2014).
- Asimaki, A., et al. Identification of a new modulator of the intercalated disc in a zebrafish model of arrhythmogenic cardiomyopathy. Sci Transl Med. 6 (240), 240ra274 (2014).
- Ding, Y., et al. Haploinsufficiency of target of rapamycin attenuates cardiomyopathies in adult zebrafish. Circ Res. 109 (6), 658-669 (2011).
- Sun, X., et al. Cardiac hypertrophy involves both myocyte hypertrophy and hyperplasia in anemic zebrafish. PLoS One. 4 (8), e6596 (2009).
- Sun, Y., et al. Activation of the Nkx2.5-Calr-p53 signaling pathway by hyperglycemia induces cardiac remodeling and dysfunction in adult zebrafish. Dis Model Mech. 10 (10), 1217-1227 (2017).
- Yang, J., Shah, S., Olson, T. M., Xu, X. Modeling GATAD1-Associated Dilated Cardiomyopathy in Adult Zebrafish. J Cardiovasc Dev Dis. 3 (1), (2016).
- Ding, Y., et al. Trapping cardiac recessive mutants via expression-based insertional mutagenesis screening. Circ Res. 112 (4), 606-617 (2013).
- Ding, Y., et al. A modifier screen identifies DNAJB6 as a cardiomyopathy susceptibility gene. JCI Insight. 2 (8), (2017).
- Kinkel, M. D., Eames, S. C., Philipson, L. H., Prince, V. E. Intraperitoneal injection into adult zebrafish. J Vis Exp. (42), (2010).
- Wang, L. W., et al. Standardized echocardiographic assessment of cardiac function in normal adult zebrafish and heart disease models. Dis Model Mech. 10 (1), 63-76 (2017).
- Desai, V. G., et al. Development of doxorubicin-induced chronic cardiotoxicity in the B6C3F1 mouse model. Toxicol Appl Pharmacol. 266 (1), 109-121 (2013).
- Zhu, W., Shou, W., Payne, R. M., Caldwell, R., Field, L. J. A mouse model for juvenile doxorubicin-induced cardiac dysfunction. Pediatr Res. 64 (5), 488-494 (2008).
- Chatterjee, K., Zhang, J., Honbo, N., Karliner, J. S. Doxorubicin cardiomyopathy. Cardiology. 115 (2), 155-162 (2010).
- Bang, C., et al. Cardiac fibroblast-derived microRNA passenger strand-enriched exosomes mediate cardiomyocyte hypertrophy. J Clin Invest. 124 (5), 2136-2146 (2014).
- Rassaf, T., Kelm, M. Protection from diabetic cardiomyopathy - putative role of the retinoid receptor-mediated signaling. J Mol Cell Cardiol. 59, 179-180 (2013).
- Wahbi, K., et al. Dilated cardiomyopathy in patients with mutations in anoctamin 5. Int J Cardiol. 168 (1), 76-79 (2013).
- Zhou, M. D., Sucov, H. M., Evans, R. M., Chien, K. R. Retinoid-dependent pathways suppress myocardial cell hypertrophy. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (16), 7391-7395 (1995).
- Hershman, D. L., et al. Doxorubicin, cardiac risk factors, and cardiac toxicity in elderly patients with diffuse B-cell non-Hodgkin's lymphoma. J Clin Oncol. 26 (19), 3159-3165 (2008).
- Silber, J. H., Barber, G. Doxorubicin-induced cardiotoxicity. N Engl J Med. 333 (20), 1359-1360 (1995).
- Von Hoff, D. D., et al. Risk factors for doxorubicin-induced congestive heart failure. Ann Intern Med. 91 (5), 710-717 (1979).
- Pugach, E. K., Li, P., White, R., Zon, L. Retro-orbital injection in adult zebrafish. J Vis Exp. (34), (2009).
- Zang, L., Morikane, D., Shimada, Y., Tanaka, T., Nishimura, N. A novel protocol for the oral administration of test chemicals to adult zebrafish. Zebrafish. 8 (4), 203-210 (2011).
- Collymore, C., Rasmussen, S., Tolwani, R. J. Gavaging adult zebrafish. J Vis Exp. (78), (2013).
