Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Polysoom profilering in Leishmania, menselijke cellen en muis Testis

Published: April 8, 2018 doi: 10.3791/57600
Automatic Translation
2, 1, 1, 2,3, 1,3, 1, 1, 1, 2, 1
1Department of Cell Biology and Biochemistry, Texas Tech University Health Sciences Center, 2Department of Biological Sciences, Texas Tech University, 3CISER (Center for the Integration of STEM Education & Research), Texas Tech University

Summary

Het algemene doel van Polysoom profiling techniek is analyse van translationeel activiteiten van individuele mRNAs of transcriptome mRNAs tijdens de eiwitsynthese. De methode is belangrijk voor de studie van eiwit synthese verordening, vertaling activering en onderdrukking in gezondheid en meerdere ziekten bij de mens.

Abstract

Goede eiwit expressie op het juiste moment en in de juiste hoeveelheden is de basis van normale cel functie en overleven in een snel veranderende omgeving. Voor een lange tijd, werden de gen expressie studies gedomineerd door onderzoek op het transcriptional niveau. Echter de steady-state niveaus van mRNAs doen niet correleren goed met de productie van eiwitten en de vertaalbaarheid van mRNAs varieert afhankelijk van de omstandigheden. In sommige organismen, zoals de parasiet, Leishmania, is het eiwit expressie meestal op de translationeel niveau geregeld. Recente studies aangetoond dat eiwitten vertaling disregulatie wordt geassocieerd met kanker, metabole, neurodegeneratieve en andere ziekten bij de mens. Polysoom profilering is een krachtige methode om te studeren eiwit vertaling verordening. U kunt de translationeel status van individuele mRNAs meten of de vertaling op de schaal van een genoom-brede onderzoeken. De basis van deze techniek is de scheiding van polysomes, ribosomen, subeenheden en gratis mRNAs tijdens centrifugeren van een cytoplasmatische lysate via een verloop van sacharose. Hier presenteren we een universele Polysoom profiling protocol dat wordt gebruikt op drie verschillende modellen - parasiet, Leishmania grote, gekweekte menselijke cellen en dierlijke weefsels. Leishmania cellen groeien vrij in suspensie en gekweekte menselijke cellen groeien in aanhangend enkelgelaagde, terwijl muis testis een dierlijk weefsel steekproef. De techniek is dus aangepast aan elk van deze bronnen. Het protocol voor de analyse van polysomal breuken bevat detectie van individuele mRNA niveaus door RT-qPCR, eiwitten door westelijke vlek en analyse van ribosomaal RNAs door elektroforese. De methode kan worden uitgebreid door onderzoek van mRNAs vereniging met het ribosoom op een niveau van transcriptome door diepe RNA-seq en analyse van ribosoom-geassocieerde eiwitten door massaspectrometrie van de fracties. De methode kan gemakkelijk worden aangepast aan andere biologische modellen.

Introduction

Verordening van genexpressie in cellen wordt gecontroleerd door middel van de mechanismen van transcriptionele, posttranscriptional en posttranslationele. Vooruitgang in de diepe RNA sequencing toestaan de studie van de stationaire toestand mRNA niveaus op de schaal van een genoom-brede op een ongeëvenaard niveau. Echter, recente bevindingen bleek dat steady-state mRNA niveau niet altijd met eiwit productie1,2 correleren. Het lot van een individuele transcript is zeer complex en hangt af van vele factoren zoals interne/externe prikkels, stress, enz. Verordening van de genexpressie tijdens de eiwitsynthese biedt een andere laag van expressie controle nodig zijn voor een snelle reactie in veranderende omstandigheden. Polysoom (of "polyribosome") profilering, de scheiding en de visualisatie van actief vertalen ribosomen, is een krachtige methode om te studeren van de regulering van de eiwitsynthese. Hoewel, de eerste experimentele toepassingen verscheen in de jaren 1960-3, is Polysoom profilering momenteel een van de belangrijkste technieken in eiwit vertaling studies4. Enkele mRNAs kan worden vertaald door meer dan één ribosoom leidt tot de vorming van een Polysoom. Afschriften kunnen worden geblokkeerd op ribosomen met cycloheximide5 en mRNAs met verschillende nummers van polysomes kunnen worden gescheiden in het proces van Polysoom fractionering door sacharose kleurovergang ultracentrifugatie6,7 , 8 , 9. RNA analyse van polysomal breuken laat dan meting van veranderingen in de translationeel Staten van individuele mRNAs op genoom-brede schaal en tijdens verschillende fysiologische omstandigheden4,7, 10. de methode is ook gebruikt voor het onthullen van de rollen van 5' UTR en 3' UTR sequenties in controle van mRNA vertaalbaarheid11, de rol van miRNAs in translationeel repressie12onderzoeken, ontdekken van defecten in ribosoom biogenese13 , en begrijpen van de rol van ribosoom-geassocieerde eiwitten met ziekten bij de mens14,15. Tijdens de afgelopen tien jaar, is een steeds grotere rol voor de regulering van de genexpressie tijdens de vertaling gebleken dat het belang ervan voor ziekten bij de mens illustreert. Het bewijs voor translationeel controle in kanker, metabole en neurodegeneratieve ziekten is overweldigend15,16,17,18. Bijvoorbeeld disregulatie van eIF4E-afhankelijke vertalende controle draagt bij aan autisme gerelateerde tekorten15 en FMRP is betrokken bij vastlopen van ribosomen op mRNAs gekoppeld aan autisme14. Polysomal profilering is dus een zeer belangrijk instrument om te studeren fouten in translationeel verordening in meerdere ziekten bij de mens.

Eiwit analyse van polysomal breuken onder verschillende fysiologische omstandigheden ontleedt de functie van factoren die samenhangen met ribosomen tijdens de vertaling. De Polysoom profiling techniek is gebruikt in vele soorten, met inbegrip van gist, cellen van zoogdieren, planten en protozoa10,19,20,21. Eencellige parasieten zoals Trypanosoma en Leishmania vertonen beperkte Transcriptionele controle op de genexpressie. Hun genoom worden ingedeeld in polycistronic gen clusters die geen promotor-gereglementeerde transcriptie22. In plaats daarvan, developmental genexpressie wordt voornamelijk geregeld op het niveau van eiwit vertaling en mRNA stabiliteit in trypanosomatid soorten23,24. Begrip voor translationeel control in de afwezigheid van transcriptionele verordening is daarom bijzonder belangrijk voor deze organismen. Polysomal profilering is een krachtig hulpmiddel om te studeren van posttranscriptional regulering van genexpressie in Leishmania25,26,27,28.

De recente vooruitgang in de opsporing van individuele mRNAs niveaus door real time kwantitatieve PCR (RT-qPCR) en volledige transcriptome door next-generation sequencing, evenals proteomics technologieën, resolutie en voordelen van polysomal profielen naar een nieuw niveau brengt. Het gebruik van deze methoden kan worden uitgebreid door analyse van individuele polysomal breuken door diepe RNA sequencing gecombineerd met Proteoom analyse om de translationeel status van cellen in een genoom-brede schaal te controleren. Hierdoor is de identificatie van nieuwe moleculaire spelers regulering van de vertaling in de verschillende fysiologische en pathologische omstandigheden. Hier presenteren we een universele Polysoom profilering protocol dat wordt gebruikt op drie verschillende modellen: de parasiet, Leishmania grote, gekweekte menselijke cellen en dierlijke weefsels. Over de voorbereiding van cel lysates presenteren we advies van verschillende organismen, optimalisatie van de helling, mits het, keuze van RNase remmers en toepassing van RT-qPCR, westelijke vlek en RNA elektroforese te analyseren Polysoom breuken in deze studie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dierlijke behandelingen en hanteren van weefsels verkregen in de studie werden uitgevoerd volgens protocollen die zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité bij de Texas Tech University Health Science Center volgens de National Institutes of Gezondheid dierenwelzijn richtsnoeren, protocolnummer 96005. Gelieve te offeren van gewervelde dieren en weefsels volgens de richtlijnen van het institutionele Animal Care en gebruik Comité voor te bereiden. Als bij gebrek aan een dergelijk comité, raadpleegt u aan de richtlijnen van de National Institutes of Health het welzijn van dieren. Volwassenen (> 60 dag oud) C57BL/6 muizen werden gebruikt. Alle dieren en weefsels waren verkregen volgens protocollen die zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité bij de Texas Tech University Health Sciences Center overeenkomstig de richtsnoeren van de National Institutes of Health het welzijn van dieren. Voor euthanasie, een enkele muis werd geplaatst in een kleine kamer, en de lucht was geleidelijk aan ontheemden met ongeveer 30% van kooldioxide tot anesthetize en de nood van het dier te minimaliseren. Na beëindiging van de ademhaling, we gewend cervicale dislocatie bevestigen de dood van het dier voordat het oogsten van de weefsels.

Let op: Al het werk met live Leishmania en gekweekte menselijke cellen was gedaan in bioveiligheid kabinet in BSL-2 gecertificeerd laboratorium.

1. voorbereiding van de cytoplasmatische Lysates van Leishmania grote , gekweekte menselijke cellen en weefsels van de muis

Opmerking: Er zijn enkele verschillen in de lysate voorbereidingen van de verschillende grondstoffen. Andere maatregelen met inbegrip van sacharose kleurovergang voorbereiding en polysomal fractionering zijn identiek en niet afhankelijk van monsterbron.

  1. Leishmania grote cytoplasmatische lysate voorbereiding
    1. Leishmania grote (FV1 stam) cellen in 1 x M199 middellange29 dat 10% foetale boviene Serum (FBS) en penicilline/streptomycine mengsel bevat 30 mL beënten (100 stuks en 100 μg/mL navenant)dichtheid 1 x 105 cellen/ml .
      Opmerking: Alle stappen waarbij Leishmania grote cellen moeten plaatsvinden in een kabinet bioveiligheid.
    2. Plaats van cellen in de incubator en ze groeien bij 27 ° C tot de logaritmische fase (medio log overeenkomt met 5 x 106 cellen/mL). Het duurt meestal ongeveer twee dagen om te groeien.
    3. Cycloheximide aan Leishmania grote cultuur om een eindconcentratie van 100 μg/mL tot arrestatie van de ribosomen op vertaalde mRNAs toevoegen. Cellen plaats terug in de incubator voor 10 min bij 27 ° C.
    4. Nadat cycloheximide behandeling is voltooid, cellen overbrengen in een conische tube van 50 mL en draaien ze op 1800 x g- en 4 ° C voor 8 min. Discard supernatant.
    5. Wassen van cellen met 30 mL Dulbecco van fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS). Centrifugeer bij 1800 x g en 4 ° C gedurende 8 min.
    6. Verwijder het supernatant. Resuspendeer de cellen in 1 mL DPBS.
    7. Nemen van een hoeveelheid cellen en meng het met 3,5% formaldehyde oplossing.
    8. Cellen tellen met hemocytometer en hun concentratie te bepalen. Breng het gewenste aantal cellen in microfuge buis. Lysate bereid uit 0.5x108-2 x 108 cellen/mL is voldoende voor één sacharose kleurovergang laden.
    9. Draai de cellen bij 1800 x g en 4 ° C voor 8 min. Verwijder het supernatant.
    10. Resuspendeer de pellet cel op ijs in 1 mL lysis-buffermengsel met proteaseinhibitors en RNase remmer (20 mM HEPES-KOH, pH 7.4, 100 mM KCl, 10 mM MgCl2, 2 mM DTT, 1% NP-40, 1 x proteaseinhibitor cocktail (EDTA-vrij), 200 eenheden/mL RNase remmer).
    11. Passeren de lysate een 23-meter naald driemaal. De lysate moet transparant worden na passage door de naald.
    12. Centrifugeer bij 11.200 x g en 4 ° C voor 10 min te verduidelijken lysate. Overdracht van de geklaarde lysate aan een frisse tube en houdt het op ijs tot sacharose kleurovergang ultracentrifugatie.
    13. Verzamelen 400-500 μL van de lysate als input (om later te analyseren), meteen bevriezen in vloeibare stikstof voor toekomstige eiwit analyse of RNA zuivering reagens toe te voegen voordat de bevriezing voor RNA analyse.
  2. Cytoplasmatische lysate bereiding op basis van gekweekte menselijke HeLa cellen
    1. HeLa cellen splitsen en zaad ze in 20 mL van het medium van de DMEM die 10% FBS en penicilline/streptomycine mengsel (100 stuks en 100 μg/mL navenant) met cel rekenen 2 x 105 cellen/mL in een plaat van 15 cm.
    2. HeLa cellen bij 37 ° C, 5% CO2 voor 20-24 h. uitvoeren plasmide DNA transfectie volgens fabrikant protocollen te groeien.
    3. Propageren cellen gedurende 24 uur na de transfectie bij 37 ° C, 5% CO2.
    4. Cycloheximide aan de uiteindelijke concentratie van 100 μg/mL tot arrestatie van de ribosomen op vertaalde mRNAs en Incubeer de cellen gedurende 10 minuten bij 37 ° C, 5% CO2volwassen HeLa cellen toevoegen. Gecombineerd medium. Wassen van de cellen tweemaal met koude DPBS op ijs.
    5. 500 μL van lysis buffer (20 mM HEPES-KOH pH 7.4, van 100 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1 mM DTT, 0,5% NP-40, 1 x proteaseinhibitor cocktail (EDTA-vrij), 200 eenheden/mL RNase remmer of 1 mg/mL heparine) toevoegen aan de plaat en schraap de cellen op het ijs.
    6. De lysed cellen overbrengen in de microfuge buis. Aanpassen van de concentratie van NP-40 tot 0,5% en MgCl2 tot 5 mM volgens de toename van het volume van het monster.
    7. Passeren de lysate een 23-meter naald 3 - 6 keer.
    8. Spin 11.200 x g en 4 ° C voor 8 min te verduidelijken lysate. Na het centrifugeren, door bovendrijvende substantie te overbrengen in een nieuwe buis. Een spectrofotometer gebruiken om cellysis doeltreffendheid te beoordelen en te bepalen bedrag van de steekproef voor het laden op de helling. 10 μL van monster toevoegen aan 0,5 mL 0,1% natrium Dodecyl Sulfaat (SDS). Lege tegen 0,1% SDS. Meten van de absorptie bij 260 nm. Waarde van de verwachte absorptie is rond 15-20 eenheden/mL.
    9. Verdun alle monsters met lysis-buffermengsel op dezelfde waarde extinctie voordat sacharose kleurovergang centrifugeren. Houd monsters op ijs tot sacharose kleurovergang centrifugeren.
  3. Cytoplasmatische lysate bereiding op basis van muis testis
    1. Ontleden de muis testis. Maak een kleine incisie in de tunica albuginea en verzamelen de seminiferous tubuli van de teelballen en overbrengen in een conische tube van 15 mL met 5 mL DPBS aangevuld met 0,1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF).
    2. Meng het weefsel krachtig door meerdere malen omkeren. Het toestaan van het weefsel te vestigen op de ernst van de eenheid op ijs gedurende 5 minuten.
    3. Verwijder en negeren de bewolkt buffer met bindweefsel cellen en weefsel fragmenten. Herhaal de procedure 2-3 keer. De resterende witte pellet wordt verrijkt voor seminiferous buisjes en geslachtscellen.
    4. De pellet van seminiferous zaadvormende overbrengen in een tube van 2 mL microcentrifuge en spin op 500 x g voor 1 min. Verwijder het supernatant.
    5. Voeg toe 500 µL van lysis buffer (20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 100 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1 mM DTT, 0,5% NP-40, 1 x proteaseinhibitor cocktail (EDTA-vrij), 1 mg/mL heparine of 200 eenheden/mL RNase remmer) aan de tubuli. Gebruik een pipet om het triturate van het weefsel.
    6. Spoel de suspensie met een klein (0,5-1,0 mL) Dounce homogenizer. Het verstoren van het weefsel met zeven tot acht lijnen van de stamper van de glazen.
    7. De lysate overbrengen naar een 1,5 mL microcentrifuge buis.
    8. Centrifugeer het monster van 12.000 x g- en 4 ° C gedurende 8 minuten om te wissen de lysate. Overbrengen in het supernatant een nieuwe buis en winkel op ijs tot laden op het verloop van sacharose.
    9. Verzamel 50 μl van de lysate als input monster, meteen bevriezen bij-80 ° C voor toekomstige eiwit analyse; of RNA zuivering reagens voor bevriezing RNA p.a. toe te voegen.

2. sacharose kleurovergang voorbereiding en ultracentrifugatie

  1. Twee sacharose kleurovergang oplossingen (20 mM HEPES-KOH, pH 7.4, 100 mM KCl, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 1 x proteaseinhibitor cocktail), bevattende hetzij 10 gewichtspercenten sacharose of 50 gewichtspercenten sacharose te bereiden. (Tris-HCl, pH 7.4, kan worden gebruikt in plaats van HEPES). Voeg 200 eenheden/mL RNase remmer of 1 mg/mL heparine volgens de proefopzet. Plaats een buis van de ultracentrifuge voor SW 41 rotor in het marker blok en trek de lijn langs het bovenste niveau van het blok. Breng de buis in een stabiele rack.
  2. Neem een 10 mL spuit met de gelaagdheid-apparaat dat is aangesloten en vul de injectiespuit met 10% sacharoseoplossing (bereid als hierboven). Voorzichtig los aan de onderkant van de buis van de ultracentrifuge totdat zij het mark op de buis tot.
  3. Vul een ander spuit met 50% sacharoseoplossing en schuif voorzichtig de gelaagdheid apparaat door de 10% sacharose laag naar de onderkant van de buis. Laat zachtjes los sacharoseoplossing vanaf de onderkant totdat zij het mark op de buis tot. Het zegel van de buis met het meegeleverde GLB.
  4. Ter voorbereiding van het verloop van sacharose, zet u de kleurovergang maker apparaat ON. Niveau van de plaat met behulp van de omhoog of omlaag knoppen en druk op DONE. Herverdeling is belangrijk voor de lineariteit van het verloop.
  5. Na de herverdeling van de plaat pers GRAD om de kleurovergang menu te openen. Ga naar de lijst op de kleurovergang menu en selecteer de SW 41 Ti-rotor. Kies vervolgens het gewenste sacharose verloop in de lijst van het menu met behulp van de knoppen omhoog en omlaag . Druk op gebruik.
  6. Plaats de houder van de kleurovergang buis op de plaat van de maker van de gradiënt. Breng de buis in de houder. Tot 6 verlopen kunnen bereid worden op hetzelfde moment. Druk op uitvoeren. De maker van de gradiënt draait de buizen op de geprogrammeerde snelheid en hoeken vormen een lineair verloop. Het duurt slechts een paar minuten te bereiden van het verloop.
  7. Wanneer het proces is voltooid, plaatst u de buizen in een rack. De doppen opstijgen. Het verwijderen van hetzelfde volume als het monstervolume vanaf de bovenkant van de ultracentrifuge buizen.
  8. Zorgvuldig laden 400-500 μL lysate bevatten 15-20 A260 eenheden van polysomes op de top. Plaatsen van de buizen in de rotor emmers en ze in evenwicht te brengen.
  9. Centrifugeer bij 260.000 x g en 4 ° C gedurende 2 h met gebruikmaking van SW 41 rotor.

3. Polysoom fractionering en Sample collectie

Opmerking: Hoewel lysate preparaten enkele verschillen afhankelijk van de bron hebben, kleurovergang voorbereiding en Polysoom fractionering protocollen zijn hetzelfde voor alle soorten lysates.

  1. Na voltooiing van de ultracentrifugatie, plaatst u de rotor emmers met de buizen op ijs. Draai breuk verzamelaar en kleurovergang fractionator ON. Klik op SCAN in het menu fractionator. Een rack met 24 collectie buizen in de collector van de Fractie gebracht.
  2. Vul een reservoir van de spoelen aan de zijkant van de fractionator met gedeïoniseerd water. Druk op de toets van de spoelen voor 10 s te spoelen de pomp op fractionator. Bevestig een spoel-adapter met de spuit gevuld met water om de zuiger voor het kalibreren.
  3. Open de fractionator software op de computer. Druk op kalibreren. Gebruik de standaardinstellingen en druk op OK. Wees klaar om het injecteren van water uit spuit.
  4. Druk op OK om te doen van de kalibratie. Onmiddellijk beginnen met het injecteren van water voor de volgende 5 s. Gedurende deze tijd, water zal stromen door de UV-detector stroom-cel en het instrument zal worden gekalibreerd. Het teken Nul Kalibratie voltooid wordt weergegeven. Het instrument is klaar voor fractionering.
  5. Verwijder de adapter spoelen met de spuit. Sluit een uiteinde aan de zuiger van de fractionator.
  6. Open de messing lucht ventiel en druk op lucht sleutel voor 10 s tot droge leidingen en stroom cel. Sluit de klep van de lucht.
  7. Zachtjes de kleurovergang buis uit de emmer rotor verwijderen en plaats deze in het rek. De buis houder GLB toepassen op de bovenkant van de buis en zorgvuldig bewegen de buis in de buis-houder en vergrendelen in positie.
  8. Plaats de houder onder de zuiger van de fractionator. Polysomal banden kunnen vaak worden gezien met het blote oog. Invoeren van de gewenste instellingen voor breuk getallen en volume (24 breuken bij 500 μL/fractie zijn meestal voldoende). Geef het bestand op de juiste manier. Druk op OKen vervolgens Ga naar grafiek knop. In het volgende venster, drukt u op START SCAN. Instellingen wordt weergegeven, drukt u op OK. De verzamelaar zal verplaatsen van de goot op de eerste breuk en de zuiger zal verhuizen naar de buis. Wanneer de zuiger de top van het verloop bereikt op zal zacht naar de geselecteerde snelheid en de fracties zal worden verzameld. Wanneer voltooid, wordt de zuiger beweegt uit de kleurovergang buis.
  9. Open de messing lucht ventiel en druk op lucht -toets op de fractionator voor het ophalen van de laatste fractie.
  10. Verplaats de buizen van het rek op ijs.
  11. Voeg 2 delen van RNA zuivering reagens voor elke fractie en flash bevriezen in vloeibare stikstof tot zuivering van RNA. Als alternatief, als proteïne worden geanalyseerd moet, trichloorazijnzuur aan toevoegen de eindconcentratie van 10% te concentreren ze voor westelijke bevlekkende (zie punt 8).

4. bereiding van synthetische RNA In Vitro normalisering van mRNAs niveaus tijdens de analyse van de gegevens van het RT-qPCR

Opmerking: De E. coli OmpA mRNA wordt gebruikt in dit protocol voor normalisatie. Elke andere RNA waaraan nog geen uitgebreide identiteit met de mRNAs van het bestudeerde organisme (zoogdieren of Leishmania) kan worden gebruikt.

  1. Het fragment van de OmpA DNA SP6 promotor reeks bevattende een standaard PCR-reactie van een plasmide met OmpA gene30voor te bereiden.
  2. 100 µL van het mengsel te bereiden: 80 mM HEPES-KOH, pH 7.5, 16 mM MgCl2, 2 mM Spermidine, 10 mM DTT, 3 mM ATP, 3 mM CTP, 3 mM UTP, 3 mM GTP, 0.5 U/μL RNase remmer, 1 μg OmpA PCR DNA, 3 μL SP6 RNA-polymerase , 0,005 U/l-pyrophosphatase.
  3. Incubeer bij 40 ° C gedurende 2 uur.
  4. Zuiveren RNA door een RNA zuivering kit.
  5. Concentratie door spectrofotometer meten en onderzoeken door agarose gelelektroforese.

5. RNA isolatie van Gradient breuken en cDNA voorbereiding

Opmerking: Ga door rechtstreeks met dit protocol voor RNA zuivering als een RNase-remmer werd gebruikt als een ribonuclease inhibitor. Echter wanneer gebruikt als een ribonuclease inhibitor, zal heparine remmen reverse-transcriptase gebruikt in cDNA voorbereiding. Daarom zal extra zuivering van RNA nodig zijn indien heparine werd gebruikt in de lysis-buffermengsel en verloop. Zie afdeling 6 voor te bereiden op RNA cDNA synthese als heparine werd gebruikt.

  1. Ontdooien van de monsters met RNA zuivering reagens, Voeg 20 ng van synthetische RNA als interne controle voor normalisatie van RT-qPCR resultaten. Doorgaan met RNA voorbereiding volgens de fabrikant protocol behalve één wijziging. Voeg 1 µL van RNA rang glycogeen (20 µg) voorafgaande isopropanol en neerslag. Ontbinden RNA pellets in 20-25 µL RNase-gratis water.
    Opmerking: Glycogeen dient als een drager en helpt om te voorkomen dat verliezen en visualiseren van RNA pellet tijdens het zuiveringsproces ongehinderd. OmpA mRNA wordt gebruikt voor verdere normalisering in RT-qPCR reacties.
  2. RNA concentratie met behulp van de spectrofotometer om voldoende opbrengst meten. Combineer gelijke hoeveelheden van RNA breuken met 40S, 60S en monosomes als prepolysomes. Breuken met 2-4 ribosomen combineren als lichte polysomes en breuken met 5-8 ribosomen combineren als zware polysomes.
  3. 5-10 µL van RNA van gecombineerde breuken gebruiken ter voorbereiding van de cDNAs met behulp van een kit en de aanbevelingen van de fabrikant.
  4. 80 µL van nuclease gratis water aan 20 µL van cDNA toevoegen. Bevriezen van de cDNA monsters bij-20 ° C.

6. RNA zuivering van heparine besmetting

Opmerking: Heparine remt nucleïnezuur verwerking van enzymen zoals reverse-transcriptase. Daarom dit extra reiniging-protocol te gebruiken wanneer heparine wordt gebruikt in de lysis-buffermengsel en/of in het verloop.

  1. LiCl toevoegen om een eindconcentratie van 1 M aan de gezuiverde RNA samples.
  2. Meng de monsters en incubeer op ijs gedurende 1 uur.
  3. Draaien van de monsters bij 16.000 x g en 4 ° C gedurende 15 minuten.
  4. Verwijder het supernatant zo compleet mogelijk met behulp van een precisiepipet.
  5. De korrels voor ongeveer 5 minuten drogen.
  6. Resuspendeer de korrels in de aanvankelijke omvang van RNase-gratis water.
  7. Uitvoeren van spectrofotometrische meting bij 260 nm tot het bepalen van de concentratie van het RNA. Meestal, is het verlies van het monster minimaal.

7. RT-qPCR en Data-analyse van mRNA distributie

  1. Combineer 10.2 μL van 20 μL van SYBR groen, water, 4.8 μL van gene specifieke primers (2,5 μM elke set), 5 μl van cDNA, meng goed en 10 μL per putje in triplicates in 384-well plaat geladen.
  2. Afdekplaat met kleeffilm strak samen en centrifugeer plaat bij 1800 x g gedurende 5 min.
  3. Met een Real-Time PCR-instrument, is instellen van qPCR reactie onder de voorwaarden vermeld in de tabel 1.
  4. Met behulp van de drempel van de cyclus (CT) bereken waarden en de vergelijkende CT (ΔΔCT) methode31 het percentage (%) van mRNA distributie in prepolysomes, licht en zware polysomes als beschreven32 met één wijziging. Gebruik synthetische RNA (OmpA hier) voor de normalisatie van de gegevens in de analyse van de gegevens van de RT-qPCR. De synthetische RNA biedt een normalisatie-besturingselement waarmee berekenen de relatieve mRNAs niveaus te vergelijken in verschillende fracties van een verloop.

8. analyse van eiwitten in Polysomal breuken door het westelijke bevlekken

  1. Uit een voorraad van 100% (m/v), trichloorazijnzuur (TCA) toevoegen aan de geselecteerde breuken (500 l) om een eindconcentratie van 10%, houd op ijs gedurende ten minste 15 minuten, centrifuge in een microfuge voor 5 min, weggeworpen, wassen tweemaal met ijskoude aceton en Los dit op in 25 μL van S DS-monster laden paginabuffer voor elektroforese.
  2. De belasting op de SDS-pagina en voeren standaard elektroforese met volgende overdracht aan het membraan PVDF. Ga verder met het westelijke bevlekken33.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

In deze studie, beschrijven we de toepassing van de polysomal profiling techniek op drie verschillende bronnen: parasitaire Leishmania grote, gekweekte menselijke cellen en muis testis. Leishmania cellen groeien vrij in de vloeibare media in suspensie, gekweekte menselijke cellen groeien in het aanhangend enkelgelaagde op platen, en de testis muis een weefsel steekproef. De methode kan gemakkelijk worden aangepast aan andere soorten vrij volwassen cellen in schorsing, verschillende types van weefsels of van een ander organisme en verschillende soorten gekweekte cellen. De aanpak bestaat uit vier belangrijke stappen: lysate voorbereiding, een kleurovergang voorbereiding van sacharose ultracentrifugatie stap, Polysoom fractionering en sample collectie gevolgd door analyse van de fracties. Cellen uit verschillende bronnen worden verzameld, gewassen en lysed in lysis-buffermengsel door passage via een naald of Dounce homogenizer. Centrifugeren wordt gebruikt voor het verwijderen van puin in cel, verduidelijking van de lysate. De regeling van de kleurovergang fractionering wordt weergegeven in figuur 1A. Een continue sacharose verloop wordt gevormd door het mengen van 10% en 50% sacharose oplossingen in de maker van een gradiënt. De lysate wordt geladen op de bovenkant van het verloop. Ultracentrifugatie scheidt mRNAs geassocieerd met een verschillend aantal ribosomen die wordt gecontroleerd door een UV-detector tijdens fractionering, vormen een aparte extinctie spectrum. Verzamelde breuken worden gebruikt voor RNA en eiwit analyse (figuur 1B). RNA kan worden geanalyseerd door elektroforese gevolgd door noordelijke vlek of gebruikt voor de productie van cDNA gevolgd door een reactie van de RT-qPCR voor het analyseren van de vereniging van individuele mRNAs met polysomes. Volgende-generatie sequencing kan worden gebruikt voor het analyseren van de translationeel status van mRNAs op een genoom-brede schaal7. Eiwitten zijn voor eiwit analyse van polysomal breuken neergeslagen met trichloorazijnzuur te concentreren op hen. Eiwitten worden vervolgens geanalyseerd door Westelijke Bevlekkende of massaspectrometrie op het proteoom-niveau.

Een typische polysomal profiel gegenereerd op basis van Leishmania grote actief groeiende cultuur wordt getoond in figuur 2A. De grafiek van de extinctie van de fractionering heeft een afzonderlijke vorm met typische pieken voor ribosoom subeenheden (40S en 60), één ribosomen (80 of monosomes) en polysomes.

Kwantitatieve RT-PCR (RT-qPCR) was te detecteren vereniging van individuele Leishmania mRNAs met ribosomen en polysomes werkzaam. De vergelijkende methode van de31 CT (ΔΔCT) is een eenvoudig en geschikte wijze om te studeren van relatieve mRNAs niveaus in de cellen. Deze methode vereist een interne controle (een stabiele mRNA, die expressie tijdens behandelingen of de omstandigheden van het experiment niet verandert) voor berekeningen. Er is echter geen interne controle in polysomal breuken omdat niveaus van mRNA of ribosomaal RNA in breuken, afhankelijk van hun associatie met ribosomen, polysomes, enz variëren zal. Wij hebben om op te lossen het probleem van een interne controle, synthetische bacteriële OmpA mRNA gebruikt voor normalisering van relatieve individuele Leishmania mRNA niveaus in de fracties. OmpA mRNA werd gesynthetiseerd in vitro en in gelijke hoeveelheden toegevoegd aan elke fractie vóór RNA extracties. Toevoeging van synthetische RNA is belangrijk, omdat het maakt berekeningen van RT-qPCR gegevens nauwkeuriger, bijeenkomen van interne controle voor berekeningen door vergelijkende methode van de CT (ΔΔCT).

Hoeveelheden van de kleurovergang breuken waren gemengd in drie groepen: prepolysomes (subeenheden en monosomes), polysomes (bestaande uit 2-4 ribosomen), en zware polysomes (bestaande uit 5-8 ribosomen) licht. RT-qPCR werd uitgevoerd op RNA van gecombineerde breuken te analyseren van mRNA verdeling tussen deze gecombineerde breuken (figuur 2B). 18s ribosomal RNA werd gebruikt als een besturingselement. Het relatieve niveau bepaald door RT-qPCR correleren goed met de geraamde verdeling van de kleine ribosomal subeenheden (gratis subeenheid, en als een onderdeel van monosomes en polysomes) op het spectrum. RT-qPCR analyse is gebleken dat individuele mRNAs getest een verschillende mate van betrokkenheid in vertaling in logaritmische fase van Leishmania groei hebben. Tubuline mRNA is bij voorkeur gekoppeld aan zware polysomes, efficiënte vertaling suggereren. Daarentegen Sherp mRNA wordt gevonden hoofdzakelijk met prepolysomes en lichte polysomes ondersteuning van minder actief vertalen in vergelijking met tubuline mRNA.

Expressie van recombinante eiwitten in gekweekte cellen is een belangrijke experimentele aanpak in diverse categorieën van studies. Hier presenteren we een voorbeeld van polysomal profilering van recombinante eiwitten mRNAs in een ander monsterbron, gekweekte menselijke cellen. HeLa cellen werden Transient transfected met plasmiden uiting van recombinante cystic fibrosis transmembrane huidgeleiding regulator (CFTR)34 of Norrie ziekte eiwit (NDP). Spectra van de absorptie van Polysoom fractionering uit deze twee onafhankelijke culturen waren zeer vergelijkbaar en bevatte verschillende pieken overeenkomen ribosomal subeenheden (40S en 60), monosomes (80) en polysomes (figuur 3A). Gelijkenis in de spectra van deze experimenten illustreert reproduceerbaarheid van de kleurovergang fractionering. Net als in de Leishmania studies, werd de verdeling van mRNAs bepaald door RT-qPCR in de fracties die prepolysomes, licht polysomes en zware polysomes (figuur 3B). Detectie van kleine ribosomal subeenheid 18S RNA gecorreleerd met hun geschatte distributie in de spectra. NDP mRNAs werden meestal geassocieerd met lichte en zware polysomal breuken, terwijl CFTR mRNAs meestal in prepolysome fracties gevonden werden, wat suggereert dat de NDP efficiënter wordt vertaald. Terwijl de NDP is een relatief kleine eiwit, is CFTR een zeer grote eiwit (1480 aminozuurresidu's), bestaande uit verschillende domeinen, dat onafhankelijk tijdens de vertaling35 vouwen. Lagere engagementen van CFTR mRNA met polysomes kunnen duiden op langzamere vertaling die nodig is voor het vouwen van de cotranslational van de verschillende domeinen.

Polysoom breuken kunnen ook worden gebruikt voor detectie van eiwitten. Detectie van eiwitten in de kleurovergang breuken vond plaats op het voorbeeld van ribosomal eiwitten in HeLa cellen (Figuur 4). Eiwitten waren geconcentreerd door precipitatie met 10% TCA van de fracties en de westelijke vlek werd gebruikt voor het detecteren van de kleine subunit ribosomal eiwit RPS6 en grote subunit ribosomal eiwit RPL11 (Figuur 4, bovenste paneel). Hun distributie gecorreleerd met de verschillende toppen op het extinctie-spectrum. Deze experimenten tonen duidelijk aan dat de fracties van de Polysoom kunnen worden gebruikt voor het analyseren van eiwitten in hen.

Veel verschillende sacharose concentraties kleurovergangen (bijvoorbeeld, 7-47%36, 5-50%7, 7-50%6 , 10-50%37, 15-50%-8en anderen) voor polysomes fractionering werden gebruikt. Hier, vergeleken we twee verlopen 10-50% en 17-51% (Figuur 5). Hoewel, 17-51% aanvaardbare resultaten opgeleverd, was de scheiding in de helling van 10-50% algehele beter.

Het is goed gedocumenteerd dat chelaatvormers, zoals EDTA, ribosomen en polysomes8,9 verstoren. Zoals is aangetoond in Figuur 6, EDTA behandeling van de HeLa lysate voordat laden op de helling tot verdwijning van de pieken leidt, overeenkomt met de monosomes en polysomes, en de aanzienlijke toename van de subeenheden van het ribosoom pieken. Dit experiment diende als een besturingselement en aangetoond dat de waargenomen pieken zonder EDTA behandeling eigenlijk ribosomal monosomes en polysomes.

Figuur 7 ziet u resultaten van Polysoom fractionering van testes van de muis. De extinctie spectrum heeft overeenkomsten met die van Leishmania en HeLa cellen: afzonderlijke pieken van ribosomal subeenheden, monosomes en polysomes. Hun vorm en distributie produceren een handtekeningweergave, waardoor het gemakkelijk om ze te identificeren op verschillende polysomal spectra. Totale RNAs werden gezuiverd van de fracties en RNAs van geselecteerde breuken werden geanalyseerd door elektroforese in agarose gel (Figuur 7, bovenste paneel). De elektroforese toont een typische verdeling van 18S en 28 ribosomaal RNAs. Hun scherpe bands geven intactheid van de monsters. De gel kan gebruikt worden voor individuele mRNAs detectie door een volgende noordelijke vlek of het kan worden gebruikt voor het evalueren van de kwaliteit van de monsters vóór verdere experimenten op RNA of eiwit analyse - de diffuus ribosomaal RNAs banden geven RNA afbraak in de monsters.

Tijdens onze studie, we gebruikten RNase remmer en heparine als RNase remmers in de lysates en sacharose verlopen. Terwijl beiden bevredigende resultaten opgeleverd, was het gebruik van RNase remmer beter voor RNA analyse omdat het niet de cDNA en RT-qPCR reacties remmen doet. Dus, het niet meer vereist extra stappen voor de zuivering van RNA. Echter als onderzoekers besluit te gebruiken van heparine tijdens de voorbereiding van de Polysoom, zich bewust dat heparine stroomafwaarts toepassingen zoals RT-qPCR remt en extra RNA zuivering nodig is (Zie Protocol punt 6).

Figure 1
Figuur 1 . Polysoom profiling. (A) regeling van de kleurovergang voorbereiding, Polysoom fractionering en absorptie-profiel. (B) schema van de analyse van de breuk. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2 . Polysoom profiel-analyse van Leishmania grote cultuur in logaritmische fase van de groei. (A) gefractioneerde Cytoplasmic lysate was in 10-50% sacharose verloop. (B) relatieve verdeling van het 18S RNA, tubuline en Sherp mRNAs (%) in prepolysomes, lichte en zware polysomes van log cellen geanalyseerd door RT-qPCR. Breuken met 40S, werden 60S en monosomes samengevoegd als prepolysomes. Breuken met 2-4 ribosomen werden samengevoegd als lichte polysomes, terwijl breuken met 5-8 ribosomen gevormd zware polysomes. Synthetische E. coli OmpA mRNA toegevoegd aan breuken voorafgaande RNA extractie diende als een controle van de normalisatie in de RT-qPCR. Vergelijkende CT (ΔΔCT)31 methode werd gebruikt voor de berekening van de mRNA niveaus. Foutbalken vertegenwoordigen standaardfouten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3 . Polysoom fractionering en analyse van recombinante CFTR en NDP mRNAs vereniging met ribosomen in HeLa cellen transfected met plasmide Ani. (A) Polysomal profiel in HeLa cellen transfected met CFTR en NDP plasmiden. 10-50% sacharose verloop werd toegepast om scheiding van polysomes. De pieken voor kleine (40S) en grote (60) subeenheden, evenals monosome (80) worden aangegeven. Breuken waren zoals op een deelvenster A gecombineerd en gebruikt voor verdere analyse. (B) distributie van mRNAs CFTR en NDP in verschillende fracties. Detectie van 18S door RT-qPCR werd gebruikt als een besturingselement voor Polysoom fractionering. RNA niveaus werden beoordeeld door RT-qPCR analyse. Gegevens waren genormaliseerd met behulp van synthetische mRNA. Vergelijkende CT (ΔΔCT)31 methode werd gebruikt voor de berekening van de mRNA niveaus. Foutbalken vertegenwoordigen standaardfouten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4 . Detectie van ribosomal eiwitten in HeLa polysomal breuken. HeLa cellen lysate werd onderworpen door 10% - 50% sacharose kleurovergang centrifugeren. Eiwitten in geselecteerde breuken werden neergeslagen met TCA en geanalyseerd door elektroforese in 12% SDS-pagina met het volgende van westelijke bevlekken met behulp van mouse monoclonal RPS6 en konijn polyclonal antilichaam van RPL11 als primaire antilichamen en Peroxidase-Conjugated geit anti-muis of anti-konijn secundaire antilichamen. Visualisatie van signalen werd gedaan door SuperSignal West Pico PLUS chemiluminescentie substraat. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5 . Vergelijking van HeLa polysomal profilering in de 10% - 50% (zwart) of 17-51% (grijs) sacharose verlopen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 6
Figuur 6 . Effect van EDTA behandeling op polysomal profiel in HeLa cellen. HeLa cellen lysate werd behandeld met 10 mM EDTA op ijs gedurende 10 minuten vóór sacharose kleurovergang centrifugeren. MgCl2 werd vervangen door 5 mM EDTA in sacharose kleurovergang oplossingen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 7
Figuur 7 . Polysomal Profiel van muis testis weefsel lysate. Breuken waren onderworpen aan RNA extractie met een RNA zuivering reagens en geanalyseerd door elektroforese in 1% agarose gel. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Stadium Stap Voorwaarde
Houd Stap 1 Verhogen van de temperatuur van 25 tot 50° C met 1,6 ° C/s
Incubeer bij 50° C voor 2:00 min
Stap 2 Verhogen van de temperatuur van 50 tot 95° C met 1,6 ° C/s
Incubeer bij 95° C gedurende 10:00 min
PCR Stap 1 Incubeer bij 95° C gedurende 00:15 min
Stap 2 Verlagen van de temperatuur van 95 tot 60° C met 1,6 ° C /
Incubeer bij 60° C gedurende 1:00 min
Aantal cycli 40
Smelten van Curve Stap 1 Verhogen van de temperatuur van 60 tot 95° C met 1,6 ° C/s
Stap 2 Verlagen van de temperatuur van 95 tot 60° C met 1,6 ° C/s
Incubeer bij 60° C gedurende 1:00 min
Stap 3 (dissociatie) Verhogen van de temperatuur van 60 tot 95° C met 0,05 ° C/s
Incubeer bij 95° C gedurende 00:15 min

Tabel 1. Voorwaarden voor RT-qPCR

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Polysoom fractionering door sacharose verloop in combinatie met RNA en eiwit analyse van breuken is een krachtige methode voor het analyseren van translationeel status van individuele mRNAs of de hele translatome en rollen van proteïne factoren reguleren translationeel machine tijdens normale fysiologische of ziekte staat. Polysomal profilering is een speciaal geschikt techniek te studeren translationeel verordening in organismen zoals trypanosomatids, met inbegrip van Leishmania waar Transcriptionele controle grotendeels afwezig is en genregulatie expressie meestal optreedt tijdens de vertaling.

Hier beschrijven we een Polysoom fractionering protocol gebruikt op drie modellen: Leishmania parasieten, gekweekte menselijke cellen en weefsels van de muis. De Polysoom fractionering stap is in wezen hetzelfde voor verschillende organismen die worden gebruikt in deze studie; de lysate voorbereiding heeft echter enkele verschillen. Leishmania cellen groeien in vloeibare cultuur en is verzameld door centrifugeren en cellen worden geteld voorafgaand aan cellysis om gelijke laden op het verloop. Menselijke cellen kunnen worden gewassen en lysed direct op de plaat. Het gelijk laden wordt gecontroleerd door de optische dichtheid. Muis weefsels vereisen een Dounce homogenizer voor efficiënte lysis terwijl in het geval van Leishmania en menselijke cellen, volstaat ze passeren met de 23-gauge naald.

Alle gebruikte reagentia moeten worden RNase en protease gratis. We vergeleken de heparine en RNase remmer als remmers van RNase activiteit in de cytoplasmatische lysates. We vonden dat beide reagentia RNase effectief kunnen blokkeren. Heparine heeft echter gevolgen voor downstream toepassingen zoals cDNA voorbereiding en RT-qPCR. Dientengevolge, vereist voorbereiding van RNA een extra zuivering wanneer heparine wordt gebruikt. Naar onze mening de RNase remmer is handiger keuze en effectief kan worden gebruikt in Polysoom profileren protocol.

Polysomal profilering is arbeidsintensief, dat een belangrijke beperking van de methode is. Tot zes verlopen kunnen bereid worden op hetzelfde moment. De kleurovergang fractionator genereert 144 breuken die moeten worden verwerkt in een korte periode van tijd. Analyse van individuele fracties kan ook tijdrovend en duur. Daarom combineren individuele breuken in pre polysomes, lichte en zware polysomes biedt een snel en minder omslachtige manier om te schatten translationeel activiteit van individuele mRNAs. Onze resultaten van de RT-qPCR op de gecombineerde breuken konden we verschillen in de vertaalbaarheid van verschillende mRNAs zowel in Leishmania en HeLa cellen (figuren 2, 3). Echter, als de resolutie van de fijnere nodig is, vervolgens analyse van individuele fracties kan worden uitgevoerd.

Ribosoom profilering is een andere methode om te studeren de translationeel status van mRNA en is gebaseerd op meting van eiwitproductie via sequentiebepaling van mRNA fragmenten beschermd door ribosoom38. Deze technologie biedt kwantitatieve informatie mRNA opeenvolgingen te koppelen aan specifieke polysomal breuken worden vertaald in een monster en precieze informatie kan verschaffen over de translationeel status van mRNAs op codon resolutie in vergelijking met Polysoom profiling technologie. Echter Polysoom profielen kunnen worden gebruikt voor zowel RNA en eiwit analyse, dus extra voorlichting over proteoom van polysomes en identificeren van de factoren die bijdragen tot de regulering van de vertaling.

Daarom is polysomal profilering een veelzijdige techniek die kan worden gebruikt voor het analyseren van translationeel staat van individuele mRNAs, onderzoeken ribosoom-geassocieerde eiwitten en translationeel verordening in verschillende modelorganismen onder verschillende experimentele studie voorwaarden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

De auteurs bedanken Ching Lee voor hulp met audio-opname. Het onderzoek werd gesteund door de Start-up middelen uit Texas Tech University Health Sciences Center en door het Center of Excellence voor translationele neurowetenschappen en Therapeutics (CTNT) toekennen PN-CTNT 2017-05 AKHRJDHW A.L.K.; gedeeltelijk door de NIH grant R01AI099380 K.Z. James C. Huffman en Kristen R. Baca waren CISER (centrum voor de integratie van STEM onderwijs & onderzoek) geleerden en werden ondersteund door het programma.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Instruments:
Gradient master Biocomp Instruments Inc. 108
Piston Gradient Fractionator Biocomp Instruments Inc. 152
Fraction collector Gilson, Inc. FC203B
NanoDrop One Thermo Scientific NanoDrop One
Nikon inverted microscope Nikon ECLIPSE Ts2-FL/Ts2
2720 Thermal Cycler Applied Biosystems by Life Technologies 4359659
CO2 incubator Panasonic Healthcare Co. MCO-170A1CUV
HERATHERM incubator Thermo Scientific 51028063
Biological Safety Cabinet, class II, type A2 NuAire Inc. NU-543-400
Revco freezer Revco Technologies ULT1386-5-D35
Beckman L8-M Ultracentifuge Beckman Coulter L8M-70
Centrifuge Eppendorf 5810R
Centrifuge Eppendorf 5424
Ultracentrifuge Rotor SW41 Beckman Coulter 331362
Swing-bucket rotor Eppendorf A-4-62
Fixed angle rotor Eppendorf F-45-30-11
Quant Studio 12K Flex Real-Time PCR machine 285880228 Applied Biosystems by life technologies 4470661
TC20 Automated cell counter Bio-Rad 145-0102
Hemacytometer Hausser Scientific 02-671-51B
Software 
Triax software  Biocomp Instruments Inc.
Materials:
Counting slides, dual chamber for cell counter Bio-Rad 145-0011
1.5 mL microcentrifuge tube USA Scientific 1615-5500
Open-top polyclear centrifuge tubes, (14 mm x 89 mm) Seton Scientific 7030
Syringe, 5 mL BD 309646
BD Syringe 3 mL23 Gauge 1 Inch Needle BD 10020439
Nunclon Delta Surface plate, 14 cm Thermo Scientific 168381
Nunclon Delta Surface plate, 9 cm Thermo Scientific 172931
Nalgene rapid-flow 90mm filter unit, 500 mL, 0.2 aPES Thermo Scientific 569-0020
BioLite 75 cm3 flasks Thermo Scientific 130193
Nunc 50 mL conical centrifuge tubes Thermo Scientific 339653
Chemicals:
Trizol LS Ambion by Life Technologies 10296028
HEPES Fisher Scientific BP310-500
Trizma base Sigma T1378-5KG
Dulbecco's Modified Eagle's Medium-high glucose (DMEM) Sigma D6429-500ML
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma F0926-50ML
Penicillin-Streptomycin (P/S) Sigma P0781-100ML
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-019
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) Sigma D8537-500ML
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2x6H2O) Acros Organics AC413415000
Potassium Chloride (KCl) Sigma P9541-500G
Nonidet P 40 (NP-40) Fluka (Sigma-Aldrich) 74385
Recombinant Rnasin Ribonuclease Inhibitor Promega N2511
Heparin sodium salt Sigma H3993-1MU
cOmplete Mini EDTA-free protease inhibitors Roche Diagnostics 11836170001
Glycogen Thermo Scientific R0551
Water Sigma W4502-1L
Cycloheximide Sigma C7698-1G
Chloroform Fisher Scientific 194002
Dithiotreitol (DTT) Fisher Scientific BP172-5
Ethidium Bromide Fisher Scientific BP-1302-10
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium dehydrate (EDTA) Fisher Scientific S316-212
Optimem Life Technologies 22600050
Puromycin dihydrochloride Sigma P8833-100MG
Sucrose Fisher Scientific S5-3KG
Trypsin-EDTA solution Sigma T4049-100ML
Hgh Capacity cDNA Reverse Transcriptase Kit Applied Biosystems by life technologies 4368814
Power SYBR Green PCR Master Mix Applied Biosystems by life technologies 4367659
HCl Fisher Scientific A144SI-212
Isopropanol Fisher Scientific BP26324
Potassium Hydroxide (KOH) Sigma 221473-500G
Anti-RPL11 antibody Abcam ab79352
Ribosomal protein S6 (C-8) antibody Santa Cruz Biotechnology Inc. sc-74459
1xM199 Sigma M0393-10X1L
Lithium cloride Sigma L-9650
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Fisher Scientific D128-500
Gel Loading Buffer II Thermo Scientific AM8546G
UltraPure Agarose Thermo Scientific 16500-100
Trichloracetic acid (TCA) Fisher Scientific A322-100
SuperSignal West Pico PLUS chemiluminescent substrate Thermo Scientific 34580
Formaldehyde Fisher Scientific BP531-500
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Sigma L5750-1KG
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Sigma P7626-5G
RNeasy Mini kit Qiagen 74104
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) Sigma A1852-1VL
Cytosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate (CTP) Sigma C1506-250MG
Uridine 5'-triphosphate trisodium salt hydrate (UTP) Sigma U6625-100MG
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate (GTP) Sigma G8877-250MG
SP6 RNA Polymerase NEB M0207S
Pyrophoshatase Sigma I1643-500UN
Spermidine Sigma S0266-1G

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schwanhausser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
  2. Capewell, P., et al. Regulation of Trypanosoma brucei Total and Polysomal mRNA during Development within Its Mammalian Host. PLoS One. 8 (6), e67069 (2013).
  3. Warner, J. R., Knopf, P. M., Rich, A. A multiple ribosomal structure in protein synthesis. Proceedings of the National Academy of Science, USA. 49, 122-129 (1963).
  4. Piccirillo, C. A., Bjur, E., Topisirovic, I., Sonenberg, N., Larsson, O. Translational control of immune responses: from transcripts to translatomes. Nature Immunology. 15 (6), 503-511 (2014).
  5. Ennis, H. L., Lubin, M. Cycloheximide: Aspects of Inhibition of Protein Synthesis in Mammalian Cells. Science. 146 (3650), 1474-1476 (1964).
  6. Masek, T., Valasek, L., Pospisek, M. Polysome analysis and RNA purification from sucrose gradients. Methods in Molecular Biology. 703, 293-309 (2011).
  7. Gandin, V., et al. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. Journal of Visualized Experiments. (87), (2014).
  8. Zuccotti, P., Modelska, A. Studying the Translatome with Polysome Profiling. Methods in Molecular Biology. 1358, 59-69 (2016).
  9. Chasse, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. Analysis of translation using polysome profiling. Nucleic Acids Research. 45 (3), e15 (2017).
  10. Arava, Y., et al. Genome-wide analysis of mRNA translation profiles in Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Science, USA. 100 (7), 3889-3894 (2003).
  11. Gandin, V., et al. nanoCAGE reveals 5' UTR features that define specific modes of translation of functionally related MTOR-sensitive mRNAs. Genome Research. 26 (5), 636-648 (2016).
  12. Bazzini, A. A., Lee, M. T., Giraldez, A. J. Ribosome profiling shows that miR-430 reduces translation before causing mRNA decay in zebrafish. Science. 336 (6078), 233-237 (2012).
  13. Zanchin, N. I., Goldfarb, D. S. Nip7p interacts with Nop8p, an essential nucleolar protein required for 60S ribosome biogenesis, and the exosome subunit Rrp43p. Molecular Cell Biology. 19 (2), 1518-1525 (1999).
  14. Darnell, J. C., et al. FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism. Cell. 146 (2), 247-261 (2011).
  15. Gkogkas, C. G., et al. Autism-related deficits via dysregulated eIF4E-dependent translational control. Nature. 493 (7432), 371-377 (2013).
  16. Robichaud, N., Sonenberg, N. Translational control and the cancer cell response to stress. Curr Opin Cell Biol. 45, 102-109 (2017).
  17. Gordon, B. S., Kelleher, A. R., Kimball, S. R. Regulation of muscle protein synthesis and the effects of catabolic states. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 45 (10), 2147-2157 (2013).
  18. Ishimura, R., et al. RNA function. Ribosome stalling induced by mutation of a CNS-specific tRNA causes neurodegeneration. Science. 345 (6195), 455-459 (2014).
  19. Petersen, C. P., Bordeleau, M. E., Pelletier, J., Sharp, P. A. Short RNAs repress translation after initiation in mammalian cells. Molecular Cell. 21 (4), 533-542 (2006).
  20. Juntawong, P., Girke, T., Bazin, J., Bailey-Serres, J. Translational dynamics revealed by genome-wide profiling of ribosome footprints in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Science, USA. 111 (1), E203-E212 (2014).
  21. Bunnik, E. M., et al. Polysome profiling reveals translational control of gene expression in the human malaria parasite Plasmodium falciparum. Genome Biology. 14 (11), R128 (2013).
  22. De Gaudenzi, J. G., Noe, G., Campo, V. A., Frasch, A. C., Cassola, A. Gene expression regulation in trypanosomatids. Essays in Biochemistry. 51, 31-46 (2011).
  23. Alves, L. R., Goldenberg, S. RNA-binding proteins related to stress response and differentiation in protozoa. World Journal of Biological Chemistry. 7 (1), 78-87 (2016).
  24. De Pablos, L. M., Ferreira, T. R., Walrad, P. B. Developmental differentiation in Leishmania lifecycle progression: post-transcriptional control conducts the orchestra. Current Opinions in Microbiology. 34, 82-89 (2016).
  25. Soto, M., et al. Cell-cycle-dependent translation of histone mRNAs is the key control point for regulation of histone biosynthesis in Leishmania infantum. Biochemical Journal. 379, 617-625 (2004).
  26. McNicoll, F., et al. Distinct 3 '-untranslated region elements regulate stage-specific mRNA accumulation and translation in Leishmania. Journal of Biological Chemistry. 280 (42), 35238-35246 (2005).
  27. Folgueira, C., et al. The translational efficiencies of the two Leishmania infantum HSP70 mRNAs, differing in their 3 '-untranslated regions, are affected by shifts in the temperature of growth through different mechanisms. Journal of Biological Chemistry. 280 (42), 35172-35183 (2005).
  28. Dumas, C., Chow, C., Muller, M., Papadopoulou, B. A novel class of developmentally regulated noncoding RNAs in Leishmania. Eukaryotic Cell. 5 (12), 2033-2046 (2006).
  29. Kapler, G. M., Coburn, C. M., Beverley, S. M. Stable transfection of the human parasite Leishmania major delineates a 30-kilobase region sufficient for extrachromosomal replication and expression. Molecular Cell Biology. 10 (3), 1084-1094 (1990).
  30. Karamyshev, A. L., Johnson, A. E. Selective SecA association with signal sequences in ribosome-bound nascent chains: a potential role for SecA in ribosome targeting to the bacterial membrane. Journal of Biological Chemistry. 280 (45), 37930-37940 (2005).
  31. Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).
  32. Panda, A. C., Martindale, J. L., Gorospe, M. Polysome Fractionation to Analyze mRNA Distribution Profiles. Bio Protocols. 7 (3), (2017).
  33. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloning. A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
  34. Patrick, A. E., Karamyshev, A. L., Millen, L., Thomas, P. J. Alteration of CFTR transmembrane span integration by disease-causing mutations. Molecular Biology of the Cell. 22 (23), 4461-4471 (2011).
  35. Kleizen, B., van Vlijmen, T., de Jonge, H. R., Braakman, I. Folding of CFTR is predominantly cotranslational. Molecular Cell. 20 (2), 277-287 (2005).
  36. van den Elzen, A. M., Schuller, A., Green, R., Seraphin, B. Dom34-Hbs1 mediated dissociation of inactive 80S ribosomes promotes restart of translation after stress. EMBO Journal. 33 (3), 265-276 (2014).
  37. Morita, M., et al. mTOR Controls Mitochondrial Dynamics and Cell Survival via MTFP1. Molecular Cell. 67 (6), 922-935 (2017).
  38. Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).

Tags

Biochemie kwestie 134 genexpressie eiwit vertaling ribosoom mRNA Polysoom profiling sacharose verloop RT-qPCR Leishmania
Polysoom profilering in <em>Leishmania</em>, menselijke cellen en muis Testis
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Karamysheva, Z. N., Tikhonova, E.… More

Karamysheva, Z. N., Tikhonova, E. B., Grozdanov, P. N., Huffman, J. C., Baca, K. R., Karamyshev, A., Denison, R. B., MacDonald, C. C., Zhang, K., Karamyshev, A. L. Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis. J. Vis. Exp. (134), e57600, doi:10.3791/57600 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter