Summary
L'obiettivo generale di tecnica di profilatura polisoma è analisi di attività traduzionale di singoli mRNA o del trascrittoma mRNA durante la sintesi proteica. Il metodo è importante per gli studi di regolamento di sintesi della proteina, l'attivazione di traduzione e repressione in salute e più malattie umane.
Abstract
Espressione della proteina corretta al momento giusto e nelle giuste quantità è alla base della funzione normale delle cellule e la sopravvivenza in un ambiente veloce-cambiante. Per lungo tempo, gli studi di espressione genica sono stati dominati dalla ricerca al livello trascrizionale. Tuttavia, i livelli allo stato stazionario di mRNA non correlano bene con la produzione di proteine, e la traducibilità dei mRNAs varia notevolmente a seconda delle condizioni. In alcuni organismi, come il parassita Leishmania, l'espressione della proteina è regolata principalmente a livello traduzionale. Studi recenti hanno dimostrato che dysregulation di traduzione della proteina è associata con cancro, metabolico, neurodegenerative e altre malattie umane. Polisoma profiling è un metodo potente per studiare il regolamento della proteina di traduzione. Permette di misurare lo stato traduzionale di singoli mRNA o esaminare la traduzione su scala genomica. La base di questa tecnica è la separazione di polisomi, ribosomi, loro subunità e mRNAs gratuito durante la centrifugazione di un pattern citoplasmatico lisato attraverso un gradiente di saccarosio. Qui, presentiamo un protocollo profilatura polisoma universale utilizzato su tre diversi modelli - parassita maggiore di Leishmania, cellule umane coltivate e tessuti animali. Leishmania cellule crescono liberamente in sospensione e cellule umane coltivate crescono nello strato monomolecolare aderente, mentre testicolo di topo rappresenta un campione di tessuto animale. Così, la tecnica si adatta a tutte queste fonti. Il protocollo per l'analisi delle frazioni polisomici include rilevamento dei singoli livelli di mRNA di RT-qPCR, proteine mediante Western blot e analisi di RNA ribosomiale (rRNA) tramite l'elettroforesi. Il metodo può essere ulteriormente esteso da esame dell'associazione di mRNA con il ribosoma a livello del trascrittoma di profonda RNA-seq e analisi delle proteine associate ribosoma di spettroscopia di massa delle frazioni. Il metodo può essere facilmente regolato ad altri modelli biologici.
Introduction
Regolazione dell'espressione genica in cellule è controllata da meccanismi trascrizionali, post-trascrizionale e post-traduzionali. Progressi nel sequenziamento di RNA profondo consentono lo studio dei livelli di mRNA di stazionario su scala genomica a un livello senza precedenti. Tuttavia, recenti scoperte hanno rivelato che il livello di mRNA allo steady-state non correla sempre con proteina produzione1,2. Il destino di una trascrizione individuale è molto complesso e dipende da molti fattori come stress, stimoli interni/esterni, ecc. Regolazione dell'espressione genica durante la sintesi delle proteine fornisce un ulteriore livello di controllo necessario per una risposta rapida in condizioni di cambiamento di espressione. Profili, la separazione e la visualizzazione di tradurre attivamente ribosomi, polisoma (o "polyribosome") è un metodo efficace per studiare la regolazione della sintesi proteica. Anche se le prime applicazioni sperimentali è apparso in the 1960s3, polisoma profilatura è attualmente una delle tecniche più importanti nella proteina traduzione studi4. Singolo mRNA può essere tradotto da più di un ribosoma che portano alla formazione di un polisoma. Le trascrizioni possono essere bloccate sui ribosomi con cicloesimmide5 e mRNA contenente diversi numeri di polisomi possa essere separati nel processo di frazionamento polisoma da saccarosio ultracentrifugazione di pendenza6,7 , 8 , 9. analisi di RNA delle frazioni polisomici quindi permette la misura dei cambiamenti negli Stati traduzionali di singoli mRNA su scala genomica e durante diverse condizioni fisiologiche4,7, 10. il metodo è stato utilizzato anche per rivelare i ruoli di 5' UTR e 3' UTR sequenze nel controllo di mRNA traducibilità11, esaminare il ruolo dei miRNA nella repressione traduzionale12, difetti nella biogenesi dei ribosomi13 e comprendere il ruolo delle proteine associate ribosoma con malattie umane14,15. Durante l'ultimo decennio, un ruolo sempre più importante per la regolazione dell'espressione genica durante la traduzione è emerso che illustra la sua importanza nelle malattie umane. La prova per controllo traduzionale in cancro, metabolico e malattie neurodegenerative è schiacciante15,16,17,18. Ad esempio, disregolazione del controllo traduzionale eIF4E-dipendente contribuisce all'autismo relativi deficit15 e FMRP è coinvolto in stallo dei ribosomi su mRNA legati all'autismo14. Così, profili polisomici è uno strumento molto importante per studiare i difetti nella regolazione traduzionale in malattie umane multiple.
Analisi della proteina di polisomici frazioni in differenti condizioni fisiologiche analizza la funzione dei fattori connessi con i ribosomi durante la traduzione. La tecnica di profilatura polisoma è stata utilizzata in molte specie tra cui il lievito, le cellule di mammiferi, piante e protozoi10,19,20,21. Protozoi parassiti come Trypanosoma e Leishmania esibiscono limitato controllo trascrizionale dell'espressione genica. Loro genomi sono organizzati in cluster di geni coregolati polycistronic che la mancanza di trascrizione promotore-regolato22. Invece, espressione genica inerente allo sviluppo è controllato principalmente al livello della proteina traduzione e stabilità del mRNA in Trypanosomatidae specie23,24. Di conseguenza, la comprensione del controllo traduzionale in assenza di regolazione trascrizionale è particolarmente importante per questi organismi. Profilatura polisomici è un potente strumento per studiare la regolazione post-trascrizionale dell'espressione genica in Leishmania25,26,27,28.
I recenti progressi nella rilevazione dei livelli di singoli mRNA dal real tempo quantitative PCR (RT-qPCR) e completo trascrittoma di sequenziamento di nuova generazione, nonché tecnologie di proteomica, offre una risoluzione e vantaggi di profilatura polisomici ad un nuovo livello. L'uso di questi metodi può essere ulteriormente esteso dall'analisi delle singole frazioni polisomici di sequenziamento di RNA profondo combinato con analisi proteomica per monitorare lo stato traduzionale delle cellule su una scala di genoma. Ciò permette l'individuazione di nuovi giocatori molecolari che regolano la traduzione sotto differenti condizioni fisiologiche e patologiche. Qui, presentiamo un polisoma universale protocollo utilizzato su tre diversi modelli di analisi: il parassita maggiore di Leishmania, cellule umane coltivate e tessuti animali. Vi presentiamo consigli sulla preparazione dei lisati cellulari da organismi differenti, ottimizzazione delle condizioni di gradiente, scelta di inibitori della RNAsi e applicazione di RT-qPCR, Western blot ed elettroforesi del RNA per analizzare le frazioni polisoma in questo studio.
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Protocol
Tutti i trattamenti degli animali e la gestione dei tessuti ottenuti nello studio sono state eseguite secondo protocolli approvati dal comitato di utilizzo presso la Texas Tech University Health Science Center secondo il National Institutes of e istituzionali Animal Care Salute benessere animale linee guida, numero di protocollo 96005. Si prega di sacrificare animali vertebrati e preparare tessuti secondo le linee guida del Comitato di uso e istituzionali Animal Care. Se in mancanza di tale comitato, consultare le linee guida sul benessere degli animali di National Institutes of Health. Adulto (> 60 giorni di età) sono stati utilizzati topi C57BL/6. Tutti gli animali e tessuti sono stati ottenuti secondo protocolli approvati dal comitato di utilizzo presso la Texas Tech University Health Sciences Center in conformità degli orientamenti di benessere degli animali del National Institutes of Health e istituzionali Animal Care. Per l'eutanasia, un singolo mouse è stato disposto in un piccolo alloggiamento, e l'aria è stato spostato gradualmente con circa il 30% anidride carbonica per anestetizzare e ridurre il disagio dell'animale. A seguito di cessazione della respirazione, abbiamo usato la dislocazione cervicale per confermare la morte dell'animale prima della raccolta di tessuti.
Attenzione: Tutti i lavori con live Leishmania e cellule umane coltivate è stato fatto in BSL-2 certificato di laboratorio di biosicurezza.
1. preparazione dei Lysates citoplasmatica da Leishmania principali , cellule umane coltivate e tessuti di topo
Nota: Ci sono molte differenze nelle preparazioni lisate i materiali di origine diversa. Altri passi tra cui preparazione gradiente di saccarosio e frazionamento polisomici sono identici e non dipendono dalla sorgente campione.
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Preparazione del lysate citoplasmico maggiore di Leishmania
- Inoculare cellule maggiore di Leishmania (FV1 ceppo) in 30 mL di 1 x M199 media29 contenente miscela al 10% siero bovino fetale (FBS) e penicillina/streptomicina (100 unità e 100 μg/mL corrispondentemente)densità di 1 x 105 cellule/mL .
Nota: Tutti i passaggi che coinvolgono le cellule maggiore di Leishmania devono essere condotta in una cappa di biosicurezza. - Posizionare le cellule nell'incubatore e farle crescere a 27 ° C, fino alla fase logaritmica (metà registro corrisponde a 5 x 106 cellule/mL). Richiede solitamente circa due giorni per crescere.
- Aggiungere cicloesimmide maggiore di Leishmania cultura ad una concentrazione finale di 100 μg/mL di arrestare i ribosomi su mRNA tradotta. Cellule di posizione indietro nell'incubatrice per 10 min a 27 ° C.
- Una volta completato il trattamento del cicloesimmide, trasferire le cellule in una provetta conica da 50 mL e li spin a 1.800 x g e a 4 ° C per 8 min. Discard surnatante.
- Lavare le cellule con 30 mL di soluzione fisiologica tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS). Centrifugare a 1.800 x g e a 4 ° C per 8 min.
- Scartare il surnatante. Risospendere le cellule in 1 mL di DPBS.
- Prendere un'aliquota di cellule e mescolare con soluzione al 3,5% di formaldeide.
- Contare le celle di un emocitometro e determinare la loro concentrazione. Trasferire il numero desiderato di cellule in provetta microfuge. Lysate preparato da 0.5x108-2 x 108 cellule/mL è sufficiente per il caricamento di gradiente di uno saccarosio.
- Gira le cellule a 1.800 x g e 4 ° C per 8 min. eliminare il supernatante.
- Risospendere il pellet cellulare sul ghiaccio in 1 mL di tampone di lisi contenente inibitori di proteasi e RNasi inibitore (20 mM HEPES-KOH, pH 7.4, 100 mM KCl, 10mm MgCl2, 2mm DTT, 1% NP-40, 1 x inibitore della proteasi cocktail (privo di EDTA), inibitore di RNAsi 200 unità/mL).
- Passare a lisato attraverso un ago di 23 gauge tre volte. Il lisato dovrebbe diventare trasparente dopo il passaggio attraverso l'ago.
- Centrifuga a 11.200 x g e a 4 ° C per 10 minuti chiarire lisato. Trasferire il chiarificato lisato di un nuovo tubo e tenerlo su ghiaccio fino al ultracentrifugazione di pendenza del saccarosio.
- Raccogliere 400-500 μL del lisato come input (per analisi successive), congelare subito in azoto liquido per analisi future della proteina o aggiungere Reagente di purificazione RNA prima del congelamento per l'analisi del RNA.
- Inoculare cellule maggiore di Leishmania (FV1 ceppo) in 30 mL di 1 x M199 media29 contenente miscela al 10% siero bovino fetale (FBS) e penicillina/streptomicina (100 unità e 100 μg/mL corrispondentemente)densità di 1 x 105 cellule/mL .
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Preparazione del lysate citoplasmatica da cellule HeLa umane coltivate
- Dividere le celle HeLa e semi in 20 mL di terreno DMEM contenente miscela al 10% FBS e penicillina/streptomicina (100 unità e 100 μg/mL corrispondentemente) con cella conteggio 2 x 105 cellule/mL in un piatto di 15 cm.
- Crescere le cellule HeLa a 37 ° C, 5% CO2 per la transfezione del DNA del plasmide di 20-24 h. eseguire secondo i protocolli del produttore.
- Propagare le cellule per 24 ore dopo la trasfezione a 37 ° C, 5% CO2.
- Aggiungere cicloesimmide coltivate cellule HeLa alla concentrazione finale di 100 μg/mL di arrestare i ribosomi su mRNA tradotta e incubare le cellule per 10 min a 37 ° C, 5% CO2. Aspirare il medio. Lavare le cellule due volte con DPBS fredda su ghiaccio.
- Aggiungere 500 μL di tampone di lisi (20 mM HEPES-KOH a pH 7.4, 100 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1mm DTT, 0,5% NP-40, inibitore della proteasi 1x cocktail (EDTA-free), 200 unità/mL di eparina di inibitore o 1 mg/mL di RNasi) alla piastra e raschiare le cellule sul ghiaccio.
- Trasferire le cellule lisate al tubo del microfuge. Regolare la concentrazione di NP-40 al 0,5% e MgCl2 a 5 mM secondo l'aumento del volume del campione.
- Passare a lisato attraverso un ago di 23 gauge 3 - 6 volte.
- Spin a 11.200 x g e a 4 ° C per 8 min a chiarire lisato. Dopo la centrifugazione, trasferire il surnatante in un nuovo tubo. Utilizzare uno spettrofotometro per valutare l'efficienza di lisi delle cellule e per determinare la quantità di campione per il caricamento sul gradiente. Aggiungere 10 μL di campione in 0,5 mL di 0,1% sodio dodecil solfato (SDS). In bianco contro 0,1% SDS. Misurare l'assorbanza a 260 nm. Valore di assorbanza previsto è di circa 15-20 unità/mL.
- Diluire tutti i campioni con tampone di lisi per lo stesso valore di assorbanza prima centrifugazione in gradiente di saccarosio. Mantenere i campioni su ghiaccio fino a centrifugazione in gradiente di saccarosio.
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Preparazione del lysate citoplasmico dal testicolo di topo
- Sezionare il testicolo di topo. Praticare una piccola incisione nella tunica albuginea e raccogliere i tubuli seminiferi dei testicoli e trasferirli in una provetta conica da 15 mL contenente 5 mL di DPBS completati con 0,1 mM phenylmethylsulfonyl fluoruro (PMSF).
- Mescolare energicamente il tessuto capovolgendo più volte. Consentire il tessuto a stabilirsi a gravità unità sul ghiaccio per 5 min.
- Rimuovere e gettare il tampone nuvoloso contenente cellule connettivali e frammenti di tessuto. Ripetere la procedura 2-3 volte. La pallina bianca restante è arricchita per tubuli seminiferi e le cellule germinali.
- Trasferire il pellet di tubulo seminifero ad un tubo del microcentrifuge 2ml e spin a 500 x g per 1 min. scartare il surnatante.
- Aggiungere 500 µ l di tampone di lisi (20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 100 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1mm DTT, 0,5% NP-40, inibitore della proteasi 1x cocktail (privo di EDTA), eparina di 1 mg/mL o 200 unità/mL di inibitore di RNasi) ai tubuli. Utilizzare una pipetta per triturare il tessuto.
- Trasferire la sospensione ad un piccolo (0,5-1,0 mL) lisata omogeneizzatore. Distruggere il tessuto con sette-otto colpi il pestello di vetro.
- Trasferire il lisato una microcentrifuga da 1,5 mL.
- Centrifugare il campione a 12.000 x g e a 4 ° C per 8 min cancellare il lisato. Trasferire il surnatante un nuovo tubo e conservare il ghiaccio fino al caricamento su gradiente di saccarosio.
- Raccogliere 50 μL del lisato come esempio di input, congelarlo subito a-80 ° C per l'analisi della proteina di futuro; o aggiungere il reagente di purificazione RNA prima del congelamento per l'analisi del RNA.
2. ultracentrifugazione e preparazione di gradiente di saccarosio
- Preparare due soluzioni gradiente di saccarosio (20 mM HEPES-KOH, pH 7.4, 100 mM KCl, 10mm MgCl2, 1 millimetro DTT, inibitore di proteasi x 1 cocktail), contenente saccarosio di 10% o 50% di saccarosio. (Tris-HCl, pH 7.4, può essere utilizzato invece di HEPES). Aggiungere 200 unità/mL eparina inibitore o 1 mg/mL di RNAsi secondo il disegno sperimentale. Inserire un tubo ultracentrifuga per rotore SW 41 il blocco segnapunti e tracciare la linea lungo il livello superiore del blocco. Il tubo di trasferimento in un rack stabile.
- Prendere una siringa da 10 mL con dispositivo di stratificazione attaccato e riempire la siringa con la soluzione di 10% di saccarosio (preparata come sopra). Delicatamente di rilasciarlo nella parte inferiore del tubo ultracentrifuga finché raggiunge il marchio sul tubo.
- Riempire un'altra siringa con soluzione di saccarosio al 50% e inserire delicatamente il suo dispositivo di stratificazione attraverso lo strato di saccarosio di 10% per il fondo della provetta. Rilasciare con soluzione di saccarosio a partire dalla parte inferiore fino a raggiungere il marchio sul tubo. Sigillare il tubo con il tappo fornito.
- Per preparare il gradiente di saccarosio, ruotare il dispositivo di gradiente maker ON. La piastra usando l'alto o verso il basso i pulsanti di livello e premere DONE. Livellamento è importante per la linearità della sfumatura.
- Dopo il livellamento della piastra premere GRAD per aprire il menu sfumato. Vai all'elenco gradiente dal menu e selezionare il rotore SW 41 Ti. Scegli il gradiente di saccarosio desiderata dall'elenco del menu utilizzando i pulsanti su e giù . Premere USA.
- Impiattare il supporto tubo gradiente gradiente maker. Trasferire il tubo nel supporto. Fino a 6 gradienti possono essere preparati allo stesso tempo. Premere Esegui. Il creatore di sfumato consente di ruotare i tubi alla velocità programmata e angoli formando una sfumatura lineare. Ci vorranno solo pochi minuti per preparare la sfumatura.
- Quando il processo è completato, è possibile posizionare i tubi in un rack. Togliere i tappi. Rimuovere lo stesso volume come il volume del campione dalla parte superiore dei tubi ultracentrifuga.
- Accuratamente caricare 400-500 μL di lisato contenente 15-20 unità di260 di polisomi sulla parte superiore. Posizionare i tubi nei secchi rotore e loro equilibrio.
- Centrifuga a 260.000 x g e a 4 ° C per 2 h con rotore SW 41.
3. polisoma frazionamento e raccolta del campione
Nota: Mentre lisati preparazioni hanno alcune differenze a seconda dell'origine, i protocolli di frazionamento di preparazione e polisoma gradienti sono lo stesso per tutti i tipi di lisati.
- Dopo aver completato l'ultracentrifugazione, mettere i secchi di rotore con i tubi sul ghiaccio. Girare frazione collezionista e gradienti frazionatore ON. Fare clic su scansione dal menu frazionatore. Mettere un rack con 24 tubi di raccolta nella bacinella di raccolta di frazione.
- Riempire un serbatoio di risciacquo sul lato il frazionatore con acqua deionizzata. Premere il tasto di risciacquo per 10 s a sciacquare la pompa il frazionatore. Collegare un adattatore di risciacquo con la siringa riempita con acqua per il pistone per la taratura.
- Aprire il software frazionatore sul computer. Premere calibrare. Utilizzare le impostazioni di DEFAULT e premere OK. Essere pronti a iniettare acqua dalla siringa.
- Premere OK per eseguire la calibrazione. Iniziare immediatamente l'iniezione dell'acqua per il prossimo 5 s. Durante questo tempo, acqua fluirà attraverso la cella di flusso rivelatore UV e lo strumento sarà calibrato. ZERO calibrazione completata apparirà il segno. Lo strumento è pronto per il frazionamento.
- Rimuovere l'adattatore di risciacquo con la siringa. Fissare una punta al pistone del frazionatore.
- Aprire la chiave di aria in ottone aria valvola e premere per 10 s a tubo asciutto e cella di flusso. Chiudere la valvola dell'aria.
- Rimuovere il tubo gradiente dal secchio rotore delicatamente e inserirlo nel rack. Applicare il cappuccio del supporto tubo alla parte superiore del tubo e attentamente spostare il tubo nel supporto del tubo e bloccarlo in posizione.
- Collocare il supporto sotto il pistone del frazionatore. Spesso, bande polisomici possono essere visto ad occhio. Introdurre le impostazioni desiderate per numeri di frazione e volume (24 frazioni a 500 μL/frazione sono di solito sufficienti). Nome del file in modo appropriato. Premere OKe poi Andare al grafico . Nella finestra successiva, premere Avvia scansione. Appariranno le impostazioni, premere OK. Il collettore si sposterà dalla grondaia per la prima frazione e il pistone si sposterà nel tubo. Quando il pistone raggiunge l'inizio della sfumatura sarà lento per la velocità selezionata e le frazioni verranno raccolti. Una volta completato, il pistone si muove fuori dal tubo gradiente.
- Aprire la chiave di aria in ottone aria valvola e premere il frazionatore per recuperare l'ultima frazione.
- Spostare i tubi dal rack sul ghiaccio.
- Aggiungere 2 volumi di reagente di purificazione di RNA da ogni frazione e flash congelato in azoto liquido fino alla purificazione del RNA. In alternativa, se la proteina deve essere analizzato, è possibile aggiungere acido tricloroacetico alla concentrazione finale di 10% di loro concentrarsi per Western blotting (Vedi sezione 8).
4. preparazione di RNA sintetico In Vitro per la normalizzazione dei mRNAs livelli durante l'analisi dei dati RT-qPCR
Nota: L'e. coli OmpA mRNA viene utilizzato in questo protocollo per la normalizzazione. Eventuali altri RNA che non dispone di ampia identità con il mRNA dell'organismo studiato (mammiferi o Leishmania) può essere utilizzato.
- Preparare il frammento di DNA OmpA contenente la sequenza del promotore SP6 da una reazione di PCR standard da un plasmide contenente OmpA gene30.
- Preparare 100 µ l della miscela: 80 mM HEPES-KOH, pH 7.5, 16 mM MgCl2, 2mm spermidina, 10 mM DTT, 3mm ATP, CTP, di 3 mM 3 mM UTP, 3mm GTP, 0,5 U/μL RNasi inibitore, 1 μg di OmpA PCR del DNA, 3 μL SP6 RNA polimerasi , 0,005 U/μL pirofosfatasi.
- Incubare a 40 ° C per 2 h.
- Purificare il RNA di un kit di purificazione di RNA.
- Misurare la concentrazione di spettrofotometro ed esaminare mediante elettroforesi su gel di agarosio.
5. RNA isolamento da frazioni gradienti e preparazione del cDNA
Nota: Procedere direttamente con questo protocollo per la purificazione di RNA se un inibitore di RNAsi è stato usato come inibitore della ribonucleasi. Tuttavia, quando viene utilizzato come un inibitore della ribonucleasi, eparina inibiscono la trascrittasi inversa utilizzata nella preparazione di cDNA. Pertanto, sarà necessari ulteriori purificazione di RNA se l'eparina è stata utilizzata nel buffer di lisi e sfumatura. Vedere la sezione 6 per preparare il RNA per la sintesi di cDNA se l'eparina è stata usata.
- Scongelare i campioni contenenti il reagente di purificazione di RNA, aggiungere 20 ng di RNA sintetico come controllo interno per la normalizzazione di RT-qPCR risultati. Procedere con la preparazione di RNA secondo il protocollo del produttore tranne una modifica. Aggiungere 1 µ l di precipitazione di isopropanolo preventiva di RNA grado glicogeno (20 µ g). Sciogliere il pellet di RNA in 20-25 µ l di acqua RNAsi-libera.
Nota: Glicogeno funge da un vettore e aiuta a evitare perdite e visualizzare la pallina del RNA durante la purificazione. OmpA mRNA viene utilizzato per ulteriore normalizzazione nelle reazioni di RT-qPCR. - Misurare la concentrazione di RNA mediante spettrofotometro per garantire rendimento adeguato. Combinare volumi uguali di frazioni di RNA contenenti 40S, 60S e monosomi come prepolysomes. Le frazioni contenenti 2-4 ribosomi combinano come luce polisomi e frazioni con 5-8 ribosomi combinano come pesante polisomi.
- Utilizzare 5-10 µ l di RNA da frazioni combinate per preparare cDNA utilizzando un kit e seguendo le raccomandazioni del produttore.
- Aggiungere 80 µ l di acqua gratuita nucleasi a 20 µ l di cDNA. Congelare i campioni di cDNA a-20 ° C.
6. RNA purificazione dalla contaminazione di eparina
Nota: L'eparina inibisce l'elaborazione di enzimi come la trascrittasi inversa dell'acido nucleico. Pertanto, utilizzare questo protocollo di purificazione supplementare quando l'eparina è usata nel buffer di lisi e/o della sfumatura.
- Aggiungere LiCl ad una concentrazione finale di 1 M per i campioni di RNA purificati.
- Mescolare i campioni e incubare in ghiaccio per 1 h.
- Girare i campioni a 16.000 x g e a 4 ° C per 15 min.
- Eliminare il surnatante più completo possibile, utilizzando una pipetta.
- Asciugare il pellet per circa 5 min.
- Risospendere il pellet nel volume iniziale di acqua RNAsi-libera.
- Eseguire la misurazione spettrofotometrica a 260 nm per determinare la concentrazione del RNA. Di solito, la perdita del campione è minima.
7. RT-qPCR e analisi dei dati di distribuzione di mRNA
- Unire 10,2 μL di acqua, 20 μL di SYBR Green, 4,8 µ l di primer specifici del gene (set di 2,5 μM ogni), 5 μL di cDNA, mescolare bene e caricare 10 μL per pozzetto in triplici copie in piastra 384 pozzetti.
- Coprite il piatto con pellicola adesiva e centrifugare piastra a 1.800 x g per 5 min.
- Utilizzando uno strumento di Real-Time PCR impostare qPCR reazione alle condizioni indicati nella tabella 1.
- Utilizzando il ciclo soglia (CT) i valori e la comparativa CT (ΔΔCT) metodo31 calcolare la percentuale (%) di distribuzione di mRNA in prepolysomes, luce e polisomi pesante come descritto32 con una modifica. Utilizzare RNA sintetico (OmpA qui) per la normalizzazione dei dati nell'analisi dei dati RT-qPCR. il RNA sintetico fornisce un controllo di normalizzazione che consente di calcolare i livelli relativi di mRNA e confrontarle in diverse frazioni di una sfumatura.
8. analisi delle proteine in frazioni polisomici mediante Western Blotting
- Da uno stock di 100% (p/v), aggiungere acido tricloroacetico (TCA) le frazioni selezionate (500 μL) ad una concentrazione finale di 10%, tenere il ghiaccio per almeno 15 min, centrifuga in una microfuge per 5 min, eliminare il surnatante, lavare due volte con acetone ghiacciata e scioglierli in 25 μL di S Buffer di caricamento del campione di DS-pagina per elettroforesi.
- Caricare su SDS-PAGE e condurre l'elettroforesi standard con trasferimento seguente alla membrana di PVDF. Procedere alla Western blotting33.
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Representative Results
In questo studio, descriviamo l'applicazione della tecnica di profilatura polisomici a tre diverse fonti: parassita maggiore di Leishmania, cellule umane coltivate e testicolo di topo. Leishmania cellule crescono liberamente in mezzi liquidi in sospensione, cellule umane coltivate crescono nello strato monomolecolare del aderente su piastre e testicolo del mouse rappresenta un campione di tessuto. Il metodo può essere facilmente regolato a altri tipi di cellule liberamente coltivati in sospensione, diversi tipi di tessuti, o da un altro organismo e diversi tipi di cellule coltivate. L'approccio è costituito da quattro fasi principali: preparazione del lysate, una preparazione di gradiente di saccarosio e ultracentrifugazione passo, frazionamento polisoma e raccolta del campione seguita da analisi delle frazioni. Cellule provenienti da fonti diverse sono raccolti, lavate e lisate nel tampone di lisi di passaggio attraverso un ago o lisata omogeneizzatore. Centrifugazione viene utilizzato per rimuovere i detriti cellulari, chiarire il lisato. Lo schema di frazionamento gradiente è riportato in Figura 1A. Un gradiente di saccarosio continuo è formato dalla miscelazione delle soluzioni di saccarosio di 10% e il 50% in un creatore del gradiente. Il lisato viene caricato sulla parte superiore della sfumatura. Ultracentrifugazione separa mRNA associato a un diverso numero di ribosomi che viene monitorato da un rivelatore UV durante il frazionamento, formando uno spettro di assorbanza distinti. Raccolta differenziata vengono utilizzati per l'analisi di RNA e proteine (Figura 1B). RNA possa essere analizzato mediante elettroforesi seguita mediante Northern blot o utilizzato per la produzione di cDNA seguita da una reazione di RT-qPCR per analizzare l'associazione di singoli mRNA con polisomi. Sequenziamento di nuova generazione può essere utilizzato per analizzare lo stato traslazionale dei mRNAs su un genoma scala7. Per l'analisi della proteina di frazioni polisomici, proteine sono precipitate con acido tricloroacetico per concentrarli. Proteine vengono poi analizzate mediante Western blotting o dalla spettroscopia di massa a livello del proteoma.
Un tipico profilo polisomici generato dalla maggiore di Leishmania attivamente crescente cultura è mostrato nella Figura 2A. Il grafico di assorbanza di frazionamento ha una forma distinta con tipici picchi per ribosoma unità secondarie (anni ' 40 e ' 60), singoli ribosomi (anni ' 80 o monosomi) e polisomi.
RT-PCR quantitativa (RT-qPCR) è stata impiegata per rilevare associazione di singoli Leishmania mRNA con ribosomi e polisomi. Il comparativo metodo31 CT (ΔΔCT) è un approccio semplice e appropriato per studiare i livelli relativi di mRNA nelle cellule. Questo metodo richiede un controllo interno (un mRNA stabile, che non cambia espressione durante trattamenti o condizioni dell'esperimento) per i calcoli. Tuttavia, non c'è nessun controllo interno nelle frazioni polisomici, perché i livelli di mRNA o RNA ribosomiale varierà in frazioni, a seconda della loro associazione con i ribosomi, polisomi, ecc. Per risolvere il problema di un controllo interno, abbiamo usato sintetica batterica OmpA mRNA per la normalizzazione dei livelli di mRNA individuali relativi di Leishmania nelle frazioni. OmpA mRNA è stato sintetizzato in vitro e aggiunto in quantità uguali per ogni frazione prima Estrazioni RNA. Aggiunta del RNA sintetico è importante perché rende i calcoli di RT-qPCR dati più precisi, che serve come controllo interno per i calcoli di metodo comparativo di CT (ΔΔCT).
Aliquote delle frazioni gradienti sono state mescolate in tre gruppi: prepolysomes (subunità e monosomi), luce polisomi (composto da 2-4 ribosomi) e pesante polisomi (composto da 5-8 ribosomi). RT-qPCR è stato effettuato su RNA dalle frazioni combinate per analizzare la distribuzione di mRNA tra queste frazioni combinate (Figura 2B). 18s che rRNA è stato usato come controllo. I suoi livelli relativi determinati dalla RT-qPCR hanno correlato bene con la distribuzione stimata delle piccole subunità ribosomali (subunità gratis e come parte di monosomi e polisomi) sullo spettro. RT-qPCR l'analisi ha rivelato che diversi mRNAs testati hanno un diverso grado di impegno nella traduzione in fase logaritmica di crescita di Leishmania . Tubulina mRNA è associato preferenzialmente pesante polisomi, suggerendo una traduzione efficiente. Al contrario, taupe mRNA è trovato principalmente con prepolysomes e luce polisomi sostiene traduzione meno attivo rispetto a tubulina mRNA.
Espressione di proteine ricombinanti in cellule coltivate è un importante approccio sperimentale in diverse categorie di studi. Qui, presentiamo un esempio di profiling polisomici di mRNA della proteina ricombinante in origine un altro esempio, cellule umane coltivate. Cellule HeLa transfected transitoriamente con plasmidi che esprimono ricombinante fibrosi cistica conduttanza transmembrana regolatore (CFTR)34 o proteina di malattia di Norrie (NDP). Gli spettri di assorbanza di frazionamento polisoma da queste due culture indipendenti sono stati molto contenuti e simili picchi distinti corrispondenti monosomi (anni ' 40 e ' 60), di subunità ribosomali (anni 80) e polisomi (Figura 3A). Somiglianza negli spettri da questi esperimenti illustra riproducibilità di frazionamento gradiente. Negli studi di Leishmania , la distribuzione degli mRNA è stata determinata dalla RT-qPCR nelle frazioni che rappresenta prepolysomes, polisomi leggeri e pesanti polisomi (Figura 3B). Rilevamento di subunità ribosomiale 18S RNA correlato con la loro distribuzione stimato negli spettri. NDP mRNAs per lo più sono stati associati con le frazioni polisomici leggeri e pesanti, mentre CFTR mRNA sono stati trovati principalmente nelle frazioni di prepolysome, suggerendo che il NDP è tradotto in modo più efficiente. Mentre NDP è una proteina relativamente piccola, CFTR è una proteina molto grande (1480 residui dell'amminoacido) costituita da diversi domini, che si piegano in modo indipendente durante traduzione35. Impegni più bassi del mRNA CFTR con polisomi possono riflettere la traduzione più lento che è necessaria per la piegatura cotranslational dei suoi domini distinti.
Frazioni di polisoma possono essere anche utilizzate per il rilevamento delle proteine. La rilevazione delle proteine nelle frazioni di gradiente è stata condotta sull'esempio delle proteine ribosomiali in cellule HeLa (Figura 4). Proteine sono state concentrate dalla precipitazione con 10% TCA dalle frazioni e il Western blot è stato utilizzato per rilevare la piccola unità secondaria ribosomal della proteina RPS6 e la grande unità secondaria ribosomal proteina RPL11 (Figura 4, pannello superiore). La loro distribuzione ha correlato bene con i picchi distinti nello spettro di assorbanza. Questi esperimenti dimostrano chiaramente che le frazioni di polisoma possono essere utilizzate per analizzare le proteine in loro.
Sono state usate molte pendenze del saccarosio diverse concentrazioni (per esempio, 7-47%36, 5-50%7, 7-50%6 , 10-50%37, 15-50%8e altri) per il frazionamento di polisomi. Qui, abbiamo confrontato due gradienti 10-50% e 17-51% (Figura 5). Anche se, 17-51% prodotto risultati accettabili, la separazione del gradiente di 10-50% nel complessiva era meglio.
È ben documentato che gli agenti chelanti, come l'EDTA, interrompono i ribosomi e polisomi8,9. Come indicato in Figura 6, EDTA trattamento dei HeLa lisato prima caricamento sulla pendenza conduce alla scomparsa delle cime, corrispondenti a monosomi e polisomi, e picchi di aumento significativo le subunità del ribosoma. Questo esperimento ha servito da un controllo e ha dimostrato che i picchi osservati senza trattamento di EDTA sono polisomi ed effettivamente ribosomal monosomi.
Figura 7 Mostra i risultati del frazionamento polisoma dai testicoli del topo. Lo spettro di assorbanza ha somiglianze con quelli da Leishmania e le cellule HeLa: picchi distinti di subunità ribosomali, monosomi e polisomi. La loro forma e distribuzione producono un aspetto della firma, che lo rendono facile per poter identificare i loro spettri polisomici differenti. RNA totale sono stati purificati da frazioni e RNAs dalle frazioni selezionate sono stati analizzati mediante elettroforesi in gel di agarosio (Figura 7, pannello superiore). L'elettroforesi Mostra tipica distribuzione di RNA ribosomiale 18S e 28S. Loro forte bande indicano integrità dei campioni. Il gel può essere usato per il rilevamento di singoli mRNA per un seguente Northern blot o può essere utilizzato per valutare la qualità dei campioni prima di ulteriori esperimenti sul RNA o proteine analisi - il RNA ribosomiale (rRNA) diffusi bande indicano degradazione di RNA nei campioni.
Durante i nostri studi, abbiamo usato inibitore di RNasi ed eparina come inibitori della RNAsi ai gradienti lisati e saccarosio. Mentre ciascuno di essi ha fornito risultati soddisfacenti, l'uso di RNAsi inibitore era preferibile per l'analisi del RNA perché non inibisce il cDNA e RT-qPCR reazioni. Così, non ha richiesto ulteriori fasi di purificazione di RNA. Tuttavia, se i ricercatori si decidono di utilizzare eparina durante la preparazione del polisoma, essere consapevoli che l'eparina inibisce downstream applicazioni come RT-qPCR e ulteriore passaggio di purificazione di RNA è necessaria (Vedi protocollo sezione 6).
Figura 1 . Profilatura di polisoma. (A) schema di preparazione gradienti, profilo di frazionamento e assorbanza polisoma. (B) schema di analisi di frazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 . Analisi del profilo polisoma di maggiore di Leishmania della coltura in fase logaritmica di crescita. (A) citoplasmatici lisato è stato frazionato in gradiente di saccarosio di 10-50%. (B) distribuzione relativa di RNA 18S, tubulina e taupe mRNA (%) in prepolysomes, leggeri e pesanti polisomi delle cellule di registro analizzate mediante RT-qPCR. Le frazioni contenenti 40S, 60S e monosomi sono stati combinati come prepolysomes. Le frazioni con i ribosomi 2-4 sono state combinate come luce polisomi, mentre le frazioni con i ribosomi 5-8 formano polisomi pesante. Sintetico e. coli OmpA mRNA aggiunto al precedente estrazione di RNA frazioni, servito da un controllo di normalizzazione in RT-qPCR. Comparativa CT (ΔΔCT)31 metodo è stato utilizzato per il calcolo dei livelli di mRNA. Barre di errore rappresentano gli errori standard. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 . Polisoma frazionamento e analisi dell'associazione ricombinante di mRNA CFTR e NDP con ribosomi in cellule HeLa transfected con il plasmide DNAs. (A) profilo polisomici in cellule HeLa transfected con plasmidi CFTR e NDP. gradiente di saccarosio di 10% - 50% è stato applicato per realizzare la separazione di polisomi. Sono indicate le vette per piccole (40S) e subunità grande (60 anni), come pure monosome (80 anni). Le frazioni sono state combinate come indicato sul pannello A e utilizzate per ulteriori analisi. (B) distribuzione dei mRNAs di CFTR e NDP in diverse frazioni. Rilevamento di 18S di RT-qPCR era utilizzato come controllo per frazionamento polisoma. I livelli del RNA sono stati valutati dall'analisi di RT-qPCR. I dati sono stati normalizzati utilizzando mRNA sintetico. Comparativa CT (ΔΔCT)31 metodo è stato utilizzato per il calcolo dei livelli di mRNA. Barre di errore rappresentano gli errori standard. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 . Rilevamento delle proteine ribosomiali in frazioni polisomici HeLa. Lysate delle cellule HeLa è stato sottoposto da centrifugazione in gradiente di saccarosio 10% - 50%. Proteine in frazioni selezionate erano precipitate con TCA e analizzati mediante elettroforesi in 12% SDS-PAGE con i seguenti Western blotting usando mouse RPS6 monoclonale e policlonale anticorpo RPL11 coniglio come gli anticorpi primari e Peroxidase-Conjugated capra anti-topo o anti-coniglio anticorpi secondari. Visualizzazione di segnali è stato fatto da substrato chemiluminescente SuperSignal West Pico PLUS. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 . Confronto di HeLa polisomici profilatura in 10% - 50% (nero) o pendenze del saccarosio 17% - 51% (grigio). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6 . Effetto del trattamento di EDTA sul profilo polisomici in cellule HeLa. Lysate delle cellule HeLa è stata trattata con 10 mM EDTA in ghiaccio per 10 minuti immediatamente prima della centrifugazione in gradiente di saccarosio. MgCl2 è stato sostituito da 5 mM EDTA nelle soluzioni di gradiente di saccarosio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7 . Polisomici profilo dal tessuto di testicolo di topo lisato. Frazioni sono stati sottoposti a estrazione di RNA con un reagente di purificazione di RNA e analizzate mediante elettroforesi in gel di agarosio all'1%. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Fase | Passo | Condizione |
| Tenere premuto | Passo 1 | Aumentare la temperatura da 25 a 50° C con 1,6 ° C/s |
| Incubare a 50° C per 02:00 min | ||
| Passo 2 | Aumentare la temperatura da 50 a 95° C con 1,6 ° C/s | |
| Incubare a 95° C per 10:00 min | ||
| PCR | Passo 1 | Incubare a + 95° C 00:15 min |
| Passo 2 | Diminuire la temperatura da 95 a 60° C con 1,6 ° C / | |
| Incubare a 60° C per 01:00 min | ||
| Numero di cicli 40 | ||
| Sciogliere la curva | Step1 | Aumentare la temperatura da 60 a 95° C con 1,6 ° C/s |
| Passo 2 | Diminuire la temperatura da 95 a 60° C con 1,6 ° C/s | |
| Incubare a 60° C per 01:00 min | ||
| Passo 3 (dissociazione) | Aumentare la temperatura da 60 a 95° C con 0,05 ° C/s | |
| Incubare a + 95° C 00:15 min | ||
Tabella 1. Condizioni per RT-qPCR
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Discussion
Frazionamento di polisoma di gradiente di saccarosio combinato con RNA e proteina analisi delle frazioni è un metodo potente per analizzare stato traduzionale di singoli mRNA o l'intero translatome e anche ruoli di fattori proteici regolazione traduzionale macchinari durante il normale stato fisiologico o malattia. Profilatura polisomici è una tecnica particolarmente adatta per studiare la regolazione traduzionale in organismi come trypanosomatids tra cui Leishmania dove controllo trascrizionale è praticamente assente e regolazione dell'espressione genica si verifica principalmente durante la traduzione.
Qui, descriviamo un protocollo di frazionamento polisoma utilizzato su tre modelli: parassiti, cellule umane coltivate e tessuti di topo di Leishmania . Il passo di frazionamento polisoma è essenzialmente lo stesso per diversi organismi utilizzati in questo studio; Tuttavia, la preparazione del lysate presenta alcune differenze. Leishmania cellule crescono in coltura liquida e raccolti mediante centrifugazione e cellule sono contati prima della lisi per garantire uguale sul gradiente di carico. Cellule umane possono essere lavate e lisate direttamente sulla piastra. Il caricamento uguale è controllato dalla densità ottica. Tessuti di mouse richiedono un omogeneizzatore lisata per lisi efficiente mentre nel caso di Leishmania e cellule umane, è sufficiente farli passare attraverso l'ago 23 gauge.
Tutti i reattivi utilizzati devono essere RNAsi e proteasi gratis. Abbiamo paragonato l'eparina e inibitore della RNAsi come inibitori dell'attività di RNAsi nei lisati citoplasmici. Abbiamo trovato che entrambi i reagenti possono bloccare efficacemente RNasi. Tuttavia, l'eparina influisce sulle applicazioni a valle come la preparazione di cDNA e RT-qPCR. Di conseguenza, preparazione di RNA richiede un passaggio di purificazione supplementare quando l'eparina è usata. A nostro parere, l'inibitore di RNAsi è la scelta più conveniente e può essere utilizzato efficacemente in polisoma protocollo di profilatura.
Profilatura polisomici è laboriosa, che è una limitazione importante del metodo. Fino a sei sfumature possono essere preparate allo stesso tempo. Il gradiente frazionatore genera 144 frazioni che devono essere elaborati in un breve periodo di tempo. Analisi delle singole frazioni possono essere troppo lunga e costosa. Pertanto, combinazione di singole frazioni in pre-polisomi, leggeri e pesanti polisomi fornisce un modo veloce e meno laborioso per stimare l'attività traduzionale di singoli mRNA. I nostri risultati di RT-qPCR le frazioni combinato ci ha permesso di identificare le differenze di traducibilità dei mRNAs differenti sia in cellule HeLa (figure 2, 3) e di Leishmania . Tuttavia, se è necessaria una risoluzione, analisi delle singole frazioni possono essere eseguita.
Ribosoma profiling è un altro metodo per studiare lo stato traslazionale del mRNA e si basa sulla misurazione della produzione di proteine tramite sequenziamento di frammenti di mRNA protetto dal ribosoma38. Questa tecnologia fornisce informazioni quantitative associando i sequenze di mRNA con specifiche frazioni polisomici tradotte in un campione e può fornire informazioni precise sullo stato traduzionale degli mRNA a risoluzione di codone in confronto con polisoma tecnologia di profilatura. Tuttavia, polisoma profiling può essere utilizzato per l'analisi di RNA e di proteine, fornendo così informazioni aggiuntive sul proteoma di polisomi e identificare i fattori che contribuiscono alla regolazione della traduzione.
Di conseguenza, profilatura polisomici è una tecnica versatile che può essere utilizzata per analizzare lo stato traduzionale di singoli mRNA, esaminare proteine associate al ribosoma e regolazione traduzionale negli organismi di modello diverso sotto diversi sperimentali di studio condizioni.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano Ching Lee per aiuto con la registrazione audio. La ricerca è stata sostenuta dai fondi di Start-up da Texas Tech University Health Sciences Center e per il centro di eccellenza per neuroscienze traslazionali e Therapeutics (CTNT) concede PN-CTNT 2017-05 AKHRJDHW a A.L.K.; in parte da grant di NIH R01AI099380 K.Z. James C. Huffman e Kristen R. Baca erano studiosi CISER (centro per l'integrazione di staminali formazione & ricerca) e sono stati sostenuti dal programma.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments: | |||
| Gradient master | Biocomp Instruments Inc. | 108 | |
| Piston Gradient Fractionator | Biocomp Instruments Inc. | 152 | |
| Fraction collector | Gilson, Inc. | FC203B | |
| NanoDrop One | Thermo Scientific | NanoDrop One | |
| Nikon inverted microscope | Nikon | ECLIPSE Ts2-FL/Ts2 | |
| 2720 Thermal Cycler | Applied Biosystems by Life Technologies | 4359659 | |
| CO2 incubator | Panasonic Healthcare Co. | MCO-170A1CUV | |
| HERATHERM incubator | Thermo Scientific | 51028063 | |
| Biological Safety Cabinet, class II, type A2 | NuAire Inc. | NU-543-400 | |
| Revco freezer | Revco Technologies | ULT1386-5-D35 | |
| Beckman L8-M Ultracentifuge | Beckman Coulter | L8M-70 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Ultracentrifuge Rotor SW41 | Beckman Coulter | 331362 | |
| Swing-bucket rotor | Eppendorf | A-4-62 | |
| Fixed angle rotor | Eppendorf | F-45-30-11 | |
| Quant Studio 12K Flex Real-Time PCR machine 285880228 | Applied Biosystems by life technologies | 4470661 | |
| TC20 Automated cell counter | Bio-Rad | 145-0102 | |
| Hemacytometer | Hausser Scientific | 02-671-51B | |
| Software | |||
| Triax software | Biocomp Instruments Inc. | ||
| Materials: | |||
| Counting slides, dual chamber for cell counter | Bio-Rad | 145-0011 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Open-top polyclear centrifuge tubes, (14 mm x 89 mm) | Seton Scientific | 7030 | |
| Syringe, 5 mL | BD | 309646 | |
| BD Syringe 3 mL23 Gauge 1 Inch Needle | BD | 10020439 | |
| Nunclon Delta Surface plate, 14 cm | Thermo Scientific | 168381 | |
| Nunclon Delta Surface plate, 9 cm | Thermo Scientific | 172931 | |
| Nalgene rapid-flow 90mm filter unit, 500 mL, 0.2 aPES | Thermo Scientific | 569-0020 | |
| BioLite 75 cm3 flasks | Thermo Scientific | 130193 | |
| Nunc 50 mL conical centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339653 | |
| Chemicals: | |||
| Trizol LS | Ambion by Life Technologies | 10296028 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| Trizma base | Sigma | T1378-5KG | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium-high glucose (DMEM) | Sigma | D6429-500ML | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F0926-50ML | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | Sigma | P0781-100ML | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) | Sigma | D8537-500ML | |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2x6H2O) | Acros Organics | AC413415000 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma | P9541-500G | |
| Nonidet P 40 (NP-40) | Fluka (Sigma-Aldrich) | 74385 | |
| Recombinant Rnasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2511 | |
| Heparin sodium salt | Sigma | H3993-1MU | |
| cOmplete Mini EDTA-free protease inhibitors | Roche Diagnostics | 11836170001 | |
| Glycogen | Thermo Scientific | R0551 | |
| Water | Sigma | W4502-1L | |
| Cycloheximide | Sigma | C7698-1G | |
| Chloroform | Fisher Scientific | 194002 | |
| Dithiotreitol (DTT) | Fisher Scientific | BP172-5 | |
| Ethidium Bromide | Fisher Scientific | BP-1302-10 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium dehydrate (EDTA) | Fisher Scientific | S316-212 | |
| Optimem | Life Technologies | 22600050 | |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma | P8833-100MG | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3KG | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | T4049-100ML | |
| Hgh Capacity cDNA Reverse Transcriptase Kit | Applied Biosystems by life technologies | 4368814 | |
| Power SYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystems by life technologies | 4367659 | |
| HCl | Fisher Scientific | A144SI-212 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP26324 | |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Sigma | 221473-500G | |
| Anti-RPL11 antibody | Abcam | ab79352 | |
| Ribosomal protein S6 (C-8) antibody | Santa Cruz Biotechnology Inc. | sc-74459 | |
| 1xM199 | Sigma | M0393-10X1L | |
| Lithium cloride | Sigma | L-9650 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128-500 | |
| Gel Loading Buffer II | Thermo Scientific | AM8546G | |
| UltraPure Agarose | Thermo Scientific | 16500-100 | |
| Trichloracetic acid (TCA) | Fisher Scientific | A322-100 | |
| SuperSignal West Pico PLUS chemiluminescent substrate | Thermo Scientific | 34580 | |
| Formaldehyde | Fisher Scientific | BP531-500 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma | L5750-1KG | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | P7626-5G | |
| RNeasy Mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sigma | A1852-1VL | |
| Cytosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate (CTP) | Sigma | C1506-250MG | |
| Uridine 5'-triphosphate trisodium salt hydrate (UTP) | Sigma | U6625-100MG | |
| Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate (GTP) | Sigma | G8877-250MG | |
| SP6 RNA Polymerase | NEB | M0207S | |
| Pyrophoshatase | Sigma | I1643-500UN | |
| Spermidine | Sigma | S0266-1G |
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