Summary
小鼠急性心肌梗死诱发左心室 (LV) 功能的急性但不完全特征性改变。lv 导管在冠状动脉闭塞小鼠中的应用是一种实时评价 lv 功能的新方法。
Abstract
急性心肌梗死可导致急性心力衰竭和心源性休克。血流动力学的评估对于评估任何针对急性左心室 (LV) 功能障碍的潜在治疗方法都是至关重要的。目前的成像方式 (例如, 超声心动图和磁共振成像) 有几个局限性, 因为 LV 压力的数据不能直接测量。lv 导管在冠状动脉闭塞小鼠中的应用, 可作为实时评价 lv 功能的一种新方法。
在手术开始时, 小鼠被麻醉后气管插管。对于 LV 插管, 右颈动脉通过中颈部切口暴露。导管被引入并放置在 LV 腔内。左开胸术进行, 左主干冠状动脉 (LCA) 结扎。为诱导再灌注, 缝线在45分钟后释放, 在任何时候都记录了压力容积数据。
结扎的 LCA 导致 LV 收缩功能下降, 这证明了30% 减少中风体积, LV 弹射分数 (EF) 和心脏输出。最大 dp/dt 作为一个参数的 LV 收缩力也显著降低, 舒张功能严重受损 (最小 dP/dt-40%)。再灌注在20分钟期间没有导致 LV 作用的完全恢复。
实时压力容积分析作为监测急性心肌梗死小鼠心功能的有效方法。保持稳定的麻醉和规范化的手术方法对确保有效的结果至关重要。急性心肌梗死的早期阶段对发病率和死亡率有重要意义, 该方法可为心肌新策略的临床前评价提供有益的借鉴。
Introduction
心血管疾病是西方文明中最常见的死亡原因1。急性心肌梗死是一个关键事件, 这是与高急性和慢性死亡率2。即使通过急诊经皮冠状动脉介入术 (PCI) 实现血管重建, 死亡率仍然很高, 特别是在48小时后, 急性心肌梗塞患者出现症状后3。急性左心室功能降低引起的心源性休克是3例住院死亡率的主要原因。这种早期的 LV 功能降低是由于缺血再灌注后心肌损伤所致。这种所谓的缺血/再灌注 (I/R) 损伤是介导的细胞代谢物的变化, 如夸大产生的活性氧物种4,5。
为了探索可能的保护机制, 导致在临床前设置的心肌损害减少, 可靠的鼠标模型是必不可少的, 包括评估的方法后, 左/R LV 功能6。在这一背景下, 经胸超声心动图7和磁共振成像 (MRI)6被广泛用于功能分型8,9。然而, 这些方法不适用于评估严重的 lv 功能障碍和心源性休克的持续急性心肌梗死, 不能直接显示有关 LV 压力的数据。在体外试验中使用隔离心脏的 Langendorff 装置提供了有关早期 I./R 损伤10的潜在 pathomechanisms 的信息。这种方法是有限的, 因为它无法重现体内的适应性机制, 如调节自主神经系统或激素调节和酸碱平衡。目前尚无方法可用于完全功能分型的心源性休克和左心室功能障碍在持续性心肌 I./R 损伤。
一种同步的方法, 结合压力容积 (PV) 插管和瞬态手术左冠状动脉主干 (LCA) 闭塞可能是有益的, 但技术上的挑战。稳定的源于血流动力学在我/R 损伤是必不可少的有效的结果, 因为不稳定的麻醉或失血可能严重影响的结果。采用低压光伏插管和瞬态 LCA 阻断技术对分型损伤的血流动力学进行研究, 可为急性心肌梗死患者心源性休克和 LV 功能障碍提供新的见解, 并作为今后分析心肌。
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Protocol
所有的实验都是按照和遵守所有相关的条例 (《欧洲保护用于实验和其他科学目的的脊椎动物的公约》 (指令 2010/63/欧盟) 完成的, 动物护理在符合机构准则。所有实验都是在6月龄的雄性 C57BL/6JRj 小鼠身上进行的。
1. 准备
- 准备一个外科显微镜和一个加热垫, 以及一个直肠探针来监测体温。清洁和消毒所有手术器械。
- 为血管结扎、5厘米6-0 聚丙烯螺纹和2毫米硅管准备2件 10 cm 5-0 丝线, 用于结扎 LCA。
- 准备 PV 导管校准试管加热到37摄氏度, 并准备100µL 哈密尔顿注射器填充15% 氯化钠 (氯化钠) 在 H2O 用于生理盐水校准。
- 将 PV 导管 (3 厘米, 1.4 F) 放在37摄氏度预加热0.9% 氯化钠在 H2O (盐水) 至少30分钟之前测量。将导管连接到数据采集装置, 并将设备连接到模拟/数字转换器。将两个设备连接到计算机。
- 设置软件。按照软件引导的工作流8的要求执行软件引导的压力校准和电导校准。
2. 麻醉和镇痛
- 麻醉小鼠使用氯胺酮100毫克/千克体重和盐酸甲苯噻嗪10毫克/千克体重的腹腔注射。在初/R 手术, 管理0.05 毫克/千克体重丁丙诺啡腹腔保持镇痛。
- 10分钟后, 使用20克静脉注射 (iv) 导管进行气管插管, 并用40% 氧 (O2) 和 2% (v) 异氟醚对小鼠进行通气。设置适当的通风参数 (例如, 220 µL 冲程体积, 150/分钟 25-30 克 C57BL/6JRj 鼠标)。
- 通过直肠探头连续监测体温。将鼠标固定在加热板上, 头部指向调查员。小鼠正常体温为 36.5-38 摄氏度。通过调整加热板温度, 保持体温在1度以内。
3. 左心室插管
- 用三 betadine 和70% 醇交替磨砂消毒胸部和颈部。 等待皮肤消毒剂干燥。用小动物剃须系统取出胸毛。
- 使用小手术剪刀, 在底部唇下对胸骨执行10毫米纵中间切口5毫米。
- 用镊子对颌下腺的左、右部分进行钝性解剖。在右 paratracheal 区域分离肌肉和脂肪组织, 以暴露右社区的颈动脉。将该血管从结缔组织中分离出来, 总长度为 5-10 毫米, 方法是通过仔细的钝性准备, 连同一条弯曲的镊子。
注意: 避免在任何时候对迷走神经或颈动脉体进行机械操作, 因为这会导致严重的低血压和心动过缓。 - 把两条准备好的丝线递给船下。结扎的远端血管有一个紧密的结, 并放置一个松散的结在近暴露的区域仍然允许通过导管。
- 固定在小鼠头部旁边的颅骨 (紧) 结的螺纹, 以便在容器上施加轻的张力, 因为这将促进导管的引入。将止血血管钳放在松散结的近端血管上, 可逆地阻断血流。
- 在颅骨结上进行楔形切口1毫米, 用微剪刀打开容器。
注: 一小滴血将表明这一步骤的正确执行。 - 小心插入导管10毫米. 开始记录导管数据。
注意: 用镊子伸展切口可以使这个过程更容易。 - 提取血管钳。在切口添加 1-2 滴生理盐水, 以促进导管运动。继续介绍导管大约另10毫米。通过与传感器尖端的近端结, 小心地固定结, 以防止血液回流旁边的导管较薄的部分, 而不损害导管运动。
注: 导管顶端的传感器大小可防止提取血管钳时血液回流。 - 轻轻地继续插入导管, 直到压力分析显示动脉血压剖面表明导管放置在主动脉 (图 3A)。
注: 导管到达主动脉瓣的导管将通过光阻和脉冲同步运动来表示。 - 当遇到阻力试图通过主动脉瓣, 拉导管回到5毫米和再次前进, 直到 LV 插管将表明在 PV 分析的变化, 因为舒张压将达到 0-20 mmHg (图 3B)。注意音量监测的变化, 以进一步确认传感器尖端的左心室位置 (图 3C)。紧固近端结以防止导管运动。
4. 缺血/再灌注手术
- 从胸骨向左腋窝进行皮肤切口, 总长度为15毫米. 进行钝性准备的两个肌肉层, 直到肋骨可以可视化。
- 切开胸腔通过切口在第三和第四左肋骨之间。使用手术钩获得心包。切除心脏上方的心包。在继续进行 LCA 结扎之前, 等待三十年代不接触动物记录 PV 数据进行有效分析。
- 定位在左耳廓下出现的 LCA, 并在心脏左侧下降朝向顶点。用6-0 聚丙烯缝合线将动脉围在左耳廓下方2毫米的环状。在循环下放置一个小的硅管, 并在上面放置一个紧的结。
注: 远端心肌变灰对 LCA 闭塞6起积极控制作用。I/R 手术应在5分钟内独立于手术调查员进行。 - 以1毫米的长度切割缝线。松开手术钩, 并手动关闭切口上方的肌肉层。连续记录 PV 数据时等待45分钟。
- 45分钟后, 重新打开切口, 取出硅管以诱导再灌注。记录其他20分钟的数据。
注意: 在缺血前看到的红色颜色的变化表明成功再灌注。
5. 校准
注: 光伏导管系统的校准包括4个强制步骤, 其中两个必须在测量后执行。每次试验后应重复校准, 以确保有效的结果。
- 在实验前进行压力校准和电导校准, 如步骤1.5 所述。
- 在实验结束后, 当导管仍放在左心室时, 执行生理盐水校准。在准备区域内定位颈动脉右颈静脉侧。在记录数据时,通过哈密尔顿注射器在 H2O 注射10µL 25% 氯化钠。
- 通过在卷曲线中突出显示提升相位来计算使用采集软件的校准 (图 5C)。重复此过程总共3次。通过使用血管钳快速压缩穿刺, 避免在注射器取出后失血。
- 通过对标准化卷的分析, 进行容积校准, 以校准容积数据的采集。获得大约500µL 小鼠血液从心脏穿刺与轻微血气1毫升注射器 (例如, 5 µL 每 200 IE 肝素)。拉回 PV 导管 10-15 毫米, 以避免损坏导管。
- 将获得的血液填入37摄氏度预加热校准试管 (图 5A)。避免气泡, 因为它可能会干扰结果。将导管尖端添加到每个井中并记录数据。通过软件引导分析获得标准曲线 (图 5B)。重复该过程总共3次。
- 弄死小鼠放血或颈椎脱位, 而充分的异氟醚麻醉始终保持。
6. 数据分析
- 完成校准步骤后, 执行软件引导的数据分析。因此, 在PV 工作流的分析部分中, 突出显示相应的部分 (至少十个周期), 并执行基线分析。排除因通风或操作而有偏差的循环 (图 3D)。
- 进行 PV 基线分析之前, 主动脉瓣 (仅动脉压力), 立即和之后的 LCA 闭塞。进行 PV 基线分析, 并在缺血和再灌注后5分钟的时间间隔进行。在实验结束后, 对左心室 (动脉压) 导管撤回后的压力数据进行分析。
- 分析至少10个周期以避免取样误差。当在通风条件下, 对所获得的值有强烈的干扰时, 可以考虑5秒内通风的瞬态中断。
- 使用在基线分析中计算的以下参数 (图 3D) 来描述 LV 函数:
- 描边音量 (µL)
- 射出分数: 中风体积/端舒张容积 (%)
- 心脏输出: 中风体积 * 心率 (µL/分钟)
- 心脏指数: 心脏输出/体表面积 (µL/(分钟 * cm²)
- 冲程工作: PV 曲线的内部区域 (mmHg * µL)
- 最大压力 (Pmax);平均压力 (Pmean)
- 最大 dP/dt (mmHg) 作为低压收缩功能的参数
- 最小 dP/dt (mmHg/秒) 作为 LV 合规性的参数
- 等容松弛时间常数: 头 (ms)
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Representative Results
经低压插管后, 45 分钟可逆性 LCA 结扎术后再灌注10分钟。PV 数据在任何时候都被记录下来 (图 1)。
通过获得特征 LV pv 图 (图 2A), 确定了 pv 导管的正确位置。LV 导管放置显示典型的心室压力范围, 至少 0-20 mmHg, 而在主动脉中的 PV 导管假放置将显示一个典型的动脉压力曲线, 最小压力为 30-60 mmHg (舒张压) 和在收缩结束时的小漂移, 表明主动脉瓣膜关闭 (图 3B 和 3C)。成功闭塞的 LCA 是通过热漂的远端 LV 心肌的视觉证实 (图 2B)。
在 LCA 闭塞后, PV 数据以5分钟的间隔获得。压力数据分析显示, 最大 LV 收缩压显示保留的周围灌注和稳定的麻醉没有变化 (图 4A)。对 LV 体积的分析显示, 英孚 (52% vs40%, p = 0.008) 和绝对笔划体积显著下降 (图 4B 和 4C)。这些变化发生在缺血的早期阶段, LV 功能数据在缺血后阶段保持不变。最大 dP/dt 作为 LV 收缩力的参数显示, 小鼠在心肌缺血时减少了30%。中风工作减少了 30% (图 4D 和 4E)。作为舒张功能的一个参数, 最小 dP/dt 明显降低, 表明左心室顺应性受损 (图 4F)。通过对硅管的萃取再灌注进行了可视化验证。再灌注在20分钟内不显示 PV 数据分析的显著变化 (图 4A-4D)。假手术动物没有显着减少 LV 收缩或舒张参数 (图 4I-4J)。
在数据采集结束时, 进行了试管校准和生理盐水校准 (图 5)。
图 1: 方法的方案.左心室 (LV) 插管序列, 左主干冠状动脉 (LCA) 闭塞和再灌注。
图 2: 手术程序.(A)通过右颈总动脉放置左心室插管。(B) 左主干冠状动脉闭塞, 采用聚丙烯缝合和硅胶管。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 代表性压力-体积数据.(a) 有代表性的动脉压力由 > 30 mmHg 的最小压力和在收缩结束时的典型漂移表明主动脉瓣闭合。(B) 有代表性的左心室压力数据显示舒张值 < 20 mmHg。(C) 代表左心室压力-容积图。(D) 基于软件的 PV 基线分析的截图。请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: 缺血/再灌注小鼠的压力/体积数据.(A) 收缩左心室血压 (Pmax)。左心室 (LV) 射血分数 (%)。(C) LV 冲程容积 (µL)。(D) 最大 dp/dt (最大 dp/dt) (mmHg/秒)。(E) LV 中风工作 (SW)。(F) 最小 dp/dt (最小 dp/dt) (mmHg/秒)。(G) 等容松弛头 (ms) 的时间常数。(H) 心肌缺血诱导后45分钟压力/容积图。(一-J)中风体积 (SV) (µL) 和最大 dp/dt (最大 dp/dt) (mmHg) 的假操作动物相比, 动物后15/30 分钟的缺血。数据 (A G) 被显示为卑鄙的电子扫描电镜. * p < 0.05通过学生的 t 测试或比例配对 t 测试, n = 4 小鼠/组 (A + D G)) 或n = 3 小鼠/组 (B, C)。+ 45:45 分钟缺血;再灌注。请单击此处查看此图的较大版本.
图 5: 特殊后校准.(A) 校准试管示意图。µL 中的卷. (B) 对获得的体积数据进行试管标定的代表性线性回归分析。(C) 在10µL 25% 氯化钠注入右颈静脉, 进行生理盐水校准后, 有代表性的容积数据。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
对急性心肌梗死的 lv 血流动力学进行光电监测, 是实时评价心源性休克和左心室损伤的 lv 功能的一种新方法。PV 导管可以提供一个广泛的参数, 关于 LV 收缩和舒张功能。除了通常由超声心动图或 MRI (腔容积, EF, 中风体积和心脏输出) 获得的 lv 容积参数外, PV 分析通过同时提供 lv 收缩的措施, 产生一个更完整的 lv 功能剖面性能 (收缩力 dp/dt, 中风工作) 和 LV 遵约 (dp/dt, 头) 作为一个参数的舒张功能。
急性心肌梗死患者急性心力衰竭是早期住院发病率和死亡率的重要预测指标2, 急性心肌梗死急性血流动力学损伤和心源性休克的监测可作为一种有价值的工具, 用于在实验环境中识别可能的保护机制。
有几个因素对成功获取数据至关重要。稳定的麻醉对有效的 PV 数据至关重要, 因为异氟醚在压力、LV EF 和中风体积方面表现出强烈的 cardiodepressive 效应。非创伤性颈动脉的制备对于避免因失血而低血容量是很重要的。此外, 迷走神经和颈动脉体的压迫或损伤可导致严重的血流动力学损伤。
盐水校准和试管校准似乎是维持有效数据的另一个关键步骤。对于生理盐水校准, 注入15% 氯化钠溶液导致电导率的增加由临时增加的体积水平 (图 5C)。在注入时保持相同的速度对稳定数据至关重要。在进行试管校准时, 必须避免小试管内的气泡, 以确保有效的结果。
获得的 PV 数据还表明, 同时采集压力和容积数据对有效的血流动力学特性的重要性, 因为单独的压力数据并没有在整个实验中显示重大变化 (图 4A).联合 PV 分析提供了两个基线参数的 lv 收缩功能 (如弹射分数) 以及参数为 lv 收缩力 (dp/dt) 和 lv 松弛 (-dp/dt, 头)。
有趣的是, 急性闭塞的 LCA 的患者通常会导致严重赤字的 LV 功能立即必要的机械血流动力学支持, 并与高死亡率11,12。在小鼠的 lca 阻断显示血流动力学损伤较少和 lca 闭塞相关死亡的过程中没有观察到。收缩期 LV 血压一直保持稳定, 是缺血期间持续血流动力学稳定的标志 (图 4A)。然而, 这一效应可能是由更远端结扎的小鼠相比, 生命周期评估闭塞的人。
同时, 对小鼠急性心肌梗死的实时血流动力学监测可以作为研究重度 LV 功能障碍的心肌机制的新方法, 旨在提高急性期患者的早期治疗效果。心肌梗塞。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者承认以下资金来源: 否则 Kröner-费森尤斯-基金会 (Tienush Rassaf);Hans 和格蒂 Fischer 基金会 (Tienush Rassaf), 补助金从医学教职员, 大学杜伊斯堡-埃森, 德国 (Tienush Rassaf, 米歇尔);Grimmke-基金会 (基督 Rammos)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Betaisodona Loesung | Mundipharma | 4162-1606/89x30mm | Povidon-Iod |
| Calibration cuvette | Millar instruments | 910-1049 | Calibration cuvette |
| Contura professional hair trimmer | Wella | HS-60 | Small animal shaving system |
| Eclipse Needle 27G | BD | REF 305770 | 27G needle |
| Forceps | FST | 11203-25, 11069-08, 11616-15, 11506-12, 11051-10 | Surgical forceps |
| Forceps | Aesculap Braun | BN731R, BD 311R | Surgical forceps |
| Foris FS2434 | Eizo | 0FTD2033 | Monitor |
| Hamilton Syringe 100 µl needle | Hamilton | 80621 | 100µl syringe with needle |
| Heated Small animal OP table | Harvard Apparatus | 15001 | Heated OP table |
| Heparin-Natrium 25000 | Ratiopharm | N68542.04 | Heparin |
| Ketamin 10% 100 mg/ml | bela-pharm | FS1670041 | Ketamin |
| Labchart Pro 8 + Pro modules | AD Instruments | MLS260/8 | PV data analysis software |
| LAS EZ | Leica | LAS EZ | Microscope camera software |
| Leica IC80 HD | Leica | IC80 HD | Microscope camera |
| Leica M80 | Leica | M80 | Microscope |
| Micro-tip catheter transducer | Millar instruments | SPR-839 | PV catheter |
| MiniVent | Harvard Apparatus | 845 | ventilation |
| MPVS Ultra | Millar instruments | PL3508B48/M | PV catheter data acquisition device |
| Octenisept | Schülke | 20000832-A | disinfectant |
| Plastipak 1ml | PD | REF 303172 | 1ml syringe |
| PowerLab 8/35 | AD Instruments | PL3508 | analog/digital converter |
| Prolene 6-0 | Ethicon | XNEH7814.P31 | Polypropylene suture |
| Retraction Kit | FST | 18200-20 | retraction of surgical situs |
| Seraflex 5-0 | Naila | IC108000 | silk suture |
| Small and micro-scissors | FST Essen | 14059-11, 15007-08, 14064-11 | Surgical scissors |
| Small silicon tube | Reichelt Chemietechnik | tube for LCA occlusion | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | Sodium Chloride |
| testo 108 | testo | 5631080 | rectal thermometer |
| Thinkcentre desktop computer | Lenovo | PC0EJS2V | Computer |
| Vasofix Safety 20G | Braun | 4269110S-01 | intubation catheter |
| Windows 10 | Microsoft | KW9-00240 | Operating system |
| Xylazin 2% | Ceva | 6324464.00.00 | Xylazine hydrochloride |
References
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