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डॉक्सोरूबिसिन के Retrobulbar इंजेक्शन द्वारा चूहों में नेफ्रोटिक सिंड्रोम की प्रेरण और निरंतर रिलीज Aprotinin द्वारा मात्रा प्रतिधारण की रोकथाम

Published: May 6, 2018 doi: 10.3791/57642
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3
1Department of Internal Medicine, Division of Endocrinology, Diabetology, Vascular Disease, Nephrology and Clinical Chemistry, University Hospital Tübingen, 2Institute of Diabetes Research and Metabolic Diseases (IDM) of the Helmholtz Center Munich, University Tübingen, 3German Center for Diabetes Research (DZD), University Tübingen

Summary

यहां, हम डॉक्सोरूबिसिन के रैपिड retrobulbar इंजेक्शन द्वारा 129S1/SvImJ चूहों में प्रयोगात्मक नेफ्रोटिक सिंड्रोम की प्रेरण का वर्णन । हम भी निरंतर जारी छर्रों aprotinin युक्त मूत्र serine को रोकना गतिविधि और सोडियम प्रतिधारण को रोकने के साथ नेफ्रोटिक चूहों का इलाज ।

Abstract

नेफ्रोटिक सिंड्रोम proteinuric गुर्दे की बीमारी का सबसे चरम अभिव्यक्ति है और भारी proteinuria, hypoalbuminemia, और सोडियम प्रतिधारण और hyperlipidemia के कारण सूजन की विशेषता है । इस सिंड्रोम के pathophysiology का अध्ययन करने के लिए, डॉक्सोरूबिसिन जैसे विषाक्त पदार्थों के इंजेक्शन के आधार पर कुतर मॉडलों को विकसित किया गया है जिससे podocyte क्षति होती है । चूहों में, केवल कुछ उपभेदों इस मॉडल के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं । wildtype 129S1/SvImJ चूहों में, retrobulbar साइनस करने के लिए तेजी से नसों इंजेक्शन द्वारा डॉक्सोरूबिसिन के प्रशासन प्रयोगात्मक नेफ्रोटिक सिंड्रोम कि सुविधाओं सोडियम प्रतिधारण और शोफ सहित मानव रोग के सभी लक्षण । proteinuria की शुरुआत के बाद, चूहों उपकला सोडियम चैनल (ENaC) और सोडियम प्रतिधारण के सक्रियण की ओर जाता है कि मूत्र serine की चिढ़ा गतिविधि में वृद्धि प्रदर्शित करता है. निरंतर रिलीज aprotinin abrogates ENaC सक्रियण के साथ उपचार के द्वारा मूत्र serine के औषधीय निषेध और सोडियम प्रतिधारण रोकता है । यह मॉडल proteasuria के pathophysiology का अध्ययन करने के लिए आदर्श है, यानी, सक्रिय serine के उत्सर्जन कि अपनी प्रोटियोलिसिस-उप इकाई के γ द्वारा सक्रियण ENaC कारण है । यह proteinuric गुर्दे की बीमारी में ENaC सक्रियण और सोडियम प्रतिधारण की प्राथमिक तंत्र के रूप में माना जा सकता है ।

Introduction

नेफ्रोटिक सिंड्रोम भारी proteinuria, hypoalbuminemia, शोफ और hyperlipidemia की विशेषता है, और proteinuric गुर्दे की बीमारी का सबसे चरम अभिव्यक्ति के रूप में माना जा सकता है । कुतर में, प्रयोगात्मक नेफ्रोटिक सिंड्रोम anthracyclines या puromycin के एकल इंजेक्शन द्वारा प्रेरित किया जा सकता है जो podocyte नुकसान की ओर जाता है और मानव न्यूनतम परिवर्तन रोग और फोकल फॉल्ट glomerulosclerosis (FSGS)1जैसा दिखता है । Frenk एट अलद्वारा १९५५ में अपनी पहली विवरण के बाद । चूहों में 2, puromycin nucleoside nephrosis (पैन) कई अध्ययनों में नेफ्रोटिक सिंड्रोम के pathophysiology की जांच करने के लिए एक मानक मॉडल बन गया है3,4,5,6. चूहों में, इसी मॉडल anthracycline डॉक्सोरूबिसिन द्वारा प्रेरित किया जा सकता है7. हालांकि, वहां है एक मजबूत तनाव निर्भरता है कि आनुवंशिक रूप से निर्धारित किया जाता है कम से कम दो आनुवंशिक loci8। इसके अलावा, proteinuric प्रतिक्रिया और नेफ्रोटिक सिंड्रोम9,10के पाठ्यक्रम में मतभेद हैं । 129S1/SvImJ चूहों और retrobulbar साइनस के माध्यम से डॉक्सोरूबिसिन के तेजी से नसों में इंजेक्शन का उपयोग करना, proteinuria प्रतिक्रियाओं नेफ्रोटिक सिंड्रोम की विशिष्ट सुविधाओं को प्रेरित करने के लिए पर्याप्त हैं कि मूल्यों तक पहुँचने, विशेष रूप से मात्रा प्रतिधारण द्वारा विशेषता जलोदर और लगभग सोडियम मुक्त मूत्र7। प्रयोगात्मक नेफ्रोटिक सिंड्रोम में सोडियम प्रतिधारण aberrantly अपनी serine-उपइकाई 4 के कारण plasmin के रूप में प्रोटियोलिसिस फ़िल्टर्ड γ के रूप में इस तरह के बाहर tubule में उपकला सोडियम चैनल (ENaC) के सक्रियकरण का परिणाम होना माना गया है ,11,12. हाल ही में, इस अवधारणा नेफ्रोटिक चूहों जो proteolytic ENaC अवरोधक aprotinin के रूप में समान रूप से प्रभावी था serine के साथ उपचार द्वारा सक्रियण और सोडियम प्रतिधारण से सुरक्षित थे में सिद्ध किया गया था ENaC ब्लॉकर amiloride13। बाहर tubule के लिए सतत वितरण सुनिश्चित करने के लिए, aprotinin के माध्यम से प्रशासित किया गया था के द्वारा संचालित निरंतर रिलीज छर्रों । भविष्य के अध्ययन के लिए serine है कि नेफ्रोटिक सिंड्रोम जो मानव स्थिति समानांतर सोचा है में proteolytic ENaC सक्रियण के लिए जिंमेदार है की पहचान की आवश्यकता है । इस प्रयोजन के लिए, डॉक्सोरूबिसिन प्रेरित नेफ्रोटिक सिंड्रोम एक मूल्यवान मॉडल है कि जंगली प्रकार चूहों में इस्तेमाल किया जा सकता है या आनुवंशिक रूप से इंजीनियर चूहों के लिए विस्तारित है । इसके फायदों में दवा की कम लागत, प्रबंधन की कम जटिलता और गुड reproducibility14शामिल हैं ।

इस अनुच्छेद में, हम डॉक्सोरूबिसिन के retrobulbar साइनस और निरंतर रिलीज छर्रों युक्त aprotinin मूत्र serine को बाधित करने के आरोपण के लिए तेजी से नसों में इंजेक्शन द्वारा प्रयोगात्मक नेफ्रोटिक सिंड्रोम की प्रेरण प्रदर्शित गतिविधि के रूप में एक chromogenic परख के साथ मापा ।

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Protocol

सभी तरीकों की देखभाल और प्रयोगशाला पशुओं के उपयोग और पशुओं के कल्याण के लिए जर्मन कानून के लिए स्वास्थ्य गाइड के राष्ट्रीय संस्थानों के अनुसार आयोजित किया गया, और वे स्थानीय अधिकारियों द्वारा अनुमोदित किया गया (Regierungspräsidium Tübingen) ।

1. Retrobulbar साइनस करने के लिए डॉक्सोरूबिसिन इंजेक्शन द्वारा प्रयोगात्मक नेफ्रोटिक सिंड्रोम की प्रेरण

  1. पिस्टन की रोक की स्थिति अंकन द्वारा एक घुड़सवार 30G प्रवेशनी के साथ एक ०.५ मिलीलीटर सिरिंज तैयार करें ।
  2. पुरुष के लिए डॉक्सोरूबिसिन के इंजेक्शन की मात्रा की गणना (७.२५ µ l/जी शरीर का वजन (bw) के बराबर १४.५ µ g/g bw डॉक्सोरूबिसिन) और मादा चूहों (६.९ µ l/जी bw के बराबर १३.८ µ g/जी bw डॉक्सोरूबिसिन) के अनुसार सुबह से शरीर के वजन के हिसाब से.
    नोट: दिया खुराक नेफ्रोटिक सिंड्रोम के प्रेरण के लिए उपयुक्त है । खुराक में मामूली परिवर्तन glomerular निस्पंदन दर में केवल छोटे परिवर्तन (१२.६ µ जी/जी bw डॉक्सोरूबिसिन) तीव्र गुर्दे की विफलता के साथ हल्के जीर्ण गुर्दे की बीमारी से पहुंचने नेफ्रोपैथी का एक महत्वपूर्ण अलग पाठ्यक्रम के लिए नेतृत्व (१५.४ µ g/g bw डॉक्सोरूबिसिन)7, 15.
  3. ३७ ° c गर्म कक्ष में डॉक्सोरूबिसिन समाधान (2 µ g/µ l) की परिकलित मात्रा को गर्म करना ।
    चेतावनी: डॉक्सोरूबिसिन अगर निगल लिया और कैंसर पैदा कर सकता है हानिकारक है । हमेशा दस्ताने पहनते है अगर डॉक्सोरूबिसिन के साथ काम करने और किसी भी त्वचा संपर्क से बचें ।
  4. अंकन बिंदु तक डॉक्सोरूबिसिन समाधान के साथ सिरिंज को भरने और शून्य करने के लिए संतुलन सेट. इंजेक्शन की मात्रा के साथ सिरिंज भरें और सिरिंज वजनी द्वारा मात्रा की जाँच करें.
  5. Narcotize माउस को गहराई से 5 vol% isoflurane के साथ एक vaporizer और ऑक्सीजन के प्रवाह का उपयोग कर 2 L/
    1. इंजेक्शन से पूर्व आंखों पर मरहम का प्रयोग न करें । ऑपरेटर एक सुरक्षित और सफल retrobulbar इंजेक्शन प्रदर्शन के लिए कक्षीय गुहा की एक स्पष्ट दृष्टिकोण की जरूरत है ।
    2. पैडल पलटा द्वारा संज्ञाहरण के स्तर का आकलन और इंजेक्शन शुरू करने से पहले यदि आवश्यक हो तो संवेदनाहारी वितरण समायोजित करें ।
  6. अपनी पीठ के साथ एक सही पार्श्व recumbency पर माउस प्लेस ऑपरेटर के शरीर और उसके सिर को ऑपरेटर के इंजेक्शन हाथ का सामना करना पड़ रहा है ।
    नोट: प्रक्रिया को बाएं हाथ के साथ इंजेक्शन प्रदर्शन कर रहे लोगों के लिए एक सही हाथ व्यक्ति के लिए वर्णन किया गया है, यह स्थिति और इंजेक्शन करने के लिए आसान है करने के लिए बाईं ओर ठीक उलट ।
  7. ध्यान से त्वचा, पृष्ठीय और आंख को ventral कोमल दबाव लागू करके आंख गर्तिका से माउस की बाईं गोलक बहर ।
  8. भीतरी आंख के कोण (औसत दर्जे का palpebral संयोजिका) से बाएं retrobulbar साइनस पंचर । माउस ´ एस गोलक के साथ किसी भी संपर्क से बचें ।
  9. थोड़ा सिरिंज झुकाव और एक जाने में पूरे मात्रा इंजेक्षन. सुनिश्चित करें कि मात्रा किसी भी प्रतिरोध के बिना और इंजेक्शन साइट से exopthalmus या रिसाव जैसे extravasation के किसी भी लक्षण के बिना इंजेक्शन है ।
  10. चूंकि डॉक्सोरूबिसिन एक अत्यंत विषैला पदार्थ है, अच्छी तरह से जांच की जा रही है एक दिन में एक बार Morton और ग्रीफिथ एट अल के अनुसार एक स्कोर शीट का उपयोग करके । 16 और इंजेक्शन साइट पर विशेष ध्यान देना । exopthalmus की तरह extravasation के किसी भी लक्षण, बिगड़ा पलक बंद करने या सूजन या त्वचा के घावों की तरह परिगलन के किसी भी लक्षण इंजेक्शन के बाद या निम्न दिनों में हो, तो माउस euthanized होना चाहिए ।

2. Aprotinin युक्त निरंतर जारी छर्रों के आरोपण

  1. आदेश प्रति दिन वांछित खुराक और अग्रिम में रिलीज की अवधि के साथ छर्रों । aprotinin के मामले में, 10 दिनों में रिलीज होने के लिए प्रति दिन 1 मिलीग्राम की एक खुराक का चयन करें.
    नोट: इस अध्ययन में, aprotinin छर्रों 10 मिलीग्राम की एक खुराक होते हैं.
    1. सूखी शर्तों के तहत छर्रों की दुकान और नमी के लिए किसी भी जोखिम से बचें ।
  2. शल्य चिकित्सा के लिए आवश्यक वस्तुओं को तैयार, बाल कैंची की एक जोड़ी, त्वचा की तैयारी कैंची, एक स्केलपेल, सर्जिकल चिमटी, ऊतक चिमटी के दो जोड़े, एक सुई धारक, और 15 सेमी monofile टांका गैर resorbable की एक जोड़ी भी शामिल है ।
    1. २४० डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए एक गर्मी नसबंदी का उपयोग कर उपकरणों को निष्फल । उपकरणों का उपयोग करने से पहले, 5 मिनट के लिए रुको जब तक वे कमरे के तापमान तक पहुँचने.
      1. बाँझ सतहों के लिए निष्फल साधन सुझावों के किसी भी संपर्क से बचें ।
      2. गर्म उपकरणों से त्वचा को जलाने से बचें ।
  3. Narcotize माउस के साथ isoflurane 5 vol% द्वारा पीछा किया १.५ vol% एक vaporizer और ऑक्सीजन के प्रवाह का उपयोग कर 2 L/
  4. एक वार्मिंग डिवाइस पर एक प्रवण स्थिति में माउस प्लेस धुंध की एक परत के साथ कवर करने के लिए माउस को थर्मल चोटों से बचने के । सतह तापमान के बारे में ३७ ° c है ।
  5. मरहम के साथ आंखों की रक्षा ।
  6. के बारे में ०.५ सेमी के एक क्षेत्र में बीच में वापस बाल निकालें2 कैंची या एक बाल trimmer का उपयोग और त्वचा संक्रमण के लिए उपयुक्त एक विसंक्रमित के साथ गंजा त्वचा को संक्रमित । कम बाल के रूप में संभव के रूप में निकालें तो यह और अधिक कठिन रहता है के लिए माउस घाव और धागे तक पहुंचने के बाद समाप्त होता है और शरीर का तापमान रखने के लिए ।
  7. लगभग 5 मिमी की लंबाई में cranio-caudal दिशा में एक स्केलपेल के साथ गंजा त्वचा Incise । एक कुंद तैयारी का उपयोग कर चमड़े के नीचे संयोजी ऊतक में 1 सेमी गहराई के बारे में एक वाम पार्श्व थैली तैयार करते हैं ।
    1. पेडल पलटा द्वारा संज्ञाहरण के स्तर का आकलन और सर्जरी शुरू करने से पहले यदि आवश्यक हो तो संवेदनाहारी वितरण समायोजित करें ।
  8. डालें १ १०-दिन जारी गोली बाँझ ऊतक चिमटी का उपयोग कर तैयार बाएँ पार्श्व थैली में । एक planar स्थिति में थैली के तल पर गोली छोड़ दें ।
    1. तैयार थैली में रखा जब तक तरल पदार्थ और आर्द्रता के लिए गोली के किसी भी संपर्क से बचें ।
  9. 2-3 टांके के साथ त्वचा को बंद करें । केवल बहुत छोटा धागा छोड़ gnawing द्वारा टांके खोलने के लिए माउस के लिए इसे और अधिक कठिन बनाने के लिए समाप्त होता है ।
  10. पश्चात कष्ट को कम करने के लिए और gnawing द्वारा टांके खोलने को रोकने के लिए चूहों को व्यक्तिगत रूप से रखें । माउस को ध्यान में रखें जब तक यह narcosis के बाद पर्याप्त चेतना फिर से प्राप्त किया है ।
    नोट: इस हस्तक्षेप के बाद से असुविधा या दर्द के किसी भी लक्षण के बिना अच्छी तरह से सहन है बाद में दर्द प्रबंधन के लिए कोई ज़रूरत नहीं है । वैकल्पिक रूप से हम सामयिक एनाल्जेसिक सलाह देते हैं, जो बंद करने से पहले चीरा पर bupivacaine की एक बूंद जैसे analgesia के 8 ज करने के लिए प्रदान करेगा ।

3. मॉडल प्रेरण, नेफ्रोटिक सिंड्रोम और अच्छी तरह से किया जा रहा के लक्षण के लिए मूल्यांकन

  1. एक प्रतिक्रिया कप (१.५ मिलीलीटर) में हर दिन सुबह मूत्र (08:00 am) इंजेक्शन दिन से मूत्राशय की मालिश करके ले लीजिए ।
    1. ब्रैडफोर्ड प्रोटीन परख का उपयोग करके proteinuria उपाय और क्रिएटिनिन को सामान्य ।
      नोट: नेफ्रोटिक सिंड्रोम के प्रेरण के लिए, proteinuria १२० मिलीग्राम/मिलीग्राम क्रिएटिनिन की दहलीज पर पहुंचना चाहिए 7 और 10 डॉक्सोरूबिसिन इंजेक्शन के बाद दिन के बीच ।
  2. जलोदर के विकास के लिए देखो । उदर परिधि को बढ़ाने के लिए जांच करें या पार्श्वों को फांसी ।
  3. माउस तौलना, भोजन छर्रों और पीने की बोतल में सुबह (08:00 am) हर दिन है ।
  4. Morton और ग्रीफिथ एट अलके अनुसार एक स्कोर-शीट का उपयोग करके अच्छी तरह से एक दिन में एक बार की जांच करें । 16

4. एक Chromogenic परख के साथ मूत्र Serine के मापन की माप

  1. lyophilised chromogenic सब्सट्रेट एस-२२५१ के 25 मिलीग्राम की एक बोतल के लिए बाँझ फॉस्फेट के 15 मिलीलीटर बफर खारा (पंजाब) को जोड़कर सब्सट्रेट काम समाधान तैयार, 2 मिमी की एकाग्रता उपज. 2 मिलीग्राम/एमएल की एकाग्रता के साथ एक aprotinin समाधान प्राप्त करने के लिए पंजाब में aprotinin भंग ।
    1. -20 डिग्री सेल्सियस पर तैयार समाधान की दुकान । इससे एस-२२५१ के ऑटो का ह्रास काफी धीमा हो जाता है । पीले रंग की एक मजबूत छाया के साथ पुराने समाधान का उपयोग न करें ।
  2. नए सिरे से तैयार या गल सब्सट्रेट काम समाधान का उपयोग करें और यह एक ३७ ° c गर्मी चैंबर में गर्म ।
  3. कमरे के तापमान पर गल मूत्र के नमूने ।
    1. दोहराया गल और ठंड से बचने के द्वारा चिढ़ा क्षरण को रोकने के । -20 डिग्री सेल्सियस पर मूत्र के नमूनों की दुकान ।
  4. भामिति माप के लिए उपयुक्त एक ९६ microwell प्लेट का उपयोग करें । दो कुओं में से प्रत्येक में पतला मूत्र के 3 µ एल जोड़ें और या तो पंजाबियों या कुओं के लिए aprotinin समाधान के 3 µ एल के साथ काम समाधान सब्सट्रेट के ५० µ एल जोड़ें । प्लेट मुहर के साथ थाली कवर ।
  5. एक ३७ डिग्री सेल्सियस गर्मी चैंबर में ६० मिनट के लिए कवर microwell थाली मशीन ।
  6. एक microplate रीडर का उपयोग कर ४५० एनएम पर एक अच्छी तरह से ऑप्टिकल घनत्व को मापने ।
  7. aprotinin के बिना और aprotinin के साथ मूत्र aprotinin संवेदनशील serine के रूप में गतिविधि के साथ आयुध डिपो के बीच अंतर ले लो ।
    नोट: के साथ एक युग्मित नमूना के माप और aprotinin के बिना परख की विशिष्टता बढ़ जाती है के बाद से सब्सट्रेट भी अंय की है कि एक pathophysiological भूमिका नहीं निभाने से सट जा सकता है ।

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Representative Results

isoflurane narcosis की प्रेरण के बाद, डॉक्सोरूबिसिन तेजी से छोड़ दिया retrobulbar साइनस के माध्यम से इंजेक्शन था । ७.२५ µ एल/जी bw की पूरी मात्रा किसी भी प्रतिरोध के बिना इंजेक्ट किया गया था और प्रवेशनी के सही नसों में स्थान साबित extravasation । माउस narcosis से तेजी से बरामद किया है और उस दिन और उसके बाद पर कोई हानि नहीं थी । विशेष रूप से, बाईं आंख में नुकसान का कोई संकेत नहीं था । डॉक्सोरूबिसिन इंजेक्शन के बाद, खाद्य और तरल पदार्थ का सेवन पहले 3 दिन डॉक्सोरूबिसिन के एक सामान्य विषाक्त प्रभाव के कारण पर गिरा दिया और उसके बाद बरामद (चित्र 1a) । इंजेक्शन के बाद पहले 3 दिनों के दौरान, माउस inappetence (चित्र 1b) के कारण अपने शरीर के वजन का ३.४% खो दिया है । 5वें दिन पर शुरू, माउस को चिह्नित proteinuria (चित्रा 1c) कि पर्याप्त भोजन सेवन (आंकड़ा 1a, बी) के बावजूद मूत्र सोडियम उत्सर्जन की एक भारी गिरावट के बाद किया गया था विकसित की है । इस सोडियम प्रतिधारण शरीर के वजन का एक विशाल लाभ के लिए नेतृत्व 3 दिन से २२.२% से 10 दिन तक और जलोदर के साथ था । proteinuria का एक परिणाम के रूप में, माउस hypoalbuminemia (चित्रा 1c) विकसित की है । एक दिन में 10 पर लिया प्लाज्मा नमूने में hyperlipidemia दिखाई दे रहा था । इन आंकड़ों से पता चलता है कि retrobulbar साइनस द्वारा दिया डॉक्सोरूबिसिन तेजी से और प्रभावशाली wildtype 129S1/SvImJ चूहों में एक पूर्ण विकसित नेफ्रोटिक सिंड्रोम लाती है ।

प्रयोगात्मक नेफ्रोटिक सिंड्रोम में सोडियम प्रतिधारण इस तरह के plasmin11,12के रूप में serine के ंयायपालिका निस्पंदन द्वारा ENaC के सक्रियण से जुड़ा हुआ था । यदि इस अवधारणा को सच मानती है, तो aprotinin द्वारा मूत्र serine के निषेध ENaC सक्रियण और सोडियम प्रतिधारण से रक्षा करनी चाहिए । ENaC सक्रियण पर aprotinin के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए, हम aprotinin के साथ एक नेफ्रोटिक माउस का इलाज किया । aprotinin तेजी से glomerular निस्पंदन द्वारा मंजूरी दे दी है के रूप में, हम 10 दिनों से अधिक बाहर tubule में aprotinin की सतत उपलब्धता सुनिश्चित करने के लिए एक निरंतर रिलीज गोली का उपयोग कर दवा प्रशासन को चुना । डॉक्सोरूबिसिन इंजेक्शन के बाद तीसरे दिन, एक माउस एक aprotinin युक्त गोली और एक नियंत्रण माउस isoflurane narcosis के तहत एक placebo गोली प्राप्त के साथ प्रत्यारोपित किया गया । पशुओं तेजी से फार्म narcosis और घाव किसी भी समस्याओं के बिना चंगा बरामद किया । 5 दिन से, दोनों चूहों में एक समान हद तक विकसित proteinuria (चित्र 2a) । हालांकि, केवल placebo-इलाज नेफ्रोटिक चूहों सोडियम प्रतिधारण (चित्रा 2 बी) और शरीर के वजन (चित्रा 2c) ENaC सक्रियण का संकेत अनुभव । इसके विपरीत, aprotinin-इलाज माउस सोडियम प्रतिधारण और शरीर के वजन से सुरक्षित किया गया था (चित्रा बी सी, सी) । यह स्पष्ट रूप से दर्शाता है कि मूत्र serine को छेड़ने गतिविधि नेफ्रोटिक सिंड्रोम में सोडियम प्रतिधारण का कारण है ।

मूत्र और प्लाज्मा में प्राप्त aprotinin एकाग्रता एक एलिसा के साथ मापा गया था । जैसा कि चित्र 3ए में दिखाया गया है, मूत्र aprotinin एकाग्रता आरोपण के बाद जल्द ही नुकीला और उसके बाद लगातार था । मूत्र aprotinin एकाग्रता मतलब २०७ ± 29 µ जी/एमएल (३२ ± 4 µ एम) जबकि प्लाज्मा aprotinin एकाग्रता उपचार के 10 दिनों के बाद किया गया था 13 µ जी/एमएल (2 µ एम), जो प्लाज्मा एकाग्रता aprotinin में हासिल करने के लिए तुलनीय है रोगियों का इलाज किया17। मूत्र serine को छेड़ने गतिविधि पर aprotinin का प्रभाव एक chromogenic प्रयोगात्मक नेफ्रोटिक सिंड्रोम के दौरान लिया मूत्र नमूने का उपयोग परख के साथ मापा गया था । इस परख nitroaniline कि आसानी से ४५० एनएम पर photometry द्वारा पता लगाया जा सकता है जारी सब्सट्रेट में पेप्टाइड बॉण्ड के hydrolysis पर आधारित है । के रूप में चित्र बीमें दिखाया गया है, serine को चिढ़ा गतिविधि placebo से मूत्र में तेजी से वृद्धि हुई नेफ्रोटिक proteinuria की शुरुआत के समानांतर माउस का इलाज किया । इसके विपरीत, मूत्र serine की गतिविधि को पूरी तरह से aprotinin-इलाज नेफ्रोटिक माउस में हिचकते थे ENaC सक्रियण और सोडियम प्रतिधारण की रोकथाम के साथ मेल खाता चित्रा बीसी में दिखाया गया, c.

Figure 1
चित्रा 1: खाद्य और तरल पदार्थ का सेवन (क), मूत्र सोडियम उत्सर्जन और शरीर के वजन (ख), और proteinuria और प्लाज्मा एल्ब्युमिन एकाग्रता (सी) से पहले और प्रयोगात्मक नेफ्रोटिक सिंड्रोम के प्रेरण के बाद के पाठ्यक्रम । डॉक्सोरूबिसिन के बाद पहले तीन दिनों में भोजन और तरल पदार्थ के सेवन में गिरावट के बाद, चूहों एक लगभग लगातार सेवन दिखाते हैं । पांच दिनों के बाद, proteinuria के विकास शुरू होता है और 7 और 10 दिन के बीच नेफ्रोटिक दहलीज तक पहुंचता है, सूजन गठन, सोडियम प्रतिधारण और hypoalbuminemia के साथ पूर्ण विकसित नेफ्रोटिक सिंड्रोम के लिए अग्रणी । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: proteinuria के पाठ्यक्रम (क), मूत्र सोडियम उत्सर्जन (ख) और शरीर के वजन (ग) एक माउस में aprotinin या placebo गोली के साथ प्रत्येक का इलाज 3 दिन पर डॉक्सोरूबिसिन इंजेक्शन के बाद । एक समान हद aprotinin में proteinuria के विकास के बावजूद सोडियम प्रतिधारण और शोफ नेफ्रोटिक सिंड्रोम के दौरान ENaC सक्रियण की वजह से गठन के खिलाफ की रक्षा करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: aprotinin के प्लाज्मा एकाग्रता के साथ गोली के आरोपण के बाद मूत्र aprotinin एकाग्रता के पाठ्यक्रम. मूत्र serine के पाठ्यक्रम chromogenic परख के साथ मापा गतिविधि चरण 4 में वर्णित है । मूत्र प्रत्यारोपण के बाद जल्द ही aprotinin एकाग्रता चोटियों और इसके बाद लगातार है । Serine नेफ्रोटिक सिंड्रोम के दौरान मूत्र में तेजी से बढ़ती गतिविधि, proteinuria की शुरुआत के समानांतर बढ़ जाती है । Aprotinin vivo में मूत्र serine को रोकने गतिविधि में वृद्धि के खिलाफ रोकता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

यहाँ, हम retrobulbar साइनस इंजेक्शन के माध्यम से डॉक्सोरूबिसिन इंजेक्शन SvImJ, सोडियम प्रतिधारण, proteinuria और hypoalbumenia के साथ 129S1/hyperlipidemia चूहों में प्रयोगात्मक नेफ्रोटिक सिंड्रोम लाती है कि प्रदर्शित करता है । हालांकि, इस मॉडल का उपयोग करते समय खाते में लिया जा करने के लिए है दो महत्वपूर्ण समस्याएँ हैं । सबसे पहले, मॉडल प्रेरण सख्ती से निर्भर है और डॉक्सोरूबिसिन खुराक के विचलन के रूप में ०.३ µ जी के रूप में छोटा है और चूहों की प्रतिक्रिया को प्रभावित करता है15. जब ऐसे 14 µ g/g bw या नीचे के रूप में एक कम खुराक के साथ इंजेक्शन, डॉक्सोरूबिसिन केवल गैर नेफ्रोटिक proteinuria कि प्रकट सोडियम प्रतिधारण, जलोदर और hyperlipidemia के साथ संबद्ध नहीं है का कारण बनता है । इसके विपरीत, एक उच्च खुराक के इंजेक्शन तीव्र गुर्दे की विफलता और उच्च तीव्र मृत्यु दर की ओर जाता है । खुराक और चूहों की प्रतिक्रिया के अनुसार, डॉक्सोरूबिसिन मानव तीव्र गुर्दे की चोट (आकि), संरक्षित glomerular निस्पंदन दर (सीकेडी स्टेज G1-3) या कम से प्रगतिशील क्रोनिक गुर्दे की बीमारी के साथ पुरानी गुर्दे की बीमारी जैसी एक कोर्स का कारण बनता है glomerular निस्पंदन दर (सीकेडी G4-5) के लिए अग्रणी यूरीमिया7,15।

दूसरे, इस मॉडल को कुछ माउस उपभेदों और व्यापक रूप से इस्तेमाल किया C57Bl/6 तनाव के लिए सीमित है8प्रतिरोधी है । इसके अलावा, आनुवंशिक संदूषण के रूप में वे एक backcross के दौरान उपस्थित हो सकता है एक काफी कम प्रतिक्रिया की दर के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । इस डॉक्सोरूबिसिन खुराक को बढ़ाने से कुछ हद तक बचा जा सकता है । हालांकि, मॉडल प्रेरण (१४.५ µ g/g bw) के लिए प्रयुक्त डॉक्सोरूबिसिन की खुराक पहले से ही 15-17 µ g/g bw के बीच वर्णित LD50 के करीब है इस तनाव में7,18।

इस माउस मॉडल के उपयोग की संभावना को खोलता है विभिंन उच्च अभिनव नेफ्रोटिक सिंड्रोम के विषय में सवालों का अध्ययन करने के लिए, proteinuria और शोफ गठन से endocrinological dysregulations और गुर्दे एनीमिया15तक पहुंचने । इस अर्थ में, डॉक्सोरूबिसिन प्रेरित नेफ्रोपैथी मानव सीकेडी की व्यापक स्पेक्ट्रम शामिल है और वर्तमान में नेफ्रोलॉजी अनुसंधान ऐसे 5/6 nephrectomy19,20 या एकतरफा मूत्रवाहिनी बंधाव21में उपयोग मॉडलों के लिए एक अच्छा विकल्प है । इसके अलावा, यह आनुवंशिक रूप से इंजीनियर चूहों के लिए मॉडल के पाठ्यक्रम में इस तरह के सीरम की कमी के रूप में ब्याज की एक निश्चित जीन की भूमिका का अध्ययन और-glucocorticoid कळेनासे 1 (SGK1)7 या कई दूसरों को लागू करने के लिए संभव है ।

प्रस्तुत मॉडल की एक विशेष विशेषता proteasuria की घटना है, अर्थात, सक्रिय serine के उत्सर्जन कि अपनी γ-उप इकाई के प्रोटियोलिसिस द्वारा सक्रियण ENaC कारण है । यह एक लगभग सोडियम मुक्त मूत्र और मात्रा प्रतिधारण proteasuria की शुरुआत के बाद तेजी से शरीर के वजन और जलोदर के विकास के द्वारा विशेषता के उत्सर्जन की ओर जाता है । हालांकि, इस घटना क्षणिक है, और 15 दिनों के बाद, चूहों अनायास ढीला जलोदर और वजन हालांकि proteinuria बनी हुई है । कारण, तथापि, मायावी रहता है । यह उलटा व्यवहार भी नेफ्रोटिक चूहों के साथ अध्ययन में मनाया गया4 और कुतर में प्रयोगात्मक नेफ्रोटिक सिंड्रोम के एक सामान्य सुविधा का प्रतिनिधित्व करने लगता है.

मूत्र serine को छेड़ो गतिविधि एक chromogenic परख कि सरल और तेजी से है के साथ मापा गया था । यह पी के छुटकारे बांड के hydrolysis पर आधारित है 4 अमीनो एसिड की लंबाई के एक पेप्टाइड से जुड़ा हुआ है कि अलग nitroaniline से सट जा सकता है । आम तौर पर, chromogenic सब्सट्रेट एक निश्चित चिढ़ाने के लिए विशिष्ट नहीं हैं और एक विशेष सब्सट्रेट सट कि छेड़ने की पर्याप्त ओवरलैप है. यहां प्रयुक्त सब्सट्रेट जैसे plasmin या प्लाज्मा kallikrein22के रूप में serine trypsin की एक पसंदीदा सब्सट्रेट है । विशिष्टता बढ़ाने के लिए, गतिविधि हमेशा के साथ एक बनती नमूना से निर्धारित किया जाना चाहिए और बिना एक अवरोध करनेवाला23,24. इस अध्ययन में, aprotinin को trypsin की तरह serine की गतिविधियों को परिभाषित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । अंतर से aprotinin-संवेदनशील गतिविधि की गणना करके, अन्य की गतिविधियों को छेड़ने से रद्द कर दिया जाता है । नेफ्रोटिक माउस में vivo में aprotinin के साथ इलाज किया, मूत्र serine को छेड़ने गतिविधि बढ़ा नहीं था और सबसे महत्वपूर्ण बात यह सोडियम प्रतिधारण की abrogation के साथ मेल खाती है. इस प्रकार, मूत्र serine को छेड़ने गतिविधि केवल नेफ्रोटिक सिंड्रोम में सोडियम प्रतिधारण के लिए कारण नहीं है, लेकिन यह भी नेफ्रोटिक सिंड्रोम में एक serine छेड़ने अवरोधक की प्रभावकारिता की भविष्यवाणी करने के लिए एक अगोचर माना जा सकता है, जो में एक नया चिकित्सकीय दृष्टिकोण बन सकता है नेफ्रोटिक सिंड्रोम का उपचार । Bohnert एट अलद्वारा अध्ययन में । 13, serine को छेड़ो अवरोध करनेवाला camostat और plasminogen रूपांतरण अवरोध करनेवाला ट्रेनेक्ज़ैमिक एसिड सोडियम प्रतिधारण जो मूत्र serine की गतिविधि को सामान्य करने के लिए एक विफलता के साथ मेल को रोकने में प्रभावी नहीं थे.

हालांकि डॉक्सोरूबिसिन एक अत्यधिक विषाक्त पदार्थ है, retrobulbar इंजेक्शन सुरक्षित है और किसी भी नुकसान है कि अच्छी तरह से पशु की जा रही बिगड़ा के साथ संबद्ध नहीं है । एक कि पूंछ नस इंजेक्शन एक और अधिक उपयुक्त पशु संकट को कम करने के दृष्टिकोण होगा बहस कर सकते हैं । एक तुलनात्मक अध्ययन में, हमें पता चला कि डॉक्सोरूबिसिन की पूंछ नस इंजेक्शन के माध्यम से प्रेरण चूहों कि नेफ्रोटिक सिंड्रोम विकसित नहीं किया था की एक उच्च दर के कारण retrobulbar मार्ग से हीन था (३४% गैर-उत्तरदाता) retrobulbar मार्ग द्वारा प्रेरित उन की तुलना में ( 0-15% गैर उत्तरदाता) । इसके अलावा, पूंछ नस इंजेक्शन द्वारा proteinuria कम करने के लिए क्षीणन सोडियम प्रतिधारण अग्रणी था । यह फार्माकोकाइनेटिक्स में मतभेद और तेजी से retrobulbar इंजेक्शन है कि podocyte क्षति से मॉडल प्रेरण के लिए आवश्यक है के बाद हासिल डॉक्सोरूबिसिन के एक उच्च शिखर एकाग्रता द्वारा समझाया जा सकता है । हालांकि, यह है कि retrobulbar इंजेक्शन एक उच्च कुशल और अनुभवी ऑपरेटर डॉक्सोरूबिसिन की भी मिनट मात्रा के extravasation से संबंधित जटिलता से बचने के लिए की जरूरत पर जोर दिया जाना चाहिए ।

अंत में, डॉक्सोरूबिसिन द्वारा प्रयोगात्मक नेफ्रोटिक सिंड्रोम 129S1 में proteinuric गुर्दे की बीमारी का एक बहुमुखी मॉडल है/SvImJ चूहों कि अत्यधिक वर्तमान वैज्ञानिक प्रश्नों की जांच करने के लिए अनुमति देता है, सबसे महत्वपूर्ण बात यह proteasuria.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह अध्ययन जर्मन रिसर्च फाउंडेशन (DFG, AR 1092/2-1) से अनुदान द्वारा समर्थित था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
supplies
BD Micro FINE + U-40 (0.30 mm x 8 mm) BD Deutschland GmbH, Heidelberg, Germany PZN: 07468060 syring
ETHILON*II (5/0, 16 mm, 3/8c, 45 cm) Johnson&Johnson Medical GmbH, Ethicon Deutschland, Norderstedt, Germany) EH7823H suture
Name Company Catalog Number Comments
reagents
aprotinin (6000 KIU/mg) LOXO, Heidelberg, Germany CAS 9087-70-1
Bepanthen, Augen- und Nasensalbe Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany PZN: 1578681 ointment
Chromogenix S-2251 HAEMOCHROM DIAGNOSTICA GmbH, Essen, Germany 82 0332 39 chromogenic substrate
doxorubicin (2.0 µg/µL) Cell Pharm, Bad Vilbel, Germany CAS 25316-40-9 doxorubicin
isofluran CP (1 mL/mL) CP-Pharma, Burgdorf, Germany CAS 26675-46-7 isofluran
pellets with matrix-driven sustained release (custom-made) Innovative Research of America, Sarasota, FL X-999 pellet
Name Company Catalog Number Comments
equipment
ELx808 Absorbance Mikroplate Reader BioTek, Bad Friedrichshall, Germany ELx808 microplate reader
MICROSTERIL - 436 B.M.S., Trescore Balneario, Italy GAL/436 sterilizer
Hybridization oven/shaker GE Healthcare UK Limited, Amersham LIFE SCIENCE, Little Chalfont, UK RPN 2511 heat chamber
Thermo MAT Pro 10 W, 15x25 cm, Lucky Reptile Import Export Peter Hoch GmbH, Waldkirch, Germany 61201 mouse warming device

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References

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मेडिसिन इश्यू १३५ प्रयोगात्मक नेफ्रोटिक सिंड्रोम डॉक्सोरूबिसिन चूहों retrobulbar aprotinin proteasuria
डॉक्सोरूबिसिन के Retrobulbar इंजेक्शन द्वारा चूहों में नेफ्रोटिक सिंड्रोम की प्रेरण और निरंतर रिलीज Aprotinin द्वारा मात्रा प्रतिधारण की रोकथाम
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Bohnert, B. N., Artunc, F. Induction … More

Bohnert, B. N., Artunc, F. Induction of Nephrotic Syndrome in Mice by Retrobulbar Injection of Doxorubicin and Prevention of Volume Retention by Sustained Release Aprotinin. J. Vis. Exp. (135), e57642, doi:10.3791/57642 (2018).

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