Summary
Burada, 129S1/SvImJ farelerde deneysel Nefrotik sendromda indüksiyon doksorubisin hızlı retrobulbar enjeksiyonu ile açıklayın. Ayrıca Nefrotik fareler sürekli yayın granül içeren aprotinin idrar serin proteaz aktivitesi inhibe ve sodyum saklama önlemek için tedavi ediyoruz.
Abstract
Nefrotik sendrom proteinuric böbrek hastalığı en uç tezahürü ve ödem sodyum retansiyonu ve hiperlipidemi nedeniyle ağır Proteinüri ve hipoalbüminemi ile karakterize. Bu sendrom Patofizyoloji çalışmaya, podocyte zarar doksorubisin gibi toksik maddelerin enjeksiyonu modelleri geliştirilmiştir kemirgen dayalı. Farelerde, sadece birkaç suş bu model için açıktır. Wildtype 129S1/SvImJ fareler, doksorubisin retrobulbar sinüs için hızlı intravenöz enjeksiyonla yönetim özellikleri insan hastalık sodyum retansiyonu ve ödem de dahil olmak üzere tüm belirtiler deneysel Nefrotik Sendromu neden olmaktadır. Proteinüri başlangıcı sonra fareler sergi epitel sodyum kanalı (ENaC) ve sodyum saklama harekete geçirmek yol açar idrar serin proteaz aktivitesi arttı. Farmakolojik idrar serin proteaz sürekli yayın aprotinin tedaviyle tarafından inhibisyonu ENaC harekete geçirmek abrogates ve sodyum saklama engeller. Bu model proteasuria, YaniPatofizyoloji çalışmaya idealdir., onun γ alt birim proteolizis tarafından ENaC harekete geçirmek neden aktif serin proteaz atılımı. Bu ENaC harekete geçirmek ve sodyum saklama proteinuric böbrek hastalığında birincil mekanizması olarak kabul edilebilir.
Introduction
Nefrotik sendrom ağır Proteinüri, hipoalbüminemi, ödem ve hiperlipidemi ile karakterizedir ve proteinuric böbrek hastalığı en uç tezahürü kabul edilebilir. Kemirgen, deneysel Nefrotik sendrom tarafından anthracyclines veya podocyte hasara yol açar ve insan minimal değişiklik hastalığı ve Fokal segmental glomerulosclerosis (FSGS)1benzer puromisindir tek enjeksiyon bağlı olmak. Frenk ve arktarafından 1955 yılında ilk açıklamasını sonra. 2, Sıçanlarda puromisindir nükleozit nefroz (PAN) çok sayıda çalışmalar3,4,5,6Nefrotik sendromda patofizyolojisi araştırmak için standart bir model haline gelmiştir. Farelerde, karşılık gelen modeli Antrasiklin doksorubisin7tarafından indüklenen. Ancak, genetik olarak en az iki genetik loci8tarafından belirlenir güçlü bir zorlanma-bağımlılık vardır. Buna ek olarak, proteinuric yanıt ve nefrotik sendrom9,10tabii farklılıklar vardır. 129S1/SvImJ fare ve doksorubisin hızlı intravenöz enjeksiyon yolu ile retrobulbar sinüs kullanılarak, Proteinüri yanıt Nefrotik sendromu, özellikle cilt saklama ile karakterize tipik özelliklerini ikna etmek yeterli olan değerleri ulaşmak asit ve idrar neredeyse sodyum ücretsiz7. Deneysel Nefrotik sendrom sodyum saklama etkinleştirme distal tübül epitel sodyum kanalının (ENaC) sonucu aberrantly süzülmüş serin proteaz proteolizis bir onun γ-alt birimi4 neden plasmin gibi tarafından olduğu tahmin ,11,12. Son zamanlarda, bu kavram proteolitik ENaC harekete geçirmek ve sodyum saklama ENaC engelleyici amiloride13eşit derecede etkili serin proteaz inhibitörü aprotinin tedaviyle tarafından korunan Nefrotik farelerde kanıtlanmış oldu. Distal tübül için sürekli teslim edilmesini sağlamak için aprotinin subkutan implante sürekli yayın topakları yönetiliyordu. Gelecekteki çalışmaları insan durum paralel düşünülmektedir Nefrotik Sendromu proteolitik ENaC harekete geçirmek için sorumludur serin proteaz tanımlamak için gereklidir. Bu amaçla, Nefrotik sendrom doksorubisin kaynaklı vahşi tipi fareler kullanılan veya genetik fareler için genişletilmiş değerli bir modeldir. Avantajları ilacın düşük maliyet, düşük karmaşıklık yönetimi ve iyi tekrarlanabilirlik14içerir.
Bu makalede, biz doksorubisin retrobulbar sinüs için hızlı intravenöz enjeksiyon ve implantasyon sürekli yayın pellet aprotinin idrar serin proteaz inhibe içeren tarafından deneysel Nefrotik sendromda indüksiyon göstermek chromogenic bir tahlil ile ölçülen aktivite.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm yöntemleri için bakım ve kullanım laboratuvar hayvan ve hayvan refahı için Alman hukuk Ulusal Sağlık Rehberi Enstitüleri göre yapılmıştır ve yerel yönetimler (Regierungspräsidium Tübingen) tarafından kabul edildi.
1. indüksiyon Retrobulbar sinüs için doksorubisin enjeksiyonla deneysel Nefrotik sendromda
- Takılı bir 30 G kanül 0.5 mL şırınga piston durağı konumunu işaretleyerek hazırlayın.
- Doksorubisin (7,25 µL/g vücut ağırlığı (bw) 14.5 µg/g bw doksorubisin için eşit) erkek ve dişi fareler (13,8 µg/g bw doksorubisin 6.9 µL/g bw eşit) sabah vücut ağırlığına bağlı enjeksiyon hacmi hesaplamak.
Not: Verilen doz Nefrotik sendromda indüksiyon için uygundur. Küçük değişiklikler dozda glomerular filtrasyon (12.6 µg/g bw doksorubisin) sadece küçük değişiklikler ile hafif kronik böbrek hastalıktan Akut böbrek yetmezliği (15,4 µg/g bw doksorubisin)7' yeulaşan nefropati, çok önemli bir farklı kurs yol, 15. - Doksorubisin çözüm (2 µg/µL) 37 ° C sıcak odasında hesaplanan miktarda sıcak.
Dikkat: Doksorubisin yuttu ve kansere neden olabilir zararlıdır. Her zaman eldiven doksorubisin ile çalışıyorsanız ve herhangi bir cilt temasından kaçının. - Şırınga doksorubisin çözüm ile işaretleme noktasına kadar prefill ve Bakiye sıfır olarak ayarlayın. Enjeksiyon birimle şırıngaya doldur ve birimin şırınga ağırlığında tarafından kontrol edin.
- Fareyi kullanarak bir Buharlaştırıcı ve oksijen akışı 2 L/dk 5 vol % isoflurane ile derinden narcotize.
- Enjeksiyon önce gözleri merhem kullanmayın. Işleç yörünge boşluğuna açık bir görünümünü güvenli ve başarılı retrobulbar enjeksiyon gerçekleştirmek için ihtiyacı var.
- Pedal refleks anestezi düzeyini değerlendirmek ve anestezik teslim enjeksiyon başlamadan önce ayarlayın.
- Fareyi sağ yanal recumbency sırtını operatörün vücut ve kafasını operatörün enjeksiyon el için karşı karşıya bakacak şekilde yerleştirin.
Not: Yordamı için sağ elini kullanan bir kişi, sol elli kişiler enjeksiyon sol el ile gerçekleştirme pozisyonu yapmak kolaydır ve doğru-e doğru ters enjeksiyon yaptı açıklanmıştır. - Dikkatle göz çukuru üzerinden fare sol gözü dorsal ve ventral göz deri hafif basınç uygulayarak çıkıntı.
- İç göz açıdan (medial palpebral komissür) sol retrobulbar sinüs delik. Herhangi bir mouse´s göz temasından kaçının.
- Biraz şırınga eğilme ve tek seferde tüm birimi enjekte. Birim herhangi bir direnç ve exopthalmus veya enjeksiyon sitesinden kaçak gibi ekstravazasyonu belirtisi olmadan enjekte edilir emin olun.
- Doksorubisin çok zehirli bir madde olduğundan, su kuyusu-varlık en az günde bir kez bir puanı yapraklık göre Morton ve Griffiths vd. kullanarak iade etme 16 ve ödeme özel ilgi enjeksiyon yeri. Ekstravazasyonu belirtisi exopthalmus seviyorsanız, Engelli göz kapağının kapatılması ya da kangren belirtisi şişme veya dış görünüm lezyonlar occure sonra enjeksiyon gibi ya da takip eden günlerde, fare euthanized.
2. sürekli yayın granül Aprotinin içeren implantasyonu
- Granül gün ve yayın süresi önceden başına istenen dozla sipariş. Aprotinin durumunda, 10 gün içinde yayımlanması günde 1 mg doz seçin.
Not: Bu çalışmada, bir doz 10 mg aprotinin granül içerir.- Granül kuru koşullarda saklamak ve herhangi bir nem maruz kaçının.
- Gerekli öğeler saç makas, Cilt hazırlık makas, neşter, cerrahi cımbız, doku cımbız iki çift, bir iğne bağı ve 15 cm monofile dikiş sigara tekrar Emilebilen gibi ameliyat için hazırlayın.
- 240 ° C'de 5 min için bir ısı sterilizasyon kullanarak aletleri sterilize Oda sıcaklığına gelinceye aletleri kullanmadan önce için 5 dakika bekleyin.
- Sterilize edilmiş araç ipuçları nonsteril yüzeyler için herhangi bir temastan kaçının.
- Cilt yanık sıcak araçlar tarafından kaçının.
- 240 ° C'de 5 min için bir ısı sterilizasyon kullanarak aletleri sterilize Oda sıcaklığına gelinceye aletleri kullanmadan önce için 5 dakika bekleyin.
- Fare ile isoflurane 5 vol % 1,5 vol % 2 L/min bir Buharlaştırıcı ve oksijen akışı kullanarak takip narcotize.
- Fare fare termal yaralanmaları önlemek için gazlı bez bir tabaka ile kaplı bir ısınma aygıtta yüzükoyun yerleştirin. Yüzey sıcaklığı yaklaşık 37 ° c.
- Merhem ile gözleri koruyun.
- Geri bir alanda makas veya saç makası kullanarak 0.5 cm2 hakkında orta saç kaldırmak ve tüysüz cilt cilt dezenfeksiyon için uygun bir dezenfektan ile dezenfekte. Olarak daha az saç bu fareyi yara ulaşmak daha zor kalır ve daha sonra konu biter böylece mümkün olduğunca ve vücut sıcaklığı tutmak için kaldırın.
- Bir neşter yaklaşık 1 cm derinlik künt bir hazırlık kullanarak deri altı bağ dokusu içinde Kraniyo-Kaudal yönde bir uzunluğunda, yaklaşık 5 mm. hazırlama sol yanal kese tüysüz kabuğuyla deşmek.
- Pedal refleks anestezi düzeyini değerlendirmek ve anestezik teslim ameliyat başlamadan önce ayarlayın.
- Bir 10 günlük yayın Pelet steril doku cımbız kullanarak hazırlanmış sol yanal kese yerleştirin. Belgili tanımlık kese dibinde Pelet düzlemsel bir konumda bırakın.
- Pelet sıvı ve nem kadar herhangi bir temas hazırlanan çantada yerleştirilen kaçının.
- 2-3 dikiş ile cilt kapatın. Sadece dikiş kemiren tarafından açmak fare için anlaması için çok kısa iş parçacığı biter bırakın.
- Tek tek ameliyat sonrası sıkıntı azaltmak ve dikiş açılması kemiren tarafından önlemek için fareler yer. Narkoz sonra yeterli bilinci yerine geldi kadar fareyi görünümde tutma.
Not: Gerek yoktur Postoperatif ağrı yönetimi için beri bu tür müdahale rahatsızlık veya ağrı belirtisi iyi tolere edilir. Alternatif olarak topikal ilaçlar, örneğin bupivacaine kesi en fazla 8 saat analjezi sağlayacak kapatma önce üzerinde bir damla öneririz.
3. değerlendirme modeli indüksiyon, Nefrotik sendrom işaretleri ve iyi olmak için
- Sabah idrar (08:00 am) mesane masaj enjeksiyon günden itibaren her gün tepki bardağa (1,5 mL) toplamak.
- Proteinüri Bradford protein tahlil kullanarak ölçün ve kreatinin için normalleştirmek.
Not: için indüksiyon Nefrotik sendromda 120 mg/mg kreatinin doksorubisin enjeksiyon sonra 7 ve 10 gün arasında bir eşik Proteinüri ulaştırılması gerekmektedir.
- Proteinüri Bradford protein tahlil kullanarak ölçün ve kreatinin için normalleştirmek.
- Asit gelişmesi için bak. Karın çevresi veya taşkın yanları artış için kontrol edin.
- Fare, gıda granül ve içki şişesi sabah (08:00 am) her gün tartın.
- Su kuyusu-varlık en az puanı yapraklık göre Morton ve Griffiths ve arkkullanarak günde bir kontrol edin. 16
4. idrar serin proteaz Chromogenic bir tahlil ile ölçülmesi
- Bir şişe lyophilised chromogenic substrat konsantrasyonu 2 mM verimli S-2251, 25 mg 15 mL steril fosfat tamponlu tuz (PBS) ekleyerek substrat çalışma çözeltisi hazırlamak. Aprotinin 2 mg/mL bir konsantrasyon ile bir aprotinin çözümü elde etmek için PBS çözülür.
- -20 ° C'de hazır çözümler depolamak Bu S-2251 otomatik bozulması önemli ölçüde yavaşlatır. Eski çözümler sarı güçlü bir gölge ile kullanmayın.
- Taze hazırlanmış veya çözdürülen substrat çalışma çözüm kullanın ve 37 ° C ısı odasında sıcak.
- İdrar numuneleri, oda sıcaklığında erimek.
- Tekrarlanan çözdürme ve dondurma kaçınarak proteaz yıkımı önlemek. İdrar numuneleri-20 ° C'de depolayın
- Fotometrik ölçüm için uygun bir 96 microwell tabak kullanın. Su katılmamış idrar 3 µL her iki kuyu içinde ekleyin ve substrat çalışma çözeltisi 50 µL PBS veya aprotinin çözüm 3 µL ile wells için ekleyin. Bir plaka mühürleyen ile plaka kapak.
- 60 dk 37 ° C ısı odasında kapalı microwell plaka kuluçkaya.
- Her şey 450 de optik yoğunluğunu ölçmek Mikroplaka okuyucu kullanarak nm.
- OD aprotinin olmadan ve aprotinin idrar aprotinin duyarlı serin proteaz aktivitesi olarak arasındaki fark almak.
Not: belgili tanımlık substrate Ayrıca patofizyolojik bir rol oynamak yok diğer proteaz tarafından i ciddi bu yana testin özgüllüğü ölçüm eşleştirilmiş örneği olan ve olmayan aprotinin artırır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
İsoflurane narkoz indüksiyon sonra doksorubisin hızla sol retrobulbar sinüs enjekte ettiler. Birimin tümü herhangi bir direnç ve ispat ekstravazasyonu kanül intravenöz konumunu doğru olmadan 7,25 µL/g bw enjekte ettiler. Fare narkoz hızla iyileşti ve o gün ve bundan sonra hiçbir bozukluk vardı. Özellikle, sol göz zarar belirtisi yok oldu. Doksorubisin genel bir toksik etkisi nedeniyle ilk 3 gün içinde düştü ve bundan sonra kurtarılan doksorubisin enjeksiyon, gıda ve sıvı alımı sonra (Şekil 1a). Enjeksiyon sonra ilk 3 gün boyunca, fare inappetence (Şekil 1b) sayesinde, vücut ağırlığının % 3.4 kaybetti. Üzerinde 5inci günden itibaren fare idrar sodyum atılımı yeterli gıda alımı (Şekil 1a, b) rağmen büyük bir düşüş izledi belirgin Proteinüri (şekil 1 c) geliştirdi. Bu sodyum saklama ve vücut ağırlığı büyük bir kazanç için 3 günden 10 güne kadar 22,2 oranında kurşun asit tarafından eşlik etti. Proteinüri sonucu olarak, fare hipoalbüminemi (şekil 1 c) geliştirdi. 10 günde alınan bir plazma örneği hiperlipidemi görünür oldu. Bu veriler doksorubisin hızla ve etkileyici retrobulbar sinüs tarafından verilen bir tam gelişmiş Nefrotik sendrom wildtype 129S1/SvImJ farelerde indükler göstermektedir.
Deneysel Nefrotik sendrom sodyum saklama ENaC harekete geçirmek plasmin11,12gibi serin proteaz anormal filtrasyon sayesinde bağlıydı. Bu kavram doğru tutuyorsa, idrar serin proteaz aprotinin tarafından inhibisyonu ENaC harekete geçirmek ve sodyum saklama korumalısınız. Aprotinin etkisi ENaC harekete geçirmek çalışmaya, Nefrotik fare aprotinin ile tedavi. Aprotinin hızla glomerular filtrasyon tarafından temizlenir, biz İlaç İdaresi 10 gün içinde sürekli distal tübül aprotinin kullanılabilirliğini sağlamak için sürekli yayın Pelet kullanarak seçti. Doksorubisin enjeksiyon sonra üçüncü gününde, tek bir fare ile bir aprotinin içeren Pelet implante ve kontrol fare bir plasebo Pelet isoflurane narkoz altında aldı. Hayvanlar hızla form narkoz yeniden elde etmek ve herhangi bir sorun olmadan yarasını iyileştirdi. Günden sonra 5, Proteinüri benzer ölçüde (şekil 2a) her iki farelerde geliştirilmiş. Ancak, yalnızca plasebo tedavi Nefrotik fareler sodyum retansiyonu (şekil 2b) ve vücut kilo ENaC harekete geçirmek gösteren (Şekil 2 c) deneyimli. Buna ek olarak, aprotinin tedavi fare sodyum saklama korumalı ve vücut ağırlığı kazanç (şekil 2b, c). Bu açıkça idrar serin proteaz aktivitesi Nefrotik Sendromu sodyum tutma nedeni olduğunu göstermektedir.
Plazma ve idrar elde aprotinin konsantrasyonu bir ELISA ile ölçüldü. Şekil 3aiçinde gösterildiği gibi Üriner aprotinin konsantrasyon ve yakında implantasyon sonra doruğa bundan sonra sabit kaldı. Plazma aprotinin konsantrasyon tedavi 10 gün sonra 13 µg/mL (2 µM), hangi aprotinin tedavi edilen hastaların17' elde plazma konsantrasyonu karşılaştırılabilir Oysa idrar aprotinin konsantrasyon 207 ± 29 µg/mL (32 ± 4 µM) olduğu anlamına. Aprotinin idrar serin proteaz aktivitesi üzerine etkisi deneysel Nefrotik sendrom süresince alınan İdrar numuneleri kullanılarak chromogenic bir tahlil ile ölçüldü. Bu tahlil fotometri 450 tarafından kolayca algılanabilir p-nitroaniline serbest bırakmak belgili tanımlık substrate peptit bağı hidroliz dayanır nm. Şekil 3b' de gösterildiği gibi serin proteaz aktivitesi idrarda Proteinüri başlangıcı paralel olarak plasebo tedavi Nefrotik fare hızla arttı. Buna ek olarak, idrar serin proteaz aktivitesi tamamen ENaC harekete geçirmek ve şekil 2b, cgösterilen sodyum saklama önlenmesi ile rastlayan aprotinin tedavi Nefrotik Mouse inhibe.
Şekil 1: Tabii ki gıda ve sıvı alımı (a), idrar sodyum atılımı ve vücut ağırlığı (b) ve proteinüri ve plazma albumin konsantrasyonu (c) önce ve sonra indüksiyon deneysel Nefrotik sendromda. Bir düşüş sonra gıda, sıvı alımı üzerine ilk üç gün sonra doksorubisin, fareler bir hemen hemen sürekli alımı göster. Beş gün sonra Proteinüri gelişimi başlar ve gün 7 ve 10, tam gelişmiş Nefrotik sendrom ödem oluşumu, sodyum saklama ve hipoalbüminemi ile yol arasındaki Nefrotik eşiği ulaşır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: Tabii ki Proteinüri (a), idrar sodyum atılımı (b) ve (c) Mouse vücut ağırlığı tedavi aprotinin veya plasebo Pelet ile her gün 3'den sonra doksorubisin enjeksiyon. Proteinüri benzer bir ölçüde geliştirilmesi rağmen aprotinin sodyum retansiyonu ve ödem oluşumu ENaC etkinleştirme sırasında Nefrotik Sendromu nedeniyle karşı koruma sağlar. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: Tabii ki Pelet implantasyonu sonrası idrar aprotinin konsantrasyon aprotinin plazma konsantrasyonu ile. 4. adımda açıklanan chromogenic tahlil ders Üriner serin proteaz aktivitesinin ölçülmüştür. İdrar aprotinin konsantrasyon yakında implantasyon sonra doruklarına ve bundan sonra sabittir. Serin proteaz aktivitesi idrarda Proteinüri başlangıcı paralel olarak Nefrotik sendrom sırasında hızla artar. Aprotinin in vivo karşı idrar serin proteaz etkinliğinde önler. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, doksorubisin enjeksiyon retrobulbar sinüs enjeksiyon yolu ile Proteinüri, sodyum retansiyonu, hypoalbumenia ve hiperlipidemi ile 129S1/SvImJ farelerde deneysel Nefrotik sendrom indükler göstermektedir. Ancak, bu model kullanırken dikkate alınması gereken iki önemli sorun vardır. İlk olarak, model indüksiyon kesinlikle doz bağımlı ve sapmalar doksorubisin doz 0.3 µg/g küçük fareler15yanıt etkiler. İle 14 µg/g gibi daha düşük bir dozda enjekte edildiğinde bw veya aşağıda, doksorubisin aleni sodyum saklama, asit ve hiperlipidemi ile ilişkili değil sadece Nefrotik Proteinüri neden olur. Buna ek olarak, daha yüksek bir doz, enjeksiyonu Akut böbrek yetmezliği ve yüksek akut ölüm yol açar. Doz ve yanıt farelerin göre insan Akut böbrek yaralanma (AKI) benzeyen bir ders, kronik böbrek hastalığı ile glomerular filtrasyon korunmuş doksorubisin nedenleri (CKD aşamasında G1-3) oranı ya da ilerici kronik böbrek hastalıkları ile sınırlı yükselmeye7,15' e lider glomerular filtrasyon (CKD G4-5).
İkinci olarak, bu model için belirli fare suşları sınırlı ve yaygın olarak kullanılan C57Bl/6 zorlanma dayanıklı8. Ayrıca, onlar bir backcross sırasında mevcut olabilecek gibi genetik kirlenme için önemli ölçüde daha düşük bir yanıt oranı neden olabilir. Bu bir ölçüde doksorubisin doz artırarak önlenebilir. Ancak, doksorubisin doz modeli indüksiyon için kullanılan (14,5 µg/g bw) olduğunu zaten açıklanan LD50 15-17 µg/g arasında yakın bw bu zorlanma7,18.
Bu fare modeli kullanımı farklı son derece yenilikçi sorular endocrinological dysregulations ve renal anemi15Proteinüri ve ödem oluşumu ulaşan Nefrotik sendromu ile ilgili çalışma imkanı sağlar. Bu anlamda, doksorubisin kaynaklı nefropati insan CKD geniş yelpazede kapsar ve Nefroloji içinde kullanılan geçerli modeller için iyi bir alternatif araştırma böyle 5/6 nefrektomi19,20 ya da tek taraflı üreter ligasyonu21. Ayrıca, belirli bir gen serum ve glukokortikoid kinaz 1 (SGK1) eksikliği gibi modeli sırasında ilgi rolü çalışmaya genetik fareler modeli uygulamak mümkündür7'yi veya diğerleri.
Proteasuria, Yanioluşumu özel özelliğidir sunulan modeli., onun γ alt birim proteolizis tarafından ENaC harekete geçirmek neden aktif serin proteaz atılımı. Bu hızlı vücut kilo alımı ve asit geliştirme sonra proteasuria baslangici ile karakterize bir neredeyse sodyum ücretsiz cilt ve idrar tutma atılımı yol açar. Ancak, bu geçici bir olgudur ve 15 gün sonra fare kendiliğinden asit gevşek ve proteinüri devam ederse rağmen kilo. Nedeni, ancak, zor kalır. Bu paradoksal davranış Ayrıca Nefrotik fareler4 ile çalışmalarda gözlenmiştir ve Rodents deneysel Nefrotik sendromda genel bir özelliği temsil edecek gibi görünüyor.
İdrar serin proteaz aktivitesi basit ve hızlı chromogenic bir tahlil ile ölçüldü. P-nitroaniline tarafından farklı proteaz i ciddi 4 amino asit uzunluğunda bir peptid bağlantılı Amid bağı hidroliz dayanmaktadır. Genel olarak, chromogenic yüzeylerde belirli bir proteaz için spesifik değildir ve belirli bir substrat ayırmak proteaz önemli örtüşme. Burada kullanılan substrat tripsin benzeri serin proteaz kallikrein22plasmin veya plazma gibi tercih edilen bir substrat var. Özgüllüğü artırmak için her zaman olan ve olmayan bir inhibitörü23,24eşleştirilmiş bir örnekten proteaz aktivitesi tespit edilmelidir. Bu çalışmada, aprotinin tripsin benzeri serin proteaz aktivitesinin belirlemek için kullanılmıştır. Fark aprotinin duyarlı aktivitesinden hesaplayarak, diğer proteaz faaliyetlerinin iptal edildi. Nefrotik Mouse aprotinin içinde vivo ile tedavi idrar serin proteaz aktivitesi değil artmış ve en önemlisi sodyum saklama ‹ptal ile aynı zamana denk geldi. Böylece, idrar serin proteaz aktivitesi sadece Nefrotik Sendromu sodyum saklama için nedensel değil ama aynı zamanda kabul edilebilir bir serin proteaz inhibitörü yeni bir tedavi amaçlı haline gelebilir Nefrotik Sendromunda etkinliğinin tahmin etmek için bir biyomarker yaklaşım Nefrotik sendromda tedavi. Çalışmayla Bohnert ve ark. 13, serin proteaz inhibitörü camostat ve plazminojen dönüşüm inhibitörü tranexamic asit idrar serin proteaz aktivitesi normalize etmek bir hata ile çakıştı sodyum saklama önlemede etkili değildi.
Doksorubisin çok zehirli bir madde olmakla beraber, retrobulbar enjeksiyon güvenli ve hayvan refahı engelliler zarar ile ilişkili değil. Bir kuyruk ven enjeksiyon yardım azaltarak daha uygun bir yaklaşım olacaktır iddia olabilir. Karşılaştırmalı bir çalışmada, biz indüksiyon doksorubisin kuyruk ven enjeksiyon yoluyla retrobulbar rota Nefrotik Sendrom (sigara % 34 cevap) bu indüklenen retrobulbar rota (tarafından) göre geliştirmek değil fareler daha yüksek oranda nedeniyle daha aşağı olduğunu öğrendim 0-%15 sigara cevap). Buna ek olarak, Proteinüri kuyruk ven enjeksiyonla zayıflatılmış sodyum saklama için önde gelen düşük oldu. Bu farklılıklar farmakokinetik ve podocyte hasar modeli indüksiyon için önemlidir hızlı retrobulbar enjeksiyon sonra elde doksorubisin daha yüksek bir tepe konsantrasyon açıkladı. Ancak, retrobulbar enjeksiyon doksorubisin bile dakika miktarda ekstravazasyonu için ilgili komplikasyon önlemek için çok yetenekli ve deneyimli bir operatör ihtiyacı vurguladı gerekir.
Sonuç olarak, doksorubisin deneysel Nefrotik Sendromu son derece geçerli bilimsel sorular, en önemlisi proteasuria araştırmak için izin veren proteinuric böbrek hastalığının 129S1/SvImJ farelerde çok yönlü bir modeldir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu çalışmada bir hibe (DFG, AR 1092/2-1) Alman Araştırma Vakfı tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| supplies | |||
| BD Micro FINE + U-40 (0.30 mm x 8 mm) | BD Deutschland GmbH, Heidelberg, Germany | PZN: 07468060 | syring |
| ETHILON*II (5/0, 16 mm, 3/8c, 45 cm) | Johnson&Johnson Medical GmbH, Ethicon Deutschland, Norderstedt, Germany) | EH7823H | suture |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| reagents | |||
| aprotinin (6000 KIU/mg) | LOXO, Heidelberg, Germany | CAS 9087-70-1 | |
| Bepanthen, Augen- und Nasensalbe | Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany | PZN: 1578681 | ointment |
| Chromogenix S-2251 | HAEMOCHROM DIAGNOSTICA GmbH, Essen, Germany | 82 0332 39 | chromogenic substrate |
| doxorubicin (2.0 µg/µL) | Cell Pharm, Bad Vilbel, Germany | CAS 25316-40-9 | doxorubicin |
| isofluran CP (1 mL/mL) | CP-Pharma, Burgdorf, Germany | CAS 26675-46-7 | isofluran |
| pellets with matrix-driven sustained release (custom-made) | Innovative Research of America, Sarasota, FL | X-999 | pellet |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| equipment | |||
| ELx808 Absorbance Mikroplate Reader | BioTek, Bad Friedrichshall, Germany | ELx808 | microplate reader |
| MICROSTERIL - 436 | B.M.S., Trescore Balneario, Italy | GAL/436 | sterilizer |
| Hybridization oven/shaker | GE Healthcare UK Limited, Amersham LIFE SCIENCE, Little Chalfont, UK | RPN 2511 | heat chamber |
| Thermo MAT Pro 10 W, 15x25 cm, Lucky Reptile | Import Export Peter Hoch GmbH, Waldkirch, Germany | 61201 | mouse warming device |
References
- Lee, V. W., Harris, D. C. Adriamycin nephropathy: a model of focal segmental glomerulosclerosis. Nephrology (Carlton). 16 (1), 30-38 (2011).
- Frenk, S., Antonowicz, I., Craig, J. M., Metcoff, J. Experimental nephrotic syndrome induced in rats by aminonucleoside; renal lesions and body electrolyte composition. Proc Soc Exp Biol Med. 89 (3), 424-427 (1955).
- Ichikawa, I., et al. Role for intrarenal mechanisms in the impaired salt excretion of experimental nephrotic syndrome. J Clin Invest. 71, (1983).
- Deschenes, G., Wittner, M., Stefano, A., Jounier, S., Doucet, A. Collecting duct is a site of sodium retention in PAN nephrosis: a rationale for amiloride therapy. J Am Soc Nephrol. 12 (3), 598-601 (2001).
- Lourdel, S., et al. Hyperaldosteronemia and activation of the epithelial sodium channel are not required for sodium retention in puromycin-induced nephrosis. J Am Soc Nephrol. 16 (12), 3642-3650 (2005).
- Seigneux, S., Kim, S. W., Hemmingsen, S. C., Frokiaer, J., Nielsen, S. Increased expression but not targeting of ENaC in adrenalectomized rats with PAN-induced nephrotic syndrome. Am J Physiol Renal Physiol. 291 (1), F208-F217 (2006).
- Artunc, F., et al. Serum- and glucocorticoid-inducible kinase 1 in doxorubicin-induced nephrotic syndrome. Am J Physiol Renal Physiol. 295 (6), F1624-F1634 (2008).
- Zheng, Z., et al. A Mendelian locus on chromosome 16 determines susceptibility to doxorubicin nephropathy in the mouse. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (7), 2502-2507 (2005).
- Kimura, M., et al. Interstrain differences in murine daunomycin-induced nephrosis. Nephron. 63 (2), 193-198 (1993).
- Wang, Y., Wang, Y. P., Tay, Y. C., Harris, D. C. Progressive adriamycin nephropathy in mice: sequence of histologic and immunohistochemical events. Kidney Int. 58 (4), 1797-1804 (2000).
- Svenningsen, P., et al. Plasmin in nephrotic urine activates the epithelial sodium channel. Journal of the American Society of Nephrology : JASN. 20 (2), 299-310 (2009).
- Passero, C. J., Hughey, R. P., Kleyman, T. R. New role for plasmin in sodium homeostasis. Curr Opin Nephrol Hypertens. 19 (1), 13-19 (2010).
- Bohnert, B. N., et al. Aprotinin prevents proteolytic epithelial sodium channel (ENaC) activation and volume retention in nephrotic syndrome. Kidney Int. 93 (1), 159-172 (2018).
- Pippin, J. W., et al. Inducible rodent models of acquired podocyte diseases. Am J Physiol Renal Physiol. 296 (2), F213-F229 (2009).
- Bohnert, B. N., et al. Impact of phosphorus restriction and vitamin D-substitution on secondary hyperparathyroidism in a proteinuric mouse model. Kidney Blood Press Res. 40 (2), 153-165 (2015).
- Morton, D. B., Griffiths, P. H. Guidelines on the recognition of pain, distress and discomfort in experimental animals and an hypothesis for assessment. Vet Rec. 116 (16), 431-436 (1985).
- Beath, S. M., et al. Plasma aprotinin concentrations during cardiac surgery: full- versus half-dose regimens. Anesth Analg. 91 (2), 257-264 (2000).
- Kanter, P. M., et al. Preclinical toxicology study of liposome encapsulated doxorubicin (TLC D-99): comparison with doxorubicin and empty liposomes in mice and dogs. In Vivo. 7 (1), 85-95 (1993).
- Ma, L. J., Fogo, A. B. Model of robust induction of glomerulosclerosis in mice: importance of genetic background. Kidney Int. 64 (1), 350-355 (2003).
- Kren, S., Hostetter, T. H. The course of the remnant kidney model in mice. Kidney Int. 56 (1), 333-337 (1999).
- Mizuno-Horikawa, Y., Mizuno, S., Tamura, S., Kurosawa, T. Advanced glomerulosclerosis is reversible in nephrotic mice. Biochem Biophys Res Commun. 284 (3), 707-713 (2001).
- Friberger, P. Chromogenic peptide substrates. Their use for the assay of factors in the fibrinolytic and the plasma kallikrein-kinin systems. Scand J Clin Lab Invest Suppl. 162, 1-298 (1982).
- Haerteis, S., et al. Plasma kallikrein activates the epithelial sodium channel in vitro but is not essential for volume retention in nephrotic mice. Acta Physiologica. , (2018).
- Schork, A., et al. Association of Plasminuria with Overhydration in Patients with CKD. Clin J Am Soc Nephrol. 11 (5), 761-769 (2016).
