Summary
Hier beschrijven we de inductie van experimentele nefrotisch syndroom bij 129S1/SvImJ muizen door snelle retrobulbaire injectie van Doxorubicine. Wij behandelen ook nefrotisch muizen met aanhoudende release pellets met aprotinin remmen urine serine protease-activiteit te voorkomen retentie van natrium.
Abstract
Nefrotisch syndroom is de meest extreme uiting van proteinuric nierziekte en gekenmerkt door zware Proteïnurie, hypoalbuminemia en oedeem te wijten aan natrium retentie en hyperlipidemie. Studeren de pathofysiologie van dit syndroom, knaagdier modellen zijn ontwikkeld gebaseerd op de injectie van giftige stoffen zoals Doxorubicine podocyte schade. Bij muizen zijn alleen enkele stammen gevoelig voor dit model. In wildtype 129S1/SvImJ muizen induceert het beheer van Doxorubicine door snelle intraveneuze injectie aan de sinus van retrobulbaire experimentele nefrotisch syndroom dat beschikt over alle symptomen van de ziekte van de mens, met inbegrip van de retentie van natrium en oedeem. Na het begin van Proteïnurie verhoogde muizen vertonen urine serine protease activiteit die tot de activering van het kanaal van de epitheliale natrium (ENaC) en de retentie van natrium leidt. Farmacologische remming van urine serine proteasen door de behandeling met aanhoudende release aprotinin intrekt ENaC activatie en retentie van natrium voorkomt. Dit model is ideaal om te studeren de pathofysiologie van proteasuria, dwz., de uitscheiding van actieve serine proteasen waardoor ENaC activering door de proteolyse van de γ-subunit. Dit kan worden beschouwd als het primaire mechanisme van ENaC activatie en retentie van natrium in proteinuric nierziekte.
Introduction
Nefrotisch syndroom wordt gekenmerkt door zware Proteïnurie, hypoalbuminemia, oedeem en hyperlipidemie, en kan worden beschouwd als de meest extreme uiting van proteinuric nierziekte. Bij knaagdieren, kan experimentele nefrotisch syndroom worden opgewekt door enkele injectie van anthracyclines of puromycin die leidt tot schade van de podocyte en lijkt op de menselijke minimale verandering ziekte en focale segmentale glomerulosclerosis (FSGS)1. Na de eerste beschrijving in 1955 door Frenk et al. 2, puromycin nucleoside nefrose (PAN) in ratten is een standaard model te onderzoeken de pathofysiologie van nefrotisch syndroom in talrijke studies3,,4,5,6geworden. Bij muizen, kan het desbetreffende model worden opgewekt door de anthracycline Doxorubicine7. Er is echter een sterke stam-afhankelijkheid die is genetisch bepaald door ten minste twee genetische loci8. Daarnaast zijn er verschillen in de proteinuric reactie en het verloop van het nefrotisch syndroom9,10. Met 129S1/SvImJ muizen en snelle intraveneuze injectie van Doxorubicine via de retrobulbaire sinus bereikt, Proteïnurie reacties waarden die toereikend zijn voor het opwekken van de typische kenmerken van nefrotisch syndroom, vooral volume retentie gekenmerkt door ascites en bijna natriumvrij urine7. Natrium retentie in experimentele nefrotisch syndroom heeft zijn ervan uitgegaan dat het resultaat van de activering van het kanaal (ENaC) van de epitheliale natrium in de distale zaadvormende door aberrantly gefilterde serine proteasen zoals Plasmine veroorzaakt proteolyse van de γ-subunit4 ,11,12. Dit concept werd onlangs, bewezen in nefrotisch muizen die werden beschermd tegen Proteolytische ENaC activatie en retentie van natrium door behandeling met de serine protease inhibitor aprotinin dat even effectief als de ENaC blocker amiloride13 was. Om te zorgen voor continue levering aan de distale zaadvormende, werd aprotinin toegediend via subcutaan geïmplanteerde aanhoudende release pellets. Toekomstige studies zijn vereist ter aanduiding van de serine proteasen die verantwoordelijk voor Proteolytische ENaC activering in nefrotisch syndroom, die wordt beschouwd zijn als de menselijke situatie parallel. Voor dit doel is Doxorubicine-geïnduceerde nefrotisch syndroom een waardevol model dat kan worden gebruikt in wild-type muizen of uitgebreid tot genetisch gemanipuleerde muizen. De voordelen zijn lage kosten van de drug, lagere complexiteit van management en goede reproduceerbaarheid14.
In dit artikel tonen we de inductie van experimentele nefrotisch syndroom door snelle intraveneuze injectie van Doxorubicine aan de retrobulbaire sinus en implantatie opgelopen-release pellets met aprotinin om te remmen urine serine protease activiteit zoals gemeten met een chromogenic test.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle methodes werden uitgevoerd volgens de nationale instituten van gezondheid gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren en het Duitse recht voor het welzijn van dieren en ze zijn goedgekeurd door de lokale autoriteiten (Regierungspräsidium Tübingen).
1. de inductie van experimentele nefrotisch syndroom door Doxorubicine injectie aan de retrobulbaire Sinus
- Bereid een 0,5 mL injectiespuit met een gemonteerde 30G canule door markering van de stop-stand van de zuiger.
- Bereken geïnjecteerde volume van Doxorubicine voor (7,25 µL/g lichaamsgewicht (bw) gelijk is aan 14,5 µg/g bw Doxorubicine) mannelijke en vrouwelijke muizen (6.9 µL/g bw gelijk aan 13.8 µg/g bw Doxorubicine) volgens het lichaamsgewicht van de ochtend.
Opmerking: De gegeven dosering is geschikt voor inductie van nefrotisch syndroom. Kleine wijzigingen in de dosering leiden tot een cruciale verschillende natuurlijk nefropathie bereiken van milde chronische nierziekte met slechts kleine veranderingen in het glomerulaire filtratie snelheid (12.6 µg/g bw Doxorubicine) naar acute nier falen (15,4 µg/g bw Doxorubicine)7, 15. - Het berekende bedrag van Doxorubicine oplossing (2 µg/µL) in een warme kamer van 37 ° C warm.
Let op: Doxorubicine is schadelijk bij opname door de mond en kanker kunnen veroorzaken. Altijd draag handschoenen als werken met Doxorubicine en Vermijd elk contact met de huid. - Prefill de spuit met Doxorubicine oplossing tot het punt van de markering en de balans op nul gezet. Vul de injectiespuit met het geïnjecteerde volume en het volume controleren door weging van de spuit.
- Narcotize diep de muis met 5 vol % Isofluraan met behulp van een vaporizer en zuurstof stroom van 2 L/min.
- Gebruik geen zalf op de ogen vóór de injectie. De exploitant moet een duidelijk beeld van de orbitale holte voor het uitvoeren van een veilige en succesvolle retrobulbaire injectie.
- Beoordelen van het niveau van de verdoving door pedaal reflex en verdoving levering pas indien nodig voordat de injectie.
- Plaatst u de muisaanwijzer op een recht laterale lighouding met haar rug kijkend naar het operator's lichaam en haar hoofd kijkend naar de exploitant injectie hand.
Opmerking: De procedure is beschreven voor een rechtshandig persoon, voor linkshandige personen die de injectie met de linkerhand het is makkelijker om te doen de positie en injectie omgekeerd rechts naar links. - Zorgvuldig uitsteken van de muis links oogbol van de oogkas door zachte druk uit te oefenen op de huid, de dorsale en ventrale voor het oog.
- Punctie van de linker retrobulbaire sinus van de hoek van het innerlijk oog (mediale ooglidreflex commissuur). Vermijd elk contact met de oogbol mouse´s.
- Lichtjes kantelen van de spuit en volledige volume in één keer te injecteren. Zorg ervoor dat het volume wordt geïnjecteerd zonder enige weerstand en zonder enig teken van extravasation zoals exopthalmus of lekkage van de injectieplaats.
- Aangezien Doxorubicine een bijzonder giftige stof is, controleren welzijn ten minste eenmaal per dag met behulp van een scorekaart volgens Morton en Griffiths et al. 16 en betalen speciale aandacht voor de injectieplaats. Symptomen van extravasation als exopthalmus, verminderde ooglid sluiting of geen tekenen van necrose zoals zwelling of huid laesies occure na injectie of in de volgende dagen, de muis moet worden euthanized.
2. het implanteren van aanhoudende-Release Pellets met Aprotinin
- Pellets met de gewenste dosis per dag en release duur op voorhand bestellen Kies in het geval van aprotinin, een dosis van 1 mg per dag gedurende 10 dagen worden vrijgegeven.
Opmerking: In deze studie, de aprotinin pellets bevatten een dosis van 10 mg.- Opslaan van de pellets onder droge omstandigheden en Vermijd eventuele blootstelling aan vochtigheid.
- Vereiste onderdelen voor te bereiden voor de operatie, met inbegrip van een paar van haar schaar, een paar huid voorbereiding schaar een scalpel, chirurgische pincetten, twee paren van weefsel pincet, een naald houder en 15 cm monofile hechtdraad niet resorbeerbare.
- Steriliseren van de instrumenten met behulp van een warmte-sterilisator voor 5 min op 240 ° C. Voordat u de instrumenten, gedurende 5 minuten te wachten totdat ze bij kamertemperatuur.
- Vermijd elk contact van gesteriliseerde instrument tips voor niet-steriele oppervlakken.
- Voorkomen branden van de huid door hete instrumenten.
- Steriliseren van de instrumenten met behulp van een warmte-sterilisator voor 5 min op 240 ° C. Voordat u de instrumenten, gedurende 5 minuten te wachten totdat ze bij kamertemperatuur.
- Narcotize muis met Isofluraan 5 vol % gevolgd door 1,5 vol % met behulp van een vaporizer en zuurstof stroom van 2 L/min.
- Hiermee plaatst u de muisaanwijzer in een liggend op een opwarming van de aarde apparaat bedekt met een laagje gaas om thermische verwondingen aan de muis. Oppervlakte temperatuur is ongeveer 37 ° C.
- Bescherm de ogen met zalf.
- De haren op het midden terug in een gebied van 0,5 cm2 met behulp van schaar of een tondeuse verwijderen en Desinfecteer de kale huid met een desinfecterend middel geschikt voor desinfectie van de huid. Verwijder als minder haren mogelijk zodat het moeilijker voor de muis tot de wond blijft en draad later eindigt en te houden van de lichaamstemperatuur.
- Incise de kale huid met een scalpel in cranio-caudal richting in een lengte van ongeveer 5 mm. voorbereiden een linker laterale zak van ongeveer 1 cm diepte in het onderhuids bindweefsel met behulp van een botte voorbereiding.
- Beoordelen van het niveau van de verdoving door pedaal reflex en verdoving levering pas indien nodig voordat chirurgie.
- Een 10-daagse introductie pellet invoegen het bereid links laterale zakje met behulp van steriele weefsel pincet. Laat de pellet aan de onderkant van het zakje in een vlakke positie.
- Vermijd elk contact van de pellet tegen vocht en vocht tot in het voorbereid zakje geplaatst.
- Sluit de huid met 2-3 hechtingen. Laat slechts zeer korte draadeinden zodat het moeilijker voor de muis om te openen de hechtingen door knagen.
- Plaats de muizen individueel te verminderen van postoperatieve nood en om te voorkomen dat de opening van de hechtingen door knagen. Houd de muis in de weergave totdat het voldoende bewustzijn na versuffing heeft herwonnen.
Opmerking: Er is geen behoefte postoperatieve pijn beheer omdat deze interventie goed zonder tekenen van ongemak of pijn verdragen wordt. Als alternatief wordt aangeraden topische analgetica, bijvoorbeeld een druppel bupivacaine op de incisie vóór sluiting die voor maximaal 8 uur van analgesie zorgen zou.
3. beoordeling voor Model inductie, tekenen van nefrotisch syndroom en welzijn
- Ochtend urine (08:00 uur) verzamelen in een reactie beker (1,5 mL), wordt elke dag vanaf de dag van de injectie door het masseren van de blaas.
- Proteïnurie meten met behulp van de analyse van Bradford eiwit en normaliseren naar creatinine.
Opmerking: Voor de inductie van nefrotisch syndroom, Proteïnurie moet bereiken een drempel van 120 mg/mg creatinine tussen dag 7 en 10 na Doxorubicine injectie.
- Proteïnurie meten met behulp van de analyse van Bradford eiwit en normaliseren naar creatinine.
- Kijk voor de ontwikkeling van ascites. Selectievakje voor verhoging van de buik omtrek of overhangende flanken.
- Weeg de muis, de voedsel-korrels en de bidon in de ochtend (08:00 am) elke dag.
- Controleren welzijn ten minste eenmaal per dag met behulp van een scorekaart volgens Morton en Griffiths et al.. 16
4. meting van de urine Serine Protease met een Chromogenic test
- Bereiden substraat werkoplossing door toevoeging van 15 mL steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) tot een fles van 25 mg drooggevroren chromogenic substraat S-2251, opbrengst van een concentratie van 2 mM. Los aprotinin in PBS te verkrijgen van een aprotinin oplossing met een concentratie van 2 mg/mL.
- Bewaar bereide oplossingen bij-20 ° C. Dit aanzienlijk vertraagt de auto-afbraak van S-2251. Gebruik geen oude oplossingen met een sterke tint van geel.
- Gebruik vers bereid of substraat werkoplossing ontdooid en warm het in een zaal van 37 ° C warmte.
- Ontdooi urine monsters bij kamertemperatuur.
- Protease degradatie voorkomen door het vermijden van herhaalde ontdooien en bevriezen. Opslaan van de urine monsters bij-20 ° C.
- Een 96 microwell plaat geschikt voor fotometrische meting gebruiken. Voeg 3 µL van onverdunde urine in elk van de twee putten en breng 50 µL van de werkoplossing substraat met 3 µL van PBS of aprotinin oplossing in de putjes. De afdekplaat met een plaat sealer.
- Incubeer de overdekte microwell plaat gedurende 60 min. in een kamer van 37 ° C warmte.
- Meet de extinctie van elk putje bij 450 nm met behulp van een microplate-lezer.
- Neem het verschil tussen de Franse overzeese departementen zonder aprotinin en met aprotinin als urine aprotinin-gevoelige serine protease-activiteit.
Opmerking: Meting van een gepaarde monster met en zonder aprotinin verhoogt specificiteit van de test, aangezien het substraat kan ook worden cleaved door andere proteasen die niet een pathofysiologische rol spelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Na de inductie van Isofluraan versuffing, was Doxorubicine snel geïnjecteerd via de linker retrobulbaire sinus. Het gehele volume van 7,25 µL/g bw werd geïnjecteerd zonder enige weerstand en extravasation blijkt intraveneuze locatie van de canule juist. De muis verhaald versuffing snel en had geen bijzondere waardevermindering op die dag en daarna. Met name, was er geen teken van schade in het linkeroog. Na Doxorubicine injectie, voedsel en vloeistof inname daalde in de eerste 3 dagen als gevolg van een algemene toxisch effect van Doxorubicine en daarna hersteld (Figuur 1a). Tijdens de eerste 3 dagen na injectie verloor de muis 3,4% van zijn lichaamsgewicht als gevolg van eetlustgebrek (Figuur 1b). Vanaf de 5th dag, ontwikkeld de muis duidelijke Proteïnurie (Figuur 1 c), die werd gevolgd door een enorme daling van urine natrium excretie ondanks voldoende voedselinname (Figuur 1a, b). Deze retentie van natrium leiden tot een enorme winst van lichaamsgewicht door 22,2% vanaf dag 3 tot en met dag 10 en ging gepaard met ascites. Als gevolg van Proteïnurie ontwikkelde de muis hypoalbuminemia (Figuur 1 c). In een plasma monster genomen op dag 10, was hyperlipidemie zichtbaar. Deze gegevens tonen aan dat Doxorubicine gegeven door de sinus retrobulbaire snel en indrukwekkend een volwaardige nefrotisch syndroom bij wildtype 129S1/SvImJ muizen induceert.
Natrium retentie in experimentele nefrotisch syndroom was gekoppeld aan de activering van ENaC door aberrant filtratie van serine proteasen zoals Plasmine11,12. Als dit concept geldt, dan is de remming van de urine serine proteasen door aprotinin moet beschermen tegen ENaC activatie en retentie van natrium. Om te bestuderen van het effect van aprotinin op ENaC activering, we een nefrotisch muis met aprotinin getrakteerd. Als aprotinin snel door glomerulaire filtratie gewist is, kozen we voor drug beheer met een pellet opgelopen-release om continue beschikbaarheid van aprotinin in de distale zaadvormende gedurende 10 dagen. Op de derde dag na Doxorubicine injectie, een muis was geïmplanteerd met een aprotinin-bevattende pellet en een controle muis ontving een placebo pellet onder Isofluraan versuffing. Dieren herstelde zich snel vorm versuffing en de wond genezen zonder enige problemen. Vanaf dag 5, Proteïnurie ontwikkeld in beide muizen in vergelijkbare mate (Figuur 2a). Echter ervaren alleen de placebo-behandelde nefrotisch muizen natrium retentie (Figuur 2b) en gewichtstoename (Figuur 2 c) die aangeeft ENaC activering. In tegenstelling, de muis aprotinin-behandeld werd beschermd tegen natrium retentie en lichaam gewichtstoename (Figuur 2b, c). Dit toont duidelijk aan dat urine serine protease-activiteit de oorzaak van de retentie van natrium in het nefrotisch syndroom is.
De concentratie van de aprotinin in urine en plasma bereikt werd gemeten met een ELISA. Zoals blijkt uit Figuur 3a, concentratie van de urine aprotinin piek kort na de inplanting en daarna constant was. Gemiddelde urine aprotinin concentratie was 207 ± 29 µg Mo/mL (32 ± 4 µM) terwijl plasma aprotinin concentratie na 10 dagen van behandeling 13 µg Mo/mL (2 µM) was, die is vergelijkbaar met de plasma concentratie bereikt in aprotinin-behandelde patiënten17. Het effect van aprotinin op urine serine protease-activiteit werd gemeten met een chromogenic test met behulp van urine monsters die zijn genomen in de loop van experimentele nefrotisch syndroom. Deze test is gebaseerd op de hydrolyse van de peptide binding in het substraat voor het vrijgeven van p-nitroaniline die gemakkelijk kan worden gedetecteerd door fotometrie bij 450 nm. Zoals blijkt uit Figuur 3b, serine protease activiteit steeg snel in de urine van de placebo-behandelde nefrotisch muis het intreden van Proteïnurie parallel. Urine serine protease-activiteit was daarentegen volledig in de aprotinin behandelde nefrotisch muis samenvalt met de preventie van ENaC activatie en retentie van natrium weergegeven in Figuur 2b, cgeremd.
Figuur 1: cursus van voedsel en vloeistof inname (a), urine natrium excretie en lichaam gewicht (b) en Proteïnurie en plasma albumine-concentratie (c) voor en na de inductie van experimentele nefrotisch syndroom. Na een daling in de voedsel- en vochtinname over de eerste drie dagen na Doxorubicine tonen muizen een bijna constante inname. Na vijf dagen, de ontwikkeling van Proteïnurie begint en nefrotisch drempel tussen dag 7 en 10, wat leidt tot volwaardige nefrotisch syndroom met vorming van oedeem, retentie van natrium en hypoalbuminemia bereikt. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: cursus van Proteïnurie (a), urine natrium excretie (b) en het lichaamsgewicht (c) in een muis elk met aprotinin of placebo pellet op dag 3 na Doxorubicine injectie behandeld. Ondanks de ontwikkeling van Proteïnurie in een vergelijkbare mate beschermt de aprotinin tegen natrium retentie en oedeem vorming veroorzaakt door ENaC activering tijdens nefrotisch syndroom. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: verloop van de concentratie van de urine aprotinin na de inplanting van de pellet met plasma concentratie van aprotinin. Cursus van urine serine protease-activiteit gemeten met de chromogenic test beschreven in stap 4. Urine aprotinin concentratie pieken kort na de inplanting en daarna constant is. Serine protease-activiteit neemt snel toe in urine tijdens nefrotisch syndroom, het begin van de Proteïnurie parallel. Aprotinin in vivo voorkomt dat tegen verhoging van urine serine protease-activiteit. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier, we laten zien dat Doxorubicine injectie via retrobulbaire sinus injectie experimentele nefrotisch syndroom bij 129S1/SvImJ muizen met Proteïnurie, retentie van natrium, hypoalbumenia en hyperlipidemie induceert. Er zijn echter twee belangrijke onderwerpen die rekening worden gehouden moet bij het gebruik van dit model. In de eerste plaats de model-inductie is strikt dosis afhankelijk en afwijkingen van Doxorubicine dosis zo klein als 0,3 µg/g invloed op de reactie van de muizen15. Wanneer geïnjecteerd met een lagere dosis zoals 14 µg/g bw of hieronder, Doxorubicine zorgt ervoor dat alleen niet-nefrotisch Proteïnurie die niet is gekoppeld aan de bewaring van de openlijke natrium, ascites en hyperlipidemie. Injectie van een hogere dosis leidt daarentegen tot acuut nierfalen en hoge acute sterfte. Volgens de dosis en de reactie van de muizen, Doxorubicine oorzaken een cursus die lijkt op de menselijke acute nier schade (AKI), chronische nierziekte met bewaard glomerulaire filtratie maximalehartslag (CKD fase G1-3) of progressieve chronische nierziekte met verminderd glomerulaire filtratie snelheid (CKD G4-5) leidt tot uremie7,15.
Ten tweede, dit model is beperkt tot bepaalde stammen van de muis en de gebruikte C57Bl/6 stam is resistent8. Bovendien, genetische verontreiniging zoals zij aanwezig zijn bij een backcross kunnen kan leiden tot een aanzienlijk lagere respons. Dit kan tot op zekere hoogte worden vermeden door het verhogen van de dosis Doxorubicine. Echter, de dosis van Doxorubicine gebruikt voor model inductie (14,5 µg/g bw) is al dicht bij de beschreven LD50 tussen 15-17 µg/g bw in dit stam7,18.
Het gebruik van deze muismodel opent de mogelijkheid te bestuderen van verschillende zeer innovatief vragen met betrekking tot het nefrotisch syndroom, bereiken van Proteïnurie en oedeem vorming van endocrinologische dysregulations en renale bloedarmoede15. In deze zin, Doxorubicine-geïnduceerde nefropathie heeft betrekking op het brede spectrum van menselijke CKD en is een goed alternatief voor de huidige modellen gebruikt in Nefrologie onderzoek zo'n 5/6 Nefrectomie19,20 of unilaterale urineleider afbinding21. Bovendien is het mogelijk om het model van toepassing op genetisch gemodificeerde muizen aan het bestuderen van de rol van een bepaald gen van belang in de loop van het model zoals het ontbreken van de serum-en-glucocorticoide kinase 1 (SGK1)7 of vele anderen.
Een speciaal kenmerk van het gepresenteerde model is het voorkomen van proteasuria, dwz., de uitscheiding van actieve serine proteasen waardoor ENaC activering door proteolyse van de γ-subunit. Dit leidt tot de uitscheiding van een bijna natriumvrij urine en volume retentie gekenmerkt door snelle gewichtstoename en ontwikkeling van ascites na aanvang van de proteasuria. Echter dit verschijnsel van voorbijgaande aard is, en na 15 dagen, muizen spontaan los van ascites en gewicht hoewel Proteïnurie geldig blijft. De reden, echter blijft ongrijpbaar. Deze paradoxale gedrag ook in studies met nefrotisch ratten4 werd waargenomen en lijkt te vertegenwoordigen een algemene voorziening van experimentele nefrotisch syndroom bij knaagdieren.
Urine serine protease-activiteit werd gemeten met een chromogenic test die is eenvoudig en snel. Het is gebaseerd op de hydrolyse van de amide-binding van p-nitroaniline gekoppeld aan een peptide van 4 aminozuren lengte die kan worden cleaved door verschillende proteasen. In het algemeen chromogenic substraten zijn niet specifiek voor een bepaalde protease en er is aanzienlijke overlapping van de proteasen die een bepaald substraat klieven. De hier gebruikte substraat is een voorkeur substraat van trypsine-achtige serine proteasen zoals Plasmine of plasma kallikrein22. Het vergroten van specificiteit, moet protease-activiteit altijd worden bepaald uit een gepaarde monster met en zonder een remmer23,24. In deze studie werd aprotinin gebruikt om te definiëren van de activiteit van trypsine-achtige serine proteasen. Door de aprotinin-gevoelige activiteit uit het verschil te berekenen, zijn de activiteiten van andere proteasen teniet gedaan. In de nefrotisch muis behandeld met aprotinin in vivo was urine serine protease-activiteit niet verhoogd en belangrijkst viel samen met de intrekking van de retentie van natrium. Dus urine serine protease-activiteit is niet alleen causale voor retentie van natrium in nefrotisch syndroom, maar kan ook worden beschouwd een biomarker te voorspellen van de werkzaamheid van een serine proteaseinhibitor in nefrotisch syndroom, die zou kunnen een nieuwe therapeutische worden aanpak in behandeling van het nefrotisch syndroom. In de studie van Bohnert et al. 13, het serine protease inhibitor camostat en plasminogen conversie remmer tranexamic zuur waren niet effectief bij het voorkomen van retentie van natrium die samenviel met een mislukking te normaliseren urine serine protease-activiteit.
Hoewel Doxorubicine een bijzonder giftige stof is, is retrobulbaire injectie veilig en niet gekoppeld aan de eventuele schade die het welzijn van het dier verminderde. Men zou kunnen stellen dat de staart veneuze injectie zou een meer geschikte aanpak vermindering van dierlijke nood. In een vergelijkende studie ontdekten we dat inductie via staart veneuze injectie van Doxorubicine inferieur aan retrobulbaire route als gevolg van een hoger tarief van muizen die heb niet de ontwikkeling van nefrotisch syndroom (34% non-responder) in vergelijking met die veroorzaakt door de retrobulbaire route (was 0-15% non-responder). Bovendien was de Proteïnurie door staart veneuze injectie lager leidt tot verzwakte natrium retentie. Dit kan worden verklaard door de verschillen in farmacokinetiek en geen hogere concentratie van de piek van Doxorubicine bereikt na snelle retrobulbaire injectie die essentieel is voor model inductie door podocyte schade. Het moet echter benadrukt worden dat retrobulbaire injectie de exploitant van een zeer bekwame en ervaren moet om te voorkomen dat aan de extravasation van zelfs minieme hoeveelheden van Doxorubicine gerelateerde complicatie.
Kortom, is experimentele nefrotisch syndroom door Doxorubicine een veelzijdig model van proteinuric nieraandoeningen in 129S1/SvImJ muizen die toelaat om zeer huidige wetenschappelijke vraagstukken, het belangrijkste proteasuria onderzoeken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Deze studie werd gesteund door een subsidie van de Duitse Research Foundation (DFG, AR 1092/2-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| supplies | |||
| BD Micro FINE + U-40 (0.30 mm x 8 mm) | BD Deutschland GmbH, Heidelberg, Germany | PZN: 07468060 | syring |
| ETHILON*II (5/0, 16 mm, 3/8c, 45 cm) | Johnson&Johnson Medical GmbH, Ethicon Deutschland, Norderstedt, Germany) | EH7823H | suture |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| reagents | |||
| aprotinin (6000 KIU/mg) | LOXO, Heidelberg, Germany | CAS 9087-70-1 | |
| Bepanthen, Augen- und Nasensalbe | Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany | PZN: 1578681 | ointment |
| Chromogenix S-2251 | HAEMOCHROM DIAGNOSTICA GmbH, Essen, Germany | 82 0332 39 | chromogenic substrate |
| doxorubicin (2.0 µg/µL) | Cell Pharm, Bad Vilbel, Germany | CAS 25316-40-9 | doxorubicin |
| isofluran CP (1 mL/mL) | CP-Pharma, Burgdorf, Germany | CAS 26675-46-7 | isofluran |
| pellets with matrix-driven sustained release (custom-made) | Innovative Research of America, Sarasota, FL | X-999 | pellet |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| equipment | |||
| ELx808 Absorbance Mikroplate Reader | BioTek, Bad Friedrichshall, Germany | ELx808 | microplate reader |
| MICROSTERIL - 436 | B.M.S., Trescore Balneario, Italy | GAL/436 | sterilizer |
| Hybridization oven/shaker | GE Healthcare UK Limited, Amersham LIFE SCIENCE, Little Chalfont, UK | RPN 2511 | heat chamber |
| Thermo MAT Pro 10 W, 15x25 cm, Lucky Reptile | Import Export Peter Hoch GmbH, Waldkirch, Germany | 61201 | mouse warming device |
References
- Lee, V. W., Harris, D. C. Adriamycin nephropathy: a model of focal segmental glomerulosclerosis. Nephrology (Carlton). 16 (1), 30-38 (2011).
- Frenk, S., Antonowicz, I., Craig, J. M., Metcoff, J. Experimental nephrotic syndrome induced in rats by aminonucleoside; renal lesions and body electrolyte composition. Proc Soc Exp Biol Med. 89 (3), 424-427 (1955).
- Ichikawa, I., et al. Role for intrarenal mechanisms in the impaired salt excretion of experimental nephrotic syndrome. J Clin Invest. 71, (1983).
- Deschenes, G., Wittner, M., Stefano, A., Jounier, S., Doucet, A. Collecting duct is a site of sodium retention in PAN nephrosis: a rationale for amiloride therapy. J Am Soc Nephrol. 12 (3), 598-601 (2001).
- Lourdel, S., et al. Hyperaldosteronemia and activation of the epithelial sodium channel are not required for sodium retention in puromycin-induced nephrosis. J Am Soc Nephrol. 16 (12), 3642-3650 (2005).
- Seigneux, S., Kim, S. W., Hemmingsen, S. C., Frokiaer, J., Nielsen, S. Increased expression but not targeting of ENaC in adrenalectomized rats with PAN-induced nephrotic syndrome. Am J Physiol Renal Physiol. 291 (1), F208-F217 (2006).
- Artunc, F., et al. Serum- and glucocorticoid-inducible kinase 1 in doxorubicin-induced nephrotic syndrome. Am J Physiol Renal Physiol. 295 (6), F1624-F1634 (2008).
- Zheng, Z., et al. A Mendelian locus on chromosome 16 determines susceptibility to doxorubicin nephropathy in the mouse. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (7), 2502-2507 (2005).
- Kimura, M., et al. Interstrain differences in murine daunomycin-induced nephrosis. Nephron. 63 (2), 193-198 (1993).
- Wang, Y., Wang, Y. P., Tay, Y. C., Harris, D. C. Progressive adriamycin nephropathy in mice: sequence of histologic and immunohistochemical events. Kidney Int. 58 (4), 1797-1804 (2000).
- Svenningsen, P., et al. Plasmin in nephrotic urine activates the epithelial sodium channel. Journal of the American Society of Nephrology : JASN. 20 (2), 299-310 (2009).
- Passero, C. J., Hughey, R. P., Kleyman, T. R. New role for plasmin in sodium homeostasis. Curr Opin Nephrol Hypertens. 19 (1), 13-19 (2010).
- Bohnert, B. N., et al. Aprotinin prevents proteolytic epithelial sodium channel (ENaC) activation and volume retention in nephrotic syndrome. Kidney Int. 93 (1), 159-172 (2018).
- Pippin, J. W., et al. Inducible rodent models of acquired podocyte diseases. Am J Physiol Renal Physiol. 296 (2), F213-F229 (2009).
- Bohnert, B. N., et al. Impact of phosphorus restriction and vitamin D-substitution on secondary hyperparathyroidism in a proteinuric mouse model. Kidney Blood Press Res. 40 (2), 153-165 (2015).
- Morton, D. B., Griffiths, P. H. Guidelines on the recognition of pain, distress and discomfort in experimental animals and an hypothesis for assessment. Vet Rec. 116 (16), 431-436 (1985).
- Beath, S. M., et al. Plasma aprotinin concentrations during cardiac surgery: full- versus half-dose regimens. Anesth Analg. 91 (2), 257-264 (2000).
- Kanter, P. M., et al. Preclinical toxicology study of liposome encapsulated doxorubicin (TLC D-99): comparison with doxorubicin and empty liposomes in mice and dogs. In Vivo. 7 (1), 85-95 (1993).
- Ma, L. J., Fogo, A. B. Model of robust induction of glomerulosclerosis in mice: importance of genetic background. Kidney Int. 64 (1), 350-355 (2003).
- Kren, S., Hostetter, T. H. The course of the remnant kidney model in mice. Kidney Int. 56 (1), 333-337 (1999).
- Mizuno-Horikawa, Y., Mizuno, S., Tamura, S., Kurosawa, T. Advanced glomerulosclerosis is reversible in nephrotic mice. Biochem Biophys Res Commun. 284 (3), 707-713 (2001).
- Friberger, P. Chromogenic peptide substrates. Their use for the assay of factors in the fibrinolytic and the plasma kallikrein-kinin systems. Scand J Clin Lab Invest Suppl. 162, 1-298 (1982).
- Haerteis, S., et al. Plasma kallikrein activates the epithelial sodium channel in vitro but is not essential for volume retention in nephrotic mice. Acta Physiologica. , (2018).
- Schork, A., et al. Association of Plasminuria with Overhydration in Patients with CKD. Clin J Am Soc Nephrol. 11 (5), 761-769 (2016).
