Summary
Her beskriver vi induktion af eksperimentelle Nefrotisk syndrom i 129S1/SvImJ mus ved hurtig retrobulbær injektion af doxorubicin. Vi behandler også nefrotisk mus med vedvarende frigivelse piller indeholdende aprotinin for at hæmme urin Serin protease aktivitet og forhindre natrium fastholdelse.
Abstract
Nefrotisk syndrom er den mest ekstreme manifestation af proteinuric nyresygdom og karakteriseret ved svær proteinuri, hypoalbuminæmi, og ødem på grund af natrium fastholdelse og hyperlipidæmi. For at studere Patofysiologi af dette syndrom, baseret gnavere modeller er blevet udviklet på injektion af giftige stoffer som doxorubicin podocyte skader. I mus er kun nogle stammer modtagelige for denne model. I vildtype 129S1/SvImJ mus inducerer administration af doxorubicin ved hurtig intravenøs injektion til retrobulbær sinus eksperimentelle Nefrotisk syndrom at funktioner alle symptomer på sygdom hos mennesker herunder natrium væskeophobning og ødem. Efter debut af proteinuri øget mus udstille urin Serin protease aktivitet, der fører til aktivering af epitel natrium kanalen (ENaC) og natrium fastholdelse. Farmakologisk hæmning af urin Serin proteaser ved behandling med vedvarende frigivelse aprotinin ophæver ENaC aktivering og forhindrer natrium fastholdelse. Denne model er ideel til at studere Patofysiologi af proteasuria, dvs., udskillelsen af aktive Serin proteaser, der forårsager ENaC aktivering af proteolyse af dens γ-underenhed. Dette kan betragtes som den primære mekanisme af ENaC aktivering og natrium fastholdelse i proteinuric nyresygdom.
Introduction
Nefrotisk syndrom er karakteriseret ved svær proteinuri, hypoalbuminæmi, ødem og hyperlipidæmi, og kan betragtes som de mest ekstreme manifestation af proteinuric nyresygdom. I gnavere, kan eksperimentelle Nefrotisk syndrom være fremkaldt af enkelt injektion af anthracyclines eller puromycin, som fører til podocyte skader og ligner menneskelige minimal ændring sygdom og fokale segmentær glomerulosclerosis (FSGS)1. Efter sin første beskrivelse i 1955 af Frenk mfl. 2, puromycin nucleoside nefrose (PAN) hos rotter er blevet en standard model til at undersøge Patofysiologi af Nefrotisk syndrom i talrige undersøgelser3,4,5,6. I mus, kan den tilsvarende model være fremkaldt af antracyklin doxorubicin7. Der er imidlertid en stærk stamme-afhængighed, der er genetisk betinget af mindst to genetiske loci8. Derudover er der forskelle i proteinuric svar og kursus i Nefrotisk syndrom9,10. Brug 129S1/SvImJ mus og hurtige intravenøs injektion af doxorubicin via retrobulbær sinus, nå proteinuri svar værdier, der er tilstrækkelig til at fremkalde de typiske træk ved Nefrotisk syndrom, især volumen opbevaring karakteriseret ved ascites og næsten natriumfrie urin7. Natrium fastholdelse i eksperimentel Nefrotisk syndrom har været formodes at være resultatet af aktivering af epitel natrium-kanal (ENaC) i den distale tubulus af anderledes filtrerede Serin proteaser som plasmin forårsager proteolyse af dens γ-subunit4 ,11,12. For nylig, dette begreb blev bevist i nefrotisk mus, som var beskyttet mod proteolytiske ENaC aktivering og natrium fastholdelse af behandling med Serin protease hæmmer aprotinin, der var lige så effektiv som ENaC blocker amilorid13. For at sikre kontinuerlig levering til den distale tubulus, blev aprotinin administreret via subkutant implanterede vedvarende frigivelse pellets. Fremtidige undersøgelser er forpligtet til at identificere de Serin proteaser, der er ansvarlig for proteolytisk ENaC aktivering i Nefrotisk syndrom, som menes at parallel den menneskelige situation. Til dette formål er doxorubicin-induceret Nefrotisk syndrom en værdifuld model, der kan bruges i wild-type mus eller udvidet til gensplejsede mus. Dens fordele omfatter lav pris for lægemidlet, lavere kompleksitet i ledelse og god reproducerbarhed14.
I denne artikel vil vise vi induktion af eksperimentelle Nefrotisk syndrom af hurtige intravenøs injektion af doxorubicin til retrobulbær sinus og implantation af vedvarende-release piller indeholdende aprotinin for at hæmme urin Serin protease aktivitet, målt med et kromogent assay.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder blev udført Ifølge National Institutes of sundhed Guide for pasning og anvendelse af forsøgsdyr og den tyske lov for dyrenes velfærd, og de blev godkendt af lokale myndigheder (Regierungspräsidium Tübingen).
1. induktion af eksperimentelle Nefrotisk syndrom af Doxorubicin injektion til retrobulbær Sinus
- Forberede en 0,5 mL sprøjte med en monteret 30G kanyle ved at markere stopposition af stemplet.
- Beregne Injektionsvolumen af doxorubicin for mandlige (7.25 µL/g legemsvægt (LGV) lig med 14,5 µg/g bw doxorubicin) og hunmus (6,9 µL/g bw svarende til 13,8 µg/g bw doxorubicin) Ifølge kropsvægt fra om morgenen.
Bemærk: Den givne dosis er velegnet til induktion af Nefrotisk syndrom. Mindre ændringer i doseringen føre til en afgørende anderledes kursus af nefropati nå fra mild kronisk nyresygdom med kun små ændringer i glomerulær filtrationshastighed (12,6 µg/g bw doxorubicin) til akutte nyre fiasko (15,4 µg/g bw doxorubicin)7, 15. - Varm det beregnede beløb af doxorubicin løsning (2 µg/µL) i et 37 ° C varm kammer.
Forsigtig: Doxorubicin er skadelige, hvis sluges og kan fremkalde kræft. Altid bære handsker, hvis arbejder med doxorubicin og undgå enhver kontakt med huden. - Prefill sprøjten med doxorubicin løsning indtil mærkning og balancen er angivet til nul. Fyld sprøjten med Injektionsvolumen og kontrollere lydstyrken ved vejning sprøjten.
- Narcotize musen dybt med 5 vol. % isofluran ved hjælp af en vaporizer og ilt flow på 2 L/min.
- Brug ikke salve øjnene før injektionen. Operatøren har brug for et klart overblik over orbital hulrummet til at udføre en sikker og vellykket retrobulbær injektion.
- Vurdering af anæstesi af pedal refleks og eventuelt justere bedøvelsesmiddel levering før injektion.
- Placer musen på en højre laterale recumbency med ryggen vender mod operatørens krop og hovedet vender til operatørens injektion hånd.
Bemærk: Proceduren, der er beskrevet for en højrehåndet person, for venstrehåndede personer, der udfører injektion med venstre hånd det er nemmere at gøre holdning og injektion vendt lige til venstre. - Omhyggeligt Rage musens venstre øjeæblet fra øjenhulen ved at anvende blid pres på huden, dorsal og ventral at øjet.
- Punktere venstre retrobulbær sinus fra indre øje vinkel (mediale palpebral commissure). Undgå enhver kontakt med mouse´s øjeæblet.
- Lidt vippe sprøjten og sprøjt hele diskenheden på én gang. Sørg for at volumen sprøjtes uden modstand og uden nogen tegn på ekstravasation såsom exopthalmus eller lækage fra injektionsstedet.
- Da doxorubicin er et meget giftigt stof, check velfærd mindst en gang om dagen ved hjælp af en score-ark ifølge Morton og Griffiths et al. 16 og betale særlig opmærksomhed på injektionsstedet. Hvis nogen tegn på ekstravasation exopthalmus, nedsat øjenlåg lukning eller tegn på nekrose som hævelse eller hud læsioner occure efter injektion eller i de følgende dage, musen bør aflives.
2. implantation af vedvarende-Release piller indeholdende Aprotinin
- Bestil træpiller med den ønskede dosis pr. dag og frigivelse varighed på forhånd. I tilfælde af aprotinin, skal du vælge en dosis på 1 mg pr. dag til at blive frigivet i 10 dage.
Bemærk: I denne undersøgelse, aprotinin træpiller indeholde en dosis på 10 mg.- Gemme pellets under tørre forhold og undgå enhver udsættelse for fugt.
- Forberede kirurgi, herunder et par hår saks, et par af huden forberedelse saks, en skalpel, kirurgisk pincet, to par væv pincet, en nål indehaveren og 15 cm monofile sutur ikke resorberbare krævede elementer.
- Sterilisere instrumenter ved hjælp af en varme sterilizer i 5 min ved 240 ° C. Før brug af instrumenterne, vente i 5 min indtil de når frem til stuetemperatur.
- Undgå enhver kontakt med steriliseret instrument tips til nonsterile overflader.
- Undgå hud brænde af hot instrumenter.
- Sterilisere instrumenter ved hjælp af en varme sterilizer i 5 min ved 240 ° C. Før brug af instrumenterne, vente i 5 min indtil de når frem til stuetemperatur.
- Narcotize mus med isofluran 5 vol. % efterfulgt af 1,5 vol % ved hjælp af en vaporizer og ilt flow på 2 L/min.
- Placere musen i en udsat position på en opvarmning enhed dækket med et lag gaze til at undgå termiske skader på musen. Overfladetemperatur er omkring 37 ° C.
- Beskyt øjnene med salve.
- Fjerne hår på midten tilbage i et område på omkring 0,5 cm2 ved hjælp af saks eller et hår trimmer og desinficere hairless huden med et desinfektionsmiddel, der er egnet til huden desinficeres. Fjern som mindre hår som muligt så det bliver vanskeligere for musen til at nå såret og tråd ender senere og at holde kropstemperaturen.
- Incise hairless huden med en skalpel i Kranio-caudale retning i en længde af omkring 5 mm. Forbered en venstre lateral pose af ca. 1 cm dybde i det subkutane bindevæv ved hjælp af en stump forberedelse.
- Vurdering af anæstesi af pedal refleks og eventuelt justere bedøvelsesmiddel levering før du starter operationen.
- Indsæt en 10-dages release pellet i rede venstre lateral posen ved hjælp af steril væv pincet. Forlade pellet i bunden af posen i en planar holdning.
- Undgå enhver kontakt pellet til væske og luftfugtighed indtil placeret i den forberedte pose.
- Lukke huden med 2-3 suturer. Kun forlade meget kort tråd ender for at gøre det vanskeligere for mus til at åbne suturer af gnavende.
- Placere mus individuelt at mindske postoperative nød og forhindre åbningen af suturer af gnavende. Hold musen i betragtning indtil den har genvundet tilstrækkelig bevidsthed efter narkose.
Bemærk: Der er ingen grund til postoperativ smertebehandling da dette indgreb er veltolereret uden nogen tegn på ubehag eller smerter. Alternativt anbefaler vi aktuelt analgetika, fx en dråbe bupivacaine på indsnit inden lukning, som ville give op til 8 h af analgesi.
3. vurdering af Model induktion, tegn af Nefrotisk syndrom og trivsel
- Indsamle morgen urin (08:00 am) i en reaktion cup (1,5 mL) hver dag fra dagens injektion af masserer blæren.
- Måle proteinuri ved hjælp af Bradford protein assay og normalisere at kreatinin.
Bemærk: For induktion af Nefrotisk syndrom, proteinuri bør nå en grænse på 120 mg/mg kreatinin mellem dag 7 og 10 efter doxorubicin injektion.
- Måle proteinuri ved hjælp af Bradford protein assay og normalisere at kreatinin.
- Ser for udvikling af ascites. Check forhøjelse af abdominale omkreds eller overhængende flanker.
- Veje musen, mad pellets og drikke flasken om morgenen (08:00 am) hver dag.
- Check velfærd mindst en gang om dagen ved hjælp af en score-ark ifølge Morton og Griffiths et al. 16
4. måling af urin Serin Protease med et kromogent Assay
- Forberede underlag arbejdende løsning ved at føje 15 mL sterilt fosfatbufferet saltopløsning (PBS) til en flaske af 25 mg af frysetørrede kromogent substrat S-2251, giver en koncentration af 2 mM. Opløs aprotinin i PBS til at opnå en aprotinin løsning med en koncentration på 2 mg/mL.
- Butik fremstillede opløsninger ved-20 ° C. Dette bremser markant auto-nedbrydning af S-2251. Brug ikke gamle løsninger med en stærk nuance af gul.
- Brug frisk tilberedt eller optøet substrat brugsopløsning og varm det i et 37 ° C varme kammer.
- Tø urinprøver ved stuetemperatur.
- Forhindre protease nedbrydning ved at undgå gentagne optøning og frysning. Gemme urinprøver ved-20 ° C.
- Bruge en 96 microwell plade egnet til fotometriske målinger. Tilføje 3 µL af ufortyndet urin i hver af to brønde og tilsæt 50 µL af substratopløsning arbejder med 3 µL af enten PBS eller aprotinin løsning til brøndene. Dække pladen med en plade sealer.
- Inkuber overdækket microwell plade i 60 min i et 37 ° C varme kammer.
- Måling af Ekstinktionen af hver brønd ved 450 nm med en mikrotiterplade læser.
- Tage forskellen mellem OD uden aprotinin og med aprotinin som urin aprotinin-følsomme Serin protease aktivitet.
Bemærk: Måling af en parret prøve med og uden aprotinin øger specificiteten af analysen, da underlaget kunne også være kløvet af andre proteaser, der ikke spiller en patofysiologiske rolle.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter induktion af isofluran narkose, blev doxorubicin hurtigt injiceres via venstre retrobulbær sinus. Den samlede mængde af 7.25 µL/g bw blev sprøjtet uden nogen modstand og ekstravasation beviser korrekt intravenøs placering af kanylen. Musen inddrives fra narkose hurtigt og havde ingen værdiforringelse på dag og derefter. Især var der ingen tegn på skader på venstre øje. Efter doxorubicin injektion, mad og væske indtag faldt over de første 3 dage på grund af en generel toksiske effekt af doxorubicin og inddrives derefter (figur 1a). I de første 3 dage efter injektion tabt musen 3,4% af sin kropsvægt på grund af inappetence (figur 1b). Starter på 5th dagen, udviklet musen markant proteinuri (figur 1 c), der blev efterfulgt af en massiv nedgang i urin natrium udskillelsen trods tilstrækkelig fødeindtagelse (figur 1a, b). Denne natrium tilbageholdelse føre til en massiv gevinst på kropsvægt af 22,2% fra dag 3 indtil dag 10 og blev ledsaget af ascites. Musen udviklet som følge af proteinuri, hypoalbuminæmi (figur 1 c). I et plasmaprøve udtaget på dagen 10, var hyperlipidæmi synlige. Disse data viser, at doxorubicin givet ved retrobulbær sinus hurtigt og imponerende inducerer en fuld-blæst Nefrotisk syndrom hos vildtype 129S1/SvImJ mus.
Natrium fastholdelse i eksperimentel Nefrotisk syndrom var forbundet til aktivering af ENaC af afvigende filtrering af Serin proteaser som plasmin11,12. Hvis dette koncept gælder, bør derefter hæmning af urin Serin proteaser ved aprotinin beskytte fra ENaC aktivering og natrium fastholdelse. For at undersøge effekten af aprotinin på ENaC aktivering, behandlede vi et nefrotisk musen med aprotinin. Som aprotinin er hastigt fjernet ved glomerulær filtrering, valgte vi drug administration ved hjælp af en vedvarende-release pellet for at sikre kontinuerlig tilgængeligheden af aprotinin i den distale tubulus over 10 dage. På den tredje dag efter doxorubicin indsprøjtning, en mus blev implanteret med en aprotinin-holdige pellet og en kontrol mus modtaget et placebo pille under isofluran narkose. Dyr kommet hurtigt form narkose og såret helede uden problemer. Fra dag 5, proteinuri udviklet i begge mus i et tilsvarende omfang (figur 2a). Dog oplevet kun de placebo-behandlede nefrotisk mus natrium fastholdelse (figur 2b) og kroppen vægtøgning (figur 2 c) med angivelse af ENaC aktivering. Derimod aprotinin-behandlede mus var beskyttet mod natrium fastholdelse og krop vægtøgning (figur 2b, c). Dette viser klart, at urin Serin protease aktivitet er årsag til natrium fastholdelse i Nefrotisk syndrom.
Aprotinin koncentration i urinen, og plasma blev målt med en ELISA. Som vist i figur 3a, urin aprotinin koncentration toppede snart efter implantation og var konstant derefter. Gennemsnitlig urin aprotinin koncentration var 207 ± 29 µg/mL (32 ± 4 µM), mens aprotinin plasmakoncentration efter 10 dages behandling var 13 µg/mL (2 µM), som er sammenlignelig med plasmakoncentrationen opnåede i aprotinin-behandlede patienter17. Effekten af aprotinin på urin Serin protease aktivitet blev målt med et kromogent analyse ved hjælp af urinprøver taget i løbet af eksperimentelle Nefrotisk syndrom. Denne analyse er baseret på hydrolyse af peptidbinding i bærematerialet frigive p-nitroaniline, der nemt kan registreres af fotometri ved 450 nm. Som vist i figur 3b, Serin protease aktivitet steg hurtigt i urinen fra placebo-behandlede nefrotisk musen parallelt med starten af proteinuri. Urin Serin protease aktivitet var derimod helt hæmmede i aprotinin-behandlet nefrotisk musen sammenfaldende med forebyggelse af ENaC aktivering og natrium fastholdelse vist i figur 2b, c.
Figur 1: kursus af mad og væske indtag (a), urin natrium udskillelsen og krop vægt (b) og proteinuri og plasma albumin koncentration (c) før og efter induktion af eksperimentelle Nefrotisk syndrom. Efter en nedgang i mad og væskeindtagelse i de første tre dage efter doxorubicin viser mus en næsten konstant indtag. Efter fem dage, udvikling af proteinuri starter og når nefrotisk tærskel mellem dag 7 og 10, hvilket fører til fuld-blæst Nefrotisk syndrom med ødem dannelse, natrium fastholdelse og hypoalbuminæmi. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: kursus af proteinuri (a), urin natrium udskillelsen (b) og kropsvægt (c) i en mus behandlet med aprotinin eller placebo pille hver dag 3 efter doxorubicin injektion. Trods udviklingen af proteinuri i et tilsvarende omfang beskytter aprotinin mod natrium væskeophobning og ødem dannelse forårsaget af ENaC aktivering under Nefrotisk syndrom. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: kursus i urin aprotinin koncentration efter implantation af toerstoffet med plasmakoncentrationen af aprotinin. Løbet af urin Serin protease aktivitet målt kromogent assay beskrevet i trin 4. Urin aprotinin koncentration toppe snart efter implantation og er konstant derefter. Serin protease aktivitet stiger hastigt i urin under Nefrotisk syndrom, parallelt med starten af proteinuri. Aprotinin i vivo forhindrer mod stigning i urin Serin protease aktivitet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi viser her, at doxorubicin injektion via retrobulbær sinus indsprøjtning inducerer eksperimentelle Nefrotisk syndrom i 129S1/SvImJ mus med proteinuri, natrium fastholdelse, hypoalbumenia og hyperlipidæmi. Men der er to vigtige spørgsmål, der skal tages i betragtning, når du bruger denne model. For det første model induktion er strengt dosisafhængige og afvigelser af doxorubicin dosis så små som 0,3 µg/g påvirke svaret af mus15. Når injiceres med en lavere dosis som 14 µg/g bw eller nedenfor, doxorubicin forårsager kun ikke-nefrotisk proteinuri, der ikke er knyttet til åbenlys natrium fastholdelse, ascites og hyperlipidæmi. Derimod fører injektion af en højere dosis til akut nyresvigt og høj akut dødelighed. Dosis og respons på mus, doxorubicin årsager et kursus, der ligner menneskets akutte nyre skade (AKI), kronisk nyresygdom med bevaret glomerulær filtration Vurder (Cementovnstøv fase G1-3) eller progressive kronisk nyresygdom med reduceret glomerulær filtrationshastighed (Cementovnstøv G4-5) fører til Uræmi7,15.
For det andet, denne model er begrænset til visse mus stammer og den udbredte C57Bl/6 stamme er resistente8. Desuden kan genetisk forurening som de kan være til stede under en backcross føre til en betydeligt lavere svarprocent. Dette kan undgås til en vis grad ved at øge doxorubicin dosis. Men dosis af doxorubicin bruges til model induktion (14,5 µg/g bw) er allerede tæt på den beskrevne LD50 mellem 15-17 µg/g bw i denne stamme7,18.
Brugen af denne musemodel åbner op for muligheden for at studere forskellige højinnovative spørgsmål vedrørende den Nefrotisk syndrom, at nå fra proteinuri og ødem dannelse til Endokrinologiske dysregulations og renal anæmi15. I denne forstand, doxorubicin-induceret nefropati dækker den bredt spektrum af menneskelige Cementovnstøv og er et godt alternativ til aktuelle modeller udnyttede i nefrologi forskning sådan 5/6 nephrectomistatus19,20 eller ensidige ureter ligatur21. Derudover er det muligt at anvende modellen for gensplejsede mus til at studere rollen, som et bestemt gen af interesse i løbet af modellen som manglen på serum og glukokortikoid kinase 1 (SGK1)7 eller mange andre.
Et særligt træk ved modellens præsenteres er forekomsten af proteasuria, dvs., udskillelsen af aktive Serin proteaser, der forårsager ENaC aktivering af proteolyse af dens γ-underenhed. Dette fører til udskillelse af en næsten natriumfrie urin og volumen opbevaring karakteriseret ved hurtig krop vægtforøgelse og udvikling af ascites efter debut af proteasuria. Dog, dette fænomen er forbigående, og efter 15 dage, mus spontant løs ascites og vægt selv om proteinuri fortsætter. Grunden til, dog stadig undvigende. Denne paradoksale adfærd blev også observeret i studier med nefrotisk rotter4 og synes at udgøre et generelt træk af eksperimentelle Nefrotisk syndrom hos gnavere.
Urin Serin protease aktivitet blev målt med et kromogent assay, der er enkel og hurtig. Det er baseret på hydrolyse af akrylamid bond af p-nitroaniline kædet sammen med en peptid af 4 aminosyrer længde, der kan være kløvet af forskellige proteaser. Generelt, kromogent substrater er ikke specifikke for en bestemt protease og der er væsentlig overlapning af de proteaser, som kløver et bestemt substrat. Den her anvendte substrat er en foretrukne substrat af trypsin-lignende Serin proteaser som plasmin eller plasma kallikrein22. For at øge specificitet, bør protease aktivitet altid bestemmes ud fra en parret prøve med og uden en inhibitor23,24. I denne undersøgelse, blev aprotinin brugt til at definere aktivitet af trypsin-lignende Serin proteaser. Ved beregning af aprotinin-følsomme aktivitet fra forskellen, er aktiviteterne i andre proteaser ophævet. I nefrotisk mus behandlet med aprotinin in vivo var urin Serin protease aktivitet ikke øget og vigtigst af alt faldt sammen med ophævelsen af natrium fastholdelse. Således urin Serin protease aktivitet er ikke kun kausale for natrium fastholdelse i Nefrotisk syndrom, men kan også betragtes en biomarkør at forudsige effekten af en Serin protease hæmmer i Nefrotisk syndrom, som kan blive en ny terapeutisk tilgang i behandling af Nefrotisk syndrom. I undersøgelsen af Bohnert mfl. 13, Serin protease hæmmer camostat og plasminogen konvertering hæmmer tranexamic syren var ikke effektive i forebyggelsen af natrium tilbageholdelse, som faldt sammen med en fiasko at normalisere urin Serin protease aktivitet.
Selvom doxorubicin er et meget giftigt stof, er retrobulbær injektion sikker og ikke forbundet med nogen skade, der nedsat dyrets velfærd. Man kunne hævde, at hale vene injektion ville være en mere passende fremgangsmåde at mindske dyrenes lidelser. I en sammenlignende undersøgelse fandt vi ud af at induktion via hale vene injektion af doxorubicin var ringere end retrobulbær ruten som følge af en højere sats af mus, der ikke udvikler Nefrotisk syndrom (34% ikke-responder) sammenlignet med dem fremkaldt ved retrobulbær rute ( 0-15% ikke-responder). Derudover var proteinuri ved halen vene injektion lavere fører til svækket natrium fastholdelse. Dette kan forklares ved forskelle i farmakokinetik og en højere peak koncentration af doxorubicin opnået efter hurtige retrobulbær injektion, der er afgørende for model induktion af podocyte skader. Det skal dog understreges, at retrobulbær injektion har brug for et højt kvalificerede og erfarne erhvervsdrivende at undgå komplikationer relateret til ekstravasation af selv små mængder af doxorubicin.
Afslutningsvis, er eksperimentelle Nefrotisk syndrom af doxorubicin en alsidig model af proteinuric nyresygdom i 129S1/SvImJ-mus, der giver mulighed for at undersøge meget aktuelle videnskabelige spørgsmål, vigtigst proteasuria.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af en bevilling fra tyske Research Foundation (DFG, AR 1092/2-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| supplies | |||
| BD Micro FINE + U-40 (0.30 mm x 8 mm) | BD Deutschland GmbH, Heidelberg, Germany | PZN: 07468060 | syring |
| ETHILON*II (5/0, 16 mm, 3/8c, 45 cm) | Johnson&Johnson Medical GmbH, Ethicon Deutschland, Norderstedt, Germany) | EH7823H | suture |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| reagents | |||
| aprotinin (6000 KIU/mg) | LOXO, Heidelberg, Germany | CAS 9087-70-1 | |
| Bepanthen, Augen- und Nasensalbe | Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany | PZN: 1578681 | ointment |
| Chromogenix S-2251 | HAEMOCHROM DIAGNOSTICA GmbH, Essen, Germany | 82 0332 39 | chromogenic substrate |
| doxorubicin (2.0 µg/µL) | Cell Pharm, Bad Vilbel, Germany | CAS 25316-40-9 | doxorubicin |
| isofluran CP (1 mL/mL) | CP-Pharma, Burgdorf, Germany | CAS 26675-46-7 | isofluran |
| pellets with matrix-driven sustained release (custom-made) | Innovative Research of America, Sarasota, FL | X-999 | pellet |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| equipment | |||
| ELx808 Absorbance Mikroplate Reader | BioTek, Bad Friedrichshall, Germany | ELx808 | microplate reader |
| MICROSTERIL - 436 | B.M.S., Trescore Balneario, Italy | GAL/436 | sterilizer |
| Hybridization oven/shaker | GE Healthcare UK Limited, Amersham LIFE SCIENCE, Little Chalfont, UK | RPN 2511 | heat chamber |
| Thermo MAT Pro 10 W, 15x25 cm, Lucky Reptile | Import Export Peter Hoch GmbH, Waldkirch, Germany | 61201 | mouse warming device |
References
- Lee, V. W., Harris, D. C. Adriamycin nephropathy: a model of focal segmental glomerulosclerosis. Nephrology (Carlton). 16 (1), 30-38 (2011).
- Frenk, S., Antonowicz, I., Craig, J. M., Metcoff, J. Experimental nephrotic syndrome induced in rats by aminonucleoside; renal lesions and body electrolyte composition. Proc Soc Exp Biol Med. 89 (3), 424-427 (1955).
- Ichikawa, I., et al. Role for intrarenal mechanisms in the impaired salt excretion of experimental nephrotic syndrome. J Clin Invest. 71, (1983).
- Deschenes, G., Wittner, M., Stefano, A., Jounier, S., Doucet, A. Collecting duct is a site of sodium retention in PAN nephrosis: a rationale for amiloride therapy. J Am Soc Nephrol. 12 (3), 598-601 (2001).
- Lourdel, S., et al. Hyperaldosteronemia and activation of the epithelial sodium channel are not required for sodium retention in puromycin-induced nephrosis. J Am Soc Nephrol. 16 (12), 3642-3650 (2005).
- Seigneux, S., Kim, S. W., Hemmingsen, S. C., Frokiaer, J., Nielsen, S. Increased expression but not targeting of ENaC in adrenalectomized rats with PAN-induced nephrotic syndrome. Am J Physiol Renal Physiol. 291 (1), F208-F217 (2006).
- Artunc, F., et al. Serum- and glucocorticoid-inducible kinase 1 in doxorubicin-induced nephrotic syndrome. Am J Physiol Renal Physiol. 295 (6), F1624-F1634 (2008).
- Zheng, Z., et al. A Mendelian locus on chromosome 16 determines susceptibility to doxorubicin nephropathy in the mouse. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (7), 2502-2507 (2005).
- Kimura, M., et al. Interstrain differences in murine daunomycin-induced nephrosis. Nephron. 63 (2), 193-198 (1993).
- Wang, Y., Wang, Y. P., Tay, Y. C., Harris, D. C. Progressive adriamycin nephropathy in mice: sequence of histologic and immunohistochemical events. Kidney Int. 58 (4), 1797-1804 (2000).
- Svenningsen, P., et al. Plasmin in nephrotic urine activates the epithelial sodium channel. Journal of the American Society of Nephrology : JASN. 20 (2), 299-310 (2009).
- Passero, C. J., Hughey, R. P., Kleyman, T. R. New role for plasmin in sodium homeostasis. Curr Opin Nephrol Hypertens. 19 (1), 13-19 (2010).
- Bohnert, B. N., et al. Aprotinin prevents proteolytic epithelial sodium channel (ENaC) activation and volume retention in nephrotic syndrome. Kidney Int. 93 (1), 159-172 (2018).
- Pippin, J. W., et al. Inducible rodent models of acquired podocyte diseases. Am J Physiol Renal Physiol. 296 (2), F213-F229 (2009).
- Bohnert, B. N., et al. Impact of phosphorus restriction and vitamin D-substitution on secondary hyperparathyroidism in a proteinuric mouse model. Kidney Blood Press Res. 40 (2), 153-165 (2015).
- Morton, D. B., Griffiths, P. H. Guidelines on the recognition of pain, distress and discomfort in experimental animals and an hypothesis for assessment. Vet Rec. 116 (16), 431-436 (1985).
- Beath, S. M., et al. Plasma aprotinin concentrations during cardiac surgery: full- versus half-dose regimens. Anesth Analg. 91 (2), 257-264 (2000).
- Kanter, P. M., et al. Preclinical toxicology study of liposome encapsulated doxorubicin (TLC D-99): comparison with doxorubicin and empty liposomes in mice and dogs. In Vivo. 7 (1), 85-95 (1993).
- Ma, L. J., Fogo, A. B. Model of robust induction of glomerulosclerosis in mice: importance of genetic background. Kidney Int. 64 (1), 350-355 (2003).
- Kren, S., Hostetter, T. H. The course of the remnant kidney model in mice. Kidney Int. 56 (1), 333-337 (1999).
- Mizuno-Horikawa, Y., Mizuno, S., Tamura, S., Kurosawa, T. Advanced glomerulosclerosis is reversible in nephrotic mice. Biochem Biophys Res Commun. 284 (3), 707-713 (2001).
- Friberger, P. Chromogenic peptide substrates. Their use for the assay of factors in the fibrinolytic and the plasma kallikrein-kinin systems. Scand J Clin Lab Invest Suppl. 162, 1-298 (1982).
- Haerteis, S., et al. Plasma kallikrein activates the epithelial sodium channel in vitro but is not essential for volume retention in nephrotic mice. Acta Physiologica. , (2018).
- Schork, A., et al. Association of Plasminuria with Overhydration in Patients with CKD. Clin J Am Soc Nephrol. 11 (5), 761-769 (2016).
