Summary
Hier beschreiben wir die Induktion eines experimentellen nephrotischen Syndroms bei 129S1/SvImJ Mäusen durch schnelle retrobulbären Injektion von Doxorubicin. Wir behandeln auch Nephrotisches Mäuse mit verzögerter Freisetzung Pellets mit Aprotinin um Harn Serin-Protease-Aktivität hemmen und verhindern, dass Natrium-Retention.
Abstract
Nephrotisches Syndrom ist die extremste Manifestation des proteinuric Nierenerkrankung und zeichnet sich durch schwere Proteinurie, Hypoalbuminämie und Ödem durch Natrium-Retention und Hyperlipidämie. Zur Untersuchung der Pathophysiologie dieses Syndroms anhand Nagetier, die Modelle entwickelt wurden der Injektion von giftigen Substanzen wie Doxorubicin hemolytic Schaden. Bei Mäusen sind nur wenige Stämme anfällig für dieses Modell. In Wildtyp-129S1/SvImJ-Mäuse induziert die Gabe von Doxorubicin durch schnelle intravenöse Injektion, dem retrobulbären Sinus experimentelle Nephrotisches Syndrom, bietet die Symptome von Krankheiten einschließlich Natrium-Retention und Ödem. Nach dem Einsetzen der Proteinurie erhöht Mäuse Ausstellung Harn Serin-Protease-Aktivität, die zur Aktivierung des epithelialen Natrium-Kanal (ENaC) und Natrium-Retention führt. Pharmakologische Hemmung der Harn Serin Proteasen durch die Behandlung mit verzögerter Freisetzung Aprotinin hebt ENaC Aktivierung und verhindert, dass Natrium-Retention. Dieses Modell ist ideal, um die Pathophysiologie der Proteasuria, dhstudieren., die Ausscheidung von aktiven Serin-Proteasen, die ENaC Aktivierung durch Proteolyse von der γ-Untereinheit verursachen. Dies kann als der primäre Mechanismus der ENaC Aktivierung und Natrium-Retention in proteinuric Nierenerkrankung betrachtet werden.
Introduction
Nephrotisches Syndrom ist gekennzeichnet durch schwere Proteinurie, Hypoalbuminämie, Ödeme und Hyperlipidämie und als die extremste Manifestation des proteinuric Nierenerkrankung angesehen werden kann. Bei Nagetieren kann experimentelle Nephrotisches Syndrom durch einmalige Injektion von Anthrazyklinen oder Puromycin führt zu hemolytic Schäden und ähnelt menschlichen minimale Änderung Krankheit und fokal segmentale Glomerulosklerose (FSGS)1induziert werden. Nach seiner Erstbeschreibung im Jahr 1955 von Frenk Et Al. 2, Puromycin Nukleosid Nephrose (PAN) bei Ratten ist ein Standardmodell zu untersuchen, die Pathophysiologie des Nephrotischen Syndroms in zahlreichen Studien3,4,5,6geworden. Bei Mäusen kann das entsprechende Modell von Anthrazyklin Doxorubicin7induziert werden. Allerdings gibt es eine starke Belastung-Abhängigkeit, die durch mindestens zwei genetische Loci8genetisch determiniert ist. Darüber hinaus gibt es Unterschiede in der proteinuric Reaktion und Kurs des Nephrotischen Syndroms9,10. Mit 129S1/SvImJ Mäusen und schnelle intravenöse Injektion von Doxorubicin über den retrobulbären Sinus, erreichen Proteinurie Antworten Werte, die ausreichen, um die typischen Merkmale eines nephrotischen Syndroms, insbesondere Volume Retention zeichnet sich durch induzieren Aszites und beinahe natriumfrei Urin7. Natrium-Retention im experimentellen Nephrotisches Syndrom hat vermutlich das Ergebnis der Aktivierung des epithelialen Natrium-Kanal (ENaC) in den distalen Röhrchen durch akzessorisch gefilterte Serin Proteasen wie Plasmin verursacht Proteolyse von der γ-Untereinheit4 ,11,12. Vor kurzem wurde dieses Konzept Nephrotisches Mäusen bewiesen die aus proteolytischen ENaC-Aktivierung und Natrium-Retention durch Behandlung mit Serin Protease-Inhibitor Aprotinin geschützt waren, die ebenso wirksam wie die ENaC Blocker Amilorid13war. Um kontinuierliche Lieferung an der distalen Röhrchen zu gewährleisten, wurde Aprotinin über subkutan implantierten verzögerter Freisetzung Pellets verabreicht. Zukünftige Studien sind verpflichtet die Serin-Proteasen zu identifizieren, die verantwortlich für die proteolytische Aktivierung der ENaC in Nephrotisches Syndrom sind die vermutlich die menschliche Situation parallel. Zu diesem Zweck ist Doxorubicin-induzierte Nephrotisches Syndrom ein wertvolles Modell, das auf gentechnisch veränderte Mäuse erweitert oder in Wildtyp Mäusen verwendet werden kann. Seine Vorteile sind niedrige Kosten für das Medikament, geringere Komplexität des Managements und der guten Reproduzierbarkeit14.
In diesem Artikel zeigen wir die Induktion der experimentellen Nephrotisches Syndrom durch schnelle intravenöse Injektion von Doxorubicin, des retrobulbären Sinus und Implantation von retard-Pellets mit Aprotinin um Harn Serin Protease hemmen Aktivität mit einem chromogenen Assay gemessen.
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Protocol
Alle Methoden wurden nach der nationalen Institute der Gesundheit Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren und das deutsche Recht für das Wohlergehen der Tiere durchgeführt, und sie wurden von den lokalen Behörden (Regierungspräsidium Tübingen) genehmigt.
1. Induktion von experimentellen Nephrotisches Syndrom von Doxorubicin Einspritzung des retrobulbären Sinus
- Bereiten Sie eine 0,5 mL Spritze mit einer montierten 30G Kanüle durch die Markierung der Stop-Stellung des Kolbens.
- Injektionsvolumen von Doxorubicin für männliche (7,25 µL/g Körpergewicht (bw) gleich 14,5 µg/g bw Doxorubicin) und weiblichen Mäusen (6.9 µL/g bw gleich 13,8 µg/g bw Doxorubicin) entsprechend dem Körpergewicht von morgens zu berechnen.
Hinweis: Die angegebene Dosis eignet sich für die Induktion eines nephrotischen Syndroms. Geringfügige Änderungen in der Dosierung führen zu einem entscheidenden verschiedene Nephropathie reicht von milden chronischen Nierenerkrankung mit nur kleinen Änderungen in glomeruläre Filtrationsrate (12,6 µg/g bw Doxorubicin) zu akuten Nierenversagens Scheitern (15,4 µg/g bw Doxorubicin)7, 15. - Den berechneten Betrag von Doxorubicin Lösung (2 µg/µL) in einem 37 ° C warmen Raum warm.
Achtung: Doxorubicin ist schädlich, wenn geschluckt und können Krebs verursachen. Immer tragen Sie Handschuhe, wenn mit Doxorubicin arbeiten und vermeiden Sie jeden Kontakt mit der Haut. - Vorausfüllen von der Spritze mit Doxorubicin Lösung bis der Markierungspunkt und die Waage auf NULL gesetzt. Füllen Sie die Spritze mit der Einspritzmenge und überprüfen Sie die Lautstärke durch Wiegen der Spritze.
- Betäuben Sie die Maus mit 5 Vol % Isofluran mit einem Vaporizer und Sauerstoff-Flow von 2 L/min tief.
- Verwenden Sie die Salbe nicht auf die Augen vor der Injektion. Der Bediener braucht einen klaren Blick auf die Augenhöhle für eine sichere und erfolgreiche retrobulbären Injektion durchführen.
- Bewertung des Anästhesie durch Pedal Reflex und ggf. Narkose Lieferung vor Beginn der Injektion.
- Platzieren Sie den Mauszeiger rechts seitlich liegen, mit dem Rücken, mit Blick auf den Körper des Fahrers und den Kopf mit Blick auf die Hand des Bedieners Injektion.
Hinweis: Das Verfahren ist für Rechtshänder, beschrieben, für Linkshänder, die Durchführung der Injektion mit der linken Hand es einfacher ist, die Position und Injektion umgekehrt rechts nach links. - Ragen Sie sorgfältig die Maus linken Augapfel aus der Augenhöhle durch sanften Druck auf die Haut, dorsalen und ventralen für das Auge.
- Punktion des linken retrobulbären Sinus vom inneren Augenwinkel (mediale palpebrale Kommissur). Vermeiden Sie den Kontakt mit dem Mouse´s Augapfel.
- Leicht kippen Sie die Spritze und injizieren Sie gesamten Datenträgers in einem Rutsch zu. Stellen Sie sicher, dass die Lautstärke ohne Widerstand und ohne irgendwelche Anzeichen von Extravasation wie Exopthalmus oder Leckage aus der Einstichstelle injiziert wird.
- Da Doxorubicin eine hochgiftige Substanz ist, überprüfen Sie Wohlbefinden mindestens einmal täglich mit einem Notenblatt nach Morton und Griffiths Et al. 16 und Zahlen besondere Aufmerksamkeit auf die Injektionsstelle. Wenn keine Anzeichen einer Extravasation Exopthalmus mögen, beeinträchtigt Augenlid Schließung oder irgendwelche Anzeichen von Nekrose wie Schwellungen oder Haut Läsionen auftreten nach der Injektion oder in den folgenden Tagen sollte die Maus eingeschläfert werden.
2. Implantation von retard-Pellets mit Aprotinin
- Pellets mit der gewünschten Dosis pro Tag und Freigabe Dauer im Voraus zu bestellen. Im Falle von Aprotinin wählen Sie eine Dosis von 1 mg pro Tag über 10 Tage freigegeben werden.
Hinweis: In dieser Studie die Aprotinin Pellets enthalten eine Dosis von 10 mg.- Speichern Sie die Pellets unter trockenen Bedingungen und vermeiden Sie jede Exposition gegenüber Feuchtigkeit.
- Bereiten Sie erforderliche Elemente für die Chirurgie, einschließlich Haar Schere, Haut Vorbereitung Schere, Skalpell, chirurgische Pinzette, zwei Paare von Gewebe Pinzette, Nadelhalter und 15 cm Monofile Faden nicht resorbierbaren vor.
- Sterilisieren Sie die Instrumente mit einem Wärme-Sterilisator für 5 min. bei 240 ° C. Vor der Verwendung der Instrumente, für 5 min warten Sie, bis sie Zimmertemperatur erreicht.
- Vermeiden Sie den Kontakt von sterilisierten Instrument Tipps unsterilen Oberflächen.
- Hautverbrennungen zu vermeiden, indem Sie heiße Instrumente.
- Sterilisieren Sie die Instrumente mit einem Wärme-Sterilisator für 5 min. bei 240 ° C. Vor der Verwendung der Instrumente, für 5 min warten Sie, bis sie Zimmertemperatur erreicht.
- Betäuben Sie Maus mit Isofluran 5 Vol-% gefolgt von 1,5 vol% mit einem Vaporizer und Sauerstoff Flow von 2 L/min.
- Platzieren Sie den Mauszeiger in Bauchlage auf einem wärmenden Gerät, bedeckt mit einer Schicht aus Gaze zur Vermeidung von thermischer Verletzungen zur Maus. Oberflächentemperatur beträgt ca. 37 ° C.
- Schützen Sie die Augen mit Salbe.
- Entfernen Sie die Haare in der Mitte zurück in eine Fläche von etwa 0,5 cm2 mit einer Schere oder einem haarschneidegerät und Desinfizieren Sie die unbehaarte Haut mit einem Desinfektionsmittel für hautdesinfektion geeignet. Entfernen Sie so weniger Haare wie möglich, so es immer schwieriger für die Maus bleibt, um die Wunde zu erreichen und Thread später endet und Körpertemperatur zu halten.
- Einzuschneiden Sie die unbehaarte Haut mit einem Skalpell in Cranio-Caudale Richtung in einer Länge von etwa 5 mm. Vorbereiten einer linken seitlichen Tasche von ca. 1 cm tief in das subkutane Bindegewebe mit einer stumpfen Zubereitung.
- Bewertung des Anästhesie durch Pedal Reflex und ggf. Narkose Lieferung vor Beginn der Operation.
- Einsetzen Sie eine 10-Tage-Version Pellet in bereit linken seitlichen Beutels Pinzette steril Gewebe. Lassen Sie die Kugel an der Unterseite des Beutels in eine planare Position.
- Vermeiden Sie jeden Kontakt des Pellet-Flüssigkeit und Feuchtigkeit bis in die vorbereitete Tasche platziert.
- Schließen Sie die Haut mit 2-3 Fäden. Lassen Sie nur sehr kurze Fadenenden machen es schwieriger für die Maus, um die Nähte durch nagen zu öffnen.
- Legen Sie die Mäuse einzeln, postoperative Stress zu reduzieren und Öffnen der Nähte durch nagen zu verhindern. Halten Sie die Maustaste im Blick, bis es nach der Narkose ausreichend Bewusstsein wiedererlangt hat.
Hinweis: Es gibt keine Notwendigkeit für die postoperative Schmerztherapie da dieser Eingriff ohne irgendwelche Anzeichen von Unbehagen oder Schmerzen gut vertragen wird. Alternativ empfehlen wir topische Analgetika, z. B. einen Tropfen Bupivacain auf den Einschnitt vor der Schließung, die bis zu 8 h Analgesie bieten würde.
3. Bewertung für Modell Induktion, Zeichen des Nephrotischen Syndroms und Wohlbefinden
- Sammeln Sie Morgenurin (08:00) in einer Reaktion Tasse (1,5 mL) täglich ab dem Tag der Injektion durch das Massieren der Blase.
- Proteinurie mithilfe von Bradford Protein Assay zu messen und zu Kreatinin normalisieren.
Hinweis: Für die Induktion eines nephrotischen Syndroms, Proteinurie sollte eine Schwelle von 120 mg/mg Kreatinin zwischen 7. und 10. Tag nach der Injektion von Doxorubicin erreichen.
- Proteinurie mithilfe von Bradford Protein Assay zu messen und zu Kreatinin normalisieren.
- Suchen Sie nach der Entwicklung von Aszites. Suchen Sie nach Erhöhung der Bauch Umfang oder überhängende Flanken.
- Wiegen Sie die Maus, die Lebensmittel-Pellets und die Trinkflasche am Morgen (08:00) jeden Tag.
- Überprüfen Sie Wohlbefinden mindestens einmal täglich mit einem Notenblatt nach Morton und Griffiths Et Al. 16
4. Messung der Harn Serin Protease mit einem chromogenen Assay
- Bereiten Sie Substrat funktionierende Lösung durch Zugabe von 15 mL sterile Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS), eine Flasche von 25 mg lyophilisiert chromogenen Substrat S-2251, mit einer Konzentration von 2 mM. Auflösen von Aprotinin in PBS, eine Aprotinin-Lösung mit einer Konzentration von 2 mg/mL zu erhalten.
- Speichern von vorbereiteten Lösungen bei-20 ° C. Dies verlangsamt deutlich den Auto-Abbau von S-2251. Verwenden Sie alte Lösungen nicht mit einem starken Gelbton.
- Verwendung frisch zubereitet oder Substrat Arbeitslösung aufgetaut und in einer Wärmekammer 37 ° C warm.
- Urinproben bei Raumtemperatur Auftauen.
- Verhindern, dass Protease-Abbau durch wiederholtes Auftauen und Einfrieren zu vermeiden. Speichern von Urinproben bei-20 ° C.
- Verwenden Sie eine 96 Microwell-Platte für photometrische Messung geeignet. Fügen Sie 3 µL des unverdünnten Urin in jedem der zwei Brunnen hinzu und 50 µL Substratlösung arbeiten mit 3 µL PBS oder Aprotinin-Lösung in die Vertiefungen. Die Platte mit einer Versiegelung Platte abdecken.
- Inkubieren Sie die überdachte Microwell-Platte für 60 min in einer Wärmekammer 37 ° C.
- Messung die optische Dichte von jedem Bohrloch bei 450 nm mit einer Mikrotestplatte Reader.
- Nehmen Sie den Unterschied zwischen der OD ohne Aprotinin und mit Aprotinin als Harn Aprotinin-Sensitive Serin-Protease-Aktivität.
Hinweis: Messung einer gekoppelten Probe mit und ohne Aprotinin erhöht Spezifität des Assays, da das Substrat auch durch andere Proteasen gespalten werden könnte, die keine pathophysiologische Rolle spielen.
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Representative Results
Nach der Induktion der Isoflurane Narkose wurde Doxorubicin rasch über den linken retrobulbären Sinus injiziert. Das gesamte Volumen von 7,25 µL/g bw injiziert wurde, ohne jeden Widerstand und Extravasation beweisen intravenöse Lage der Kanüle korrigieren. Die Maus schnell von Narkose erholt und hatte keine Wertminderung an jenem Tag und danach. Insbesondere gab es keine Anzeichen einer Beschädigung am linken Auge. Nach Doxorubicin Einspritzung, Nahrung und Flüssigkeit Einnahme sank in den ersten 3 Tagen aufgrund einer allgemeinen toxischen Wirkung von Doxorubicin und erholte sich danach (Abbildung 1a). Während der ersten 3 Tage nach der Injektion verloren die Maus 3,4 % seines Körpergewichts wegen Appetitlosigkeit (Abbildung 1 b). Abdem 5 Tag , entwickelt die Maus markierten Proteinurie (Abbildung 1 c), die durch einen massiven Rückgang der Harn Natrium-Ausscheidung trotz ausreichende Nahrungsaufnahme (Abbildung 1a, b) folgte. Diese Natrium-Retention führen zu einer massiven Verstärkung von Körpergewicht um 22,2 % von Tag 3 bis Tag 10 und wurde begleitet von Aszites. Als Folge der Proteinurie entwickelt die Maus Hypoalbuminämie (Abbildung 1 c). In einer Plasma-Probe am Tag 10 war Hyperlipidämie sichtbar. Diese Daten zeigen, dass Doxorubicin gegeben durch den Sinus retrobulbären schnell und eindrucksvoll ein ausgewachsenes Nephrotisches Syndrom in Wildtyp-129S1/SvImJ-Mäuse induziert.
Natrium-Retention im experimentellen Nephrotisches Syndrom wurde die Aktivierung der ENaC von aberranten Filtration von Serin-Proteasen wie Plasmin11,12verbunden. Wenn dieses Konzept gilt, sollte die Hemmung der Harn Serin Proteasen durch Aprotinin vor ENaC Aktivierung und Natrium-Retention schützen. Um die Wirkung von Aprotinin auf ENaC Aktivierung zu untersuchen, haben wir eine nephrotische Maus mit Aprotinin behandelt. Wie Aprotinin durch glomeruläre Filtration rasch ausgeglichen wird, wählten wir Medikamentengabe mit einer retard-Tablette, um ständige Verfügbarkeit von Aprotinin in den distalen Röhrchen über 10 Tage sicherzustellen. Am dritten Tag nach der Injektion von Doxorubicin eine Maus mit einem Pellet-Aprotinin-haltige implantiert wurde und eine Kontrolle Maus erhielt eine Placebo-Tablette unter Isofluran-Narkose. Tiere erholt sich rasch Form Narkose und die Wunde verheilt ohne Probleme. Ab Tag 5 Proteinurie in beide Mäuse in ähnlichem Ausmaß (Abbildung 2a) entwickelt. Allerdings erlebt nur das Placebo behandelten Nephrotisches Mäuse Natrium-Retention (Abb. 2 b) und Körpergewichtszunahme (Abbildung 2 c) Angabe ENaC Aktivierung. Im Gegensatz dazu die Aprotinin behandelten Maus wurde aus Natrium-Retention geschützt und Körpergewicht gewinnen (Abb. 2 b, c). Dies zeigt deutlich, dass Harn Serin-Protease-Aktivität der Natrium-Retention in Nephrotisches Syndrom verursacht.
Die Aprotinin-Konzentration im Urin und Plasma erreicht wurde mit einem ELISA gemessen. Wie in Abbildung 3a, Harn Aprotinin Konzentration erreichte bald nach der Implantation und danach konstant war. Bedeutet, dass Urin Aprotinin Konzentration 207 ± 29 µg/mL (32 ± 4 µM) war, während Aprotinin Plasmakonzentration nach 10 Tagen Behandlung 13 µg/mL (2 µM), vergleichbar mit der Plasmakonzentration Aprotinin behandelten Patienten17erreicht. Die Wirkung von Aprotinin auf Harn Serin-Protease-Aktivität gemessen wurde mit einem chromogenen Assay mit Urinproben genommen im Laufe des experimentellen Nephrotisches Syndrom. Dieser Test basiert auf der Hydrolyse der Peptidbindung in das Substrat p-Nitroaniline, die leicht durch Photometrie bei 450 erkannt werden kann die Freigabe nm. Wie in Abbildung 3 bgezeigt, erhöhte sich zusehends Serin-Protease-Aktivität im Urin aus der Placebo-behandelten Nephrotisches Maus gleich von Beginn der Proteinurie. Im Gegensatz dazu war Harn Serin-Protease-Aktivität in der Aprotinin behandelten Nephrotisches Maus zeitgleich mit der Prävention von ENaC Aktivierung und Natrium-Retention, dargestellt in Abbildung 2 b, cvöllig gehemmt.
Abbildung 1: Verlauf der Nahrung und Flüssigkeit-Aufnahme (a), Harn Natrium Ausscheidung und Körper Gewicht (b) und Proteinurie und Plasma-Albumin-Konzentration (c) vor und nach der Induktion der experimentellen Nephrotisches Syndrom. Nach einem Rückgang in der Nahrung und Flüssigkeitszufuhr während der ersten drei Tage nach Doxorubicin zeigen Mäuse eine nahezu konstante Einnahme. Nach fünf Tagen beginnt die Entwicklung der Proteinurie und nephrotisches Schwellenwert zwischen Tag 7 und 10, zu vollwertigen Nephrotisches Syndrom mit Ödembildung, Natrium-Retention und Hypoalbuminämie erreicht. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Verlauf der Proteinurie (a), Harn Natrium-Ausscheidung (b) und (c) in einer Maus Körpergewicht behandelt mit Aprotinin oder Placebo Pellet jeweils am 3. Tag nach der Injektion von Doxorubicin. Trotz der Entwicklung der Proteinurie in ähnlichem Umfang schützt Aprotinin Natrium Retention und Ödem Bildung durch ENaC Aktivierung während Nephrotisches Syndrom verursacht. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Verlauf der urinausscheidenden Aprotinin Konzentration nach der Implantation des pelletofens mit Plasmakonzentration von Aprotinin. Verlauf der Harn Serin-Protease-Aktivität gemessen mit dem chromogenen Assay in Schritt 4 beschrieben. Harn Aprotinin Konzentration Gipfel bald nach der Implantation und danach konstant ist. Serin-Protease-Aktivität steigt im Urin bei nephrotischem Syndrom, wie das Auftreten von Proteinurie. Aprotinin in Vivo verhindert gegen Erhöhung im Harn Serin-Protease-Aktivität. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Hier zeigen wir, dass Doxorubicin Injektion mittels retrobulbären Sinus Injektion experimentelle Nephrotisches Syndrom bei 129S1/SvImJ Mäusen mit Proteinurie, Natrium-Retention, Hypoalbumenia und Hyperlipidämie induziert. Allerdings gibt es zwei kritische Fragen, die bei der Verwendung dieses Musters berücksichtigt werden müssen. Erstens die Modell-Induktion ist streng dosisabhängig und Abweichungen von Doxorubicin Dosis so klein wie 0,3 µg/g beeinflussen die Reaktion der Mäuse15. Wenn Sie mit einer niedrigeren Dosis wie 14 µg/g injiziert bw oder unten, Doxorubicin verursacht nur nephrotische Proteinurie, die nicht mit offener Natrium-Retention, Aszites und Hyperlipidämie verbunden ist. Im Gegensatz dazu führt Injektion einer höheren Dosis zu akutem Nierenversagen und eine hohe akute Sterblichkeit. Je nach Dosis und Reaktion der Mäuse Doxorubicin Ursachen einen Kurs ähnlich menschlichen akuten Nierenversagens Verletzungen (AKI), chronischer Nierenerkrankung mit glomeruläre Filtration erhalten bewerten (CKD Stufe G1-3) oder progressive chronische Nierenerkrankungen mit reduziert glomeruläre Filtrationsrate (CKD G4-5) führt zu Urämie7,15.
Zweitens, dieses Modell beschränkt sich auf bestimmte Mausstämme und der weit verbreitete C57Bl/6-Sorte ist resistent8. Darüber hinaus kann genetische Verunreinigung wie sie, während eine Rückkreuzung sein könnte zu eine deutlich geringere Ansprechrate führen. Dies kann zu einem gewissen Grad durch Erhöhung der Dosis von Doxorubicin vermieden werden. Jedoch die Dosis von Doxorubicin für Modell Induktion verwendet (14,5 µg/g bw) ist bereits in der Nähe der beschriebenen LD50 zwischen 15-17 µg/g bw in diesem Stamm7,18.
Die Verwendung von dieser Maus-Modell eröffnet die Möglichkeit, verschiedene hochinnovative Fragen rund um das nephrotische Syndrom, endokrinologische Regulationsstörungen und renale Anämie15von Proteinurie und Ödemen Bildung bis zu studieren. In diesem Sinne Doxorubicin-induzierte Nephropathie deckt das breite Spektrum der menschlichen CKD und ist eine gute Alternative zu aktuellen Modellen genutzt in Nephrologie Forschung solche 5/6 Nephrektomie19,20 oder einseitige Harnleiter Ligatur21. Darüber hinaus ist es möglich, die Anwendung des Modells auf gentechnisch veränderte Mäuse, die Rolle eines bestimmten Gens von Interesse im Laufe des Jahres das Modell wie das Fehlen von Serum und Glukokortikoid-Kinase 1 (SGK1) zu studieren7 oder viele andere.
Eine Besonderheit des vorgestellten Modells ist das Auftreten von Proteasuria, IE., die Ausscheidung von aktiven Serin-Proteasen, die ENaC Aktivierung durch Proteolyse von der γ-Untereinheit verursachen. Dies führt zur Ausscheidung von einer beinahe natriumfrei Urin und Volumen Aufbewahrung zeichnet sich durch rasche Gewichtszunahme und Entwicklung von Aszites nach Beginn der Proteasuria. Aber dieses Phänomen ist vorübergehend, und nach 15 Tagen, Mäuse spontan locker Aszites und Gewicht obwohl Proteinurie besteht. Der Grund bleibt jedoch schwer. Dieses paradoxe Verhalten wurde auch in Studien mit nephrotischem Ratten4 beobachtet und scheint ein allgemeines Merkmal der experimentellen Nephrotisches Syndrom bei Nagetieren vertreten.
Harn Serin-Protease-Aktivität wurde mit einem chromogenen Assay gemessen, die einfach und schnell. Es basiert auf der Hydrolyse der Amid-Bindung von p-Nitroaniline verbunden, ein Peptid 4 Aminosäuren Länge, die durch verschiedene Proteasen gespalten werden kann. In der Regel chromogene Substrate sind nicht spezifisch für einen bestimmten Protease und gibt es erhebliche Überschneidungen von Proteasen, die ein bestimmtes Substrat zu Spalten. Das hier verwendete Substrat ist eine bevorzugte Substrat von Trypsin-ähnlichen Serin Proteasen wie Plasmin oder Plasma Kallikrein22. Um die Spezifität zu erhöhen, sollte Protease-Aktivität von einer gekoppelten Probe mit und ohne ein Inhibitor23,24festgelegt werden. In dieser Studie wurde Aprotinin zur Aktivität von Trypsin-ähnlichen Serin Proteasen definieren. Durch die Berechnung der Aprotinin-Sensitive-Aktivität aus der Differenz, sind die Aktivitäten der anderen Proteasen egalisiert. In der Nephrotisches Maus mit Aprotinin in vivo behandelt war Harn-Serin-Protease-Aktivität nicht erhöht und vor allem fiel mit Aufhebung der Natrium-Retention. So, Harn Serin-Protease-Aktivität ist nicht nur in Nephrotisches Syndrom ursächlich für Natrium-Retention, sondern kann auch betrachtet werden ein Biomarker, Wirksamkeit von Serin-Protease-Inhibitor in Nephrotisches Syndrom, vorherzusagen, die eine neue therapeutisch werden könnte zu nähern, Behandlung eines nephrotischen Syndroms. In der Studie von Bohnert Et Al. 13, die Serin Protease-Inhibitor Camostat und Plasminogen Konvertierung Inhibitor Tranexamsäure Säure waren nicht wirksam bei der Verhinderung von Natrium-Retention mit Nichtbeachtung der Harn Serin-Protease-Aktivität normalisieren.
Doxorubicin ist eine hochgiftige Substanz, zwar retrobulbären Injektion sicher und Schäden, die das Wohlbefinden des Tieres beeinträchtigt nicht zugeordnet. Man könnte argumentieren, dass Heck Vene Injektion ein geeigneter Ansatz Reduktion tierischer not wäre. In einer vergleichenden Studie fanden wir heraus, dass Induktion über Heck Vene Injektion von Doxorubicin retrobulbären Route durch eine höhere Rate von Mäusen unterlegen war, die nicht Nephrotisches Syndrom (34 % non-Responder) im Vergleich zu denen durch die Retrobulbärneuritis Route (induzierte entwickelt haben 0-15 % non-Responder). Darüber hinaus verringerte Proteinurie durch Rute Vene Injektion führt zu attenuierten Natrium-Retention. Dies könnte durch die Unterschiede in der Pharmakokinetik und eine höhere maximale Konzentration von Doxorubicin durch hemolytic Schäden nach schnellen retrobulbären Injektion, die wesentlich für die Modell-Induktion ist erreicht. Allerdings muss betont werden, dass retrobulbären Injektion eine hoch qualifizierte und erfahrene Bediener zur Vermeidung von Komplikationen im Zusammenhang mit Extravasation selbst kleinste Mengen von Doxorubicin braucht.
Zusammenfassend ist experimentelle Nephrotisches Syndrom von Doxorubicin ein vielseitiges Modell der proteinuric Nierenerkrankung bei 129S1/SvImJ-Mäusen, die erlaubt, um hoch aktuelle wissenschaftliche Fragestellungen, vor allem Proteasuria zu untersuchen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Studie wurde unterstützt durch ein Stipendium der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG, AR 1092/2-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| supplies | |||
| BD Micro FINE + U-40 (0.30 mm x 8 mm) | BD Deutschland GmbH, Heidelberg, Germany | PZN: 07468060 | syring |
| ETHILON*II (5/0, 16 mm, 3/8c, 45 cm) | Johnson&Johnson Medical GmbH, Ethicon Deutschland, Norderstedt, Germany) | EH7823H | suture |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| reagents | |||
| aprotinin (6000 KIU/mg) | LOXO, Heidelberg, Germany | CAS 9087-70-1 | |
| Bepanthen, Augen- und Nasensalbe | Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany | PZN: 1578681 | ointment |
| Chromogenix S-2251 | HAEMOCHROM DIAGNOSTICA GmbH, Essen, Germany | 82 0332 39 | chromogenic substrate |
| doxorubicin (2.0 µg/µL) | Cell Pharm, Bad Vilbel, Germany | CAS 25316-40-9 | doxorubicin |
| isofluran CP (1 mL/mL) | CP-Pharma, Burgdorf, Germany | CAS 26675-46-7 | isofluran |
| pellets with matrix-driven sustained release (custom-made) | Innovative Research of America, Sarasota, FL | X-999 | pellet |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| equipment | |||
| ELx808 Absorbance Mikroplate Reader | BioTek, Bad Friedrichshall, Germany | ELx808 | microplate reader |
| MICROSTERIL - 436 | B.M.S., Trescore Balneario, Italy | GAL/436 | sterilizer |
| Hybridization oven/shaker | GE Healthcare UK Limited, Amersham LIFE SCIENCE, Little Chalfont, UK | RPN 2511 | heat chamber |
| Thermo MAT Pro 10 W, 15x25 cm, Lucky Reptile | Import Export Peter Hoch GmbH, Waldkirch, Germany | 61201 | mouse warming device |
References
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