Summary
Микроглии являются иммунные клетки мозга, которые обследования и реагировать на изменения мозга физиологии через морфологических изменений, которые могут быть оценены количественно. Этот протокол описывает ImageJ на основе анализа протокола для представления микроглии морфология как непрерывных данных согласно метрик, например клетки ветвления, сложности и формы.
Abstract
Микроглии являются фагоциты мозга, которые участвуют в мозг гомеостаза и непрерывно обследования окружающей их среды дисфункции, травмы и болезни. Как первый responders Микроглии есть важные функции для смягчения нейронов и глии дисфункции, и в этом процессе, они проходят широкий спектр морфологических изменений. Микроглии морфологии могут быть классифицированы описательно или, альтернативно, может быть определена количественно как непрерывной переменной для параметров, таких как клетки ветвления, сложности и формы. Хотя методы для количественного определения микроглии применяются для единичных клеток, несколько методы применяются к нескольким микроглии в весь Микрофотография. Этот метод предназначен для количественного определения нескольких и единичных клеток с помощью легко доступных ImageJ протоколов. Этот протокол является резюме шагов и плагинов ImageJ рекомендовала преобразовать флуоресценции и ярко поле микрофотографиями в представительных двоичные и каркасный изображения и проанализировать их с помощью программного обеспечения плагины AnalyzeSkeleton (2D/3D) и FracLac для сбора данных морфологии. Результаты работы этих плагинов суммировать морфологии клеток с точки зрения процесса конечные точки, развязок и длины, а также сложности, форма ячеек и размер дескрипторов. Скелет анализа протокола, описываемые хорошо подходит для регионального анализа нескольких микроглии в пределах всей Микрофотография или региона интерес (ROI), в то время как FracLac обеспечивает анализ дополнительных индивидуальных клеток. Комбинированные, протокол предоставляет объективную, чувствительной и всеобъемлющей оценки инструмент, который может использоваться для стратификации между разнообразными микроглии морфологии в мозг здорового и раненых.
Introduction
Микроглии есть немедленного и различных морфологических ответ на изменения в физиологии мозга1 вдоль континуума возможностей диапазоне от гипер ветвления и весьма сложные морфологии для исключения из разветвленной и Саркодовые морфологии2 . Микроглии может также стать поляризованные и палочковидные3. Микроглии клеток ветвления обычно определяется как сложную форму, имея несколько процессов и часто сообщается как количество конечных точек в клетку и длина клеточных процессов. Так как микроглии тонко настроены нейронов и глиальных функции посредством непрерывной ячеек кросс talk и в естественных условиях подвижности4,5, микроглии морфологии может служить показатели функций различных клеток и дисфункции в головном мозге. Количественный подход необходимо адекватно описать разнообразие этих морфологических изменений и выделить различия между разветвленной клетки, которые происходят с тонкими физиологического возмущения (например, эпилепсии5,6 и сотрясение7) в дополнение к грубой травмы (например инсульта8). Более широкое использование морфологии количественная оценка7,8,9,10,11,12,13,14 покажет все разнообразие микроглии морфологии во время болезни и здоровья. В настоящем исследовании детали поэтапного использования плагинов ImageJ необходимо обобщить микроглии морфология от флуоресцентных или не люминесцентные микрофотографиями микроглии приобрел в фиксированных грызунов ткани после иммуногистохимия (IHC).
Центральным для анализа методов, описанных здесь ImageJ плагины AnalyzeSkeleton (2D/3D)15, разработан в 2010 году для количественного определения больших молочных структур и FracLac16, разработанный в 2014 году интегрировать ImageJ и Фрактальный анализ количественную оценку отдельных микроглии фигур. Эти плагины предоставляют быстрый анализ микроглии ветвления в течение всего микрофотографиями или несколько микроглии определенной рентабельности в рамках Микрофотография. Этот анализ может использоваться отдельно или в комплекте с Фрактальный анализ. Одноклеточных Фрактальный анализ (FracLac) требует инвестиции времени, но предоставляет множество выходов морфология относительно сложности микроглии, форма и размер. Использование обоих инструментов не является избыточным, как клетки ветвления дополняет сложности клеток, и комбинация нескольких параметров может использоваться для различения различных микроглии морфологии в рамках наборов данных12,17.
Protocol
Все эксперименты были одобрены и выполнены в соответствии с руководящими принципами, установленными университета штата Аризона институционального ухода за животными и использовать Комитет и руководящие принципы НИЗ для ухода и использования лабораторных животных. Внимание было уделено минимуму животных боль и дискомфорт. Методы эвтаназии согласно утвержденным протоколом и состоят из шейки матки обезглавливание под изофлюрановая наркозом.
1. Подготовка тканей
Примечание: Провести анализ морфологии микроглии на фиксированной, образцы тканей cryoprotected для сохранения морфологии клеток. Ниже приведен стандартный протокол для подготовки и непосредственно ломтик фиксированных тканей для флуоресценции IHC.
- Удаление мыши или крысы мозги Усыпленных животных после желаемого эксперимента и согласно протоколу Стандартный лабораторный. Поместите мозга в 10 мл флакон с 5 мл 4% раствора параформальдегида для 24 ч при 4 ° C. Затем сполосните и место в 5-10 мл 30%-ая сахароза фосфата буферизуются решение (PBS, 0,01 М) за 72 ч при 4 ° C. Хранить весь мозг на-80 ° C до разрезания ткани с криостат, или на 4 ° C, если секционирование с микротома.
Примечание: Этот протокол имеет еще не были протестированы с использованием ткани, нарезанный от парафин врезанных тканей. - В разделе ткани мозга в нужный раздел толщина и ориентации с помощью криостата или микротома и хранить свободные секций в растворе криозащиты (50 мм PBS, этилен гликоль, глицерин) при-20 ° C.
Примечание: Этот протокол был успешно осуществил на разделах корональных ткани от 50 мкм до 200 микрон в толщину. Ткани, разделы меньше чем 50 мкм не может захватить полный диапазон микроглии процессов, в то время как в разделах толстые ткани, ИГХ окрашивания могут быть несовершенным вследствие антитела проникновения в ткани. Ткани могут быть либо секционного в корональных или сагиттального ориентации, и этот выбор будет зависеть от экспериментальных цели и мозг регион(ы) необходимо изучить.
2. иммуногистохимии
Примечание: Скелета и фрактальные методы анализа могут применяться для флуоресценции или 3, 3 ' диаминобензидин (DAB) IHC. Следующее является стандартным флуоресценции IHC протокол и может быть заменен при необходимости. Флуоресценции IHC дает превосходной визуализации клеточных процессов по сравнению с DAB IHC.
- Поместите в разделах ткани в 4 мл во флаконе стекла (до 15 мыши мозга разделы/флакона) и инкубировать с 1 мл раствора, содержащего до 10% лошадь сыворотке, PBS (0.01 М), 0,5% Тритон, 0,04% НАН3 при комнатной температуре (23 ° C) за 1 ч.
- Вымыть за 5 мин с PBS (0.01 М) три раза при комнатной температуре.
- Проинкубируйте с основного антитела (Iba1, 1:1, 000) при комнатной температуре за 72 ч в 1 мл раствора, содержащего PBS (0.01 М), 0,5% Тритон, 0,04% НАН3и покрыты (для сохранения эффективности3 NaN).
- Вымыть за 5 мин с PBS (0.01 М) три раза при комнатной температуре.
- Проинкубируйте с вторичное антитело (анти кролик 488, 1: 250) распространяется на комнатной температуре в течение 4 ч в 1 мл раствора, содержащего PBS (0.01 М), 0,5% Тритон, 0,04% НАН3
- Вымыть за 5 мин с PBS (0.01 М) три раза при комнатной температуре.
- Монтирования разделов ткани мозга (количество и ориентации на основе предпочтений) subbed слайды, применять средства монтажа мягкой набор на слайд и поместите coverslip ткани. Хранить слайды при 4 ° C.
Примечание: Толщина 1,5 стекла coverslip требуется для конфокальная томография. Софт набор является средством предпочтительным монтажа, потому что высокая вязкость не сжимать ткани и лучше сохраняет морфологии, когда по сравнению с hard-set монтаж средств массовой информации.
3. томография
- Изображение Iba1 клеток в разделе ткани мозга, используя ярко поле или Конфокальный микроскоп, который имеет возможность приобретения z стека с помощью 20 X объективных или больше.
Примечание: Параметры и настройки программного обеспечения должна быть постоянным для всех Микрофотография приобретения в эксперименте. Отличный процесс подробно получается с помощью 40 X или 63 X цели. Это позволяет применять протокол скелет анализа, описываемые всего Микрофотография или ROI нескольких ячеек в пределах крупных Микрофотография.- Приобрести 8-битные изображения с помощью соответствующего программного обеспечения параметров, характерных для Микроскоп программного обеспечения.
Примечание: Преобразование файлов в 8-битных после приобретения может исказить коллекции данных. - Приобрести по крайней мере 30 мкм z стек с не более чем 2 мкм интервал между изображениями с использованием соответствующего программного обеспечения параметров, характерных для Микроскоп программного обеспечения.
Примечание: Микроскоп и программное обеспечение должно позволить для захвата изображений в X, Y и Z оси. Z стек может быть увеличен, и интервала могут быть уменьшены предоставлять дополнительные микроглии деталь. В обмен визуализации времени будет увеличиваться. Возможности используйте Найквиста выборки для микроскопии флуоресцирования.
- Приобрести 8-битные изображения с помощью соответствующего программного обеспечения параметров, характерных для Микроскоп программного обеспечения.
- Сохраните все файлы, как Tif файлов или как того требует программного обеспечения микроскопа.
- Открыть файлы Tif в ImageJ и используйте панель инструментов для разделения каналов, нажав изображение | Цвет | Разделить каналыи стек изображений, нажав изображение | Стеки | X проекта | Максимальная интенсивность проекции при необходимости. Сохраните как файлы TIF.
4. скелет анализ
- Скачать Фиджи или ImageJ от < https://imagej.net/Fiji/Downloads>. Для отдельных плагинов, скачать AnalyzeSkeleton(2D/3D) от < http://imagej.net/AnalyzeSkeleton>15 и скачать FracLac от < https://imagej.nih.gov/ij/plugins/fraclac/fraclac.html>16.
Примечание: Весь процесс преобразования Микрофотография в двоичном каркасный занимает менее 1 мин. - При использовании флуоресценции Микрофотография, убедитесь, что изображение является 8-битовым и преобразовать в градации серого лучше визуализировать все положительный пятнать. Использование панели инструментов и нажмите изображение | Таблицы подстановки | Грейс. При использовании DAB ярко поле фотография, первого использования FFT полосовой фильтр плагин (с помощью панели инструментов, нажав процесс | БПФ | Полосовой фильтр), а затем преобразовать в градации серого.
Примечание: Для целей настоящего Протокола, ImageJ параметры по умолчанию для FFT фильтр полосы являются достаточно (фильтр до 3 пикселей, до 40, не полоса подавления). Применяя FFT полосовой фильтр удаляет шум (малые функции) при сохранении общей крупные аспекты изображения. Это особенно полезно в светлые области изображения, где расщепляется и трещин в ткани может появиться как фон и таким образом осложнить скелет анализа18. - Отрегулируйте яркость и контрастность, если изображение слишком тусклое и не могут быть визуализированы микроглии процесс. Использование панели инструментов и нажмите изображение | Отрегулируйте | Яркость/контрастность. Отрегулируйте ползунки, минимум или максимум, при необходимости, до края гистограммы, но не дальше.
Примечание: В ImageJ, яркость и контрастность изменяются путем обновления таблицы подстановки изображения (LUT), поэтому значения пикселей являются неизменными. Max и min ползунков управления нижнего и верхнего пределов диапазон отображения значений пикселов выше 255, появляется белый и значений пикселов ниже 0, появляются черные18. В случае флуоресценции микрофотографиями должны использоваться максимум ползунок, тогда как минимум ползунок будет использоваться для микрофотографиями DAB, окрашенных микроглии. - Запустить фильтр Unsharp Mask для дальнейшего увеличения контрастности с помощью панели инструментов, нажав процесс | Фильтры | Нерезкая маска. Для целей настоящего Протокола, параметры по умолчанию ImageJ (пиксель радиусом 3 и маска вес 0,6) используются.
Примечание: Маски нерезкости обостряет и расширяет возможности края изображения путем вычитания размытым версии изображения (Unsharp Mask), из оригинала, а затем Слияние результирующего изображения с высокой контрастностью версией исходного изображения. Таким образом фильтр Unsharp Mask не создавать детали, но скорее разъясняет существующие деталей в изображении. Радиус параметр изменения как размытые Нерезкая маска будет (и таким образом сколько размытия будет удалена), и маска вес установки изменения степень контраста, что Нерезкая маска будет объединен с (и таким образом регулирует контраст изображения). - Выполните шаг фильтр для удаления salt-and-pepper шума, создаваемого Unsharp Mask. Использование панели инструментов и нажмите процесс | Шум | Очистить от.
Примечание: Удаление пятен удаляет salt-and-pepper шум, заменив каждый пиксель значение медианы в окрестности 3 × 3. Эффект является, что выбросы интенсивности заменяются средний пиксел не затрагивая резкости краев18. - Преобразовать изображение в двоичный файл с помощью панели инструментов, нажав изображение | Отрегулируйте | Порог.
Примечание: Бинаризация территории изображения в градациях серого в особенности интерес против фон и преобразует изображение в двоичные18. - Применить despeckle, близко-и удалить останцы функции: В результате двоичного образа, может быть один пиксель фоновый шум и пробелы между процессами.
- Применить despeckle функция, с помощью панели инструментов, нажав процесс | Шум | Очистить от.
Примечание: Применение ретушь к двоичному файлу изображение удаляет любые оставшиеся шум одного пикселя. - Применить функцию закрыть с помощью панели инструментов, нажав процесс | Двоичные | Закрыть.
Примечание: Этот плагин соединяет два темных пикселей, если они разделены на 2 пикселя. - Примените функцию останцы удалить с помощью панели инструментов, нажав процесс | Шум | Удаление нетипичные.
Примечание: Для целей настоящего Протокола, яркие останцы ориентированы с пиксель радиусом 2 и пороговое значение 50. Этот плагин заменяет яркие или темные останец пиксель на средний пикселов в окрестности, если оно отклоняется более чем определенного значения (порог)18.
- Применить despeckle функция, с помощью панели инструментов, нажав процесс | Шум | Очистить от.
- Сохранить изображение как отдельный файл для будущего использования и/или фрактального анализа и Скелетонизация изображения с помощью панели инструментов, нажав процесс | Двоичные | Скелетонизация.
- Выберите изображение, каркасный и запустить плагин AnalyzeSkeleton(2D/3D) с помощью панели инструментов, нажав плагины | Скелет | Анализировать скелети флажок филиал информации.
Примечание: Вполне вероятно, что обработка изображений потребует оптимизации с помощью добавления или удаления выше предлагаемых шагов. В этом процессе каркасный изображения для точности оцениваются Создание накладываемого скелета и исходное изображение. СОСМ должно быть точек одного происхождения с процессами, вытекающих из центра; круговой СОСМ смешивать данные и следует избегать через протокол перестройки. Пример единого происхождения точки против круговой СОСМ показано на рисунке 1.
Общие проблемы, что приводит к не представитель скелеты и предлагаемые решения:
- Изображение слишком тусклое: преобразование в оттенки серого, отрегулировать яркость/контрастность ползунков или применить Нерезкая маска
- Слишком много фон: Отрегулируйте Слайдер Яркость/контраст, применить Despeckle и/или удалять промахов
- Круговой СОСМ каркасный изображения (особенно для флуоресценции изображений): применить FFT полосовой фильтр, или контурная
- Трещины в ткани (особенно для светлые области изображения): БПФ полосовой фильтр, или удаление пятен
- Скопируйте все данные из результатов и Отделение информационных мероприятий и вставить данные в таблицу Excel.
- В Excel усекая данные для удаления скелет фрагменты, которые в результате приобретения IHC и изображения.
- Дублировать книгу эксперимент с результатом скелет анализа исходных данных и добавьте отделкой к имени файла. Все последующие данные обрезки должно происходить в дублированных книги для сохранения исходных данных для использования в будущем и ссылки.
- Определите, какой длины фрагменты будут обрезаны из набора данных, открыв каркасный изображения в ImageJ и выбрав инструмент линия. Измерить несколько фрагментов, принимая к сведению средней длины и решение о пороговое значение.
Примечание: Для целей данные, представленные здесь, отсечки для нежелательные фрагменты длиной 0,5. Это значение должно быть постоянной в течение всего набора данных. - Пользовательский сортировки таблицы Excel, нажав Сортировка и фильтр | Пользовательская сортировка. Сортировать по «вокселей конечной точки» от крупнейших маленький и в новом уровне, путем «Mx филиал pt» от наибольшего к наименьшему.
- Удалите все строки, содержащей 2 конечных точек с максимальной филиал длиной меньше, чем пороговое значение (т.е.., 0,5). Сумма данных в столбце конечные точки, чтобы вычислить общее количество конечных точек собрана из образа.
- Повторите эти действия для отделения информации данных: Сортировать по «филиал длина» от крупнейших в наименьший. Просмотрите данные и удалить каждую строку, которая имеет длину филиал меньше порогового значения(т.е.., 0,5). Суммировать значения в столбце Длина ветви для расчета суммарного длины всех ветвей, собранные из образа.
- Повторите шаги 4.11.3-4.11.5 для каждого изображения/листа до тех пор, пока все данные были обрезаны и суммируются.
- Разделите данные из каждого изображения (суммируется число конечных точек и подвел филиал длина) количество СОСМ микроглии в соответствующее изображение. Введите в статистическое программное обеспечение окончательные данные (конечные точки/клетка & филиал длина/клетка).
Примечание: Суммируются филиал длина/ячейки данных может потребоваться преобразование Длина таблицы в пикселах в мкм.
5. Фрактальный анализ
Примечание: FracLac является возможность запустить ряд анализов различной формы, которые не охвачены в настоящем Протоколе. Для более подробного объяснения FracLac различные функции, смотрите руководство по FracLac в < https://imagej.nih.gov/ij/plugins/fraclac/FLHelp/Introduction.htm> и связанные ссылки 2,16,19. Фрактальный анализ использует протокол шаги 4.1-4.7, описанных выше.
- Определите размер Руа, который будет использоваться для всех Фрактальный анализ. Используйте инструмент прямоугольник для рисования ROI. Убедитесь, что поле является достаточно большой, чтобы захватить всю ячейку и может оставаться постоянной в течение всего набора данных.
Примечание: Используйте прямоугольное выделение, вместо того, чтобы руки отбора для обеспечения всех ROIs же размера прямоугольника, и поэтому, клетки имеют той же шкале. Это не будет случай, если руки выбора были использованы, потому что ImageJ будет автоматически масштабировать квадратных рентабельности с учетом различных размеров прямоугольные окна, результате клетки с различными весами. В то время как фрактальных фигур не зависят от масштаба, процесс анализа фрактал, используя FracLac для ImageJ зависит от масштаба16. Таким образом существует необходимость постоянно размера ROI на протяжении всего сбора данных. - Случайным образом выберите микроглии фрактального анализа в каждом Микрофотография и соответствующий двоичный образ. В окне диспетчера ROI выберите Обновление для блокировки ROI на позицию ячейки. Использовать сочетание клавиш Ctrl + Shift + D для дублирования область в пределах ROI в новом окне, а затем сохранить обрезанное ячейки. На изображении соответствующий двоичный (от скелета анализа) дублировать области с той же ячейке с помощью диспетчера ROI. Повторяйте до тех пор, пока достаточное количество клеток были случайным образом выбраны для фрактального анализа и сохраните все файлы.
Примечание: Генератор случайных чисел и пронумерованных сетка может использоваться для произвольно выбрать ячейки. - Откройте двоичное изображение с отдельной ячейки. Дважды щелкните инструмент «кисть», задайте цвет черный и при необходимости измените ширину кисти. С помощью сопоставления Микрофотография как ссылка, используйте кисть для удаления прилегающих клеточных процессов, соединения фрагментации процессов и изолировать клетки интереса. После того, как двоичные ячейки был изолирован, сохраните двоичный файл.
Примечание: Холдинг «alt» будет переключаться кисть из цвет переднего плана (черный) (белый) цвет фона. - Преобразование двоичных ячейки в наброски с помощью панели инструментов через процесс | Двоичные | Контур.
Примечание: FracLac для изображений J может использоваться либо твердых фигур или форму очертания, однако, нынешняя Конвенция использовать форму излагаются16. - В панели инструментов, откройте FracLac с помощью панели инструментов, нажав плагины | Фрактальный анализ | FracLac и выберите пункт до н.э. (поле подсчет). В параметрах Сетки дизайна равным 4 Num G . В разделе Параметры графики установите флажок метрики для анализа выпуклой и ограничивающий круг ячейки. Когда закончите, нажмите кнопку ОК.
Примечание: Num G поле число подсчета ориентации сетки используется во время сканирования и рекомендуемый диапазон для Num G 4-12. Параметр Num G и предлагаемый ассортимент тщательно рассматривается в ручной FracLac16. Увеличение Num G может значительно замедлить время вычислений. FracLac параметры только нужно будет установить один раз за сеанс. После ввода параметров нажмите кнопку Сканировать станут доступны. - Выберите кнопку Сканировать для выполнения подсчета коробки проверки на выбранное изображение.
Примечание: Проверка будет генерировать три окна с выходы данных: корпуса и круг результаты, файл резюме Box игр и проверка типов. Окно сканирования типов содержит журнал настройки, используемые, а также стандартные отклонения для определенных мер. Для целей настоящего Протокола в окно проверки типов не используется и может закрыты или сохранить для будущей справки. - В окне Халл и Круг результатов скопировать все нужные данные (т.е., плотность, span соотношение и округлость) результаты. В окне Поле Count Summary , скопируйте нужные данные (т.е., фрактальная размерность и лакунарности) результаты. Перенесите скопированные данные в файл Excel или статистического программного обеспечения.
Примечание: Полный перечень FracLac выходные данные предоставляются и тщательно разъясняется в FracLac для ручной ImageJ16.
Representative Results
Протоколы анализа морфологии микроглии, описываемые суммировать шаги полезны при обработке люминесцентных и DAB микрофотографиями морфометрического анализа. Эти шаги визуально приводится на рисунке 2 и на рисунке 3. Цель этих шагов является создание образа представителя двоичные и каркасный, надлежащим образом моделирующее оригинальные Микрофотография таким образом, чтобы накопленные данные являются допустимыми. После применения протокола, плагин AnalyzeSkeleton приводит в образе тегами скелет из которого количество конечных точек и филиал (т.е., процесс) lengthcan резюмировать от результате выходных файлов. Для оценки степени микроглии ветвления в Микрофотография или Руа затем используются конечные точки и длины данных процесса. Рисунок 4 приведены результирующие данные (конечные точки/клеток и процесса длина/клетка), собранные с и без применения протокола. Хотя существуют аналогичные тенденции, данных, которые обобщены в рисунке 4F разнообразны меньше чем в рисунке 4E. Кроме того, эти данные показывают, повышенная чувствительность к обнаружить различия между группами, когда применяется протокол. И наконец необходимо позаботиться об изменчивости между пользователем в приложении протокола. Такие различия приводятся на рисунке 5 , где один и тот же набор данных был проанализирован двумя независимыми пользователями применения одинаковых протокола приводится выше.
Дополнительные морфология данные собираются из одной клетки изолированы от двоичные образы, созданные во время применения протокола. Протокол шаги для анализа морфологии микроглии до и с помощью плагина FracLac приведены на рисунке 6. Мы иллюстрируют этот анализ в обеих ранен (рис. 6A) и ранения ткани (Рисунок 6B). Представитель изображений двоичных, изложил, выпуклой корпуса/инкапсуляции круг и поле подсчета примеры для каждой ячейки проанализированы с и без протокола приложения приводятся в Рисунок 6 c–F. Эти образы помогают проиллюстрировать причины различий в морфологии данных, которые обобщены в рисунке цилиндровая.
Рисунок 1. Иллюстрации каркасный микроглии с круговой Сома (субоптимальные) против одного происхождения Сома (оптимальная) и соответствующего оверлея между каркасный клеток и оригинальные Микрофотография. Шкалы бар = 10 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Протокол приложений для флуоресцентных микрофотографиями. Иллюстрации скелет анализа протокола применительно к флуоресцентные Микрофотография с одной ячейкой обрезанное Показать подробности. Шкалы бар = 10 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Протокол приложений для DAB ярко поле микрофотографии. Иллюстрации скелет анализа протокола применяется к Микрофотография DAB ярко поля с одной ячейкой обрезанное Показать подробности. Шкалы бар = 10 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4. Анализ данных с и без применения протокола. (A) пример Микрофотография флуоресцентные IHC и обрезанного ячейку, соответствующую желтую коробку (B). Пример двоичной и каркасный изображения с (C) и (D) Протокол применяется как описано. Сводные данные микроглии конечных точек/клеток и процесса длина/ячейки в невредимой (белый) и ранено кортикального слоя ткани (серый) с (E) и без (F) применяется протокол. Статистический анализ с использованием t тест студента и n = 3, ** обозначает p < 0.01. Шкалы бар = 10 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5. Различия пользователя с приложением протокола. Пример исходного изображения и протокол преобразования двоичных и скелет изображений пользователь 1 и пользователь 2. Различия между двумя изображениями, выделены с совпадающими цветные круги. Сводные графики микроглии процесса и конечных точек на ячейку данных длина/ячейки в регионах ранен и получивших травмы мозга пользователь 1 и пользователь 2. Статистический анализ с ANOVA и образца размер равен n = 3; p < 0,05, **p < 0.01, ***p < 0,001. Шкалы бар = 10 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6. Фрактальный анализ с и без применения протокола. Пример обрезки микрофотографиями микроглии в ранен (A) и раненых (B) коры с соответствующий двоичный (C) и наброски (D) изображений, которые приводят с и без применения протокола. Связанные выпуклой (синий) и препровождающее круг (розовый) для соответствующего плана фигур (E) используются для вычислить плотность форму, охватывают соотношение и округлость (G). Поле, подсчитывая метод иллюстрируется в (F) и используется для фрактальной размерности (DB) и вычисления лакунарности (λ) (G). Шкалы бар = 10 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Discussion
Микроглии клеток тонко настроены на физиологии и патологии в пределах их микро доменов и отображать широкий спектр морфологии2 тонкие7,14 и грубой травмы8. Использование протоколов ImageJ делает количественной морфологии микроглии доступным для всех лабораторий в качестве платформы и плагины являются открытым исходным кодом обработки изображений программное обеспечение. Хотя описанные протокол ориентирована на анализ с использованием этого программного обеспечения и обработки изображений, согласованности сбора данных, достоверности и надежности начинается с отличным IHC и микроскопии. Этот протокол используется для улучшения двоичный, скелет и наброски представления всей микрофотографиями и отдельные ячейки, но не может занять место бедных IHC окрашивание и микроскопии, что приводит к низкой контрастности, размыты или искаженные изображения. Как дополнительного рассмотрения должны позаботиться не придавить ткани мозга во время хранения, до секционирование, которая безвозвратно изменяет микроглии морфологии. И наконец в рамках каждого эксперимента, быть imaged микроглии с использованием той же шкале, а так же микроскопа. Приборостроение, цели и программное обеспечение различаются среди Микроскопы, которые приведет к различных размеров микрофотографиями, несмотря на схожие цели и изменить детали, а также количество клеток в каждом кадре. Например получение изображения с помощью 40 X цель на Leica SPII результаты в два раза числа клеток и менее подробно, чем приобретение с помощью Zeiss 880. Это особенно важно для ячейки ветвления данных, собранных из всего кадра, а не одну ячейку, как это становится проблемой выборки данных.
В общем скелет анализ, который использует весь Микрофотография предшествует одноклеточного Фрактальный анализ по двум причинам. Определяющим ветвления клеток всех ячеек в Микрофотография является быстрым, по сравнению с одной ячейке Фрактальный анализ и может рассматриваться как инструмент скрининга, если время является фактором. Кроме того двоичных изображений, полученных в ходе скелет анализа используются для фрактального анализа. После записи образа, существует ряд важных шагов, которые могут повлиять на результаты анализа скелета и ввести пользователя влияние. Протокол шаги, которые большинство переменной между пользователями являются шагом 4.2 (увеличение яркости изображения) и шаг 4.5 (определение порога). Там, где это возможно, оптимального числа для увеличения яркости (max или min ползунок между 0-255) определяется и удерживается в постоянном для всех изображений и пользователей. Где изображение изменчивость велик, пользователь может вместо этого выбрать яркость, которая будет варьироваться между изображениями. В качестве альтернативы, если изображения ярких и высокий контраст, затем увеличение яркости может быть опущен и порог может быть стандартизирована с помощью фильтра порог специальность (например., Хуан) вместо более переменной по умолчанию. После того, как оптимизированы, параметры следует придерживаться для того, чтобы свести к минимуму влияния дополнительных пользователей.
Пример пользовательского изменчивости представлен на рисунке 5. Значения данных были увеличены в User 1 против 2 пользователя и поэтому изменчивость будет увеличено, если пользователь 1 и пользователь 2 способствовали сбору данных. Пример различий в пользователь 1 и пользователь 2 бинарных и каркасный изображения выделяются цветные круги (Рисунок 5). В этом случае оба пользователи были кратко подготовленных студентов с ограниченным опытом в микроглии. Регулярного надзора и наставничества микроглии экспертов наряду с повышенной протокол подготовки2 может снизить изменчивость между пользователем. Хотя здесь не оценены, Фрактальный анализ является менее подвержен изменчивость между пользователем потому что бинарные клетки вручную и индивидуально изолирован от Микрофотография вместо того, чтобы полагаться исключительно на порог для определения микроглии фигур. Однако все методы обладают некоторые изменчивость между пользователями. Таким образом, один пользователь (в идеале, подготовленных некоторый опыт в Микроглии клеток) должна завершить сбор данных для всего набора данных.
Дополнительные изменения можно легко внести этот протокол и будет зависеть от качества изображения и усилия, предпринятые для уменьшения шума и обеспечить процесс подключения. Например если контраст, затем маска нерезкости не является необходимым и может быть опущен. Это разумно, чтобы оптимизировать и завершить подготовку протокола для определенного набора изображений, экспериментальных дел и управления, до сбора данных из всего набора. И наконец, дополнительные плагины могут использоваться вместо других уточнить или резкость изображения, которые не были описаны в настоящем протоколе такие как расширяются или резкость.
Преимуществами этого протокола являются всеобщей доступности и адаптируемость. Кроме того оценки клеток ветвления с помощью AnalyzeSkeleton быстро и применимых к весь Микрофотография. Преимущество нескольких ячеек анализ подхода является фокус на весь регион, а не на отдельные клетки. Таким образом это позволяет быстро оценить средний ветвления (с точки зрения конечных точек и процесс длина) всех микроглии в пределах изображения. Скелет анализ представляет собой анализ нескольких ячеек: выборка данных с точки зрения числа клеток, которые не могут быть подкреплены Фрактальный анализ из-за инвестиций требуется время для изоляции единичных клеток от микрофотографиями. Экземпляр, где это может быть наилучшим будет скрининга микроглии морфологии в proximities фокуса травмы. Одно ограничение — это несовершенной, когда по сравнению с подходом больше времени одну ячейку поля целиком рендеринга изображений для создания скелета моделей IHC микрофотографиями. Кроме того анализ региона не соответствующие обстоятельства, когда Микроглия морфологии резко отличаются в пределах той же области. Наконец этот метод анализа зависит число ячеек, параметр, который может отличаться между экспериментальных условиях.
Фрактальный анализ проводится на одну ячейку и поэтому дополняет результате скелет анализа выходных данных ветвления средний клеток. Хотя гораздо больше времени, эта инвестиция дает широкий спектр морфометрических данных. Например, ячейка плотность, span отношение, и округлость данных описывают размер, удлинение и форму контура ячейки, соответственно. Фрактальная размерность и лакунарности суммировать ячейки сложности и формы неоднородность, соответственно. Более глубокое изложение как рассчитывается каждый параметр и интерпретации данных приводится в интерактивной ручной16 и такая деталь следует рассматривать в связи с вопросом конкретных исследований. Результаты описанных протокол в чувствительных инструментов для количественного определения небольшие изменения в 2D микроглии морфологии, которые могут произойти в условиях физиологического и патологического. Дополнительные морфометрический анализ прочности, выпуклости и форма фактор16,20 может быть возможным, если создание 3D-фигур.
Разработка протокола и адаптация непрерывной и ориентированные на пользователя. Он был продлен с флуоресцентным8 DAB/ярко поле изображения7 , но еще не парафин встроенных ткани. Это Кроме того, он может использоваться в сочетании с патентованного программного обеспечения, такие как Imaris для дополнительного анализа. Этот протокол может применяться к различным физиологии и не ограничивается микроглии, но может быть применен к любой клетки или ткани с конкретной модели или формы, которые могут быть идентифицированы с помощью методов IHC. Наконец с достаточным размером выборки, кластер или многовариантный анализ может быть применен к стратифицировать микроглии по морфологии12,21; Это значимой информации как морфология микроглии является жизненно важным показателем микроглии функций и ответы на их окружение. Признательность за микроглии морфологической разнообразия расширяющейся и важно полностью понимать нейрон глии сосудистой взаимодействий во время болезни и здоровья. Рост в этой области усиливается развитая, простой в использовании и воспроизводимые протоколы для количественной оценки и обобщения микроглии морфологии, используя несколько непрерывной переменных.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Это исследование получил финансовую поддержку от NINR (F32NR013611). Мы хотели бы также признать и поблагодарить разработчиков AnalyzeSkeleton(2D/3D) и FracLac (Арганда-Каррерас et al. и Karperien et al., соответственно) без которых анализ, описанные здесь, не представляется возможным.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| primary antibody anti-IBA1 | Wako | 019-19741 | rabbit host |
| Vectashield soft mount | Vector Labs | H-1000 | |
| Secondary antibody | Jackson ImmunorResearch | 711-545-152 | donkey host |
| 4 mL glass vial | Wheaton | UX-08923-11 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151 | |
| Sodium Azide (NaN3) | Sigma | S-8032 | |
| glass coverslip | Fisher Scientific | 12-544-G |
References
- Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nat Neurosci. 8 (6), 752-758 (2005).
- Karperien, A., Ahammer, H., Jelinek, H. F. Quantitating the subtleties of microglial morphology with fractal analysis. Front Cell Neurosci. 7 (3), eCollection (2013).
- Taylor, S. E., Morganti-Kossmann, C., Lifshitz, J., Ziebell, J. M. Rod microglia: a morphological definition. PLoS One. 9 (5), e97096 (2014).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
- Abiega, O., et al. Neuronal Hyperactivity Disturbs ATP Microgradients, Impairs Microglial Motility, and Reduces Phagocytic Receptor Expression Triggering Apoptosis/Microglial Phagocytosis Uncoupling. PLoS Biol. 14 (6), e1002466 (2016).
- Wyatt-Johnson, S. K., Herr, S. A., Brewster, A. L. Status Epilepticus Triggers Time-Dependent Alterations in Microglia Abundance and Morphological Phenotypes in the Hippocampus. Front Neurol. 8 (700), eCollection (2017).
- Morrison, H., Young, K., Qureshi, M., Rowe, R. K., Lifshitz, J. Quantitative microglia analyses reveal diverse morphologic responses in the rat cortex after diffuse brain injury. Sci Rep. 7 (1), 13211 (2017).
- Morrison, H. W., Filosa, J. A. A quantitative spatiotemporal analysis of microglia morphology during ischemic stroke and reperfusion. J Neuroinflammation. 10 (4), (2013).
- Gyoneva, S., Traynelis, S. F. Norepinephrine modulates the motility of resting and activated microglia via different adrenergic receptors. J Biol Chem. 288 (21), 15291-15302 (2013).
- Xu, H., et al. Environmental Enrichment Potently Prevents Microglia-Mediated Neuroinflammation by Human Amyloid beta-Protein Oligomers. J Neurosci. 36 (35), 9041-9056 (2016).
- Rodriguez, J. J., Noristani, H. N., Verkhratsky, A. Microglial response to Alzheimer's disease is differentially modulated by voluntary wheel running and enriched environments. Brain Struct Funct. 220 (2), 941-953 (2015).
- Soltys, Z., et al. Quantitative morphological study of microglial cells in the ischemic rat brain using principal component analysis. J Neurosci Methods. 146 (1), 50-60 (2005).
- Orlowski, D., Soltys, Z., Janeczko, K. Morphological development of microglia in the postnatal rat brain. A quantitative study. Int J Dev Neurosci. 21 (8), 445-450 (2003).
- Morrison, H. W., Filosa, J. A. Sex differences in astrocyte and microglia responses immediately following middle cerebral artery occlusion in adult mice. Neuroscience. 339, (2016).
- Arganda-Carreras, I., Fernandez-Gonzalez, R., Munoz-Barrutia, A., Ortiz-De-Solorzano, C. 3D reconstruction of histological sections: Application to mammary gland tissue. Microsc Res Tech. 73 (11), 1019-1029 (2010).
- Karperien, A. FracLac for ImageJ. , Available from: http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/fraclac/FLHelp/Introduction.htm (2013).
- Davis, B. M., Salinas-Navarro, M., Cordeiro, M. F., Moons, L., De Groef, L. Characterizing microglia activation: a spatial statistics approach to maximize information extraction. Sci Rep. 7 (1), 1576 (2017).
- Ferreira, T., Rasband, W. ImageJ User Guide. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/ (2014).
- Karperien, A. L., Jelinek, H. F., , Fractal, Multifractal, and Lacunarity Analysis of Microglia in Tissue Engineering. Front Bioeng Biotechnol. 3 (51), eCollection (2015).
- Martyanova, E. K., Tishkina, A. O. 3D quantitative analysis of microglial morphology. available as conference preceedings SkoltechOn. , (2015).
- Fernandez-Arjona, M. D. M., Grondona, J. M., Granados-Duran, P., Fernandez-Llebrez, P., Lopez-Avalos, M. D. Microglia Morphological Categorization in a Rat Model of Neuroinflammation by Hierarchical Cluster and Principal Components Analysis. Front Cell Neurosci. 11 (235), eCollection (2017).
