Summary
التدفق الخلوي في تركيبة مع المجموعات المرئية يوفر وسيلة سهلة الاستخدام وسريعة لدراسة الأغشية الحيوية المائية. يمكن استخدامه لتوصيف بيوفيلم، الكشف عن التغيرات في هيكل المجتمع بيوفيلم، والكشف عن الجسيمات اللاأحيائية جزءا لا يتجزأ من بيوفيلم.
Abstract
الأغشية الحيوية هي اتحادات الحيوي من الكائنات الدقيقة التي تلعب دوراً أساسيا في النظم الإيكولوجية للمياه العذبة. عن طريق تغيير بنية المجتمع بهم، الاستجابة بسرعة للتغيرات البيئية الأغشية الحيوية ويمكن استخدامها كمؤشرات لنوعية المياه وهكذا. في الوقت الراهن، يستند تقييم بيوفيلم معظمهم نهايات التكاملي والوظيفي، مثل نشاط التمثيل الضوئي أو الجهاز التنفسي، التي لا تقدم معلومات عن هيكل المجتمع بيوفيلم. التدفق الخلوي والتصور الحسابية يوفر طريقة بديلة وحساسة، وسهلة الاستخدام لتقييم تكوين المجتمع، لا سيما الجزء فوتواوتوتروفيك من المياه العذبة الأغشية الحيوية. فهو يتطلب إعداد العينة الأساسية فقط، بعدها يتم تشغيل نموذج كامل عن طريق سيتوميتير تدفق. يتم استخدام المعلومات البصرية ونيون خلية واحدة للتصور الحسابية والتفسير البيولوجي. مميزاتها الرئيسية عبر طرق أخرى هي سرعة التحليل وطبيعة عالية-معلومات-المحتوى. التدفق الخلوي ويقدم معلومات عن العديد من الصفات الخلوية وبيوفيلم في قياس واحد: حجم الجسيمات، والكثافة، محتوى الصباغ، محتوى اللاأحيائية في بيوفيلم، والمعلومات التصنيفية الخشنة. بيد أنه لا يقدم معلومات عن تكوين بيوفيلم على مستوى الأنواع. ونحن نرى إمكانية كبيرة في استخدام طريقة للرصد البيئي للنظم الإيكولوجية المائية كتقييم أولى بيوفيلم مفصلة الخطوة التي يبلغ مجرى النهر التحقيقات بأساليب متكاملة وأكثر تفصيلاً.
Introduction
الأغشية الحيوية هي اتحادات الحيوي من الكائنات الدقيقة التي تلعب دوراً أساسيا في النظم الإيكولوجية للمياه العذبة، بدءاً من الإنتاج الأولى، والمغذيات، وتنقية المياه إلى التأثير على توزيع الكائنات الحية الدقيقة وتنوعها البيولوجي في النظام الإيكولوجي 1-عندما يتعرض الأغشية الحيوية للظروف البيئية المتغيرة أو لعوامل الإجهاد، مثل المواد الكيميائية، على بنية المجتمع بسرعة التحولات نحو أكثر تسامحا الأنواع2،3. يتحول حساسية عالية الأغشية الحيوية إلى نموذج جذاب نظم ل الرصد البيئي4، إلا أن أيا من الأساليب الحالية تعتبر مناسبة تماما لتتبع دينامية مجتمع بيوفيلم فعلا بطريقة سريعة وسهلة.
مجموعة شائعة من أساليب لتوصيف الأغشية الحيوية يتكون القياس من نقاط النهاية الوظيفية والهيكلية. على مستوى المجتمع بأكمله، نشاط التمثيل الضوئي والجهاز التنفسي، فضلا عن نشاط إنزيمات خارج الخلية ويقدم معلومات عن الدولة الوظيفية بيوفيلم5،،من67،8 ،9. الاستحقاق الكتلة الحيوية كمؤشر للنمو بيوفيلم العام. يتم قياس التغيرات الهيكلية حاليا أما باستخدام تعريف الأنواع التقليدية الخفيفة الميكروسكوب أو مع التقنيات المستندة إلى النوكليوتيدات (مثلاً، يشوه جل التدرج التفريد (دج)، فاصل إينتيرجينيك ريبوسومال الآلي تحليل (اريسا)، metagenomics)10،،من1112. هذه الأساليب توفير المعلومات ولكن تستغرق وقتاً طويلاً لإجراء، أو يتطلب معرفة محددة، أو لا تزال قيد التطوير. وأخيراً، أساليب جديدة للتقييم لل13،المواد البوليمرية خارج الخلية (EPS)14 وبيوفيلم العمارة1، بينما يراعي، الإنتاجية منخفضة ولم توضع حتى الآن نحو أغراض الرصد.
فمن الواضح أن لتوصيف كامل للأغشية الحيوية المياه العذبة، من الضروري الجمع بين عدة طرق مختلفة، التي توفر نظرة ثاقبة وظيفة بيوفيلم وتكوينها والهندسة المعمارية. للرصد البيئي، من ناحية أخرى، طريقة سريعة والحساسة التي قادرة على الكشف عن التغييرات في بيوفيلم وتمكين تفسير البيولوجية الأساسية من التحولات على المستوى الوظيفي والهيكلي المطلوب.
لقد قمنا بتطوير أسلوب جديد لتوصيف المجتمع الميكروبي لعنصر فوتوتروفيك تيار الأغشية الحيوية (periphyton)، وهي سريعة بما يكفي لأغراض الرصد، وفي نفس الوقت يقدم معلومات كافية عن المجتمع بيوفيلم هيكل للسماح للتفسير البيولوجي15. أنه استناداً إلى خلية واحدة التدفق الخلوي (FC) من عينات بيوفيلم ويقترن التصور الحسابية ويوفر معلومات عن الخصائص البصرية ونيون بيوفيلم على مستوى الخلية الواحدة.
يتكون سير العمل بعد أخذ العينات بيوفيلم لإعداد نموذج في شكل sonication والتثبيت وعلى أساس حجم تصفية عينات متبوعاً بتقييم العينة بالتدفق الخلوي. البيانات المكتسبة بتقديم معلومات عن العديد من الصفات الخلوية في قياس واحد: حجم الجسيمات، والكثافة، محتوى الصباغ، اللاأحيائية المحتوى (مثل ميكروبلاستيكس) في بيوفيلم. هذه المجموعة من البيانات من تحليلها عن طريق التصور الحسابية الجار العشوائية المرئية التضمين (فيسني)16، الذي يتيح لتفسير البيانات بسرعة وسهولة باستخدام. على الرغم من أن بضعة أسابيع هي المطلوبة لإعداد وتحسين الأسلوب، مرة بإعداد، فإنه يأخذ فقط بضع ساعات من جمع عينات بيوفيلم لتفسير النتائج.
المزايا الرئيسية لأسلوب عرضها على الآخرين هي سرعة التحليل وعالية-معلومات-المحتوى. وعلاوة على ذلك، يمكن تخزين العينات لعدة أسابيع بعد جمع دون فقدان بهم الضوئية وخصائص الأسفار. يمكن أن يكون هذا مفيداً عندما وصف عدد كبير من العينات المطلوبة، مثل دراسات عينات كبيرة أو برامج الرصد البيولوجي، ولكن يمكن أيضا أن توفر كمية كبيرة من المعلومات في أصغر من الدراسات الاستكشافية.
البروتوكول قدم يستند إلى تحليل تدفق سيتوميتريك فوتوتروفيك الأغشية الحيوية (periphyton) التي تم جمعها من مواقع مختلفة من دفق. العديد من الخطوات للبروتوكول، مثل اختيار مواقع مناسبة لأغراض، الرصد تعتمد على أهداف البحث و ولذلك لا يمكن وصفه. الآخرين السماح أقل حرية، وتتطلب أن البروتوكول هو تابع عن كثب، وهذا هو توضيحها في البروتوكول بالتفصيل أدناه.
البروتوكول يبدأ باختيار مواقع للرصد البيئي على أساس بيوفيلم. والخطوة التالية لإنشاء التدفق--سيتوميتير (FC) حيث أن تمكين قياساته التمييز بين الكائنات فوتوتروفيك مختلفة تعيش في الأغشية الحيوية في رصد البيئة. هذا يتم عن طريق جمع عينات بيوفيلم من المواقع، وتحديد خصائص الأنواع المختلفة الموجودة في بيوفيلم وإعداد التدفق--سيتوميتير مع أشعة الليزر وعوامل التصفية التي تمكن من قياس في المناسبة الضوئية الفلورية الأطوال الموجية. وبمجرد لجنة التيسير وقد تم إنشاء، الأغشية الحيوية يمكن جمعها من المواقع دورياً، خصائص الجسيمات مفردة موجودة في بيوفيلم تقاس بالتدفق الخلوي، وبيانات تحليلها من قبل المجموعات المرئية البصرية ونيون. أفضل تفسير للنتائج، فمن الممكن بناء قاعدة مرجعية FC الأنواع الحية بيوفيلم المحلية وتعمل بها، واستخدام قاعدة البيانات للتعرف على التصنيفات المختلفة في البيانات FC. من الممكن التحقق من الصحة من خلال الأسفار-على أساس فرز المجموعات المحددة للخلايا المفردة باستخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية وتحديد التقسيمي القائم على الفحص المجهري للأنواع الحالية. ويرد في الشكل 1تخطيطي للبروتوكول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-النظام الإيكولوجي الاختيار وأخذ العينات بيوفيلم
- حدد النظام إيكولوجي المائي من الاهتمام والبحث عن مواقع أخذ العينات التي تنمو فيها الأغشية الحيوية. الأجزاء الضحلة من تيار مع بطء تدفق المياه المتوسطة وجف حجرية لمرفق بيوفيلم المناسبة17،18.
- اختياري: إذا لم يكن لديه الموقع الأسطح ما يكفي لمرفق بيوفيلم، أو لتقليل تقلب الأغشية الحيوية ضمن موقع ما، وضع ركائز اصطناعية لمرفق بيوفيلم (مثل الشرائح الزجاجية والسيراميك) في الموقع، مع التأكد من أن يتم وضعها في نفس الاتجاه فيما يتعلق بتدفق المياه وفي عمق مماثلة وكثافة الضوء19.
- لتحديد الشروط البيئية في موقع أخذ العينات باستخدام الأدوات المحمولة لقياس شدة الضوء، درجة حرارة المياه الموصلية والأكسجين ودرجة الحموضة حق أعلاه بيوفيلم السطحية أخذ عينات من. على مدى العينات، اتخاذ التدابير المتكررة (3-5) لحساب متوسط القيم.
- اختياري: أخذ عينات المياه من أجل تحديد الصلة معلمات كيمياء المياه (حل الكربون العضوي (DOC)، ك+, نا+, Ca2 +, Mg2 +, Cl–، و، هكذا42، ص. ب42- ، لا32-،4SiO4-).
- استخدام قفازات واقية، جمع الحجارة قابلة للمقارنة (في الحجم والشكل والنوع) من كل موقع (أو ركائز اصطناعية). ينبغي أن تتعرض الحجارة لتدفق مماثل وظروف الإضاءة18.
- تصفية ما يكفي من المياه دفق من الموقع عن طريق 0.22 ميكرومتر المرشحات، حيث أنها مستعدة لجميع العينات التي تم جمعها (مثلاً 15 مل كل عينة).
- استخدام فرشاة ناعمة لإزالة بيوفيلم من الركازة إلى قارورة (الفرشاة حتى تتم إزالة جميع بيوفيلم) مع 15 مل من المياه التي تمت تصفيتها تيار20.
- إصلاح العينات في 0.01 ٪ بارافورمالدهيد و 0.1 ٪ glutaraldehyde21.
2-تحديد معلمات التدفق الأمثل-سيتوميتريك (FC)
- نقل عنها مجهر خفيفة (استخدام 40 ×/0.75 الهدف؛ وإذا لزم الأمر استخدام هدفا نفط 100 × 1.3) والتعرف على الأنواع الموجودة في العينات22،23.
- أمر تحديد نوع واحد من مجموعات الثقافة المناسبة (مثل حبليات واجنة تجريبية والثقافة مجموعة من الطحالب في جامعة غوتنجن [ابساج] أو ثقافة مجموعة من الطحالب في جامعة كولونيا [ككاك] إذا الرصد يتم في النظم الإيكولوجية الأوروبية المركزية).
- تنمو الأنواع واحد باستمرار في ظروف بيئية مشابهة (مثل الضوء ودرجة الحرارة ودرجة الحموضة) للبيئة أخذت عينات بيوفيلم من. البقاء داخل 1 درجة مئوية و 0.5 نقطة درجة الحموضة من العينات البيئية ويوصي.
- لفصل/تفريق الخلايا، وضع 15 مل عينات الأنواع وحيدة في أنابيب الطرد المركزي ووضع الأنابيب في وسط حمام مائي وتغرق، حيث يكون سطح السائل العينة في نفس مستوى سطح الحمام. Sonicate العينات لمدة 1 دقيقة في 45 كيلو هرتز24،25.
- تسجيل أطياف امتصاص والأسفار من الأنواع واحد باستخدام قارئ لوحة. الرجاء الرجوع إلى لوحة للقارئ الاختيار للحصول على إرشادات. في هذا المثال، تم تحميل لوحات شفافة بوليستيرول أسفل شقة 96-جيدا مع حجم العينة ميليلتر 200 وتم قياس امتصاص. (الإعدادات المستخدمة: وضع المسح الضوئي (أ) الأسفار؛ والانبعاثات خطوة الطول الموجي حجم 10 نانومتر، والانبعاثات مسح رقم 30، عرض النطاق الترددي 20 نانومتر، والحصول على 100، 25 ومضات، 20 الولايات المتحدة وضع المسح الضوئي الوقت أو (ب) امتصاص التكامل؛ 25 ومضات، عرض النطاق الترددي 9 نانومتر).
- إعداد cytometer التدفق مع أشعة الليزر وشق مزدوج اللون وعوامل التصفية التي تغطي جميع تلك النطاقات الفلورسنت فيها الأنواع المختلفة لها خصائص محددة في تركيبة. لتيارات الأوروبية المركزية، و 405 نانومتر، 488 نانومتر و 638 نانومتر الليزر تحقيق نتائج مفيدة.
- ضبط وضع الجهد فوتومولتيبليرس (لا ينطبق على كل تدفق سيتوميتيرس) والمجموعة من فلوريسسينسيس قياس ليشمل 99 في المائة على الأقل من جميع الأحداث من العينات.
- بدلاً من ذلك، إذا كانت المعرفة بشأن الأنواع الموجودة في الأغشية الحيوية تتوفر، ابدأ بالخطوة 2، 2. إذا كانت خصائص الفلورسنت معروفة، تبدأ بخطوة 2.6.
3-اختياري: إعداد قاعدة مرجعية التدفق--سيتوميتريك
ملاحظة: لا تسمح FC التصنيفية تحديد خلايا موجودة في بيوفيلم. قاعدة بيانات مرجعية القياسات FC لواحد من الأنواع المعروفة ليكون حاضرا في الأغشية الحيوية، نمت في ظروف مشابهة كالأغشية الحيوية، يمكن أن تساعد في تفسير البيانات.
-
المرجع: نوع واحد
- استخدام معلمات FC الأمثل أنشئت في 2، 5-7، وقياس الخصائص البصرية ونيون من نوع واحد (الثابتة في بارافورمالدهيد و glutaraldehyde وتصفيتها من خلال مرشحات ذات الحجم المناسب ل cytometer تدفق).
- تطبيع البيانات من نوع واحد بنفس الطريقة كالبيانات من الأغشية الحيوية (راجع الخطوة 6.1.2).
-
المرجعية: الخلايا التالفة والمتآكلة
واحدة من أهم مؤشرات الصحة بيوفيلم هو جزء صغير الخلايا التالفة/الموت في بيوفيلم. لتحديد حجم هذه الخلايا، يمكن إعداد مرجع الخلايا المتحللة.- تأخذ عنها 1 مل من الأغشية الحيوية مخففة والطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة في س 8,000 ز لمدة 10 دقائق في أجهزة الطرد مركزي منضدية. تعليق بيليه الناتجة في الإيثانول 90% 1 مل وتخزين تعليق بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. كرر في اليوم التالي.
- باستخدام إعدادات FC الأمثل، قياس الخصائص البصرية ونيون الخلايا التالفة والمتآكلة (الثابتة وتصفيته).
-
المرجع: ميكروبلاستيكس
ملاحظة: إذا كانت مهتمة برصد جسيمات ميكروبلاستيك في الأغشية الحيوية، تحقق ما إذا كانت تختلف ما يكفي من الجزيئات الحيوية في بصري وخصائص الأسفار لتحديد الهوية.- تعليق الجسيمات ميكروبلاستيك وفقا لتعليمات المنتج ميكروبلاستيكس وقياس خصائصها الضوئية ونيون (باستخدام معلمات FC من 2.7).
- إضافة جسيمات ميكروبلاستيك للعينة بيوفيلم وتترك طوال الليل في 4 درجات مئوية.
- تصفية بتعليق والتدبير مع نفس المعلمات FC وصفه أعلاه.
4-عينة من التحضير والتخزين
- متى تم تشكيل لجنة التيسير وقاعدة البيانات المرجعية FC مستعدة، واحد يمكن المضي قدما في تقييم عينات بيوفيلم الطازجة، التي جمعت وفقا للخطوات 1، 1-7. لفصل/تفريق بيوفيلم، نقل 15 مل العينات من قوارير (راجع الخطوة 1، 7) في أنابيب أجهزة الطرد المركزي.
- وضع كل أنبوبة في وسط حمام مائي وتغرق حيث يكون سطح السائل العينة في نفس مستوى سطح الحمام. Sonicate العينات لمدة 1 دقيقة في 45 كيلو هرتز.
- إصلاح العينات في 0.01 ٪ glutaraldehyde بارافورمالدهيد و 0.1% (الأسهم في المياه نانوبوري). تخزين في 4 درجات مئوية حتى جاهزة للتحليل.
- هام: استخدام نصف عينات لتحليل التدفق الخلوي والاحتفاظ بنصف في مخزن للسلامة والتحقق من صحة اختياري مع الفرز fluorescence تنشيط الخلية و/أو الخفيفة الميكروسكوب (انظر القسم 6).
ملاحظة: مخزنة في الثلاجة، عينات بيوفيلم الثابتة ينبغي الحفاظ على خصائصها الضوئية ونيون لمدة تصل إلى ثلاثة أسابيع.
5-تشغيل العينة من خلال لجنة التيسير
- إذا تم تخزين العينات في الثلاجة، sonicate منها بسرعة أو "الماصة؛" عدة مرات لفصل الجسيمات. تصفية عنها مع 50 ميكرومتر المرشحات (حجم تصفية يعتمد على عرض شعري FC) قبل القياس.
- تحميل العينات الفردية (1 – 2 مل، وهذا يعتمد على cytometer تدفق المستخدمة) في سيتوميتير تدفق وقياس الخصائص البصرية ونيون كل الجسيمات. كرر قياس ثلاث مرات في كل تكرار البيولوجية (replicates التقنية الثلاثة).
- تصدير البيانات من لجنة التيسير بتنسيق csv.
6-بيانات إعداد وتحليل الارتباط
ويمكن تحليل نادي العديد من المعلمات (مثلاً، منطقة إشارة، الطول، العرض) لكل خاصية الضوئية المقاسة ومجموعة الأسفار. تشغيل تحليل ارتباط على المتغيرات المقاسة وإلا تبقى تلك القياسات التي لا ارتباطاً وثيقا. وهذا يزيل عادة لكن كل معلمة FC واحدة (مثلاً، منطقة إشارة) ويمكن أيضا إزالة ارتباطاً وثيقا القياسات الفلورسنت (عادة نابعة من نفس الليزر والمجاورة مرشحات).
-
تشغيل سيت كأدوات في Matlab:
- استيراد بيانات FC مخفضة بتنسيق csv من جميع العينات التي يتم تحليلها في سيت البرنامج16، بما في ذلك جميع التقنية والبيولوجية وإنشاء نسخ متماثلة. (انقر فوق + ملف تصفية *.csv، قم بتحديد ملفات الاستيراد).
- تحويل القنوات الفلورسنت جميع العينات استخدام التحويل الجيب الزائدي. قيمة مساعد يحتاج إلى أن تكون محددة؛ قد يكون من الضروري للأجهزة التجريبية خاصة والأغشية الحيوية متغايرة يعمل 150 للأغشية الأكثر فوتوتروفيك الحيوية وتدفق سيتوميتيرس، ولكن الأمثل. (الحق-النقر/التحويل/إدخال مساعد 150)
- لمراقبة الجودة، وبصريا مقارنة (في سيت) رسوم بيانية لعينات الأفراد والقنوات البصرية ونيون الفردية للتأكد من أن هناك لا القيم المتطرفة على الصعيد التقني والبيولوجي للنسخ المتماثل. سوف تظهر القيم المتطرفة في توزيعات فلوري/بصري تحول إلى حد كبير بين replicates. (قم بتحديد البيانات، حدد قناة، الأرض)
- البديل: تشغيل تحليل عنصر الرئيسي (PCA) على القيم الوسطية لتوزيعات الفلورسنت، وتأكد من أن المجموعة replicates التقنية والبيولوجية معا.
- دمج التقنية وإنشاء نسخ متماثلة في كل تكرار البيولوجية، وعينه فرعية يتطابق البيولوجية، حيث أن كل واحد يمثل نفس العدد من الجسيمات (الخلايا ويفتت الخلايا والجزيئات اللاأحيائية) وحيث أن العدد الكلي للجزيئات تحليلها من قبل الجار العشوائية بارنز-هت التضمين (البوسنة والهرسك-SNE) هو حوالي 150,000 (لأفضل نتائج التصور26). (حدد دمج البيانات، انقر بزر الماوس،/فرعية)
- للمقارنة بين العينات، من المهم تحديد فقط تلك العينات التي يمكن مقارنتها. تحديد العينات وتشغيل SNE البوسنة والهرسك27. بمجرد الخوارزمية الانتهاء، جديد القنوات، تظهر المسماة البوسنة والهرسك-SNE1 والبوسنة والهرسك-SNE2. وهذه هي إحداثيات SNE الجسيمات تحليل كافة، التي يمكن استخدامها لتمثيل البيانات في مخطط مبعثر (خريطة فيسني). (قم بتحديد البيانات، حدد القنوات، انقر بالزر الأيمن، البوسنة والهرسك-SNE، نعم البيانات الموحدة)
- في خريطة فيسني، المتمركزة وفقا للتشابه بين الجسيمات وتجميعها في مجموعات يمكن فصله بشكل مرئي. فحص خصائص بصرية/فلوري الكتل وعلامة واسم تلك التي تفصل جيدا ولها خصائص بصرية/الأسفار المختلفة باستخدام أدوات الرسم المتوفرة في سيت. (حدد قناة البوسنة والهرسك-SNE1، البوسنة والهرسك-SNE2)
- اختياري: إذا توفر قاعدة بيانات مرجعية وحيدة الأنواع الميكروبية (تقاس بنفس الإعداد التدفق الخلوي ونمت تحت ظروف مماثلة)!، تصدير خرائط فيسني في Matlab ومشروع قاعدة البيانات المرجعية على الخرائط. وبهذه الطريقة، يمكن توصيل مجموعات خاصة لمجموعات خاصة الأنواع/التصنيفية (مخطوطات متاحة للتحميل في https://github.com/anzezupanic/FC_analysis). (دورة/حفظ)
- استكشاف الأخطاء وإصلاحها: إذا كان التحليل SNE البوسنة والهرسك لا يقوم بإرجاع مجموعات يمكن فصله بشكل مرئي، ولكن واحد كبير، عدد كبير جداً من الجزيئات واستخدمت في البوسنة والهرسك-SNE. حاول مرة أخرى مع جزيئات أقل كل عينة. إذا كان هناك لا مجموعات، ولكن النقاط الفردية المتفرقة بدلاً من ذلك، زيادة عدد الجسيمات المستخدمة.
- اختياري: بدلاً من الاعتماد على البوسنة والهرسك-SNE لتجميع، أساليب تجميع أخرى (مثلاً، الهرمية، المستندة إلى centroid أو الكثافة على أساس تجميع) يمكن استخدامها في البيانات الموحدة وثم فرضه على خريطة فيسني (https://github.com/ أنزيزوبانيك/FC_analysis).
- وحالما يتم تحديد المجموعات، إحصاء عدد الجسيمات في كل مجموعة تنتمي إلى كل تكرار البيولوجية في كل عينة. تقييم الفروق بين العينات، باستخدام اختبار ANOVA وفي توكي مع الملائمة (مثلاً، هولمز) تصحيح للمقارنة متعددة.
7-اختياري: التحقق من صحة التفسير الكتلة باستخدام الفرز Fluorescence تنشيط الخلية
- حالما يتم تحديد المجموعات، استخدام خلية تنشيط fluorescence الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية) لفرزها من العينات إذا رغبت في ذلك، شريطة أن نظام مراقبة الأصول الميدانية تكوين مماثلة (أو مماثلة) أشعة الليزر ومرشحات الفلورسنت.
- لكل نظام المجموعة التي تم تحديدها، يوفر سيت غيتس الفلورسنت والبصرية التي تقوم بتعريف الكتلة. استخدام هذه البوابات لفرز الجزيئات في كل مجموعة بنظام مراقبة الأصول الميدانية وثم تحديد الخلايا تم فرزها باستخدام الفحص المجهري الخفيفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
استخدام الإجراء المعروضة هنا (الشكل 1)، تم تحليل العينات المأخوذة من عدة مواقع لتيار المحلية في سويسرا. في كل موقع، واتخذت ثلاثة أحجار الحجم مماثلة (10-12 سم)، والأغشية الحيوية كانت تجاهلت الحجارة. العينات كانت ثم سونيكاتيد والثابتة، وتصفيتها وتحليلها في وقت لاحق بواسطة التدفق الخلوي. الإعداد cytometer تدفق وقاعدة البيانات المرجعية المستخدمة هي نفس كما هو موضح في ورقة سابقة15: استخدمت أشعة الليزر ثلاثة (405، 488 و 638 nm)، شق مزدوج اللون سبعة وعشرة عوامل التصفية التي تغطي انبعاثات الأسفار من 425 إلى > 755 nm ، بما في ذلك قاعدة بيانات مرجع > 30 الأنواع تشمل البكتيريا والطحالب الخضراء، الدياتومات والطحالب الحمراء التي تم العثور عليها في الأغشية الحيوية في تيار السويسرية. وكان العدد الكلي للجزيئات المستخدمة لإنشاء خرائط فيسني 150,000 تقريبا (الشكل 2A). استخدام النهج المبين، فمن الممكن التمييز بين مواقع مختلفة (الشكل 2)، تصنيف أجزاء مختلفة من الخريطة فيسني في يتدنى الخلايا التي تحتوي على المعلومات التصنيفية الخشنة (الشكل 3) ووضع فيها وكانت الفئات السكانية الفرعية المختلفة بين العينات (الشكل 4).
واستخدمت لقياس الجسيمات ميكروبلاستيك في بيوفيلم نهجاً مماثلاً. عينات نقية من جسيمات ميكروبلاستيك لحجم مماثل للخلايا في المياه العذبة الأغشية الحيوية (ca. 10 ميكرومتر)، عينات الأغشية الحيوية التي نمت في المختبر في وجود أو عدم وجود جزيئات ميكروبلاستيك (باستخدام بروتوكولات النمو بيوفيلم الموصوفة في التليلي et al. 20115) تم قياس ومقارنة (الشكل 5). وتبين أن جزيئات ميكروبلاستيك مع الخصائص البصرية والفلورسنت المعروفة يمكن كشفها بقوة في تركيزات أعلاه 1,000 جزء في المليون.
رقم 1: مخطط بروتوكول تجريبي. ويعقب جمع العينات البيئية الأغشية الحيوية تحديد الأنواع الحالية في بيوفيلم، وتحديد خواصها الضوئية والفلورسنت واحتواء التدفق--سيتوميتير مع أشعة الليزر المناسبة ومرشحات لقياس هذه خصائص. لقياسات التدفق--سيتوميتريك، هي سونيكاتيد العينات، وإصلاح وتخزينها. عندما تم تجميع عينات كافية أنها تقاس بالتدفق الخلوي حيث لكل خلية المقاسة، عددا من بصري وخصائص الأسفار يتم الحصول عليها وتحليلها باستخدام المجموعات المرئية. بشكل اختياري (الأسهم المنقطة)، فمن الممكن لبناء قاعدة بيانات FC من الأنواع الموجودة في الأغشية الحيوية رصدها واستخدامها قاعدة لتفسير النتائج. من الممكن أيضا استخدام مزيد من أساليب التحقق من الصحة، مثل الخلية المستندة إلى الأسفار الفرز والتحليل التقسيمي باستخدام الفحص المجهري الخفيفة الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: مقارنة الأغشية الحيوية البيئية باستخدام خرائط فيسني. (أ) فيسني الخرائط التي تم الحصول عليها من عدد كبير من الخلايا (300,000) كتلة كبيرة واحدة (أعلى)، وعدد قليل جداً من الخلايا (10,000) لا تشكل مجموعات في جميع (السفلي)، بينما عدد أمثل للخلية (ca. 150,000) نموذج يمكن فصله بوضوح بصريا مجموعات (وسط). (ب) مجموعات فرعية الخريطة فيسني التي تنتمي إلى ست عينات مختلفة تتميز بكثافات مختلفة في أجزاء مختلفة من الخريطة فيسني. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: تجميع الفئات السكانية الفرعية للجسيمات في الأغشية الحيوية. (أ) أجزاء مختلفة من الخريطة فيسني التي يسكنها الجسيمات مع مختلف الضوئية وخصائص الأسفار التي تعطي أدلة لأصل الجزيئات الحيوية/الأحيائية واللااحيائيه وإلى الذي التصنيفية مجموعة الجزيئات الحيوية (الخلايا) تنتمي إلى (أطوال موجية من أعلى إلى أسفل: 525 نانومتر، 695 نانومتر، 660 nm). لكل طول موجي، هو تطبيع مقياس اللون من الأسفار يقاس أعلى (أحمر) لقياس أدنى (أزرق). (ب) الإسقاط لقاعدة بيانات مرجعية (نقاط حمراء) على خريطة فيسني يمكن أن تساعد في تفسير أجزاء من الخريطة هي يسكنها فيها الأصناف و/أو جسيمات اللاأحيائية: المتحللة الخلايا (أعلى)، الدياتومات (وسط)، البكتيريا الزرقاء (أسفل). (ج) استناداً إلى المعلومات في (أ) و (ب) ومجموعات منفصلة بصريا خريطة فيسني، من الممكن تعيين أجزاء مختلفة من الخريطة فيسني إلى مجموعات مختلفة (SP1-11) وتصنيف المجموعات تبعاً لذلك. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: التحليل الإحصائي من العينات بيوفيلم. (أ) الكمي هو يؤديها عد عدد الجسيمات ليتدنى كل المنتمين إلى replicates البيولوجية المختلفة. ألف – واو تمثل ستة مواقع مختلفة على طول دفق محلية، وأخذت منها عينات بيوفيلم. (ب) يمكن استخدام ANOVA لتقييم الفرق الإحصائي بين العينات، مع مناسبة متعددة مقارنة التصحيح (ف < 0.05، اقتران HSD توكي جميع المواقع مقابل الموقع A). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 5: تتبع الجسيمات ميكروبلاستيك مع فيسني. (أ) ميكروبلاستيك الجسيمات، الأغشية الحيوية المياه العذبة (ب) ، (ج) المياه العذبة بيوفيلم مختلطة مع جزيئات ميكروبلاستيك، (د) الأسفار من الجسيمات تقاس FC في 695 شمال البحر الأبيض المتوسط. مقياس اللون هو تطبيع من الأسفار يقاس أعلى (أحمر) إلى أدنى قياس الفلورية (أزرق) في 695 شمال البحر الأبيض المتوسط. النسبة بين الجسيمات ميكروبلاستيك وجسيمات بيوفيلم هو حوالي 1:1. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
بسيطة نسبيا لتنفيذ البروتوكول، المذكورة أعلاه. ومع ذلك، بينما أظهرت الإعدادات الافتراضية المعروضة تكون مناسبة لجميع فوتوتروفيك بيوفيلم اختبارها حتى الآن، الأمثل (كما هو موضح في البروتوكول) اللازمة لتحقيق أقصى قدر من المعلومات المستقاة من الأسلوب. وفي الواقع، يمكن أن تختلف الخصائص البصرية ونيون للأغشية الحيوية، تبعاً للظروف البيئية (الموسم ودرجة الحرارة والتركيب الكيميائي للمياه)1. ولذلك، من المهم أن تأخذ في الاعتبار هذا التغير عند إعداد التحليلات FC. طريقة واحدة للقيام بهذا أخذ عينات تمثيلية للأغشية الحيوية من مواقع أخذ العينات و/أو أخذ نوع واحد وتزايد عليها في ظروف مختلفة والتدبير لهم باستخدام الأجهزة المختلفة. زراعة الأنواع واحد مفيد أيضا لبناء قاعدة الفلورسنت الخصائص التي يمكن استخدامها لتفسير النتائج FC. ومع ذلك، للقيام بذلك، المهم أن الأنواع الوحيدة التي قيست في ظروف مماثلة لتلك التي تسير الأغشية الحيوية أخذ عينات. على سبيل المثال، قاعدة بيانات لقياسات FC واحد الأنواع التي تنمو عند 25 درجة مئوية كفيل بالقليل جداً عن تكوين بيوفيلم تزايد في 15 درجة مئوية. مع ذلك، ليس من الضروري على الإطلاق لإنشاء قاعدة بيانات مرجعية استخدام هذا الأسلوب بشكل فعال. الفعل مع استخدام بروتوكول FC الأساسية، من الممكن للحصول على معلومات عن حجم ومستوى ووجود صبغات مختلفة في خلايا موجودة في بيوفيلم. تجميع البصرية يسمح تصنيف الخلايا إلى مجموعات متشابهة في الخصائص المقاسة والتصميم التي تغيرت الخاصية الأكثر بين العينات. قاعدة البيانات المرجعية، ومع ذلك، يصبح هامة عند تعيين هويات تصنيفية لمختلف المجموعات. عندما تم الكشف عن التغييرات في خصائص بيوفيلم، فمن الممكن لربط لهم بالقياسات الفيزيائية والكيميائية للمياه في مواقع أخذ العينات. يسمح هذا تحديد العوامل البيئية التي قد أقوى تأثير على المجتمع بيوفيلم في النظام الإيكولوجي للمراقبة.
وهناك أيضا بعض القيود للأسلوب. على سبيل المثال، نادي لا تسمح بتحديد تكوين بيوفيلم على مستوى الأنواع. وعلاوة على ذلك، عندما يتم الكشف عن التغييرات في خصائص بيوفيلم، لا يمكن أن تنسب FC الأسباب المسؤولة: تحول نحو الأنواع أكثر تسامحا أو نحو تعمل أكثر تسامحا (الأنواع المتبقية نفسها). أساليب تكميلية أخرى، مثل ميتاجينوميكس، هناك حاجة لمعالجة هذه المسألة. قيد آخر من الأسلوب أن عنصر فوتوتروفيك فقط في الأغشية الحيوية، غنية بأصباغ مع مختلف خصائص الفلورسنت، ويتم تحليل. في حين أنه من الممكن بالتأكيد لاستخدام الأسلوب لتوصيف بيوفيلم متغايرة، هو ليس من الواضح ما إذا كان يمكن الحصول على ما يكفي من المعلومات مع تحليل خالية من وصمة عار. سبب fluorescence الطبيعية منخفضة من البكتيريا والفطريات، لديها إعدادات مختلفة لاستخدامها، ومن ولذلك فإنه لا يمكن تقييم مكونات بيوفيلم معا في نادي واحد تشغيل فوتوتروفيك ومتغايرة. بدلاً من ذلك، سيكون من الضروري فصل العينة وتقييم جزء واحد مع فوتوتروفيك وجزء واحد مع إعداد متغايرة. وأخيراً، هناك قيد مع استخدام فيسني للتصور بيوفيلم. وتتحقق أفضل النتائج مع ca. الخلايا 150,000 تصويرها معا. وهذا يضع حدا لعدد العينات التي يمكن تحليل ومقارنة مع الأسلوب دون تمييع حسابياً العينات كثيرا. على سبيل المثال، إذا كان أحد المطلوبين لمقارنة العينات 150، ثم كل عينة فقط سيمثل ca. 1,000 الخلايا. طريقة واحدة للتغلب على هذا القيد لتحليل العينات باستخدام نهج "تحريك النافذة" التي تداخل المجموعات عينات يمكن تحليلها بشكل منفصل باستخدام فيسني ومن ثم النتائج المجمعة معا، مثل هذا حل، ومع ذلك، لم ينفذ حتى الآن.
ونحن نعتقد أن تدفق-الخلوي على أساس تقييم الأغشية الحيوية يمكن أن تطبق على كفاءة لرصد النظم الإيكولوجية المائية. يمكن استخدامه لمقارنة العينات السلسلة الزمنية أو العينات المأخوذة في مواقع مختلفة، واستثناء العينات نفسها، لديها إمكانات لأتمتة كاملة. يمكن اعتبار الطريقة تفصيلية خطوة تقييم بيوفيلم أولية التي توفر المعلومات المصب التحقيقات مع أساليب متكاملة وأكثر تفصيلاً. وأخيراً، فإنه يمكن تمديدها إلى تطبيقات أكثر تحديداً، مثل الكشف عن التلوث غير الحيوية للأغشية الحيوية، كما أظهرنا في حالة ميكروبلاستيك.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
أيد العمل قدمت زمالة أمبيزيوني الجبهة الوطنية الصومالية (PZ00P2_142533) ومنحة بحثية فيلا (أمبليبيج). نود أن نشكر بتينا فاغنر للحصول على تعليمات العمل التجريبي.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Multimeter | WTW | MultiLine 3620 IDS | For measuring temperature, pH, dissolved oxygen |
| Ultrasonic cleaner | VWR International | 97043-986 | Tank dimesions: 15*14*10 cm |
| Flow cytometer | Beckman Coulter | Gallios | Lasers: 405, 488 and 638 nm. Filters bands in Supplementary Table 11. Sgier et, Nat Comm, 2016. |
| Plate reader | Tecan | Infinite M200 | used for selecting appropriate setting of the FC |
| Cell sorter | Beckman Coulter | MoFlo Astrios | Settings in Supplementary Table 12. Sgier et, Nat Comm, 2016. |
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axiovert 135 | Zeiss EC Plan-Neofluar 40x/0.75 objective |
| SOFTWARE | |||
| Matlab | MathWorks | R2013a | software for numerical computing |
| CYT | Dana Pe'er Lab | Version 1.1 | free interactive visualization tool for analysis of cytometry data |
References
- Battin, T. J., Besemer, K., Bengtsson, M. M., Romani, A. M., Packmann, A. I. The ecology and biogeochemistry of stream biofilms. Nat Rev Microbiol. 14 (4), 251-263 (2016).
- Rotter, S., Heilmeier, H., Altenburger, R., Schmitt-Jansen, M. Multiple stressors in periphyton - comparison of observed and predicted tolerance responses to high ionic loads and herbicide exposure. J Appl Ecol. 50 (6), 1459-1468 (2013).
- Tlili, A., et al. Pollution-induced community tolerance (PICT): towards an ecologically relevant risk assessment of chemicals in aquatic systems. Freshw Biol. 61 (12), 2141-2151 (2016).
- Lavoie, I., Lavoie, M., Fortin, C. A mine of information: Benthic algal communities as biomonitors of metal contamination from abandoned tailings. Science of the Total Environment. 425, 231-241 (2012).
- Tlili, A., Montuelle, B., Berard, A., Bouchez, A. Impact of chronic and acute pesticide exposures on periphyton communities. Sci Total Environ. 409 (11), 2102-2113 (2011).
- Dorigo, U., et al. Lotic biofilm community structure and pesticide tolerance along a contamination gradient in a vineyard area. Aquat Microb Ecol. 50 (1), 91-102 (2007).
- Pesce, S., et al. Evaluation of single and joint toxic effects of diuron and its main metabolites on natural phototrophic biofilms using a pollution-induced community tolerance (PICT) approach. Aquat Toxicol. 99 (4), 492-499 (2010).
- Ricart, M., et al. Effects of low concentrations of the phenylurea herbicide diuron on biofilm algae and bacteria. Chemosphere. 76 (10), 1392-1401 (2009).
- Martinez, A., Kominoski, J. S., Larranaga, A. Leaf-litter leachate concentration promotes heterotrophy in freshwater biofilms: Understanding consequences of water scarcity. Sci Total Environ. , 1677-1684 (2017).
- Corcoll, N., et al. Comparison of four DNA extraction methods for comprehensive assessment of 16S rRNA bacterial diversity in marine biofilms using high-throughput sequencing. Fems Microbiol Lett. 364 (14), (2017).
- Welsh, A. K., McLean, R. J. Characterization of bacteria in mixed biofilm communities using denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE). Curr Protoc Microbiol. , Chapter 1, Unit 1E 1 (2007).
- Ranjard, L., et al. Characterization of bacterial and fungal soil communities by automated ribosomal intergenic spacer analysis fingerprints: Biological and methodological variability. Appl Environm Microbiol. 67 (10), 4479-4487 (2001).
- Stewart, T. J., Traber, J., Kroll, A., Behra, R., Sigg, L. Characterization of extracellular polymeric substances (EPS) from periphyton using liquid chromatography-organic carbon detection-organic nitrogen detection (LC-OCD-OND). Environ Sci Pollut R. 20 (5), 3214-3223 (2013).
- Kroll, A., et al. Mixed messages from benthic microbial communities exposed to nanoparticulate and ionic silver: 3D structure picks up nano-specific effects, while EPS and traditional endpoints indicate a concentration-dependent impact of silver ions. Environ Sci Pollut R. 23 (5), 4218-4234 (2016).
- Sgier, L., Freimann, R., Zupanic, A., Kroll, A. Flow cytometry combined with viSNE for the analysis of microbial biofilms and detection of microplastics. Nat Commun. 7, 11587 (2016).
- Amir el, A. D., et al. viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia. Nat Biotechnol. 31 (6), 545-552 (2013).
- Mora-Gomez, J., Freixa, A., Perujo, N., Barral-Fraga, L. Limits of the biofilm concept and types of aquatic biofilms. Aquatic Biofilms: Ecology, Water Quality and Wastewater Treatment. , 3-27 (2016).
- Matthaei, C. D., Guggelberger, C., Huber, H. Local disturbance history affects patchiness of benthic river algae. Freshw Biol. 48 (9), 1514-1526 (2003).
- Tlili, A., Hollender, J., Kienle, C., Behra, R. Micropollutant-induced tolerance of in situ periphyton: Establishing causality in wastewater-impacted streams. Water Res. 111, 185-194 (2017).
- Robinson, C. T., Rushforth, S. R. Effects of physical disturbance and canopy cover on attached diatom community structure in an idaho stream. Hydrobiologia. 154, 49-59 (1987).
- Pomati, F., Nizzetto, L. Assessing triclosan-induced ecological and trans-generational effects in natural phytoplankton communities: A trait-based field method. Ecotoxicology. 22 (5), 779-794 (2013).
- Hulliger, J. Methoden zur Untersuchung und Beurteilung der Fliessgewässer. , Vol. Umwelt-Vollzug Nr. 0740, Bundesamt für Umwelt, Bern (2007).
- Tlili, A., et al. In situ spatio-temporal changes in pollution-induced community tolerance to zinc in autotrophic and heterotrophic biofilm communities. Ecotoxicology. 20 (8), 1823-1839 (2011).
- Foladori, P., Laura, B., Gianni, A., Giuliano, Z. Effects of sonication on bacteria viability in wastewater treatment plants evaluated by flow cytometry - Fecal indicators, wastewater and activated sludge. Water Res. 41 (1), 235-243 (2007).
- Buesing, N., Gessner, M. O. Comparison of detachment procedures for direct counts of bacteria associated with sediment particles, plant litter and epiphytic biofilms. Aquat Microb Ecol. 27 (1), 29-36 (2002).
- van der Maaten, L., Hinton, G. Visualizing Data using t-SNE. J Mach Learn Res. 9, 2579-2605 (2008).
- van der Maaten, L. Accelerating t-SNE using Tree-Based Algorithms. J Mach Learn Res. 15, 3221-3245 (2014).
