Summary
Flowcytometri i kombinasjon med visuelle klynger tilbyr en enkel å bruke og rask metode for å studere vannplanter biofilm. Den kan brukes for biofilm karakterisering, gjenkjenning av endringer i biofilm samfunnet struktur og gjenkjenning av abiotiske partikler i biofilm.
Abstract
Biofilm er dynamisk konsortier av microorganism som spiller en viktig rolle i ferskvann økosystemer. Ved å endre samfunnet strukturen, biofilm respons rask til endringer i miljøet, og dermed kan brukes som indikatorer på vannkvalitet. Foreløpig er biofilm vurdering hovedsakelig basert på integrerende og funksjonelle sluttpunkter, som fotosynteseaktiviteten eller luftveiene aktivitet, som ikke gir informasjon på biofilm samfunnet strukturen. Flowcytometri og beregningsorientert visualisering tilbyr en alternativ, følsom og lett-å-bruke metode for vurdering av samfunnet sammensetningen, spesielt i den photoautotrophic delen av ferskvann biofilm. Det krever bare grunnleggende eksempel forberedelse, hvoretter hele prøven kjøres gjennom flyt-cytometer. Informasjon om encellede optisk og fluorescerende brukes for beregningsorientert visualisering og biologiske tolkning. De viktigste fordelene over andre metoder er analyse og høy-informasjon innhold natur. Flowcytometri inneholder informasjon om flere mobilnettet og biofilm egenskaper i et enkelt mål: partikkelstørrelse, tetthet, pigment innhold, abiotiske innhold i biofilm og grov taksonomisk informasjon. Men gir det ikke informasjon på biofilm komposisjon på arter nivå. Vi ser stort potensiale i bruk av metoden for miljøovervåking til akvatiske økosystemer og som en innledende biofilm evaluering trinn som informerer nedstrøms detaljerte undersøkelser av komplementære og mer.
Introduction
Biofilm er dynamisk konsortier av microorganism som spiller en nøkkelrolle i ferskvann økosystemer, oppstiller fra primærproduksjon, Nærings sykling og vannrensing å påvirke fordelingen av mikroorganismer og deres biologisk mangfold i økosystemet 1. Når biofilm er utsatt på endrede miljøforhold eller stressorer, som kjemikalier, samfunnet strukturen raskt Skift mot mer tolerante arter2,3. Deres høy følsomhet blir biofilm attraktive modellsystemer for miljømessige overvåking4, men ingen av gjeldende metoder er perfekt egnet til å spore faktisk dynamiske av en biofilm samfunnet på en rask og enkel måte.
Brukte settet med metoder å karakterisere biofilm består av måling av funksjonelle og strukturelle endepunktene. På nivå med hele samfunnet gir fotosynteseaktiviteten og luftveiene aktivitet som aktiviteten til ekstracellulære enzymer informasjon om funksjonelle tilstanden av biofilm5,6,7,8 ,9. Biomasse belastning brukes som en indikator for samlet biofilm vekst. Strukturelle endringer er foreløpig målt enten ved hjelp av tradisjonelle arter identifikasjon med * lys eller nukleotid-baserte teknikker (f.eksdenaturing gradient gel geleelektroforese (DGGE), automatisert ribosomal intergenisk spacer analyse (ARISA), metagenomics)10,11,12. Disse metodene informasjon men er tidkrevende å utføre, eller krever spesifikk kunnskap, eller er fortsatt under utvikling. Endelig nye metoder for vurdering av den ekstracellulære polymere stoffer (EPS)13,14 og biofilm arkitektur1, mens følsom, er lav gjennomstrømming og har ennå ikke utviklet mot overvåking formål.
Det er tydelig at for komplett karakteristikk av ferskvann biofilm, er det nødvendig å kombinere flere forskjellige metoder, som gir innsikt i biofilm funksjon, komposisjon og arkitektur. For miljøovervåking, derimot, kreves en rask og følsom metode som kan registrere endringer i biofilm og aktiverer grunnleggende biologisk tolkning av endringer på funksjonelle og strukturelle.
Vi har utviklet en ny metode for mikrobiell samfunnet karakterisering av phototrophic komponenten av strømmen biofilm (periphyton), som er rask nok for overvåking formål, og samtidig gir tilstrekkelig informasjon om biofilm samfunnet struktur slik at biologiske tolkning15. Den er basert på én celle flowcytometri (FC) av biofilm prøver og kombinert med beregningsorientert visualisering og gir informasjon om optisk og fluorescerende egenskaper biofilm på enkeltcelle nivå.
Arbeidsflyten etter biofilm utvalg består av prøven forberedelse i form av sonication, fiksering og -basert filtrering av prøvene etterfulgt av vurdere utvalget av flowcytometri. Ervervet dataene gir informasjon om flere mobilnettet egenskaper i et enkelt mål: partikkelstørrelse, tetthet, pigment innhold, abiotiske innhold (f.eks microplastics) i biofilm. Disse dataene er analysert via beregningsorientert visualisering ved hjelp av visuelle Stokastisk nabo innebygging (viSNE)16, som gir rask og enkel tolkning av dataene. Selv om noen uker kreves for å konfigurere og optimalisere metoden når satt opp, det tar bare et par timer fra samle biofilm prøvene å tolke resultatene.
De viktigste fordelene med metoden presentert over andre er analyse og høy-informasjon innhold. Videre kan prøvene lagres i flere uker etter samling uten tap av deres optisk og fluorescens egenskaper. Dette kan være veldig nyttig når karakteristikk av en rekke prøver kreves, for eksempel store prøvetaking studier eller biomonitoring programmer, men kan også gi en betydelig mengde informasjon i mindre utforskende studier.
Presentert protokollen er basert på flyt-cytometric analyse av phototrophic biofilm (periphyton) fra forskjellige steder i en strøm. Mange skritt av protokollen, f.eks valg av områder egnet for overvåking formål, avhenger av målene for forskningen og derfor ikke kan foreskrives. Andre gi mindre frihet og krever at protokollen følges nøye, dette er gjort klart i detaljert protokollen nedenfor.
Protokollen starter med valg av nettsteder for biofilm-baserte miljøovervåking. Neste skritt er å sette opp flyt-cytometer (FC) slik at dens mål aktiverer diskriminering mellom ulike phototrophic organismer som lever i biofilm i overvåkede miljøet. Dette utføres ved å samle biofilm prøver fra nettsteder, identifisere fluorescerende egenskapene til ulike arter til stede i biofilm og konfigurere flyt-cytometer med lasere og filtre som aktiverer måling på riktig optisk bølgelengder. Når FC er satt opp, biofilm kan være samlet fra områder med jevne mellomrom egenskapene optisk og fluorescerende enkelt partikler tilstede i biofilm målt ved flowcytometri, og dataene analysert av visuelle klynger. For bedre tolkning av resultatene er det mulig å bygge en FC referansedatabase med lokale biofilm-levende arter og deres fenotyper og bruke databasen for å identifisere ulike taksonomier i FC data. Validering er mulig gjennom fluorescens-basert sortering av de identifiserte klyngene av enkeltceller FACS og mikroskopi-baserte taksonomisk identifikasjon av nåværende arter. En skjematisk av protokollen som er angitt i figur 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. økosystem utvalg og Biofilm prøvetaking
- Velg en akvatisk økosystem rundt og finne målestasjoner hvor biofilm vokse. Grunne delene av en strøm med treg til middels vannføring og en steinete streambed biofilm feste er riktig17,18.
- Valgfritt: Hvis området ikke har nok flater biofilm feste, eller redusere biofilm variasjon innen et område, plassere kunstig substrater for biofilm vedlegg (f.eks glass lysbilder, keramiske fliser) i området, mens at de er plassert i samme retning når det gjelder vannstrømmen og lignende dybde og lysintensiteten19.
- For å fastslå miljøforholdene på webområdet prøvetaking, bruk bærbar instrumenter for å måle lysintensiteten, skal vanntemperatur, ledningsevne, oksygen og pH rett over overflaten biofilm prøves fra. I løpet av prøvetaking, ta gjentatte measures (3-5) for å beregne gjennomsnittlig verdier.
- Valgfritt: Ta vannprøver for å finne relevante vann kjemi parametere (oppløst organisk karbon (DOC), K+Na+Ca2 +, Mg2 +, Cl-, F-, så42 -, PO42 - , Nei32-, SiO44 -).
- Bruke vernehansker, samle sammenlignbare steiner (i størrelse, form og type) fra hver området (eller kunstig underlag). Steinene skal bli utsatt for lignende flyt og lys18.
- Filtrere nok strøm vann fra området gjennom 0.22 μm filtre, slik at det er klart for alle innsamlede eksemplene (f.eks 15 mL per prøve).
- Bruke en myk tannbørste for å fjerne biofilm fra underlaget i en kolbe (pensel til alle biofilm er fjernet) med 15 mL filtrerte strømmen vann20.
- Fastsette prøvene i 0,01% paraformaldehyde og 0,1% glutaraldehyde21.
2. fastsettelse av Optimal flyt-cytometric (FC)
- Overføre underutvalg til lys mikroskop (bruker en 40 X / 0,75 mål, hvis nødvendig bruker en 100 × 1.3 oljeobjektiv) og identifisere arten finnes i prøvene22,23.
- Bestill identifisert én art fra aktuelle kultur samlinger (f.eks den eksperimentelle Phycology og kultur samling av alger på universitetet av Goettingen [EPSAG] eller kultur samling av alger på universitetet av Cologne [CCAC] hvis overvåkningen skjer i sentrale europeiske økosystemer).
- Vokse enkelt arter kontinuerlig i lignende forhold (f.eks lys, temperatur, pH) til miljøet biofilm prøvene er tatt fra. Bor innenfor 1 ° C og 0,5 pH punkt fra miljøprøver anbefales.
- For å koble/spre cellene, 15 mL av én art prøver inn sentrifuge rør og satte rørene i midten av et vannbad og dukke, slik at flytende overflaten av prøven er på samme nivå som overflaten av badekaret. Sonicate prøvene for 1 min på 45 kHz24,25.
- Posten absorbans og fluorescens spektra av én art likner en plate. Se plate-leser av valget for instruksjoner. I dette eksemplet, 96-brønns flat bunn gjennomsiktig polystyrol platene var lastet med 200 µL eksempel volum og absorbansen ble målt. (Innstillingene brukes: (a) fluorescens skannemodus, utslipp bølgelengde trinn størrelse 10 nm, utslipp skanning nummer 30, båndbredden 20 nm, få 100, 25 blinker, 20 amerikanske integrering tid eller (b) absorbansen skannemodus, 25 blinker, båndbredde 9 nm).
- Definere flyt cytometer med lasere, dichroic splittere og filtre som sammen dekker alle de fluorescerende områdene der ulike arter har spesielle egenskaper. For sentral europeisk bekker, en 405 nm, 488 nm og 638 nm laser gi nyttige resultater.
- Juster Spenningsinnstillingen for photomultipliers (ikke gjelder alle flyt cytometers) og omfanget av de målte fluorescences inkluderer minst 99% av alle hendelser av prøvene.
- Alternativt, hvis kunnskap om arter til stede i biofilm tilgjengelig, start med trinn 2.2. Hvis fluorescerende egenskapene er kjent, start med trinn 2.6.
3. alternativ: Utarbeidelse av en flyt-cytometric referansedatabase
Merk: FC tillater ikke taksonomisk identifikasjon av celler i biofilm. En referansedatabase med FC målinger av én art kjent for å være til stede i biofilm, vokst under like forhold som biofilm, kan hjelpe til med tolkningen av dataene.
-
Referanse: én art
- Bruker optimalisert FC parameterne definert i 2.5-7, måle egenskapene optisk og fluorescerende én art (fast i paraformaldehyde og glutaraldehyde og filtrert gjennom filtrene av passende størrelse for flyt-cytometer).
- Normalisere dataene fra én art på samme måte som dataene fra biofilm (se trinn 6.1.2).
-
Referanse: skadet og råtnende celler
En av de viktigste indikatorene på biofilm helse er en brøkdel av skadet/døde celler i biofilm. For å måle disse cellene, kan en referanse til råtnende celler tilberedes.- Ta 1 mL underutvalg av utvannet biofilm og sentrifuge dem ved romtemperatur 8000 x g i 10 minutter i en tabletop sentrifuge. Avbryte den resulterende pellet 1 mL 90% etanol og lagre suspensjon overnatting på 4 ° C. Gjenta på neste dag.
- Bruker innstillingen for optimalisert FC, måle egenskapene optisk og fluorescerende skadet og råtnende cellene (fast og filtrert).
-
Referanse: microplastics
Merk: hvis interessert i overvåking microplastic partikler i biofilm, se om de forskjellig nok fra biotiske partikler i optisk og fluorescens egenskaper for identifikasjon.- Suspendere microplastic partikler i henhold til instruksjonene av microplastics produsent og måle optisk og fluorescerende egenskapene (med FC parameterne fra 2.7).
- Legge til microplastic partikler biofilm prøven og la over natten på 4 ° C.
- Filtrere suspensjon og mål med samme FC parametere som ovenfor.
4. Prøv forberedelse og lagring
- Når FC er definert og FC referanse databasen er klar, kan man fortsette med evalueringen av fersk biofilm prøver, samlet etter trinn 1.1-7. For å koble/spre biofilm, overføre 15 mL av prøvene fra kolber (se trinn 1.7) i sentrifuge rør.
- Sett hver rør i midten av et vannbad og senke slik at flytende overflaten av prøven er på samme nivå som overflaten av badekaret. Sonicate prøvene for 1 min på 45 kHz.
- Fix prøvene i 0,01% paraformaldehyde og 0,1% glutaraldehyde (lager i nanopure vann). Lagre på 4 ° C til du er klar for analyse.
- Viktig: Bruk halvparten av prøvene for flowcytometri analyse og holde halvparten lagring for sikkerhet og valgfri validering med fluorescens-aktivert celle sortering og/eller * lys (se punkt 6).
Merk: lagret i kjøleskapet, fast biofilm prøvene bør holde optisk og fluorescerende egenskapene i opptil tre uker.
5. kjører utvalget gjennom FC
- Hvis prøvene var lagret i kjøleskapet, sonicate dem raskt eller Pipetter flere ganger for å skille partikler. Filtrere underutvalg med 50 μm filter (filter størrelse, avhenger av bredden på av FC kapillær) før måling.
- Laste individuelle prøvene (1-2 mL, dette avhenger flyt cytometer brukt) i flyt-cytometer og måle egenskapene optisk og lysrør for hver partikkel. Gjenta målingen tre ganger per hver biologiske replikere (tre tekniske gjentak).
- Eksportere data fra FC i CSV-format.
6. data forberedelse og sammenheng analyse
FC kan analysere flere parametere (f.eks, signal området, høyde, bredde) for hver målte optisk egenskapen og fluorescens. Kjøre en korrelasjon analyse på målt variabler og bare holde dem mål som ikke er høyt korrelert. Dette fjerner vanligvis alle bortsett fra én FC parameter (f.eks, signal området) og kan også fjerne sterkt korrelert fluorescerende målinger (vanligvis stammer fra den samme laseren og nabolandet filtre).
-
Kjør CYT som en verktøykasse i Matlab:
- Importdataene redusert FC i CSV-format fra alle prøvene som skal analyseres i CYT programvare16, inkludert alle tekniske og biologiske replikerer. (Klikk + fil filtrere *.csv, velge filer for import).
- Transformere fluorescerende kanaler for alle prøvene bruker hyperbolsk arcus sinus transformasjonen. Verdien av kofaktor må velges; 150 arbeider for mest phototrophic biofilm og flyt cytometers, men optimalisering kan være nødvendig for bestemt eksperimentelle oppsett og heterotrofe biofilm. (Høyre-klikke/Transform/angi kofaktor 150)
- For kvalitetskontroll, visuelt sammenligne (i CYT) histogrammer for individuelle prøver og personlige optisk og fluorescerende kanaler for å gjøre at det ikke er noen outliers på tekniske og biologiske replikasjon. Outliers vil manifestere seg i betydelig skiftet fluorescerende/optisk distribusjoner mellom gjentak. (Velg Data, Velg kanal, Plot)
- Alternativ: Kjør en viktigste komponenten analyse (PCA) på median verdiene av fluorescerende distribusjoner og kontroller at tekniske og biologiske gjentak klynge sammen.
- Flett teknisk replikeres i hver biologiske replikere og subsample biologisk replikerer, slik at hver er representert av samme antall partikler (cellene, cellen fragmenter og abiotiske partikler), og slik at antall partikler analysert av Barnes-hytta Stokastisk nabo innebygging (bh-SNE) er rundt 150 000 (for beste visualisering resultatene26). (Velg Data, høyreklikker flettingen/Subsample)
- Til sammenligning mellom prøvene er det viktig å velge bare disse prøvene som skal sammenlignes. Velg prøvene og Kjør bh-SNE27. Når algoritmen er ferdig, nye kanaler, vises navngitt bh-SNE1 og bh-SNE2. Dette er SNE koordinatene til alle analysert partikler, som kan brukes til å visualisere dataene i et spredningsdiagram (viSNE kart). (Velg Data, Velg kanaler, høyreklikker bh-SNE, ja normalisert data)
- ViSNE kart, er partikler plassert etter likhet og gruppert i visuelt separable klynger. Kontroller egenskapene optisk/fluorescerende klynger og merke og navn som skilles godt og har forskjellige optisk/fluorescens egenskaper ved hjelp av tegneverktøyene i CYT. (Velg kanal bh-SNE1, bh-SNE2)
- Valgfritt: Hvis en referansedatabase med enkelt mikrobielle arter (målt med samme flowcytometri innstilling og dyrket under like forhold) er tilgjengelig, eksporttilknytninger viSNE i Matlab og prosjektet referanse databasen på kartene. På denne måten kan bestemt klynger kobles til bestemt arter/taksonomisk grupper (skript tilgjengelig for nedlasting på https://github.com/anzezupanic/FC_analysis). (Økt/lagre)
- Feilsøking: Hvis bh-SNE analysen ikke returnerer visuelt separable klynger, men en eneste stor en, for mange partikler ble brukt i bh-SNE. Prøv på nytt med færre partikler per prøve. Hvis det ikke finnes klynger, men ganske sparsom enkeltpunkt, øke antall partikler som brukes.
- Valgfritt: I stedet for å stole på bh-SNE for den klynging, andre klynger metoder (f.ekshierarkisk, centroid-basert eller tetthet basert klynging) kan brukes på normalisert data og deretter lagt på viSNE kartet (https://github.com/ anzezupanic/FC_analysis).
- Når klynger identifisert, telle antall partikler i hver klynge tilhører hver biologiske replikere i hver prøve. Vurdere forskjeller mellom utvalgene, bruker ANOVA og Tukey's test med riktig (f.eksHolmes) korreksjon for flere sammenligning.
7. alternativ: Validering av klyngen tolkning bruke fluorescens-aktivert celle sortering
- Når klynger identifisert, kan du bruke fluorescens-aktivert celle sortering (FACS) for å fjerne dem fra prøvene hvis ønskelig, forutsatt at FACS har en lignende (eller identiske) konfigurasjon av lasere og fluorescerende filtre.
- For hver identifisert klynge gir CYT optisk og fluorescerende portene som definerer klyngen. Bruk disse portene til å sortere ut partikler i hver klynge med FACS og identifisere sorterte cellene med * lys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bruke fremgangsmåten presenteres her (figur 1), ble prøver tatt fra flere steder av en lokal strøm i Sveits analysert. Tre lignende størrelse steiner (10-12 cm) ble tatt på hvert område, og biofilm var børstet av steinene. Prøvene var så sonicated, fast, filtrert og senere analysert av flowcytometri. Oppsettet av flyt cytometer og referanse databasen brukes var de samme som beskrevet i en tidligere papir15: tre lasere ble brukt (405, 488 og 638 nm), syv dichroic splittere og ti filtre som dekket fluorescens utslipp fra 425 til > 755 nm , og referanse databasen inkludert > 30 arter som dekker Cyanobakterie, grønne alger, kiselalger og Rødalger som ble funnet i biofilm i sveitsiske strømmen. Totalt antall partikler brukes for etableringen av viSNE kartene var ca 150 000 (figur 2A). Bruke beskrevet tilnærming, er det mulig å skille mellom forskjellige områder (figur 2B), kategorisere ulike deler av viSNE kartet i subpopulasjon av celler med grov taksonomisk informasjon (Figur 3) og etablere som subpopulasjoner var annerledes mellom prøvene (Figur 4).
En lignende fremgangsmåte ble brukt om å kvantifisere microplastic partikler i en biofilm. Ren prøver av microplastic partikler av samme størrelse på celler i ferskvann biofilm (ca. 10 µm), biofilm prøver dyrket i laboratoriet i tilstedeværelse eller fravær av microplastic partikler (bruker biofilm vekst protokoller beskrevet i Tlili et al. 20115) ble målt og sammenlignet (figur 5). Det ble besluttet at microplastic partikler med kjente optisk og fluorescerende egenskaper kan oppdages robust ved konsentrasjoner over 1.000 ppm.
Figur 1: skjemaet fra experimental protokollen. Samling av miljømessige biofilm prøvene etterfølges av identifikasjon av arter til stede i biofilm, bestemmelse av optisk og fluorescerende egenskaper og passende flyt-cytometer med riktige lasere og filtre til å måle disse egenskaper. For flyt-cytometric målinger, prøvene er sonicated, rette og lagret. Når nok prøver har vært samlet de måles av flowcytometri for hver målte celle, en rekke optiske og fluorescens egenskaper er innhentet og analysert ved hjelp av visuelle klynger. Valgfritt (prikket piler), er det mulig å bygge en FC database av arter til stede i overvåkede biofilm og bruker databasen for tolkning av resultatene. Det er også mulig å bruke ytterligere validering metoder, f.eks fluorescens-baserte celle sortering og taksonomisk analyse bruker * lys Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: sammenligne miljømessige biofilm bruker viSNE maps. (A) viSNE kart fra for mange celler (300.000) har en enkelt stor klynge (øverst), for få (10.000) celler utgjør ikke klynger på alle (nederst), mens et optimalt antall celle (ca. 150.000) form tydelig visuelt separable klynger (midten). (B) delsett av viSNE kartet som tilhører seks forskjellige utvalgene har forskjellige tettheter i ulike deler av viSNE kartet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: klynging av subpopulasjoner av partikler i biofilm. (A) ulike deler av viSNE kartet er befolket av partikler med ulike optisk og fluorescens egenskaper som gir ledetråder til biotiske/abiotiske opprinnelsen til partikler og som taksonomisk gruppere biotiske partikler (celler) tilhører (bølgelengder fra topp til bunn: 525 nm, 695 nm, 660 nm). For hver bølgelengde normaliseres fargeskala fra høyeste målte fluorescens (rød) til laveste målt (blå). (B) av referansedatabase (røde prikker) på viSNE kartet kan bidra til å tolke hvilke deler av kartet er befolket av hvilke taxa og/eller abiotiske partikler: råtnende celler (øverst), kiselalger (midten), Cyanobakterie (nederst). (C) basert på informasjon i (A) og (B) og visuelt separable klynger av viSNE kartet, er det mulig tilordne forskjellige deler av viSNE kartet til forskjellige klynger (SP1-11) og kategorisere klynger tilsvarende. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: statistisk analyse av biofilm prøvene. (A) kvantifisering utføres ved å telle antall partikler av hver subpopulation tilhører forskjellige biologiske gjentak. A-F representerer seks forskjellige steder langs en lokal elv, som biofilm prøvene er tatt. (B) ANOVA kan brukes til å evaluere statistiske forskjellen mellom prøvene, med riktig flere sammenligning korreksjon (p < 0,05, parvis Tukey HSD alle områder vs område A). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: sporing microplastic partikler med viSNE. (A) Microplastic partikler, (B) ferskvann biofilm, (C) ferskvann biofilm blandet med microplastic partikler, (D) fluorescens partikler målt ved FC på 695 nm. Fargeskala normaliseres fra høyeste målte fluorescens (rød) til laveste målt fluorescens (blå) på 695 nm. Forholdet mellom microplastic partikler og biofilm partikler er ca 1:1. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen beskrevet ovenfor er relativt enkel å implementere. Men mens presentert standardinnstillingene har vist seg å være egnet for alle phototrophic biofilm testet hittil, er optimalisering (som beskrevet i protokollen) nødvendig å maksimere informasjonen fra metoden. Faktisk kan egenskapene optisk og fluorescerende biofilm variere, avhengig av miljømessige forhold (sesong, temperatur, kjemisk sammensetning av vann)1. Derfor er det viktig å ta hensyn til dette variasjon når FC analysene. En måte å gjøre dette er ved å ta representative utvalg av biofilm fra webområdene prøvetaking og/eller tar én art og voksende dem i ulike forhold og mål av ulike oppsett. Voksende én art er også nyttig å bygge en database med fluorescerende egenskaper som kan brukes til å tolke FC resultatene. Dette er det imidlertid viktig at den eneste arten blitt målt under like forhold til dem som biofilm skal prøves. For eksempel vil en database med FC målinger av enkelt arter vokser ved 25 ° C forteller svært lite om sammensetningen av en biofilm vokser på 15 ° C. Det er imidlertid ikke helt nødvendig å bygge en referansedatabase for å bruke denne metoden effektivt. Allerede med hjelp av grunnleggende FC-protokollen, er det mulig å få informasjon om størrelse, tetthet og tilstedeværelse av ulike pigment i cellene i biofilm. Visuelle klynging kan klassifisering av celler i klynger som har lignende målt egenskaper og besluttsomhet som egenskapen er endret de mellom eksempler. Referanse databasen, men blir viktig når du tilordner taksonomisk identiteter til forskjellige klynger. Når endringer i biofilm egenskaper har blitt oppdaget, er det mulig å relatere dem med fysiske og kjemiske målinger av vannet på prøvetaking nettsteder. Dette kan bestemme hvilke miljøfaktor har den sterkeste innflytelsen over biofilm samfunnet i overvåkede økosystemet.
Det er også noen begrensninger for metoden. FC tillater for eksempel ikke identifikasjon av biofilm sammensetningen på arter nivå. Videre, når endringer i biofilm egenskaper oppdages, FC ikke tilskrive ansvarlig årsaker: et skifte mot mer tolerante arter eller mot mer tolerante fenotyper (arter forblir de samme). Andre, utfyllende metoder, som metagenomics, for å løse dette spørsmålet. En annen begrensning av metoden er at bare phototrophic komponenten av biofilm, rik med pigmenter med ulike fluorescerende egenskaper, er analysert. Mens det er absolutt mulig å bruke metoden for heterotrofe biofilm karakterisering, er det ikke klart om nok informasjon kan fås med flekken-fri analyse. På grunn av den lave naturlig fluorescensen av bakterier og sopp, forskjellige innstillinger må brukes, og det er derfor ikke mulig å vurdere det phototrophic og heterotrofe komponenter i biofilm sammen i en enkelt FC kjøre. Snarere vil skille prøven og evaluere en del med phototrophic og en del med innstillingen heterotrofe være nødvendig. Endelig er det en begrensning med benytter viSNE for biofilm visualisering. De beste resultatene oppnås med ca. 150 000 celler fotografert sammen. Dette setter en grense for antall eksempler som kan analyseres og sammenlignet med metoden uten fortynne beregningsmessig prøvene for mye. For eksempel hvis en ønsket å sammenligne 150 prøver, vil så hvert utvalg bare representeres av ca. 1000 celler. En vei rundt denne begrensningen analysere prøvene med en "flytte vinduet" tilnærming som overlappende grupper av prøver kan analyseres separat ved viSNE og deretter resultatene gruppert sammen, slik løsning, men er ennå implementert ikke.
Vi tror at basert på flowcytometri evaluering av biofilm kan bli effektivt brukt til overvåking av akvatiske økosystemer. Den kan brukes til å sammenligne tidsserier prøver eller prøver tatt på forskjellige steder, og med unntak av prøvetaking, har potensial for komplett automatisering. Metoden kan betraktes som et første biofilm evaluering skritt som gir informasjon om nedstrøms detaljerte undersøkelser med utfyllende og mer. Til slutt kan det utvides til mer spesifikke programmer, for eksempel gjenkjenning av abiotiske forurensning av biofilm, som vi har vist for tilfelle av microplastic.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Presentert arbeidet ble støttet av et SNF Ambizione fellesskap (PZ00P2_142533) og et Velux forskningsstipend (Amplebig). Vi vil gjerne takke Bettina Wagner for hjelp med eksperimentelle arbeidet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Multimeter | WTW | MultiLine 3620 IDS | For measuring temperature, pH, dissolved oxygen |
| Ultrasonic cleaner | VWR International | 97043-986 | Tank dimesions: 15*14*10 cm |
| Flow cytometer | Beckman Coulter | Gallios | Lasers: 405, 488 and 638 nm. Filters bands in Supplementary Table 11. Sgier et, Nat Comm, 2016. |
| Plate reader | Tecan | Infinite M200 | used for selecting appropriate setting of the FC |
| Cell sorter | Beckman Coulter | MoFlo Astrios | Settings in Supplementary Table 12. Sgier et, Nat Comm, 2016. |
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axiovert 135 | Zeiss EC Plan-Neofluar 40x/0.75 objective |
| SOFTWARE | |||
| Matlab | MathWorks | R2013a | software for numerical computing |
| CYT | Dana Pe'er Lab | Version 1.1 | free interactive visualization tool for analysis of cytometry data |
References
- Battin, T. J., Besemer, K., Bengtsson, M. M., Romani, A. M., Packmann, A. I. The ecology and biogeochemistry of stream biofilms. Nat Rev Microbiol. 14 (4), 251-263 (2016).
- Rotter, S., Heilmeier, H., Altenburger, R., Schmitt-Jansen, M. Multiple stressors in periphyton - comparison of observed and predicted tolerance responses to high ionic loads and herbicide exposure. J Appl Ecol. 50 (6), 1459-1468 (2013).
- Tlili, A., et al. Pollution-induced community tolerance (PICT): towards an ecologically relevant risk assessment of chemicals in aquatic systems. Freshw Biol. 61 (12), 2141-2151 (2016).
- Lavoie, I., Lavoie, M., Fortin, C. A mine of information: Benthic algal communities as biomonitors of metal contamination from abandoned tailings. Science of the Total Environment. 425, 231-241 (2012).
- Tlili, A., Montuelle, B., Berard, A., Bouchez, A. Impact of chronic and acute pesticide exposures on periphyton communities. Sci Total Environ. 409 (11), 2102-2113 (2011).
- Dorigo, U., et al. Lotic biofilm community structure and pesticide tolerance along a contamination gradient in a vineyard area. Aquat Microb Ecol. 50 (1), 91-102 (2007).
- Pesce, S., et al. Evaluation of single and joint toxic effects of diuron and its main metabolites on natural phototrophic biofilms using a pollution-induced community tolerance (PICT) approach. Aquat Toxicol. 99 (4), 492-499 (2010).
- Ricart, M., et al. Effects of low concentrations of the phenylurea herbicide diuron on biofilm algae and bacteria. Chemosphere. 76 (10), 1392-1401 (2009).
- Martinez, A., Kominoski, J. S., Larranaga, A. Leaf-litter leachate concentration promotes heterotrophy in freshwater biofilms: Understanding consequences of water scarcity. Sci Total Environ. , 1677-1684 (2017).
- Corcoll, N., et al. Comparison of four DNA extraction methods for comprehensive assessment of 16S rRNA bacterial diversity in marine biofilms using high-throughput sequencing. Fems Microbiol Lett. 364 (14), (2017).
- Welsh, A. K., McLean, R. J. Characterization of bacteria in mixed biofilm communities using denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE). Curr Protoc Microbiol. , Chapter 1, Unit 1E 1 (2007).
- Ranjard, L., et al. Characterization of bacterial and fungal soil communities by automated ribosomal intergenic spacer analysis fingerprints: Biological and methodological variability. Appl Environm Microbiol. 67 (10), 4479-4487 (2001).
- Stewart, T. J., Traber, J., Kroll, A., Behra, R., Sigg, L. Characterization of extracellular polymeric substances (EPS) from periphyton using liquid chromatography-organic carbon detection-organic nitrogen detection (LC-OCD-OND). Environ Sci Pollut R. 20 (5), 3214-3223 (2013).
- Kroll, A., et al. Mixed messages from benthic microbial communities exposed to nanoparticulate and ionic silver: 3D structure picks up nano-specific effects, while EPS and traditional endpoints indicate a concentration-dependent impact of silver ions. Environ Sci Pollut R. 23 (5), 4218-4234 (2016).
- Sgier, L., Freimann, R., Zupanic, A., Kroll, A. Flow cytometry combined with viSNE for the analysis of microbial biofilms and detection of microplastics. Nat Commun. 7, 11587 (2016).
- Amir el, A. D., et al. viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia. Nat Biotechnol. 31 (6), 545-552 (2013).
- Mora-Gomez, J., Freixa, A., Perujo, N., Barral-Fraga, L. Limits of the biofilm concept and types of aquatic biofilms. Aquatic Biofilms: Ecology, Water Quality and Wastewater Treatment. , 3-27 (2016).
- Matthaei, C. D., Guggelberger, C., Huber, H. Local disturbance history affects patchiness of benthic river algae. Freshw Biol. 48 (9), 1514-1526 (2003).
- Tlili, A., Hollender, J., Kienle, C., Behra, R. Micropollutant-induced tolerance of in situ periphyton: Establishing causality in wastewater-impacted streams. Water Res. 111, 185-194 (2017).
- Robinson, C. T., Rushforth, S. R. Effects of physical disturbance and canopy cover on attached diatom community structure in an idaho stream. Hydrobiologia. 154, 49-59 (1987).
- Pomati, F., Nizzetto, L. Assessing triclosan-induced ecological and trans-generational effects in natural phytoplankton communities: A trait-based field method. Ecotoxicology. 22 (5), 779-794 (2013).
- Hulliger, J. Methoden zur Untersuchung und Beurteilung der Fliessgewässer. , Vol. Umwelt-Vollzug Nr. 0740, Bundesamt für Umwelt, Bern (2007).
- Tlili, A., et al. In situ spatio-temporal changes in pollution-induced community tolerance to zinc in autotrophic and heterotrophic biofilm communities. Ecotoxicology. 20 (8), 1823-1839 (2011).
- Foladori, P., Laura, B., Gianni, A., Giuliano, Z. Effects of sonication on bacteria viability in wastewater treatment plants evaluated by flow cytometry - Fecal indicators, wastewater and activated sludge. Water Res. 41 (1), 235-243 (2007).
- Buesing, N., Gessner, M. O. Comparison of detachment procedures for direct counts of bacteria associated with sediment particles, plant litter and epiphytic biofilms. Aquat Microb Ecol. 27 (1), 29-36 (2002).
- van der Maaten, L., Hinton, G. Visualizing Data using t-SNE. J Mach Learn Res. 9, 2579-2605 (2008).
- van der Maaten, L. Accelerating t-SNE using Tree-Based Algorithms. J Mach Learn Res. 15, 3221-3245 (2014).
