Summary
Akış Sitometresi görsel kümeleme ile birlikte su biyofilmler çalışmak için kullanımı kolay ve hızlı bir yöntem sunar. Biyofilm karakterizasyonu, biyofilm toplum yapısındaki değişikliklerin tespiti ve biyofilm içinde gömülü abiyotik parçacıklar tespiti için kullanılabilir.
Abstract
Biyofilmler tatlı su ekosistemleri önemli bir rol oynamak dinamik konsorsiyumlar mikroorganizma, vardır. Onların toplum yapısını değiştirerek biyofilmler çevresel değişikliklere hemen tepki vermek ve böylece su kalitesi göstergeleri olarak kullanılabilir. Şu anda, biyofilm değerlendirme hangi bilgileri biyofilm toplum yapısına vermeyeceğini bütünleştirici ve fonksiyonel bitiş noktaları, etkinlik, fotosentetik veya solunum gibi çoğunlukla dayanmaktadır. Akış Sitometresi ve hesaplamalı görselleştirme topluluk bileşimi, tatlı su biyofilmler photoautotrophic parçası özellikle değerlendirilmesi için alternatif, hassas ve kullanımı kolay bir yöntem sağlar. Yalnızca temel numune hazırlama, sonra tüm örnek akış sitometresi ile çalıştığı gerektirir. Tek hücreli optik ve floresan bilgi Hesaplamalı görselleştirme ve biyolojik yorumu için kullanılır. Başlıca avantajları diğer yöntemler üzerinde analiz ve yüksek bilgi içerik doğa hızı vardır. Akış Sitometresi birkaç cep ve biyofilm özellikleri tek bir ölçüm üzerinde bilgi sağlar: parçacık boyutu, yoğunluk, pigment içeriği, abiyotik içeriğinde biyofilm ve kaba taksonomik bilgi. Ancak, bu bilgileri ilgili biyofilm kompozisyon türleri düzeyde sağlamaz. Biz çevre sucul ekosistemler izleme için yöntem kullanımındaki yüksek potansiyel görüyorum ve bir ilk biyofilm değerlendirme olarak aşağı bilgilendirir adım araştırmalar tamamlayıcı ve daha ayrıntılı yöntemlerle ayrıntılı.
Introduction
Tatlı su ekosistemleri, mikroorganizmalar ve onların biyolojik çeşitlilik ve ekosistem içinde dağılımını etkileyen birincil üretim, besin Bisiklete binme ve su arıtma arasında değişen önemli bir rol oynamaktadır dinamik konsorsiyumlar mikroorganizma, biyofilmler vardır 1. onların toplum yapısı hızla biyofilmler çevre koşulları değişen veya stresler, kimyasallar gibi maruz karşı daha hoşgörülü türler2,3vardiya. Geçerli yöntemlerden hiçbiri aslında bir biyofilm topluluk dinamik hızlı ve kolay bir şekilde izlemek için mükemmel uygundur ancak onların yüksek hassasiyet çevresel izleme4için çekici model sistemleri biyofilmler dönüşüyor.
Fonksiyonel ve yapısal bitiş noktaları ölçümü oluşan biyofilmler karakterize yöntemleri yaygın olarak kullanılan küme. Tüm toplum düzeyinde fotosentetik ve solunum aktivite yanı sıra ekstraselüler enzim aktivitesi sağlar bilgi biyofilm5,6,7,8 fonksiyonel durumunu ,9. Biyokütle tahakkuk genel biyofilm büyüme için bir göstergesi olarak kullanılır. Yapısal değişiklikler şu anda ya ışık mikroskobu ile veya nükleotid tabanlı teknikleri (degrade jel elektroforez (DGGE), otomatik ribozomal intergenic rondela denaturingÖrneğin, geleneksel tür kimliği kullanarak ölçülür Analizi (furkan), metagenomics)10,11,12. Bu yöntemler bilgi sağlar ama gerçekleştirmek, ya da belirli bilgi gerektirir zaman alıcı veya hala geliştiriliyor. Son olarak, hücre dışı polimer maddeler (EPS)13,14 ve biyofilm Mimarlık1, duyarlı, süre değerlendirilmesi için yeni yöntemler düşük işlem hacmi ve henüz doğru geliştirilmiştir değil izleme amacıyla.
Tatlı su biyofilmler tam karakterizasyonu için bu biyofilm işlevi, kompozisyon ve mimarisi hakkında bilgi sağlayan birkaç farklı yöntem birleştirmek için gerekli olduğunu belirgindir. Çevre kontrolü için öte yandan, biyofilm değişiklikleri algılayıp temel biyolojik yorumu orijinalinde fonksiyonel ve yapısal düzeyinde etkinleştirmek hızlı ve duyarlı Yöntem gereklidir.
Mikrobiyal topluluk karakterizasyonu için izleme amacıyla hızlı ve aynı zamanda biyofilm toplum üzerinde yeterli bilgi sağlayan akış biyofilmler (periphyton), Kemotrofik bileşen için yeni bir yöntem geliştirdik yapısı biyolojik yorumu15izin vermek için. Tek hücreli akış sitometresi biyofilm örnekleri üzerinde (FC) dayalı ve hesaplamalı görselleştirme ile birleştiğinde ve biyofilm tek hücre düzeyinde optik ve floresan özellikleri hakkında bilgi sağlar.
İş akışı biyofilm örnekleme sonra numune hazırlama sonication, fiksasyon ve örnek akış sitometresi tarafından değerlendirilmesi tarafından takip örneklerin boyutu tabanlı filtreleme şeklinde oluşur. Alınan veri tek bir ölçüm çeşitli hücresel özellikleri hakkında bilgi vermek: parçacık boyutu, yoğunluk, pigment içeriği, biyofilm abiyotik içeriği (Örneğin microplastics). Bu veri kümesini (viSNE)16hızlı ve kolay bir yorum veri sağlar, katıştırma visual Stokastik komşu kullanarak hesaplama görselleştirme ile analiz daha var. Bir kaç hafta ayarlamak ve yöntemi, en iyi duruma getirmek için gerekli olmasına rağmen bir kez kurmak, bu biyofilm örnekleri sonuçlarını yorumlama için toplanıyor sadece birkaç saat sürer.
Diğerleri sunulan yönteminin ana avantajları hızı yüksek-bilgi-içerik ve analiz edilmektedir. Ayrıca, örnekler koleksiyon floresans özellikleri ve onların optik kaybı olmadan sonra birkaç hafta saklanır. Çok sayıda örnekleri karakterizasyonu, biomonitoring program veya büyük örnekleme çalışmaları gibi gereklidir, ancak aynı zamanda önemli bir miktar daha küçük keşif çalışmaları bilgi sağlayabilir bu çok yararlı olabilir.
Sunulan Protokolü akış sitometrik analizinde bir akışı farklı konumlardan toplanan Kemotrofik biyofilmler (periphyton) temel alır. İletişim kuralı, Örneğin siteleri için izleme amacıyla, uygun seçimi birçok adım araştırma hedefleri üzerinde bağlıdır ve bu nedenle reçete olamaz. Diğerleri daha az özgürlük izin ve protokol yakından takip eder, bu açık ayrıntılı iletişim kuralında aşağıdaki yapılır gerektirir.
Protokol biyofilm tabanlı çevresel izleme siteleri seçimi ile başlar. Böylece onun ölçümleri biyofilmler izlenen ortamda yaşayan farklı Kemotrofik organizmalar arasında ayrımcılık etkinleştirmek sonraki adım için akış sitometresi (FC) düzmece. Bu sitelerden farklı türler mevcut biyofilm ve akış sitometresi lazer ve optik ölçüm, uygun etkinleştirmek filtreleri ayarlama floresan özelliklerini tanımlayan biyofilm örnekleri toplayarak yapılır dalga boylarında. FC set-up edildikten sonra biyofilmler olabilir siteleri düzenli olarak, optik ve floresan özellikleri tek parçacık akışı-sitometresi tarafından ölçülen biyofilm ve görsel kümeleme tarafından analiz veri mevcut toplanan. Sonuçlar daha iyi yorumlayabilmek için FC başvuru veritabanı, yerel biyofilm-canlı türlerine ve onların fenotipleri ve farklı Taksonomiler FC veri tanımlamak için veritabanını kullanmak mümkündür. Doğrulama floresans tabanlı tek hücre FACS ve taksonomik tanımlaması mikroskobu tabanlı mevcut türler kullanarak tanımlanan kümelerini sıralama yoluyla mümkündür. İletişim kuralının bir şematik resim 1' de verilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ekosistem seçimi ve biyofilm örnekleme
- Faiz bir sucul ekosistem seçin ve biyofilmler yetiştiği örnekleme siteleri bulmak. Sığ bir dere ile parçaları orta su akışını yavaş ve taşlı streambed biyofilm eki için uygun17,18vardır.
- İsteğe bağlı: site biyofilm eki için veya bir site içinde biyofilmler değişkenliği azaltmak için yeterli yüzeyler varsa, yapay yüzeylerde biyofilm ek (Örneğin cam slaytlar, seramik) için site, o emin yaparken yeri Bunlar su akışı ile ilgili ve benzer derinlik ve ışık şiddeti19aynı yönde yerleştirilir.
- Örnekleme sitesinde, ışık yoğunluğunu ölçmek için taşınabilir aletleri kullanımı çevre koşulları belirlemek için su sıcaklığı, iletkenlik, oksijen ve pH hemen üzerinde yüzey biyofilm olduğunu örneklemeyi için. Örnekleme boyunca, tekrarlanan (3-5) ortalama değerleri hesaplamak için tedbirler.
- İsteğe bağlı: kimya parametreleri almak su örnekleri ilgili belirlemek için su (çözünmüş organik karbon (DOC), K+, Na+, Ca+ 2, Mg2 +, Cl-, F-, SO42 -, PO42 - , Hayır32 -, SiO44 -).
- Koruyucu eldiven kullanarak, benzer taşlar (boyut, şekil ve türü) her site (veya yapay yüzeylerde) toplamak. Taşlar benzer akış ve ışık koşullarında18maruz.
- Yeterli akış su sitesinden 0,22 mikron filtrelerden filtre uygulayarak tüm toplanan örnekleri (Örneğin, örnek başına 15 mL) için hazırdır.
- Yumuşak bir diş fırçası biyofilm--dan belgili tanımlık substrate (tüm biyofilm kaldırılana kadar fırça) bir şişesi süzülmüş akış su2015 mL ile kaldırmak için kullanın.
- Örnekleri %0.01 paraformaldehyde ve % 0.1 oxazolidin21' düzeltmek.
2. en iyi akış sitometrik (FC) parametreleri tespiti
- Subsamples ışık mikroskop için transfer (40 X / 0,75 kullanarak amaç; gerekli bir 100 × 1.3 petrol hedefi kullanırsanız) ve örnekleri22,23' mevcut türler tanımlamak.
- Tanımlanan sipariş tek tür uygun kültür koleksiyonlarından (Örneğin deneysel Phycology ve kültür koleksiyonu algler, Goettingen Üniversitesi [EPSAG] veya kültür koleksiyonu yosun Köln Üniversitesi [CCAC] adlı Eğer İzleme Merkezi Avrupa ekosistemleri gerçekleştirilir).
- Biyofilm örnekleri üzerinden alınan çevre için tek tür benzer çevre koşulları (Örneğin, ışık, sıcaklık, pH) içinde sürekli büyür. 1 ° C ve 0,5 içinde kalan çevre örnekleri noktasından pH tavsiye edilir.
- Hücreleri ayırma/dağıtmak için tek tür örnekleri 15 mL santrifüj tüpler içine koymak ve tüpler bir su banyosu ortasına koyup daldırın, böylece örnek sıvı yüzeyinin banyo yüzeyi olarak aynı düzeyde. Örnekleri 1 dk. 45 kHz24,25için solüsyon içeren temizleyicide.
- Bir plaka okuyucu kullanarak tek türün absorbans ve floresan spectra kaydedin. Lütfen yönergeleri için tercih edilen plaka okuyucu bakın. Bu örnekte, 96-şey düz dipli şeffaf polystyrol plakaları 200 µL numune hacmi ile doluydu ve absorbans ölçüldü. (Kullanılan ayarlar: (a) Floresan tarama modu; boyutu 10 nm, emisyon tarama sayısı 30, bant genişliği 20 nm, 100, kazanç emisyon dalga boyu adım 25 yanıp söner, 20 ABD entegrasyon zaman ya da (b) absorbans tarama modu; 25 yanıp söner, bant genişliği 9 nm).
- Akış Sitometresi kadar lazerler, dikroik kırma ve birlikte farklı türler belirli özelliklere sahip bu floresan aralıkların kapak filtreleri ayarlayın. Merkez Avrupa akışları, bir 405 nm, 488 nm ve 638 nm lazer yararlı sonuçlar üretmek.
- Photomultipliers (tüm akışı cytometers için geçerli değil) voltaj ayarı ve ölçülen fluorescences dizi örnekleri tüm olayların en az % 99 içerecek şekilde ayarlayın.
- Alternatif olarak, türler içinde biyofilmler mevcut bilgi varsa, adım 2.2 ile başlayın. Floresan özellikleri biliniyorsa, adım 2.6 ile başlayın.
3. isteğe bağlı: Bir akış sitometrik başvuru veritabanı hazırlanması
Not: FC taksonomik kimlik hücre içinde biyofilm mevcut izin vermez. Benzer koşullar biyofilmler olarak yetiştirilen biyofilmler bulunması için bilinen tek türün FC ölçü referans veritabanı verileri yorumu ile yardımcı olabilir.
-
Referans: tek tür
- En iyi duruma getirilmiş FC parametrelerini kullanarak, 2,5 – 7'ayarlayın (Sabit paraformaldehyde ve oxazolidin ve akış sitometresi için uygun büyüklükte filtrelerden filtre) tek tür optik ve floresan özelliklerini ölçmek.
- (Bkz. Adım 6.1.2) biyofilmler üzerinden veri olarak aynı şekilde tek tür verileri normalleştirmek.
-
Başvurma: zarar görmüş ve çürüyen hücrelere
Biyofilm sağlık en önemli göstergeleri biri hasarlı/ölen hücreleri biyofilm içinde mevcut bölümüdür. Bu hücreler ölçmek için bir başvuru hücre bozulması hazırlanabilir.- 1 mL subsamples, seyreltilmiş biyofilmler al ve onları 8.000 x g de oda sıcaklığında 10 dakika içinde bir masa üstü santrifüj için santrifüj kapasitesi. 1 mL % 90 etanol elde edilen Pelet askıya alma ve süspansiyon gecede 4 ° C'de depolayın Ertesi gün tekrarlayın.
- En iyi duruma getirilmiş FC ayarları kullanarak, zarar görmüş ve çürüyen bir hücre (sabit ve filtre) optik ve floresan özelliklerini ölçmek.
-
Referans: microplastics
Not: microplastic parçacıklar biyofilmler izleme ilgilenen varsa, onlar yeterince farklı olup olmadığını kontrol optik biyotik parçacıklar ve floresan özellikleri tanımlama.- Microplastic parçacıklar microplastics üreticinin talimatlarına göre askıya alma ve (2,7 FC parametreleri kullanarak) optik ve floresan özelliklerini ölçmek.
- Biyofilm örnek microplastic parçacıkları eklenir ve gece 4 ° C'de bırakılır
- Süspansiyon ve ölçü aynı FC parametreleri ile filtre.
4. örnek hazırlama ve depolama
- Bir kez FC kurulmuş olan ve FC başvuru veritabanı hazırdır, bir taze biyofilm örnekleri, adımları 1.1-7 göre toplanan değerlendirilmesi ile devam edebilirsiniz. Biyofilm ayırmak/dağıtmak için örnekleri 15 mL (bkz. Adım 1,7) şişeler santrifüj tüpler içine aktarın.
- Her tüp su banyosu ortasına koymak ve böylece örnek sıvı yüzeyinin banyo yüzeyi olarak aynı düzeyde daldırın. Örnekleri 1 dk. 45 kHz için solüsyon içeren temizleyicide.
- Örnekleri %0.01 paraformaldehyde ve % 0,1 oxazolidin (nanopure su stokta) düzeltin. Analiz için hazır kadar 4 ° C'de depolayın.
- Önemli: örnekleri yarısı Akış Sitometresi Analizi için kullanın ve muhafazası için güven ve floresan aktif hücre sıralama ve/veya ışık mikroskobu (bkz. Bölüm 6) ile isteğe bağlı doğrulama için ikiye tutun.
Not: buzdolabında saklanan, üç hafta kadar optik ve floresan özellikleri sabit biyofilm örnekleri tutmalı.
5. FC örneğini çalıştırmak
- Örnekleri buzdolabında saklanan vardı, onları hızlı bir şekilde solüsyon içeren temizleyicide veya birkaç kez parçacıklar ayırmak için pipet. Subsamples 50 mikron filtre (filtre boyutu FC kılcal damar genişliğine bağlıdır) ile ölçme önce filtre uygulayın.
- Bireysel örnekleri yük (1-2 mL, bu kullanılan akış sitometresi bağlıdır) akış sitometresi içine ve her bir parçacık optik ve floresan özelliklerini ölçmek. Ölçüm her biyolojik Çoğalt (üç teknik çoğaltır) başına üç kez tekrarlayın.
- Verileri FC .csv formatında verilecek.
6. veri hazırlama ve korelasyon analizi
FC her ölçülen optik özelliği ve floresan Spektrometre aralığı için çeşitli parametreleri (Örneğin, sinyal alanı, yükseklik, genişlik) analiz edebilirsiniz. Korelasyon analizi üzerinde ölçülen değişkenleri çalıştırın ve sadece değil son derece correlated bu ölçümler tutun. Bu genellikle her bir FC parametre (Örneğin, sinyal alan) kaldırır ve de kaldır yüksek korelasyon (genellikle aynı lazer dallanma ve filtreler komşu) Floresan ölçümleri.
-
Matlab Toolbox'dan olarak CYT çalıştırın:
- Tüm teknik ve biyolojik dahil olmak üzere CYT yazılım16, analiz edilecek olan tüm örneklerini .csv formatında veri alma azaltılmış FC çoğaltır. (Basılı tutup tıklatın + dosya *.csv filtre, dosyaları içe aktarma için seçin).
- Ark hiperbolik sinüsünü dönüştürme kullanarak tüm örnekleri floresan kanalları dönüşümü. Kofaktör değerini seçilmiş olması gerekir; En Kemotrofik biyofilmler ve akış cytometers ama en iyi duruma getirme için 150 çalışmalar özellikle deneysel kurulumları ve heterotrofiktir biyofilmler için gerekli olabilir. (Sağ-Right-Click/dönüştürme/girin kofaktör 150)
- Kalite kontrol için görsel olarak çubuk grafikler tek tek örnekler ve çoğaltma teknik ve biyolojik düzeyinde hiçbir aykırı olduğundan emin olmak için tek tek görme duyusuyla ilgili ve floresan kanalları (CYT) karşılaştırın. Aykırı önemli ölçüde değiştirdi floresan/optik dağılımları arasında çoğaltır tezahür edecektir. (Veri, kanal, arsa seçin)
- Alternatif: asıl bileşen analizi (PCA) Floresan dağıtımları medyan değerleri üzerinde çalıştırın ve teknik ve biyolojik çoğaltır birlikte küme emin olun.
- Birleştirme teknik her biyolojik REPLICATE çoğaltır ve biyolojik çoğaltır, her parçacıklar (hücreler, hücre parçası ve abiyotik parçacıklar) aynı sayıda tarafından temsil edilir ve parçacıklar toplam sayısı analiz subsample Barnes-Hut Stokastik komşu (bh-SNE) katıştırma yaklaşık 150.000 (için en iyi görsel sonuçları26) olduğunu. (Veri, sağ tıklama, birleştirme/Subsample seçin)
- Örnekler arasındaki karşılaştırma için sadece karşılaştırılacak olan örnekleri seçmek önemlidir. Örnekleri seçin ve bh-SNE27çalıştırın. Sonra algoritma bitmiş, yeni kanallar, adlandırılmış bh-SNE1 ve bh-SNE2 görünür. Bir dağılım çizim (viSNE harita) verileri görselleştirmek için kullanılan tüm analiz parçacıklar SNE koordinatlarını bunlar. (Verileri seçin, kanalları, sağ tıklama, bh-SNE seçin, Evet normalleştirilmiş veri)
- ViSNE eşleminde, parçacıklar benzerliklerine göre konumlandırılmış ve görsel olarak ayrılabilir kümeler halinde gruplandırılmış. Kümeleri ve mark ve adı optik/floresan özelliklerini de ayrılır ve CYT içinde çizim araçlarını kullanarak farklı optik/floresan özelliklere sahip kontrol edin. (Kanal bh-SNE1, bh-SNE2)
- İsteğe bağlı: tek mikrobiyal türün (aynı akış sitometresi ayarı ile ölçülen ve benzer koşullar altında yetiştirilen!) bir başvuru veritabanı varsa, viSNE haritalar Matlab verebilir ve haritalar başvuru veritabanı proje. Bu şekilde, belirli kümeler belirli türler/taksonomik grupların (komut dosyaları elde edilebilir için download vasıl https://github.com/anzezupanic/FC_analysis) bağlanabilir. (Oturum/Kaydet)
- Sorun giderme: bh-SNE analiz görsel olarak ayrılabilir kümeleri ama tek büyük bir döndürmezse, çok fazla parçacıklar bh-SNE içinde kullanılmıştır. Örnek başına daha az parçacıkları ile yeniden deneyin. Kümeleri, ama oldukça seyrek bireysel puan varsa, kullanılan parçacıkları sayısını artırmak.
- İsteğe bağlı: kümeleme için bh-SNE güvenmek yerine, diğer kümeleme Yöntemleri (Örneğin, hiyerarşik, centroid tabanlı veya kümeleme göre yoğunluğu) normalleştirilmiş veri kullanılabilen ve viSNE harita (https://github.com/ üzerinde üst üste anzezupanic/FC_analysis).
- Bir kez kümeleri tespit edilmiştir, parçacıklar biyolojik her çoğaltma her örnek ait her küme sayısını saymak. ANOVA ve Tukey'nın test uygun (Örneğinile Holmes) kullanarak örnekleri, arasındaki farklılıkları değerlendirmek düzeltme birden fazla karşılaştırma için.
7. isteğe bağlı: Doğrulama floresans aktif hücre sıralama kullanarak küme yorumlama
- Kümeleri tespit edilmiştir sonra floresans aktif hücre (FACS) sıralama FACS lazerler ve floresan filtreler aynı (veya benzer) yapılandırılmasını sahip olması koşuluyla istenirse, örnekleri dışarı sıralamak için kullanabilirsiniz.
- Tanımlanan her küme için küme tanımlamak optik ve floresan kapıları CYT sağlar. Bu kapılardan FACS ile her küme parçacıkları çözmek ve daha sonra ışık mikroskobu kullanılarak sıralanmış hücrelerini tanımlamak için kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada sunulan (Şekil 1) yordamını kullanarak yerel bir Stream İsviçre çeşitli sitelerden alınan örnekleri analiz edildi. Her sitede üç benzer büyüklükteki taşlar (10-12 cm) alınmış ve biyofilmler pulunu fırça. Örnekler vardı o zaman sonicated, sabit, filtre ve daha sonra akış sitometresi tarafından analiz. Akış Sitometresi ve kullanılan referans veritabanı kurulumu aynı bir önceki kağıt15' te açıklandığı gibi vardı: üç lazerler kullanılmıştır (405, 488 ve 638 nm), yedi dikroik ayırıcılar ve floresan emisyonları için 425 kaplı on Filtreler > 755 nm ve dahil olmak üzere başvuru veritabanı > 30 tür Siyanobakteriler, yeşil algler, Diyatomlarla ve biyofilmler içinde İsviçre akışında bulunan kırmızı algler kapsayan. Parçacıklar viSNE haritaların oluşturulması için kullanılan toplam sayısı yaklaşık 150.000 (Şekil 2A) yapıldı. Açıklanan yaklaşım kullanarak, farklı siteler arasında (Şekil 2B) ayırt etmek, subpopulation kaba taksonomik bilgisi (Şekil 3) içeren hücrelerin viSNE eşlemesinde farklı bölümlerini kategorilere ayırmak ve hangi kurmak mümkündür altgrupları örnekleri (Şekil 4) arasında farklıydı.
Benzer bir yaklaşım microplastic parçacıklar bir biyofilm ölçmek için kullanıldı. Saf temiz su biyofilmler (ca. 10 µm), bulunan hücrelere benzer boyutta parçacıkların microplastic örnekleri microplastic parçacıklar (Tlili ve ark. içinde açıklanan biyofilm büyüme protokolleri kullanarak olup laboratuvarda yetiştirilen biyofilmler örnekleri 20115) ölçüldü ve (Şekil 5) karşılaştırıldığında. Bu microplastic parçacıklar bilinen optik ve floresan özellikleri ile sağlam 1000 ppm üzerinde konsantrasyonlarda algılanabilir belirlendi.
Şekil 1: Deneysel protokol eması. Çevre biyofilmler örnekleri topluluğu takip türler içinde biyofilm mevcut tanımlaması, bunlar ölçmek için tayini optik ve floresan özellikleri ve uygun lazerler ve filtreler ile akış sitometresi montaj tarafından özellikleri. Akış sitometrik ölçüleri, örnekleri sonicated, düzeltmek ve depolanan. Yeterli örnekleri nerede ölçülen her hücre için akış sitometresi tarafından ölçülür toplanmıştır, optik sayıda ve floresan özellikleri elde edilen ve görsel kümeleme kullanılarak analiz. İsteğe bağlı olarak (noktalı oklar), izlenen biyofilmler mevcut türlerin bir FC veritabanı oluşturmak ve sonuçların yorumlanması için veritabanını kullanmak mümkündür. Daha fazla doğrulama yöntemleri, Örneğin hücre floresans tabanlı sıralama ve ışık mikroskobu taksonomik analizi kullanmak mümkündür Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: çevre biyofilmler viSNE haritalar kullanarak karşılaştırma. (A) çok fazla hücrelerden (300.000) elde edilen viSNE haritalar var tek bir büyük küme (üst), çok az (10.000) hücre kümeleri tüm (altta), hücre (ca. 150.000) formu açıkça görsel olarak ayrılabilir kümeleri (orta) sayısı oluşturmaz. (B) için altı farklı örnekleri ait viSNE haritanın alt kümelerine farklı yoğunlukları farklı kısmını viSNE harita özelliği. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: biyofilmler parçacıklar altgrupları ve kümeleme. (A) viSNE harita farklı bölümlerini moleküller tarafından farklı optik doldurulur ve parçacıklar biyotik/abiyotik kökenli ve taksonomik hangi biyotik parçacıklar (hücreler) gruplandırmak için ipuçları vermek floresans özellikleri ait (boyları için yukarıdan aşağıya doğru: 525 nm, 695 nm, 660 nm). Her dalga boyu için en yüksek ölçülen Floresan (kırmızı) en düşük ölçülen (mavi) renk ölçeği normalleştirilmiş. (B) projeksiyon viSNE haritanın üzerine başvuru veritabanı (kırmızı nokta) harita hangi bölümlerinin hangi özellikleri ve/veya abiyotik parçacıklar tarafından doldurulur yorumlamaya yardımcı: hücreleri (üst), Diyatomlarla (orta), siyanobakteriler (alt) bozulması. (C) tabanlı bilgileri (A) ve (B) ve viSNE harita görsel olarak ayrılabilir kümeleri, bu mümkündür viSNE harita farklı bölümlerini farklı kümeleri (SP1-11) atamak ve kümeleri buna göre kategorize. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: istatistiksel analiz biyofilm örnekleri. (A) miktar için farklı biyolojik çoğaltır ait her subpopulation parçacıkların sayılması tarafından gerçekleştirilir. A-F altı farklı yerlerde hangi biyofilm örnekleri alınmıştır yerel bir dere boyunca temsil eder. (B) ANOVA ile birden fazla karşılaştırma düzeltme uygun örnek arasında istatistiksel fark değerlendirmek için kullanılabilir (p < 0,05, ikili Tukey HSD tüm siteleri vs sitesi A). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: microplastic parçacıklar viSNE ile izleme. (A) Microplastic parçacıklar, (B) tatlı su biyofilmler, (C) tatlı su biyofilm microplastic parçacıklar, (D) floresan 695 FC tarafından ölçülen parçacıkların karışık nm. Renk ölçeği için en düşük ölçülen Floresan (mavi) 695, en yüksek ölçülen Floresan (kırmızı) normalleştirilmiş nm. Microplastic parçacıklar ve biyofilm parçacıklar arasındaki oran yaklaşık 1: 1'dir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Yukarıda açıklanan iletişim kuralı uygulamak oldukça kolaydır. Sunulan varsayılan ayarları tüm Kemotrofik biyofilm şimdiye kadar test için uygun olduğu gösterilmiştir, ancak, (iletişim kuralında tanımlandığı gibi) en iyi duruma getirme yönteminden elde ettiği bilgileri en üst düzeye çıkarmak için gerekli iken. Nitekim, biyofilmler optik ve floresan özelliklerini, çevre koşulları (sezon, sıcaklık, su kimyasal bileşimi)1bağlı olarak değişebilir. Bu nedenle, FC analizleri ayarlarken bu değişkenliği dikkate almak önemlidir. Temsilcisi biyofilmler örneklerini örnekleme sitelerden alarak ve/veya tek tür alarak ve onları farklı koşullar ve ölçü birimi içinde büyüyen yapmanın bir yolu bu onlara farklı kurulumları kullanarak. Tek tür büyüyen de FC sonuçları yorumlamak için kullanılan floresan özelliklerinin bir veritabanı oluşturmak yararlıdır. Ancak, bunu yapmak için bu tek tür o altında biyofilmler örnek olacak benzer koşullarda ölçülen var önemlidir. Örneğin, bir veritabanı 25 ° C'de büyüyen tek türün FC ölçümlerin 15 ° C'de büyüyen bir biyofilm bileşimi hakkında çok az şey söyleyecektir Ancak, bu yöntem etkili biçimde kullanmak için bir başvuru veritabanı oluşturmak kesinlikle gerekli değil. Zaten temel FC protokolünü kullanarak ile biyofilm içinde mevcut hücrelerdeki boyutu, parçalı yapı ve farklı pigment varlığı hakkında bilgi almak mümkün. Görsel kümeleme ölçülen özellikleri ve bunların en iyi örnekleri arasında özellik değişti kararlılık benzer kümeler halinde hücre sınıflandırma sağlar. Referans veritabanı ancak, taksonomik kimlikleri farklı kümelere atarken önemli hale gelir. Kez biyofilm yapılan değişikliği algılandı, onları örnekleme sitelerdeki suyun fiziksel ve kimyasal ölçümleri ile ilişkilendirmek mümkündür. Bu hangi çevre faktörü izlenen ekosistem içinde biyofilm toplum üzerinde güçlü etkiye sahip belirleme sağlar.
Ayrıca yöntemine bazı sınırlamalar vardır. Örneğin, FC biyofilm kompozisyon türleri düzeyinde tanımlaması izin vermez. Ayrıca, ne zaman biyofilm yapılan değişikliği tespit edilir, FC sorumlu nedenleri atfetmek değil: karşı daha hoşgörülü türler veya daha hoşgörülü fenotipleri (aynı kalan tür) doğru bir kayma. Metagenomics gibi diğer, tamamlayıcı Yöntemler bu soruyu çözmek için ihtiyaç vardır. Başka bir yöntem yalnızca biyofilmler, pigmentler ile farklı floresan özellikleri ile zengin Kemotrofik bileşen analiz edilir kısıtlamasıdır. O heterotrofiktir biyofilm karakterizasyonu için yöntem kullanmak kesinlikle mümkün olmakla birlikte, yeterli bilgi leke ücretsiz analizi ile elde edilebilir olup olmadığı belli değil mi. Düşük doğal floresans bakteri ve mantar nedeniyle farklı ayarlar kullanılması gerekir ve bu nedenle birlikte tek bir FC çalıştırmak biyofilm Kemotrofik ve heterotrofiktir bileşenleri değerlendirmek mümkün değildir. Bunun yerine, örnek ayıran ve Kemotrofik ile bir bölümü ve heterotrofiktir ayarı ile bir kısım değerlendirerek gerekli olacaktır. Son olarak, viSNE biyofilm görselleştirme için kullanarak bir kısıtlamadır. En iyi sonuçlar birlikte görüntüsü ca. 150.000 hücreleri ile elde edilir. Bu analiz ve hesaplama açısından çok fazla örnekleri sulandrarak olmadan yöntemi ile karşılaştırıldığında örnekleri sayısı için bir sınır ayarlar. Bir 150 örnekleri karşılaştırmak isterseniz, örneğin, o zaman her örnek yalnızca ca. 1.000 hücreleri tarafından gösterilir. Bu sınırlama bir yol hangi örneklerinin gruplar örtüşen ayrı ayrı viSNE ve sonra sonuçları kullanılarak analiz edilebilir "pencere taşıma" bir yaklaşım kullanarak örnekleri analiz etmek için birlikte, böyle bir çözüm, ancak havuza alınmış, değil henüz uygulamaya konmuştur.
Biyofilmler akış sitometresi göre değerlendirilmesi verimli sucul ekosistemler izleme için uygulanabilir olduğunu düşünüyoruz. Zaman serileri örnekleri ya da farklı yerlerde alınan örnekler karşılaştırmak için kullanılabilir ve örnekleme dışında kendi, tam otomasyon için potansiyel vardır. Aşağı için bilgiler bir ilk biyofilm değerlendirme adım araştırmalar ile tamamlayıcı ve daha ayrıntılı yöntemleri ayrıntılı olarak yöntemi kabul edilebilir. Biz microplastic durum için gösterdiği gibi sonunda, o biyofilmler, abiyotik kirlenme tespiti gibi daha özel uygulamalar için uzatılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Sunulan iş SNF Ambizione Bursu (PZ00P2_142533) ve bir Velux Araştırma Bursu (Amplebig) tarafından desteklenmiştir. Bettina Wagner deneysel çalışma ile yardım için teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Multimeter | WTW | MultiLine 3620 IDS | For measuring temperature, pH, dissolved oxygen |
| Ultrasonic cleaner | VWR International | 97043-986 | Tank dimesions: 15*14*10 cm |
| Flow cytometer | Beckman Coulter | Gallios | Lasers: 405, 488 and 638 nm. Filters bands in Supplementary Table 11. Sgier et, Nat Comm, 2016. |
| Plate reader | Tecan | Infinite M200 | used for selecting appropriate setting of the FC |
| Cell sorter | Beckman Coulter | MoFlo Astrios | Settings in Supplementary Table 12. Sgier et, Nat Comm, 2016. |
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axiovert 135 | Zeiss EC Plan-Neofluar 40x/0.75 objective |
| SOFTWARE | |||
| Matlab | MathWorks | R2013a | software for numerical computing |
| CYT | Dana Pe'er Lab | Version 1.1 | free interactive visualization tool for analysis of cytometry data |
References
- Battin, T. J., Besemer, K., Bengtsson, M. M., Romani, A. M., Packmann, A. I. The ecology and biogeochemistry of stream biofilms. Nat Rev Microbiol. 14 (4), 251-263 (2016).
- Rotter, S., Heilmeier, H., Altenburger, R., Schmitt-Jansen, M. Multiple stressors in periphyton - comparison of observed and predicted tolerance responses to high ionic loads and herbicide exposure. J Appl Ecol. 50 (6), 1459-1468 (2013).
- Tlili, A., et al. Pollution-induced community tolerance (PICT): towards an ecologically relevant risk assessment of chemicals in aquatic systems. Freshw Biol. 61 (12), 2141-2151 (2016).
- Lavoie, I., Lavoie, M., Fortin, C. A mine of information: Benthic algal communities as biomonitors of metal contamination from abandoned tailings. Science of the Total Environment. 425, 231-241 (2012).
- Tlili, A., Montuelle, B., Berard, A., Bouchez, A. Impact of chronic and acute pesticide exposures on periphyton communities. Sci Total Environ. 409 (11), 2102-2113 (2011).
- Dorigo, U., et al. Lotic biofilm community structure and pesticide tolerance along a contamination gradient in a vineyard area. Aquat Microb Ecol. 50 (1), 91-102 (2007).
- Pesce, S., et al. Evaluation of single and joint toxic effects of diuron and its main metabolites on natural phototrophic biofilms using a pollution-induced community tolerance (PICT) approach. Aquat Toxicol. 99 (4), 492-499 (2010).
- Ricart, M., et al. Effects of low concentrations of the phenylurea herbicide diuron on biofilm algae and bacteria. Chemosphere. 76 (10), 1392-1401 (2009).
- Martinez, A., Kominoski, J. S., Larranaga, A. Leaf-litter leachate concentration promotes heterotrophy in freshwater biofilms: Understanding consequences of water scarcity. Sci Total Environ. , 1677-1684 (2017).
- Corcoll, N., et al. Comparison of four DNA extraction methods for comprehensive assessment of 16S rRNA bacterial diversity in marine biofilms using high-throughput sequencing. Fems Microbiol Lett. 364 (14), (2017).
- Welsh, A. K., McLean, R. J. Characterization of bacteria in mixed biofilm communities using denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE). Curr Protoc Microbiol. , Chapter 1, Unit 1E 1 (2007).
- Ranjard, L., et al. Characterization of bacterial and fungal soil communities by automated ribosomal intergenic spacer analysis fingerprints: Biological and methodological variability. Appl Environm Microbiol. 67 (10), 4479-4487 (2001).
- Stewart, T. J., Traber, J., Kroll, A., Behra, R., Sigg, L. Characterization of extracellular polymeric substances (EPS) from periphyton using liquid chromatography-organic carbon detection-organic nitrogen detection (LC-OCD-OND). Environ Sci Pollut R. 20 (5), 3214-3223 (2013).
- Kroll, A., et al. Mixed messages from benthic microbial communities exposed to nanoparticulate and ionic silver: 3D structure picks up nano-specific effects, while EPS and traditional endpoints indicate a concentration-dependent impact of silver ions. Environ Sci Pollut R. 23 (5), 4218-4234 (2016).
- Sgier, L., Freimann, R., Zupanic, A., Kroll, A. Flow cytometry combined with viSNE for the analysis of microbial biofilms and detection of microplastics. Nat Commun. 7, 11587 (2016).
- Amir el, A. D., et al. viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia. Nat Biotechnol. 31 (6), 545-552 (2013).
- Mora-Gomez, J., Freixa, A., Perujo, N., Barral-Fraga, L. Limits of the biofilm concept and types of aquatic biofilms. Aquatic Biofilms: Ecology, Water Quality and Wastewater Treatment. , 3-27 (2016).
- Matthaei, C. D., Guggelberger, C., Huber, H. Local disturbance history affects patchiness of benthic river algae. Freshw Biol. 48 (9), 1514-1526 (2003).
- Tlili, A., Hollender, J., Kienle, C., Behra, R. Micropollutant-induced tolerance of in situ periphyton: Establishing causality in wastewater-impacted streams. Water Res. 111, 185-194 (2017).
- Robinson, C. T., Rushforth, S. R. Effects of physical disturbance and canopy cover on attached diatom community structure in an idaho stream. Hydrobiologia. 154, 49-59 (1987).
- Pomati, F., Nizzetto, L. Assessing triclosan-induced ecological and trans-generational effects in natural phytoplankton communities: A trait-based field method. Ecotoxicology. 22 (5), 779-794 (2013).
- Hulliger, J. Methoden zur Untersuchung und Beurteilung der Fliessgewässer. , Vol. Umwelt-Vollzug Nr. 0740, Bundesamt für Umwelt, Bern (2007).
- Tlili, A., et al. In situ spatio-temporal changes in pollution-induced community tolerance to zinc in autotrophic and heterotrophic biofilm communities. Ecotoxicology. 20 (8), 1823-1839 (2011).
- Foladori, P., Laura, B., Gianni, A., Giuliano, Z. Effects of sonication on bacteria viability in wastewater treatment plants evaluated by flow cytometry - Fecal indicators, wastewater and activated sludge. Water Res. 41 (1), 235-243 (2007).
- Buesing, N., Gessner, M. O. Comparison of detachment procedures for direct counts of bacteria associated with sediment particles, plant litter and epiphytic biofilms. Aquat Microb Ecol. 27 (1), 29-36 (2002).
- van der Maaten, L., Hinton, G. Visualizing Data using t-SNE. J Mach Learn Res. 9, 2579-2605 (2008).
- van der Maaten, L. Accelerating t-SNE using Tree-Based Algorithms. J Mach Learn Res. 15, 3221-3245 (2014).
