Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

بروتوكول لخلق الجروح المزمنة في الفئران السكري

Published: September 25, 2019 doi: 10.3791/57656
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular, Cell and Systems Biology, University of California, Riverside

Summary

يتم تطوير الجروح المزمنة من الجروح الحادة على نموذج الماوس السكري عن طريق تحفيز مستويات عالية من الإجهاد التأكسدي بعد جرح جلدي كامل السماكة. يتم علاج الجرح مع مثبطات للكاتالاز والجلوتاثيون بيروكسيداز، مما أدى إلى ضعف الشفاء وتطوير biofilm من قبل البكتيريا الموجودة في ميكروبيوم الجلد.

Abstract

تتطور الجروح المزمنة نتيجة للتنظيم المعيب في واحدة أو أكثر من العمليات الخلوية والجزيئية المعقدة التي تنطوي على الشفاء السليم. أنها تؤثر على ~ 6.5M الناس وتكلفة ~ $40B / سنة في الولايات المتحدة وحدها. على الرغم من أنه تم بذل جهد كبير في فهم كيفية تطور الجروح المزمنة في البشر، لا تزال الأسئلة الأساسية دون إجابة. في الآونة الأخيرة، قمنا بتطوير نموذج فأر جديد للجروح المزمنة السكرية التي لها العديد من خصائص الجروح المزمنة البشرية. باستخدام db/db-/- الفئران، يمكننا توليد الجروح المزمنة عن طريق تحفيز مستويات عالية من الإجهاد التأكسدي (OS) في أنسجة الجرح مباشرة بعد الإصابة، وذلك باستخدام علاج لمرة واحدة مع مثبطات محددة للإنزيمات المضادة للأكسدة catalase وcatalase الجلوتاثيون بيروكسيداز. هذه الجروح لديها مستويات عالية من نظام التشغيل، وتطوير biofilm بشكل طبيعي، وتصبح مزمنة تماما في غضون 20 يوما بعد العلاج، ويمكن أن تبقى مفتوحة أكثر لأكثر من 60 يوما. هذا النموذج الجديد لديه العديد من الميزات من الجروح المزمنة السكري في البشر، وبالتالي يمكن أن تسهم بشكل كبير في تعزيز الفهم الأساسي لكيفية الجروح تصبح مزمنة. وهذا إنجاز كبير لأن الجروح المزمنة في البشر تسبب آلاما وكربا كبيرة للمرضى وتؤدي إلى بتر الأطراف إذا لم تحل. وعلاوة على ذلك، فإن هذه الجروح مكلفة للغاية وتستغرق وقتا طويلا لعلاجها، وتؤدي إلى خسارة كبيرة في الدخل الشخصي للمرضى. التقدم في هذا المجال من الدراسة من خلال استخدام نموذج الجرح المزمن لدينا يمكن أن تحسن بشكل كبير الرعاية الصحية للملايين الذين يعانون في ظل هذه الحالة المنهكة. وفي هذا البروتوكول، نوصف بتفصيل كبير الإجراء الذي يسبب الجروح الحادة لتصبح مزمنة، وهو ما لم يحدث من قبل.

Introduction

يتضمن التئام الجروح العمليات الخلوية والجزيئية المعقدة التي يتم تنظيمها زمنياً ومكانياً، وتنظم في مراحل متتابعة ومتداخلة تشمل العديد من أنواع الخلايا المختلفة بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر الاستجابة المناعية والأوعية الدموية النظام1. مباشرة بعد الجلد يعاني من إصابة، والعوامل وخلايا الدم تتجمع إلى موقع الجرح والشروع في تتالي تخثر لتشكيل جلطة. بعد تحقيق التوازن، تمدد الأوعية الدموية للسماح للأكسجين في موقع الجرح، والمواد الغذائية، والأنزيمات، والأجسام المضادة والعوامل الكيميائية التي تجذب الخلايا المتعددة الأشكال إلى إزالة الجرح من الحطام الأجنبي وإفراز الإنزيمات البروتيوليتيك 2.تفرز الصفائح الدموية المنشطة مجموعة متنوعة من عوامل النمو لتحفيز الخلايا الكيراتينية على حافة الجرح لإعادة epitheliliize المنطقة المصابة. الخلايا الأحادية التي تم تجنيدها إلى موقع الجرح تميز في الضامة التي البكتيريا phagocytose والعدلات الميتة وتفرز عوامل إضافية للحفاظ على إشارات الكيراتينية التكاثرية والمؤيدة للهجرة. في مرحلة الانتشار ، في حين تستمر إعادة الظهارة ، تستمر أنسجة التحبيب الجديدة المكونة من الخلايا الليفية ، والخلايا الأحادية /الضامة ، والخلايا الليمفاوية ، والخلايا البطانية في عملية إعادة البناء2. يتم تحفيز تكوين الأوعية الدموية من خلال تعزيز انتشار الخلايا البطانية والهجرة، مما يؤدي إلى تطوير سفينة جديدة. Epithelialization وإعادة تشكيل المصفوفة خارج الخلية بناء حاجز ضد البيئة. كما يشفي الجرح وتحبيب الأنسجة يتطور إلى ندبة، والمبرمج يزيل الخلايا الالتهابية، والخلايا الليفية، والخلايا البطانية دون التسبب في تلف الأنسجة إضافية. يتم تعزيز قوة الشد من الأنسجة عن طريق الخلايا الليفية إعادة عرض مكونات مختلفة من المصفوفة خارج الخلية، مثل الكولاجين، بحيث الأنسجة شكلت حديثا هو تقريبا قوية ومرنة مثل الجلد غير المصاب2.

أي انحراف عن هذا التقدم المتضافر للغاية نحو إغلاق الجرح يؤدي إلى ضعف و / أو الجروح المزمنة3. وتتميز الجروح المزمنة بزيادة الإجهاد التأكسدي، والتهاب مزمن، وmicrovasculature التالفة، ومصفوفة الكولاجين غير طبيعية في الجرح4. الإجهاد التأكسدي، وخاصة في الجرح، يمكن أن يؤخر إغلاق الجرح2،5. عندما، في المرحلة الأولى من التئام الجروح، تصبح المرحلة الالتهابية غير منظمة، والأنسجة المضيفة يفترض ضررا كبيرا بسبب التدفق المستمر للخلايا الالتهابية5 التي تطلق الإنزيمات السامة للخلايا، وزيادة في الجذور الأكسجين الحرة، و الوسطاء الالتهابية غير المنظمة، مما أدى إلى وفاة الخلية6،7.

في هذه البيئة الدقيقة المدمرة، البكتيريا التي تشكل biofilm الاستفادة من المواد الغذائية المضيفة والمساهمة في تلف الأنسجة المضيفة2. هذه biofilms من الصعب السيطرة عليها وإزالتها لأن المواد البوليمرية خارج الخلية رطبة تتكون من البروتينات، الحمض النووي، RNA، والسكريات يسمح البكتيريا التي تأوي داخل لتكون متسامحة مع العلاجات المضادات الحيوية التقليدية والتهرب من استجابة المناعة الفطريةوالتكيفية 2،8،9.

دراسة الجروح المزمنة أمر بالغ الأهمية لأنها تؤثر على ~ 6.5 مليون شخص وتكلف ~ 40 مليار دولار سنويا في الولايات المتحدة وحدها10. المرضى الذين يعانون من مرض السكري قد زادت من مخاطر الإصابة بالجروح المزمنة التي تتطلب بتر الأطراف من أجل احتواء انتشار العدوى. هؤلاء المرضى لديهم خطر الوفاة 50٪ في غضون 5 سنوات من البتر الذي يعزى إلى آلية الفيزيولوجيا المرضية لمرض السكري11. العلاقة بين الجهاز المناعي للمضيف والميكروبيوم في التئام الجروح هو موضوع حيوي من البحوث الجارية لأن عواقب الجروح المزمنة، إذا لم يتم حلها، وتشمل بتر والوفاة12.

على الرغم من أنه تم بذل جهد كبير في فهم كيفية تطور الجروح المزمنة في البشر، فإنه لا يزال من غير الواضح كيف ولماذا تشكل الجروح المزمنة. من الصعب إجراء تجارب لدراسة آليات ضعف الشفاء في البشر، ولا يرى أخصائيو التئام الجروح سوى المرضى الذين يعانون من الجروح المزمنة التي وصلت بالفعل إلى المزمنة لأسابيع إلى أشهر. وهكذا، فإن المتخصصين غير قادرين على دراسة ما هي العمليات التي ذهبت خطأ التي تؤدي إلى تطور الجرح لتصبح مزمنة2. هناك نقص في النماذج الحيوانية التي تلخص تعقيد الجروح البشرية المزمنة. وحتى تم تطوير نموذجنا، لم يكن هناك نموذج لدراسات الجروح المزمنة.

تم تطوير نموذج الجرح المزمن في الفئران التي لديها طفرة في مستقبلات اللبتين(db/db-/-)13. هذه الفئران هي السمنة والسكري، وتعاني من ضعف الشفاء ولكن لا تتطور الجروح المزمنة14. متوسط مستويات الجلوكوز في الدم حول 200 ملغ / دل, ولكن يمكن أن تكون عالية مثل 400 ملغ / دل15. عندما يتم حث مستويات عالية من الإجهاد التأكسدي (OS) في أنسجة الجرح مباشرة بعد الجرح ، يصبح الجرحمزمنا 16. وتعتبر الجروح المزمنة لمدة 20 يوما ً وتبقى مفتوحة لمدة 60 يوماً أو أكثر. ويمكن رؤية Biofilm التي تنتجها البكتيريا النامية بداية ثلاثة أيام بعد الجرح. يمكن رؤية فيلم حيوي ناضج بعد 20 يوما من الإصابة ويستمر حتى إغلاق أي من الجرح. البكتيريا التي تشكل biofilm نجد في هذه الفئران وجدت أيضا في الجروح المزمنة السكري الإنسان.

يتم تحفيز الإجهاد التأكسدي عن طريق علاج الجروح مع اثنين من مثبطات الإنزيمات المضادة للأكسدة، كاتالاز والجلوتاثيون بيروكسيداز، وهما إنزيمان مع القدرة على كسر بيروكسيد الهيدروجين. بيروكسيد الهيدروجين هو نوع من الأكسجين التفاعلي ويمكن أن يسبب تلف الخلايا من خلال أكسدة البروتينات والدهون والحمض النووي. كاتالاز يحفز تحلل بيروكسيد الهيدروجين إلى مواد كيميائية أقل ضررا الأكسجين والماء. 3-أمينو-1,2,4-تريازول (ATZ) يمنع الكاتالاز عن طريق ربط على وجه التحديد وبشكل مشترك إلى المركز النشط للإنزيم، وتعطيله17،18،19. وقد استخدمت ATZ لدراسة آثار الإجهاد التأكسدي على حد سواء في المختبر وفي الجسم الحي من خلال تثبيط catalase20،21،22،23،24. الجلوتاثيون بيروكسيداز يحفز الحد من بيروكسيد الهيدروجين من خلال مضادات الأكسدة، الجلوتاثيون، وهو إنزيم مهم يحمي الخلية من الإجهاد التأكسدي25. حمض ميركابتوسوتشيك (MSA) يمنع الجلوتاثيون بيروكسيداز عن طريق ربط الموقع النشط سيلينوسيستين للإنزيم مع ثيول، وتعطيل ه26. وقد استخدمت MSA لدراسة آثار الإجهاد التأكسدي في المختبر وفي الجسم الحي وكذلك20،27،28.

هذا النموذج الجديد من الجروح المزمنة هو نموذج قوي للدراسة لأنه يشارك العديد من نفس الميزات التي لوحظت في الجروح المزمنة السكري البشري، بما في ذلك التهاب لفترات طويلة من زيادة نظام التشغيل وتشكيل biofilm الطبيعية من ميكروبيوم الجلد. وقد ضعفت الجروح التفاعل الجلدي والبشرة، وترسب المصفوفة غير الطبيعية، وضعف تكوين الأوعية الدموية والأوعية الدموية التالفة. سوف تتطور الجروح المزمنة في كل من الفئران الذكور والإناث، بحيث يمكن استخدام كلا الجنسين لدراسة الجروح المزمنة. ولذلك، فإن نموذج الجرح المزمن يمكن أن يسهم بشكل كبير في تعزيز الفهم الأساسي لكيفية بدء هذه الجروح. استخدام هذا النموذج الجروح المزمنة يمكن أن توفر إجابات على الأسئلة الأساسية حول كيفية بدء المزمنة / تحقيقها من خلال مساهمات من علم وظائف الأعضاء من ضعف التئام الجروح والميكروبيوم من المضيف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وقد أُنجزت جميع التجارب وفقاً للأنظمة الاتحادية، وقد وافقت جامعة كاليفورنيا، ريفرسايد IACUC على سياسة وإجراءات جامعة كاليفورنيا.

1. الحيوان

  1. استخدام مرض السكري والسمنة B6. BKS (D) -Leprdb/ J الفئران لنموذج الجرح المزمن. وتشمل خيارات الشراء إما heterozygotes لتربية أو homozygotes مباشرة للتجارب.
  2. تولد الذكور والإناث heterozygote لإنتاج الذرية. فقط ربع القمامة، إحصائيا، سوف تنمو لتصبح السكري والسمنة(db / db-/-).
  3. الواء ومنزل db /db-/- الفئران جنبا إلى جنب مع القمامة 3 أسابيع بعد الولادة. منفصلة db / db-/- الفئران من القمامة 5 أسابيع بعد الولادة والمنزل مع أخرى db / db-/- الفئران حتى تكون 5-6 أشهر من العمر، ويمكن استخدامها لنموذج الجرح المزمن. خلال هذا الوقت ، يمكن أن يتطور ميكروبيوم الجلد ناضجة ومعقدة.
    ملاحظة: يتم التعرف بسهولة على الفئران db/db-/- بصرياً من زملاء القمامة بين 3-5 أسابيع من العمر. ال[دب/دب]--فأرات بدينة, [سبّي], وسوف يكون بشكل ملحوظ كبيرة ومستديرة من النوع وحشيّة و [متّروزغوس] [متّرس]. قد تظهر بطنهم وردي قليلا والوركين أكبر. يجب تأكيد زيادة الوزن قبل الجراحة. أيضا، فمن الممكن لقياس مستويات عالية من الجلوكوز في الدم والنمط الجيني الماوس لتأكيد الطفرة في مستقبلات اللبتين.

2. فيفيريوم وتربية

  1. منزل db/db-/- الفئران في vivarium التقليدية (وليس حاجز / مرفق محدد خالية من مسببات الأمراض) بحيث يمكن إنشاء البكتيريا على الجلد من db / db-/- الفئران. لنمذجة البشر الذين يعانون من الجروح المزمنة على وجه التحديد، لا تتخذ احتياطات خاصة لمنع التعرض للأمراض.
  2. حماية الأقفاص مع قمم العزل الصغيرة للحد من انتشار العدوى داخل vivarium. تغيير أقفاص مرتين في الأسبوع مع الفراش الجديد وإطعام الفئران مع تشاو vivarium العادية. لا الأوتوكلاف إما الفراش أو الطعام.
  3. تعيين درجة حرارة الغرفة تتراوح بين 21 و 24 درجة مئوية، مع تقلبات طفيفة اعتمادا على الوقت من السنة. الرطوبة، التي تعكس المناخ والموقع، وسوف تتراوح بين 19 و 70٪.

3- متطلبات تطور الجروح المزمنة

  1. استخدام الفئران الذكور والإناث فقط التي هي السمنة الظاهرة، والسكري، وعلى الأقل 5-6 أشهر من العمر لتطوير الجروح المزمنة. يجب أن يتراوح وزن هذه الفئران بين 40-80 غرام، بمتوسط حوالي 60 غرام.
  2. لا تستخدم الفئران التي تعتبر بدينة ولكن تزن أقل من 50 غرام.
    ملاحظة: كافة الفئران المشار إليها في هذا البروتوكول تمرير المؤهلات الموضحة هنا ما لم يذكر خلاف ذلك.

4. الحلاقة وتطبيق غسول مزيل الشعر

ملاحظة: إزالة الشعر غير المرغوب فيه على dorsum الماوس قبل الجرح. يتم إجراء الإجراء التالي على الفئران الحية db/db-/- التي ليست تحت التخدير في اليوم السابق للجراحة. اتخاذ الاحتياطات اللازمة لمنع الإجهاد والضرر للحيواني.

  1. الحلاقه
    1. وضع الماوس على سطح نظيف وقبضة قاعدة ذيل الماوس مع الإبهام والإصبع الثاني لتأمين موقف الماوس. قد الماوس القفز أو جعل الحركات المفاجئة. إذا كان ذلك، والاستجابة بسرعة وسحب كليبرز لمنع الإصابة.
    2. حلاقة شعر الماوس مع المقص الشعر(أرقام 1A، 1B). وضع شفرة موازية لجلد الماوس وحلق كامل الظهر من الرقبة إلى الذيل، بما في ذلك في جميع أنحاء الذيل، للسماح لمساحة سطح ية كبيرة بما فيه الكفاية لوضع شريط فيديو شفاف (انظر جدول المواد). تشغيل طفيفة شفرة ضد اتجاه نمو الشعر لقطع الأكثر كفاءة. (الشكل1باء).
      1. لا تضغط على النصل بعمق في الجلد، لأنه قد يضر الجلد عن طريق كدمات أو قطع.
  2. تطبيق غسول مزيل الشعر
    ملاحظة: استخدم غسول مزيل الشعر للحصول على بشرة ناعمة جداً بحيث يمكن لخلع الملابس الشفافة الالتزام بقوة.
    1. نقع الجلد من الماوس بالماء لمنع الحروق الكيميائية عن طريق الضغط بخفة على ورقة منقوع مسح ضد الجلد حلق مع ما يكفي من الضغط لترطيب الشعر قص بالفعل أسفل ضد الجلد.
    2. في حين أن الجلد الرطب، فرك طفيفة جلد الماوس مع دمية صغيرة من غسول مزيل الشعر (انظر جدول المواد)لمدة 15-20 ق(أرقام 1C، 1D). نشر غسول تماما على أي مكان تم قطع الشعر قصيرة. استخدام المزيد من محلول إذا كان الماوس أكبر.
    3. لا تطبق غسول على آذان الماوس، الذيل، أو في أي مكان بالقرب من الوجه. إذا كان الغسول يحصل على الأذنين أو الذيل، ببساطة مسح مع ورقة مبللة مسح حتى الفرينة. إذا كان المستحضر يحصل على وجه الماوس، وغسل الماوس على الفور تحت الصنبور تشغيل أو الماء منزوع الأيونات لمنع تلف العينين والأنف والفم.
    4. اترك المستحضر ليتفاعل مع الشعر لمدة 20-45 ق إضافية بعد الاستخدام.
    5. قبل الإنزلاق، تحقق من إكمال رد الفعل مزيل الشعر عن طريق مسح طفيفة بعيدا عن محلول من الجلد في مواقع مختلفة(الشكل 1E)مع إصبع القفاز أو ملعقة معدنية رقيقة. رد الفعل الكامل إذا كان الجلد وردي دون وجود الشعر الأسود. فمن الأفضل للتحقق بسرعة من أن الشعر قد أزيلت في الواقع قبل الرينمنت من الرينص قبل الأوان ومن ثم الحاجة إلى تطبيق غسول مرة أخرى.
  3. الشطف
    ملاحظة: بمجرد التحقق من الانتهاء من رد فعل إزالة الشعر، اغسل الماوس بالماء الجاري أو الماء منزوع الأيونات لإزالة محلول إزالة الشعر ومنع الحروق الكيميائية.
    1. وضع الماوس على اليد اليسرى القفاز واضغط على قاعدة الذيل ضد النخيل مع الإبهام الأيسر لمنع الماوس من التحرك. إغلاق وتصويب بقية الأصابع اليسرى لمنع الماوس من العض.
    2. وضع الماوس حتى منطقة الوجه / الرأس هو بعيدا عن تيار المياه وتيار من الماء الفاتر يمكن أن تقع وراء الرأس وفقط على ظهره. بسرعة ولكن بلطف فرك الجزء الخلفي من الماوس مع اليد اليمنى القفاز لغسل بعيدا غسول.
    3. مرة واحدة في جلد الماوس خالية من محلول، ومسح بسرعة الماوس مع منشفة ورقية لامتصاص معظم الماء(الشكل 1F).
  4. العناية بعد الحلاقة وإزالة الشعر
    1. فحص وتنظيف أي غسول مزيل الشعر المتبقية التي قد تبقى على الأذنين والذيل مع مسح ورقة مبللة.
    2. وضع الماوس مرة أخرى في قفصه الفردية ووضع القفص على وسادة التدفئة (40-45 درجة مئوية) لمدة 30 دقيقة. يجب أن يعود الماوس إلى السلوك الطبيعي، والهرولة حولها، والعريس نفسه في غضون بضع دقائق.
    3. منزل كل فأر في قفص منفصل طوال مدة التجربة. لم يعد جلد الفئران محميًا ويمكن خدشه وعضه بسهولة من قبل فئران أخرى.
    4. منذ غسول مزيل الشعر يمكن أن يكون لها آثار مزعجة طفيفة التي قد تتداخل مع أو تغيير عملية التئام الجروح، والانتظار 18-24 ساعة قبل الجراحة للسماح لجلد الماوس لتهدئة والماوس للتكيف مع عدم وجود الشعر على ظهره.
  5. إزالة الشعر من البشرة مع التصبغ الداكن
    ملاحظة: بعض db/db-/- الفئران من المحتمل أن يكون بقع داكنة في الجلد التي سيكون الشعر ينمو مرة أخرى أسرع وأقوى من الجلد دون هذه البقع. (الشكل2ألف). هذه المناطق المظلمة من الجلد تبدو أغمق في اللون بسبب في منتصف وقت متأخر بصيلات الشعر مرحلة anagen و / أو سلس البول الصباغ29،30.
    1. إذا لوحظت بقع داكنة، وتطبيق غسول مزيل الشعر مرة أخرى، ولكن فقط في هذه المناطق، وكرر الخطوة 4.2 و 4.3(الشكلين 2B، 2C).
      ملاحظة: بقع الظلام من الجلد سوف تنمو الشعر بشكل أسرع طوال مدة التجربة، حتى مقطع الشعر القصير كل 3-5 أيام، عند الضرورة. التصحيح أو اثنين بعيدا عن الموقع المطلوب من الجرح هو مقبول. إذا كان الجزء الخلفي من الماوس مغطى بشكل كبير من قبل هذه البقع الداكنة، لا تستخدم هذا الماوس لنموذج الجرح المزمن.

5. إعداد الكاشف

ملاحظة: يتم تطوير الجروح المزمنة في db/db-/- الفئران عن طريق العلاج مع مثبطات محددة للكاتالاز والجلوتاثيون بيروكسيداز، 3-أمينو-1،2،4-تريازول (ATZ) وحمض ميركابتوسوتشيك (MSA)، على التوالي16 . الإجراء التالي تفاصيل الجرعة وإدارة التسكين والمثبطات على أساس وزن الماوس.

  1. حقن مسكن الألم Buprenex intraperitoneally في 0.05 ملغ / كغ الماوس في PBS معقمة. حقن حجم 120 درجة مئوية ل60 غرام ماوس حوالي 30 دقيقة قبل الجراحة. إعطاء جرعة أخرى 6 ح بعد الجراحة. ويمكن إعطاء جرعة إضافية حسب الحاجة.
  2. حقن ATZ داخل اقابي عند 1 غرام / كغ الماوس في PBS معقمة. حقن حجم 480 درجة مئوية ل60 غرام ماوس حوالي 20 دقيقة قبل الجراحة. حقن نصف حجم على الجانب الأيسر من البطن والنصف الآخر على الجانب الأيمن.
  3. إيداع MSA موضعيا على الجرح بين خلع الملابس شفافة والأنسجة الجرح في 150 ملغ / كغ الماوس في PBS معقمة. إدارة حجم 60 درجة مئوية لفأر ة 60 غرام في غضون 10 دقائق بعد الجراحة.

6. الجراحة

ملاحظة: يعتمد نجاح نموذج الجرح المزمن على الظروف غير المعقمة. هذه الفئران ليست خالية من الجراثيم وتقع في حيوية التقليدية. البكتيريا ميكروبيوم الذي يقيم في الجلد أمر بالغ الأهمية لبدء وتطوير الجروح المزمنة في وقت لاحق عند العلاج مع مثبطات الإنزيمات المضادة للأكسدة. ولذلك، فإن التحضير التقليدي قبل الجراحة للموقع هو العكس المشار إليها.

  1. حقن داخل العين
    1. تأمين الماوس على جزء مائل من رف القفص وعقد الذيل مع الماوس يقف بشكل مريح مع الرأس أقل من جسم الماوس. وهذا يضمن أننا نحاول نقل الأعضاء الداخلية بعيدا عن نقطة الحقن الممكنة.
    2. أدخل الإبرة في الربع الأيمن السفلي من البطن لتجنب الحقن في المثانة، أو غيرها من أجهزة البطن.
    3. يستنشق الإبرة قبل الحقن.
  2. العلاج والتخدير
    1. إدارة Buprenex 30 دقيقة وATZ 20 دقيقة قبل الجراحة، كما هو موضح في الخطوتين 5.1 و 5.2.
    2. ضع الماوس في حاوية بلاستيكية صغيرة فوق وسادة تدفئة دافئة كما هو موضح في الشكل 3ألف لمدة 15-20 دقيقة تقريبًا.
    3. ضع مسحة ورقية أو منشفة ورقية فوق الجزء العلوي من الحاوية الصغيرة لاحتواء الحرارة بشكل أفضل. يجب أن يهدأ الماوس كما يدفئ. الشكل 3 يعرض B المواد اللازمة للجراحة.
    4. ضع الماوس في حاوية مغلقة يتم ربطها بمرذاذ الأيسوفلوران في غطاء محرك السيارة الكيميائي في حالة استخدام نظام مفتوح.
    5. في نظام مفتوح، إدارة 5٪ isoflurane لمدة 1-2 دقيقة بمعدل تدفق من 2-3.5 لتر / دقيقة.
      1. مرة واحدة الماوس هو فاقد الوعي أو لم يعد يتحرك، ووضع الماوس على وسادة جراحية بيضاء وتناسب الرأس مع مخروط الأنف التي يتم تأمينها إلى المرذاذ للسماح بالإدارة المستمرة للisoflurane أثناء الجراحة.
    6. في نظام مفتوح، وإدارة 2-3٪ isoflurane في نفس معدل التدفق أثناء الجراحة والتكيف مع تدفق isoflurane للحفاظ على عمق التخدير.
    7. تقليل تركيز ومدة الأيسوفلوران تدار أثناء الجراحة. db/db -/- الفئران حساسة جدا للتخدير لذلك فمن الأفضل للحفاظ على التعرض isoflurane إلى الحد الأدنى. إذا كان الماوس لا يزال يستجيب بعد 2 دقيقة في 5٪ isoflurane، وتأمين مخروط الأنف وإدارة 3-5٪ isoflurane لمدة 15-30 s قبل بدء الجراحة.
      1. تأكد من التخدير المناسب قبل الإصابة. يتم تأكيد عمق التخدير بسبب عدم الاستجابة للمحفزات البدنية مثل قرصة اصبع القدم القوية. طول الوقت من الماوس تحت التخدير استنشاق أقل من 5 دقائق لذلك لا يتم تطبيق مرهم الطبيب البيطري على العينين.
  3. اصابه
    1. رش ورقة مسح مع الإيثانول 70٪ أو منشفة الإيثانول السريرية ومسح الجزء الخلفي من الماوس لتنظيف منطقة موقع الجرح. تنظيف سطح الجلد بحيث يمكن أن تلتزم خلع الملابس شفافة بحزم، منذ الغبار من الفراش، والغذاء، أو الجلد يمكن أن تمنع خلع الملابس من الالتصاق بشكل صحيح(الشكل 4A). لا تمسح بشكل مفرط، أو سيكون هناك خطر قتل البكتيريا الموجودة على الجلد.
    2. تحديد موضع موقع الجرح. أفضل مكان لأداء الجرح هو على الجانب الظهري من الماوس، تتمحور وبعيدا عن بقع من الجلد مع تصبغ أعلى.
      ملاحظة: لقد حددنا من خلال التجربة أن هذه الفئران يمكن أن تصمد فقط عبء جرح واحد.
    3. إنشاء جرح في غضون 30-45 ق باستخدام 7 ملم لكمة خزعة الجلد، ملاقط ومقص الجراحية. اضغط برفق على لكمة خزعة على موقع الجرح المطلوب وتحريف لكمة حول عميق بما فيه الكفاية لترك انطباع طفيف من لكمة(الشكل 4B). استئصال الجلد المبينة عن طريق سحب ما يصل وسط لكمة مع ملاقط وقطع على طول الخطوط العريضة مع مقص الجراحية(أرقام 4C-4E).
    4. تغطية الجرح بحزم مع نصف قطعة من شريط يركن شفاف (6 سم × 3.5 سم).
    5. وقف إدارة 2٪ isoflurane إلى الماوس(الشكل 4F).

7. العلاج بعد الجراحة والتعافي

  1. إدارة علاج MSA بعد الجراحة كاملة ويتم تطبيق خلع الملابس شفافة كما هو موضح في الخطوة 5.3. إيداع MSA على منطقة الجرح تحت خلع الملابس.
  2. ضع الماوس مرة أخرى في حاوية صغيرة على لوحة التدفئة لمدة 30 دقيقة للمساعدة في الانتعاش. مرة واحدة وقد ارتفعت درجة حرارة الماوس، ووضع الماوس مرة أخرى في قفصه. تأثير isoflurane مؤقت، وينبغي أن تتحرك الماوس في جميع أنحاء بعد ذلك بوقت قصير.
  3. لا تترك الفئران دون مراقبة ولا إعادتها إلى حيوية حتى الفئران قد استعادت الوعي الكافي للحفاظ على recumbency صارمة.
    ملاحظة: التخدير المفضل عند العمل مع هذه الفئران هو isoflurane على وجه التحديد بسبب الحث السريع والظهور اللاحقة من التخدير.
    1. الفئران البيت التي خضعت لعملية جراحية بشكل فردي لتجنب تداخل فأر واحد مع الجرح المزمن لآخر. وكما ذُكر أعلاه، فإنها لا تعود إلى الفيفيوم حتى تتعافى تماما.
  4. إدارة الجرعة الثانية من Buprenex 6 ح بعد الجراحة.
  5. مراقبة الفئران بعناية لأول 48 ساعة بعد الجراحة.
    ملاحظة: الجراحة، إلى جانب مثبطات لخلق الجرح المزمن، مرهقة جدا على الحيوان الذي هو بالفعل على حد سواء السكري والسمنة. الفئران التي البقاء على قيد الحياة في اليومين الأولين بعد الجراحة عادة البقاء على قيد الحياة مدة التجربة.

8. جمع البيانات، واستراتيجيات البقاء على قيد الحياة، والتعامل مع الفئران بعد الجرح، ونصائح إضافية

  1. جمع البيانات
    1. التقاط الصور في وقت مبكر مباشرة بعد الجراحة. يتم ملاحظة Biofilms في أي مكان بين 5-10 أيام بعد الجرح، وفي وقت مبكر من 3 أيام.
    2. إذا كانت البكتيريا هي محور التحليل، لفة مبادلة معقمة مع ضغط الضوء حول الجرح لمدة 10-15 ق. تخزين مسحة، في وسائل الإعلام الفريزر المناسبة للزراعة أو الجافة دون أي وسائل الإعلام لتحليل التسلسل مستقلة عن الثقافة، في -80 درجة مئوية. جمع المواد البوليمرية خارج الخلية عن طريق ملعقة معدنية معقمة في أنبوب الطرد المركزي الدقيق وتخزينها في -80 درجة مئوية قبل التحليل.
    3. لا تقم بتخدير الماوس أثناء التعامل مع جمع الأفلام الحيوية أو التقاط الصور. خلال هذه الإجراءات، ضع قطعة من الطعام أمام الماوس لتهدئة الماوس ومنعه من الهرب. معظم الفئران سوف يصعد على رأس الطعام، والجلوس على ذلك، وليس التحرك.
  2. كما يمكن أن تتطور العدوى الثانوية والجروح المزمنة غير المقصودة أو القرحة إذا كان الماوس لا يتحرك بشكل صحيح أو إذا لم يتم تطبيق خلع الملابس بشكل صحيح، والتحقق بشكل دوري من نشاط الماوس والجانب البطني للقروح. الاحتكاك بين الجلد والفراش الرطب(db / db-/- الفئران هي polyuric) يمكن أن يزعج الجلد إذا لم يتم تغيير أقفاص في كثير من الأحيان.
    ملاحظة: تراكم السوائل تحت خلع الملابس يمكن أن يسبب لاصقة لتفقد الالتصاق والسماح للسائل للتسرب. يمكن لخلية الجلد الميتة، والفراش، والبراز ثم التمسك على الجلد وتصلب. يجب إزالة هذه البقع المجففة والمجاميع على الجلد على الفور لمنع العدوى الثانوية.
  3. إذا وقفت الفئران أو الجلوس على أرجلها الخلفية، نقل هذه الفئران إلى قفص حيث الوصول إلى الغذاء والماء أقل بكثير. إذا كان وضع الطعام والماء في القفص مرتفعًا، فقد يقف الماوس أو يجلس على ساقيه الخلفيتين للوصول إليه. معظم الفئران لن يكون لها مشكلة في تناول الطعام والشرب إذا كان يمكن أن تفعل ذلك قبل الجراحة، على الرغم من أن هناك احتمال أن بعض الفئران قد الوجه على ظهورهم. هذه "الزعانف" قد تواجه صعوبة كبيرة في تسليم حتى أنها سوف تحتاج إلى المساعدة والمزيد من الرصد.
  4. اترك الضمادات الشفافة على الجلد لمدة تصل إلى 20 يومًا إذا كان الجلد خاليًا من الحطام والجلد والشعر المجعد. إذا حدث أي من هذه على الجلد، وإزالة خلع الملابس القديمة وتطبيق قطعة جديدة.
    1. لخلع خلع الملابس، قرصة طفيفة الجلد مباشرة وراء الرأس، ثم سحب خلع الملابس بعيدا عن الرأس في حركة واحدة على نحو سلس.
    2. لوضع قطعة من خلع الملابس على نحو آمن، يكون الماوس البقاء لا يزال قدر الإمكان. من المهم أن تكون البشرة نظيفة وخالية من خلايا الجلد الميتة المقشرة، والغبار من الفراش، وقطع الطعام. ضعي هاذا التلبس في الجلد حول الجرح لتأمينه.
    3. إذا كان وضع قطعة من الطعام أمام الماوس لا يحد من تحركاته، ثم وضع الماوس على رأس قفص الأسلاك. مرة واحدة وقد سيطرت على الماوس السكك الحديدية على القفص، وعقد الذيل أقرب إلى الجسم ممكن وسحب مع الحد الأدنى من القوة. كما يسحب الماوس إلى الأمام الظهر سوف تمتد وتصويب لسهولة التطبيق. وضع خلع الملابس بشكل آمن في هذه المرحلة.
    4. لا تعيد يُعيد استخدام الضمادات القديمة. دائما تطبيق خلع الملابس الجديدة إلى الخلف لأعظم التصاق.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويبين الشكل 5 مثالاً على جرح دون علاج مثبطات تتقدم نحو إغلاق الجرح وجرح مع علاج مثبطات تتقدم نحو المزمنة. وقد تركت خلع الملابس شفافة في مكان على الجرح المزمن بحيث يمكن رؤية biofilm وتراكم السوائل.

يتم بدء الجروح المزمنة في أقل من 6 ساعات ويتم تغيير هامش الجرح بشكل واضح من الإجهاد التأكسدي. الأدلة النسيجية لهذا الهامش الجرح يكشف أن الأنسجة نخرية ولن تشارك في التئام الجروح. يمكن للبكتيريا المكونة للأفلام الحيوية في الجرح استخدام هذا النسيج النخري في وقت لاحق كمصدر للمغذيات والمكونات الهيكلية لإنتاج biofilm. الجرح المزمن هو الجرح الذي لا يزال مفتوحا، وتضخم بالمقارنة مع الجرح الأولي، ويحتوي على biofilm (EPS زائد البكتيرية المسببة للأمراض وجدت في الجروح المزمنة البشرية) ويستغرق شهرا أو سنوات للشفاء اعتمادا على كمية ومحتوى biofilm الذي يمنع الجرح من حل عادة. في نموذج الجرح المزمن، يتم تعيين المزمنة الكاملة إلى > 20 يوما بعد الجراحة لأن الجروح التي لا تعالج مع مثبطات سوف تغلق بحلول هذا الوقت(الشكل 5). عادة ما يستغرق الشفاء > 60 يوما والوقت يعتمد على البكتيريا المسببة للأمراض الأولية الموجودة في الجرح. في بعض الأحيان قد تخضع الفئران للعدوى عندما تكون البكتيريا الأكثر عدوانية التي تشكل الأفلام الحيوية، مثل Pseudomonas، هي الغالبة في الجرح. وهكذا، يتم تعريف الجرح المزمن على أنه جرح لن يغلق في غضون 20 يوما، ويستغرق أكثر من 60 يوما للشفاء، ولديه biofilm الحاضر على الجرح.

وقد تم العثور على الاختلافات بين الجنسين في مختلف نماذج مرض السكري، بما في ذلك db / db-/- نموذج الماوس32،33. وفي حين أن هذه الاختلافات موجودة، فقد لاحظنا أن الجنس ليس عاملا هاما في تطور الجروح المزمنة. وتتطور الجروح المزمنة في الفئران الذكور والإناث إلى حد مماثل، بحيث يمكن استخدام كلا الجنسين لدراسة الجروح المزمنة. وبالتالي، فإن استخدام هذا النموذج مفيد لأن الجروح المزمنة البشرية يمكن العثور عليها على كل من مرضى السكري الذكور والإناث.

Figure 1
الشكل 1 . عملية الحلاقة وإزالة الشعر. (أ)الماوس قبل الحلاقة. (ب)يتم حلق جلد الماوس لإزالة معظم الشعر على ظهره. (C)دمية من غسول مزيل الشعر على طرف إصبع. يتم استخدام المزيد إذا كان الماوس أكبر. (D)يتم تغطية الجزء الخلفي من الماوس مع غسول مزيل الشعر وترك للرد. (E)يتم استخدام ملعقة لكشط بعض من محلول لمعرفة ما إذا كان قد تم إزالة الشعر. بشرة وردية زاهية دون أي وجود للشعر يدل على أن إزالة الشعر كاملة. (F)تتم إزالة غسول على ظهره بالماء الجاري. يجب أن يكون جلد الماوس وردي ًا قليلاً. وقد تم تعديل هذا الرقم من كيم ومارتينز غرين31. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2 . إزالة الشعر من بقع أصغر من الجلد الداكن. (أ)تم بالفعل علاج الماوس مرة واحدة والجلد الرطب مرة أخرى لمنع الحروق. (B)يتم تطبيق غسول مزيل الشعر فقط على رقعة من الجلد الذي هو الظلام ولها شعر كثيف. (C)يتم غسل هاذا اللوشن بعد رد الفعل للكشف عن التصحيح الداكن من الجلد دون شعر. وقد تم تعديل هذا الرقم من كيم ومارتينز غرين31. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3 . إعداد ما قبل الجراحة. (أ)يتم وضع الفئران التي سيتم جرحها في حاويات بلاستيكية صغيرة على رأس وسادة التدفئة. (ب)يتم عرض بعض المواد المستخدمة في الجراحة. المقص الجراحي تحتاج إلى أن تكون حادة لضمان عدم سحق الجلد عند قطع. يتم قطع خلع الملابس شفافة إلى النصف. وقد تم تعديل هذا الرقم من كيم ومارتينز غرين31. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4 . جعل جرح الختان. (أ)بعد أن يكون الماوس تحت التخدير، يتم مسح الجزء الخلفي من الماوس مع الإيثانول 70٪ مرة واحدة. (ب)يتم وضع لكمة خزعة الجلد على الجزء الخلفي من الماوس والضغط من الصعب بما فيه الكفاية لترك انطباع. يمكن تدوير لكمة الخزعة لإجراء شق ضحل. (ج)يتم قرصة منتصف المنطقة المبينة مع ملاقط ويتم استخدام مقص الجراحية الحادة لجعل الشق الأولي. (D)يتم مناورة المقص الجراحي لقطع على طول المخطط الذي أدلى به لكمة خزعة. (E)يتم استئصال منطقة من الجلد المبينة بواسطة مضخة خزعة بنجاح. (F)يتم وضع خلع الملابس شفافة على الجزء الخلفي من الماوس وتأمينها. وقد تم تعديل هذا الرقم من كيم ومارتينز غرين31. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5 . صور من الجروح. (أ)الجرح على الفأر في أوقات متتالية بعد الجراحة كما أنه يتطور إلى المزمنة بدءا من يوم الجراحة. يمكن رؤية Biofilm في وقت مبكر من اليوم 5 وكشف في وقت مبكر من اليوم 3. الجرح مزمن تماما مع biofilm قوية في اليوم 20. (ب)أمثلة على الجروح البشرية المزمنة، وعلى وجه التحديد قرحة القدم السكرية. وقد تم تعديل هذا الرقم من كيم ومارتينز غرين31. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

بمجرد إنشاء الجروح المزمنة على الفئران، يمكن استخدام النموذج لدراسة عمليات التئام الجروح المعاقة التي تنطوي عليها بداية المزمنة. ويمكن أيضا استخدام النموذج لاختبار فعالية مجموعة واسعة من المواد الكيميائية والأدوية التي يمكن أن تعكس تطور الجروح المزمنة وضعف الشفاء ويؤدي إلى إغلاق الجروح والشفاء. يمكن دراسة نقاط زمنية مختلفة بعد بداية المزمنة: على سبيل المثال، أيام 1-5 بعد الإصابة للبداية المبكرة للمزمنة والأيام 20 وما بعدها للجروح المزمنة كاملة القوة.

نموذج الجروح المزمنة هو أيضا نموذج قوي لدراسة مختلف جوانب التئام الجروح والمضاعفات مثل العبء البيولوجي وcachexia. العبء الحيوي هو مجرد واحد من العديد من جوانب الجروح المزمنة التي يمكن دراستها في هذا النموذج، كما أنه يؤثر أيضا على الجروح البشرية المزمنة. تحدد إجراءاتنا وبروتوكول استخدام الحيوانات بوضوح الأعراض التي سيتم رصدها، جنبا إلى جنب مع جدول زمني محدد للرصد. يتم قتل الحيوانات التي تم تحديدها على أنها المهووسين، استناداً إلى المعايير المعتمدة من IACUC، من أجل تجنب معاناة كبيرة. وبالإضافة إلى ذلك، يتم استشارة الطبيب البيطري الجامعي وفني صحة الحيوان عندما تنشأ بعض الأعراض وتقديم التوجيه الداعم في تقييم المعايير.

وتشمل الخطوات الحاسمة داخل البروتوكول إسكان الفئران db/db-/- في حيوية تقليدية، وإزالة الشعر مع غسول مزيل الشعر، والتدفئة قبل إدارة isoflurane. تطوير الجروح المزمنة في نموذج الجرح المزمن يعتمد على الظروف والممارسات غير المعقمة. هذه الفئران ليست خالية من الجراثيم ولا تنمو في vivariums نظيفة جدا. البكتيريا التي توجد في الجلد أمر بالغ الأهمية للبدء في وقت لاحق وتطوير الجروح المزمنة عند العلاج مع مثبطات للإنزيمات المضادة للأكسدة. يجب أن تتعرض هذه db /db-/- الفئران إلى بيئة تحتوي على البكتيريا، سواء commensal والمسببة للأمراض. إذا تم تنظيف الجلد وإصابة المصابين باليود أو غيرها من الطرق المطهرة قبل الجراحة من أجل "تعقيم" الجلد، قد لا يصبح الجرح مزمنًا. البكتيريا في ميكروبيوم الجلد ضرورية لتشكيل وتطوير biofilm، وتأخير الشفاء وإغلاق الجروح. في العيادة ، يزيد وجود biofilm في الجرح من تعقيد عمليات التئام الجروح ويزيد من خطر بتر الأطراف في البشر إذا لم يتم التحكم في العدوى في الجرح.

إزالة الشعر مع غسول مزيل الشعر هو خطوة هامة لإزالة الشعر الزائد والسماح لسطح ناعم ونظيف لخلع الملابس شفافة التمسك بحزم. غسول إزالة الشعر المستخدم في هذا البروتوكول هو مزيل الشعر الكيميائي مع الألوة المضافة لتقليل الحروق. هذا المنتج هو الحد الأدنى في تغيير مورفولوجيا الجلد، فضلا عن الحفاظ على ميكروبيوم الجلد. ينصح المنتج المدرجة في جدول المواد على غيرها من منتجات إزالة الشعر، بما في ذلك مزيلات الشعر المادية والميكانيكية (الشمع وإزالة الشعر التجارية) التي يمكن أن تحرق والساحبة في الجلد و / أو قتل ميكروبيوم الجلد. على الرغم من أن هذا مزيل الشعر الكيميائي هو لطيف جسديا، فإنه لا يزال يمكن تهيج الجلد قليلا، وهو تأثير يمكن أن يغير عمليات التئام الجروح. وبالتالي، فمن الأكثر فعالية الانتظار 18-24 ساعة قبل الجراحة للسماح للبشرة للتعافي من الإجراء وضمان الجلد والجرح لا تتأثر به.

هذه الفئران هي سهلة للغاية وغير مستجيبة لعوامل الإجهاد. من السهل جدا التعامل معها دون تخدير. فهي هادئة بما فيه الكفاية لوضع على النخيل أو على رأس مقاعد البدلاء دون الهروب. إذا تم تأمين قاعدة ذيل الماوس مع الإبهام والإصبع الثاني، فإن الماوس لن تكون قادرة على الهرب أو العودة إلى لدغة بسبب حجم البطن كبيرة. الأهم من ذلك، في تجربتنا، هذه الفئران حساسة للغاية للتخدير، وخاصة فيما يتعلق بفقدان التوازن. وهكذا، وبالتشاور مع IACUC لدينا، تقرر أن الخيار الأفضل هو الحد من إدارة التخدير.

الغرض الرئيسي من هذا النموذج هو خلق جرح كبير غير التئام على ظهره، وذلك بمجرد إجراء الجرح، وعقد الماوس تقليديا لجعل حقن IP من buprenex إضافية أو غيرها من العلاجات الكيميائية بشكل دوري من المستحيل. عقد الماوس من الجلد الظهري يسبب الماوس الكثير من الانزعاج والألم ربما جدا إذا تم عقد الماوس في مثل هذه الطريقة التقليدية. وبالتالي، كل حقن مع الجانب الأيمن الماوس حتى في حين أنه يقف على جميع الأقدام الأربعة. تجارب أخرى باستخدام db/db-/- سلالة استخدام هذه الفئران عندما تكون أصغر سنا ولا تزن بقدر, وبالتالي فإن الطريقة التقليدية لأداء حقن IP قد تستخدم. منذ نموذج الجرح المزمن يستخدم الفئران تصل إلى 6 أشهر من العمر وهذه الفئران يمكن أن تزن ما يصل إلى 80 غرام، والطريقة التقليدية ليست الأمثل ويمكن أن تؤذي الماوس. لقد استخدمنا الطريقة الموضحة أعلاه لمواس هذا السمنة ولم نلاحظ أي نتائج سلبية عند حقن مع هذه الطريقة مع الطموح الناجح.

في السابق، تم استخدام التخدير عن طريق الحقن مثل الكيتامين والإكسيلازين. ومع ذلك، ثبت أنها صعبة الاستخدام مع db/db-/- الفئران. ومع مرور أقل من 5 دقائق على التشغيل الكلي، لم يكن وقت الحث والاسترداد الطويل ضروريًا لأغراض التجربة. تم تحديد Isoflurane ليكون الخيار الأفضل للتخدير لهذا الإجراء بسبب سهولة الإدارة والمعايرة، وبداية سريعة والانتعاش، وعمق التخدير الكافي. أيضا، isoflurane يسبب الحد الأدنى من الاكتئاب القلبي ويحافظ BP بشكل جيد جدا34. لذلك، كان تغيير كبير في الإجراء لنموذج الجرح المزمن لاستخدام isoflurane كالتخدير المفضل.

التدفئة قبل الجراحة مهمة لمنع الوفيات في 2-3 أيام بعد الجراحة. هذه الفئران لديها انخفاض كبير في درجة حرارة الجسم الأساسية35 وغير قادرة على السيطرة على درجة حرارة الجسم الأساسية على نحو فعال بسبب التلاعب الوراثية، لذلك يتم توفير مصدر التدفئة الخارجية قبل الجراحة للحماية من انخفاض إضافي في درجة حرارة الجسم الأساسية الناجمة عن التخدير. لقد قمنا بتقييم الحاجة إلى وسادة التدفئة قبل وأثناء وبعد الجراحة. من المهم أن نلاحظ أن db/db-/- الفئران لديها استجابات فسيولوجية غير عادية. من الناحية التجريبية، وجدنا هذه الفئران لتكون أكثر فعالية محمية مع دعم الحرارة قبل وبعد الجراحة. من خلال استبدال isoflurane كمخدر، قمنا بقياس وتحديد أن درجة حرارة الجسم الأساسية لم تنخفض بشكل ملحوظ خلال أقل من خمس دقائق من الجراحة. في حين أننا وجدنا دعم الحرارة قبل وبعد الجراحة لتكون حاسمة لهذه الفئران، لم نجد الدعم الحراري الجراحية ليكون لها تأثير. وتجدر الإشارة إلى أن رئيس اللجنة الدولية للاستشعار عن بعد قدم التوجيه ورصد اختباراتنا المتعلقة بدرجة الحرارة والآثار المخدرة. وبينما نبلغ بهذه الطريقة، نجد من المهم الإشارة إلى ما هو ضروري لنجاح الإجراء.

حد من استخدام هذه الطريقة لدراسة تطوير biofilm هو حقيقة أن البكتيريا الموجودة على الجرح وإنتاج biofilm لا يتم التحكم فيها. إذا كان لا بد من دراسة بكتيريا محددة تشكل الفيومتر الحيوي، قد يكون هذا النموذج مفيدا إذا كان يمكن إلغاء ميكروبيوم الأصلي قبل الجرح إما عن طريق اليود أو غيرها من أساليب مطهر. استجابة لمستويات مفرطة من الإجهاد التأكسدي، يتم تحفيز البكتيريا المسببة للأمراض الرئيسية في ميكروبيوم الجلد لبدء تشكيل biofilm. في جروحنا المزمنة، وتشمل البكتيريا التي تشكل biofilm، على سبيل المثال لا الحصر، الزائفة aeruginosa36،37،38،39، Enterobacter cloacae37، 38 , 39، ومختلف المكورات العنقودية40،41 وكورينباكتريوم الأنواع41،42،43،44، 45، وكلها يمكن العثور عليها في الجروح البشرية المزمنة. وقد أجريت عدة دراسات ميكروبيوم الجروح المزمنة على الجروح البشرية المزمنة للبكتيريا39،40،41،43،44،45 ، والفطريات46،47 المجتمع ، بما في ذلك الدراسات الاستقصائية الطولية المرتبطة بالشفاء الفقراء48،49. ويمكن أيضا أن تتبع الدراسات الطولية من هذا النوع من خلال مع نموذج الجرح المزمن.

من المهم الاعتراف بأنه يمكن الحصول على نتائج مختلفة بسبب الاختلافات في ظروف vivaria، والإمدادات، والمعدات، والبائعين، ومستعمرات المصدر لdb/db-/- الفئران. للحد من هذه الاختلافات، المنصوص عليها في البروتوكول هو بالضبط الفئران متنوعة والمصدر الذي يستخدم لتجربة الجرح المزمن. لتربية هذه الفئران، تم توفير الفراش الدقيق والعلامات التجارية الغذائية في جدول المواد للحد من التباين. في تجاربنا، نجد أن الإجهاد التأكسدي العالي ضروري وكاف لخلق جروح مزمنة في هذه الفئران، طالما أن الفئران موجودة في حيوية تقليدية وتتعرض للبكتيريا. قد تختلف مجموعات البكتيريا والمجتمعات مع vivaria; ومع ذلك، طالما لم يتم استخدام منشأة خالية من الجراثيم لإيواء الفئران، ينبغي أن يكون لديهم ما يكفي من البكتيريا، سواء commensal والمسببة للأمراض، للإقامة على الشعر والجلد.

هذه الطريقة لخلق الجروح المزمنة في هذا البروتوكول مهم لدراسة الجروح المزمنة وضعف التئام الجروح لأن مستويات الإجهاد التأكسدي فقط يتم تغييرها بشكل كبير تجريبيا. الإجهاد التأكسدي مطلوب لعمليات التئام الجروح العادية2. من المهم لتنظيم في الوقت المناسب وعنصر حاسم في وظائف الخلايا اللازمة للتئام الجروح5. ومع ذلك، عندما لا يتم التحكم في مستويات الإجهاد التأكسدي، يمكن أن تضر أنواع الأكسجين التفاعلية خلايا بطانة الرحم، وتمنع وظائف الخلايا الكيراتينية، وتأخير إغلاق الجرح2،5. الجروح البشرية المزمنة لديها مستويات عالية من الإجهاد التأكسدي50. نموذج الماوس لديه ارتفاع الجلوكوز في الدم وزيادة بالفعل مستويات الإجهاد التأكسدي بسبب اعتلاله. يتم تقاسم هذه الخصائص مع البشر الذين يعيشون مع مرض السكري وتوفير بيئة صغيرة مواتية للمزمنة بعد الإصابة50. البشر أيضا استضافة microbiota متنوعة ومعقدة في العديد من المواقع على الجسم، بما في ذلك الجلد، لذلك يسمح معقدة، ولكن الطبيعية، ميكروبيوم لتطوير على جلد الماوس.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ويعلن صاحبا البلاغ أنهما ليس لديهما مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgments

وليس لدى أصحاب البلاغ أي اعتراف.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
B6.BKS(D)-Leprdb/J  The Jackson Laboratory  00697 Homozygotes and heterozygotes available 
Nair Hair Remover Lotion with Soothing Aloe and Lanolin Nair a chemical depilatory
Buprenex (buprenorphine HCl) Henry Stein Animal Health 059122 0.3 mg/ml, Class 3
3-Amino-1,2,4-triazole (ATZ) TCI A0432
Mercaptosuccinic acid (MSA) Aldrich 88460
Phosphate buffer solution (PBS) autoclave steriled
Isoflurane Henry Schein Animal Health 029405 NDC 11695-6776-2
Oxygen Tank must be compatible with vaporizing system
Isoflurane vaporizer JA Baulch & Associates 
Wahl hair clipper Wahl Lithium Ion Pro
Acu Punch 7mm skin biopsy punches Acuderm Inc. P750
Tegaderm  3M Ref: 1624W Transparent film dressing (6 cm x 7 cm)
Heating pad Conair Moist Dry Heating Pad
Insulin syringes BD 329461 0.35 mm (28G) x 12.7 mm (1/2")
70% ethanol
Kimwipes
Tweezers
Sharp surgical scissors
Thin metal spatula
Tubing
Mouse nose cone
Gloves
small plastic containers

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Singer, A. J., Clark, R. A. F. Cutaneous wound healing. New England Journal of Medicine. 341 (10), 738-746 (1999).
  2. Nouvong, A., Ambrus, A. M., Zhang, E. R., Hultman, L., Coller, H. A. Reactive oxygen species and bacterial biofilms in diabetic wound healing. Physiological Genomics. 48 (12), 889-896 (2016).
  3. MacLeod, A. S., Mansbridge, J. N. The innate immune system in acute and chronic wounds. Advanced Wound Care. 5 (2), 65-78 (2016).
  4. Zhao, G., et al. Biofilms and Inflammation in Chronic Wounds. Advanced Wound Care. 2 (7), 389-399 (2013).
  5. Wlaschek, M., Scharffetter-Kochanek, K. Oxidative stress in chronic venous leg ulcers. Wound Repair and Regeneration. 13 (5), 452-461 (2005).
  6. Stadelmann, W. K., Digenis, A. G., Tobin, G. R. Physiology and healing dynamics of chronic cutaneous wounds. American Journal of Surgery. 176 (2), 26-38 (1998).
  7. Loots, M. A., Lamme, E. N., Zeegelaar, J., Mekkes, J. R., Bos, J. D., Middelkoop, E. Differences in cellular infiltrate and extracellular matrix of chronic diabetic and venous ulcers versus acute wounds. Journal of Investigative Dermatology. 111 (5), 850-857 (1998).
  8. Costerton, W., Veeh, R., Shirtliff, M., Pasmore, M., Post, C., Ehrlich, G. The application of biofilm science to the study and control of chronic bacterial infections. Journal of Clinical Investigation. 112 (10), 1466-1477 (2003).
  9. Fux, C. A., Costerton, J. W., Stewart, P. S., Stoodley, P. Survival strategies of infectious biofilms. Trends in Microbiology. 13 (1), 34-40 (2005).
  10. Sen, C. K., et al. Human skin wounds: A major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair and Regeneration. 17 (6), 763-771 (2009).
  11. Armstrong, D. G., Wrobel, J., Robbins, J. M. Are diabetes-related wounds and amputations worse than cancer. International Wound Journal. 4 (4), 286-287 (2007).
  12. James, G. A., et al. Biofilms in chronic wounds. Wound Repair and Regeneration. 16 (1), 37-44 (2008).
  13. Chen, H., et al. Evidence that the diabetes gene encodes the leptin receptor: Identification of a mutation in the leptin receptor gene in db/db mice. Cell. 84 (3), 491-495 (1996).
  14. Coleman, D. L. Obese and diabetes: Two mutant genes causing diabetes-obesity syndromes in mice. Diabetologia. 14 (3), 141-148 (1978).
  15. Garris, D. R., Garris, B. L. Genomic modulation of diabetes (db/db) and obese (ob/ob) mutation-induced hypercytolipidemia: cytochemical basis of female reproductive tract involution. Cell Tissue Research. 316 (2), 233-241 (2014).
  16. Dhall, S., et al. Generating and reversing chronic wounds in diabetic mice by manipulating wound redox parameters. Journal of Diabetes Research. , 2014, Article ID 562625 (2014).
  17. Feinstein, R. N., Berliner, S., Green, F. O. Mechanism of inhibition of catalase by 3-amino-1,2,4-triazole. Archives of Biochemistry and Biophysics. 76 (1), 32-44 (1958).
  18. Margoliash, E., Novogrodsky, A. A study of the inhibition of catalase by 3-amino-1:2:4:-triazole. Biochemical Journal. 68 (3), 468-475 (1958).
  19. Margoliash, E., Novogrodsky, A., Schejter, A. Irreversible reaction of 3-amino-1:2:4-triazole and related inhibitors with the protein of catalase. Biochemical Journal. 74 (2), 339-348 (1960).
  20. Shiba, D., Shimamoto, N. Attenuation of endogenous oxidative stress-induced cell death by cytochrome P450 inhibitors in primary cultures of rat hepatocytes. Free Radical Biology and Medicine. 27 (9-10), 1019-1026 (1999).
  21. Ishihara, Y., Shimamoto, N. Critical role of exposure time to endogenous oxidative stress in hepatocyte apoptosis. Redox Report. 12 (6), 275-281 (2007).
  22. Valenti, V. E., de Abreu, L. C., Sato, M. A., Ferreira, C. ATZ (3-amino-1,2,4-triazole) injected into the fourth cerebral ventricle influences the Bezold-Jarisch reflex in conscious rats. Clinics. 65 (12), 1339-1343 (2010).
  23. Welker, A. F., Campos, E. G., Cardoso, L. A., Hermes-Lima, M. Role of catalase on the hypoxia/reoxygenation stress in the hypoxia-tolerant Nile tilapia. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (9), 1111-1118 (2012).
  24. Bagnyukova, T. V., Vasylkiv, O. Y., Storey, K. B., Lushchak, V. I. Catalase inhibition by amino triazole induces oxidative stress in goldfish brain. Brain Research. 1052 (2), 180-186 (2005).
  25. Falck, E., Karlsson, S., Carlsson, J., Helenius, G., Karlsson, M., Klinga-Levan, K. Loss of glutathione peroxidase 3 expression is correlated with epigenetic mechanisms in endometrial adenocarcinoma. Cancer Cell International. 10 (46), (2010).
  26. Chaudiere, J., Wilhelmsen, E. C., Tappel, A. L. Mechanism of selenium-glutathione peroxidase and its inhibition by mercaptocarboxylic acids and other mercaptans. Journal of Biological Chemistry. 259 (2), 1043-1050 (1984).
  27. Dunning, S., et al. Glutathione and antioxidant enzymes serve complementary roles in protecting activated hepatic stellate cells against hydrogen peroxide-induced cell death. Biochimica et Biophysica Acta. 1832 (12), 2027-2034 (2013).
  28. Franco, J. L., et al. Methylmercury neurotoxicity is associated with inhibition of the antioxidant enzyme glutathione peroxidase. Free Radical Biology and Medicine. 47 (4), 449-457 (2009).
  29. Sundberg, J. P., Silva, K. A. What color is the skin of a mouse. Veterinary Pathology. 49 (1), 142-145 (2012).
  30. Curtis, A., Calabro, K., Galarneau, J. R., Bigio, I. J., Krucker, T. Temporal variations of skin pigmentation in C57BL/6 mice affect optical bioluminescence quantitation. Molecular Imaging & Biology. 13 (6), 1114-1123 (2011).
  31. Kim, J. H., Martins-Green, M. Protocol to create chronic wounds in diabetic mice. Nature Protocols Exchange. , (2016).
  32. Aasum, E., Hafstad, A. D., Severson, D. L., Larsen, T. S. Age-dependent changes in metabolism, contractile function, and ischemic sensitivity in hearts from db/db mice. Diabetes. 52 (2), 434-441 (2003).
  33. Vannucci, S. J., et al. Experimental stroke in the female diabetic, db/db, mouse. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 21 (1), 52-60 (2001).
  34. Janssen, B. J., et al. Effects of anesthetics on systemic hemodynamics in mice. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 287 (4), 1618-1624 (2004).
  35. Osborn, O., et al. Metabolic characterization of a mouse deficient in all known leptin receptor isoforms. Cellular and Molecular Neurobiology. 30 (1), 23 (2010).
  36. Scales, B. S., Huffnagle, G. B. The microbiome in wound repair and tissue fibrosis. Journal of Pathology. 229 (2), 323-331 (2013).
  37. Gjødsbøl, K., et al. No need for biopsies: Comparison of three sample techniques for wound microbiota determination. International Wound Journal. 9 (3), 295-302 (2012).
  38. Wolcott, R. D., et al. Analysis of the chronic wound microbiota of 2,963 patients by 16S rDNA pyrosequencing. Wound Repair Regeneration. 24 (1), 163-174 (2016).
  39. Gjødsbøl, K., Christensen, J. J., Karlsmark, T., Jørgensen, B., Klein, B. M., Krogfelt, K. A. Multiple bacterial species reside in chronic wounds: a longitudinal study. International Wound Journal. 3 (3), 225-231 (2006).
  40. Dowd, S. E., et al. Survey of bacterial diversity in chronic wounds using Pyrosequencing, DGGE, and full ribosome shotgun sequencing. BMC Microbiology. 8 (43), (2008).
  41. Price, L. B., et al. Community analysis of chronic wound bacteria using 16S rrna gene-based pyrosequencing: Impact of diabetes and antibiotics on chronic wound microbiota. PLoS One. 4 (7), 6462 (2009).
  42. Scales, B. S., Huffnagle, G. B. The microbiome in wound repair and tissue fibrosis. Journal of Pathology. 229 (2), 323-331 (2013).
  43. Dowd, S. E., et al. Polymicrobial nature of chronic diabetic foot ulcer biofilm infections determined using bacterial tag encoded FLX amplicon pyrosequencing (bTEFAP). PLoS One. 3 (10), 3326 (2008).
  44. Price, L. B., et al. Macroscale spatial variation in chronic wound microbiota: A cross-sectional study. Wound Repair and Regeneration. 19 (1), 80-88 (2011).
  45. Gontcharova, V., Youn, E., Sun, Y., Wolcott, R. D., Dowd, S. E. Comparison of bacterial composition in diabetic ulcers and contralateral intact skin. Open Microbiology Journal. 4, 8-19 (2010).
  46. Smith, K., et al. One step closer to understanding the role of bacteria in diabetic foot ulcers: characterising the microbiome of ulcers. BMC Microbiologyogy. 16 (54), (2016).
  47. Gardner, S. E., Hillis, S. L., Heilmann, K., Segre, J. A., Grice, E. A. The Neuropathic diabetic foot ulcer microbiome is associated with clinical factors. Diabetes. 62 (3), 923-930 (2013).
  48. Loesche, M., et al. Temporal stability in chronic wound microbiota is associated with poor healing. Journal of Investigative Dermatology. 137 (1), 237-244 (2017).
  49. Kalan, L., et al. Redefining the chronic-wound microbiome: Fungal communities are prevalent, dynamic, and associated with delayed healing. MBio. 7 (5), 01058-01116 (2016).
  50. Blakytny, R., Jude, E. The molecular biology of chronic wounds and delayed healing in diabetes. Diabetic Medicine. 23 (6), 594-608 (2006).

Tags

الطب العدد 151 التئام الجروح الجروح المزمنة ضعف الشفاء قرحة القدم السكري الإجهاد التأكسدي biofilm
بروتوكول لخلق الجروح المزمنة في الفئران السكري
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kim, J. H., Martins-Green, M.… More

Kim, J. H., Martins-Green, M. Protocol to Create Chronic Wounds in Diabetic Mice. J. Vis. Exp. (151), e57656, doi:10.3791/57656 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter